Αφηρημένο

Η ανάπτυξη του όγκου μετά την ακτινοθεραπεία είναι μια ευρέως αναγνωρισμένη αιτία της θεραπευτικής αποτυχίας. Με τον τρόπο αυτό, εξετάσαμε την κυτταρική ανάπτυξη του όγκου μετά την ακτινοθεραπεία με τη δημιουργία ενός μοντέλου ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vitro

. Έχουμε καταφέρει αυτό το μοντέλο με σπορά μη-ακτινοβολημένα πυγολαμπίδας luciferase2 και γονίδιο πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης σύντηξης (διακύμανση των) σημασμένα ζώντα κύτταρα ανταποκριτή του καρκίνου σε ένα τροφοδοτικό στρώμα ακτινοβολημένων κυττάρων καρκίνου. Το ζωντανό ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων παρακολουθήθηκε με απεικόνιση βιοφωταύγειας. Τα ζωντανά κύτταρα ανταποκριτή αυξήθηκε ταχύτερα όταν εμβολιάζονται σε θανατηφόρα ακτινοβολημένων τροφοδοτικών κυττάρων από όταν εμβολιάζονται σε μη ακτινοβολημένα τροφοδοτικά κύτταρα ή όταν εμβολιάστηκαν σε απουσία κυττάρων τροφοδοσίας. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών Shh και Gli1, δύο από τα οποία είναι κρίσιμα πρωτεΐνες σε Sonic hedgehog (SHH) σηματοδότησης, αυξήθηκαν μετά την ακτινοβόληση και ότι αυτή η έκφραση συσχετίστηκε θετικά με την ανάπτυξη των κυττάρων αναφοράς. Επιπλέον, η διέγερση θανάτου κυττάρου των έμβιων κυτταρικής ανάπτυξης όγκου ενισχύεται με την προσθήκη του SHH αγωνιστών σηματοδότησης και αναστέλλεται από ανταγωνιστές SHH σηματοδότησης. SHH αγωνιστές ενισχυμένη επίσης την ανάπτυξη των κυττάρων ρεπόρτερ σε απουσία ακτινοβολημένα τροφοδοτικά κύτταρα, υποδηλώνοντας το μηχανισμό αυτό παίζει ένα ρόλο στην διέγερση της ανάπτυξης των κυττάρων τροφοδότη. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα αποτελέσματα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η Shh ενεργοποίηση σηματοδότησης παίζει σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της αποκατάστασης του πληθυσμού του όγκου μετά την ακτινοθεραπεία

Παράθεση:. Ma J, Tian L, Cheng J, Chen Ζ, Xu Β, Wang L, et al. (2013) Sonic Hedgehog μονοπάτι σηματοδότησης Υποστηρίζει Καρκίνος ανάπτυξη των κυττάρων κατά τη διάρκεια του καρκίνου Ακτινοθεραπεία. PLoS ONE 8 (6): e65032. doi: 10.1371 /journal.pone.0065032

Επιμέλεια: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 του Φεβ 2013? Αποδεκτές: 20 Απρίλη 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 του Ιούνη, 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (81120108017, 81172030) και το Εθνικό πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας (2010CB529902) (για Q Huang και L Tian) και εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από τις Ηνωμένες Πολιτείες Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (CA131408, CA136748, CA155270 ) (για να CY Li). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σε πολλούς τύπους καρκίνου, την αύξηση του πληθυσμού του όγκου μετά την ακτινοθεραπεία συμβαίνει και αποτελεί σημαντική πρόκληση για τους κλινικούς ιατρούς. Στη διαδικασία αυτή, τα λίγα καρκινικά κύτταρα που επιβιώνουν μετά την ακτινοθεραπεία θα αναγεννηθούν και να αντικαταστήσει τα χαμένα κύτταρα όγκου. Ανασύσταση του πληθυσμού κατά τη διάρκεια κλασματοποιημένη ακτινοθεραπεία αναγνωρίζεται ως μια σημαντική αιτία της αποτυχίας της θεραπείας και τα στοιχεία δείχνουν ότι το ποσοστό εμπλουτισμού πληθυσμών μπορεί να συμβεί με επιταχυνόμενο ρυθμό σε ορισμένες περιπτώσεις [1]. Ανασύσταση εξαρτάται από την ενεργοποίηση των μονοπατιών που διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και πολλά μοριακά στοχευμένες παράγοντες σηματοδότησης έχουν αναπτυχθεί που αναστέλλουν αυτά τα μονοπάτια, όπως gefitinib το οποίο στοχεύει τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) σηματοδότησης [2]. Προκειμένου να δημιουργηθεί ένα μοντέλο για τη μελέτη αποκατάστασης του πληθυσμού των κυττάρων του όγκου μετά την ακτινοθεραπεία, πολλοί άλλοι έχουν δοκιμάσει τη χρήση λεγόμενη «τροφοδοτικά κύτταρα» που έχουν υποστεί επεξεργασία με ακτινοβολία για την προώθηση της ανάπτυξης των μη επεξεργασμένων κυττάρων όγκου σπάρθηκαν σε πειράματα συν-καλλιέργειας. Αν και αυτό το μοντέλο δεν δείχνει απευθείας κατεργασία του σμήνους των καρκινικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της ακτινοθεραπείας, πιστεύουμε ότι τα σήματα που προάγουν την ανάπτυξη που απελευθερώνεται από θανατηφόρα αγωγή τροφοδοτικά κύτταρα αναπαράγουν τις συνθήκες σε ένα ομοιογενώς θεραπεία όγκου. Ως εκ τούτου, θα χρησιμοποιήσουμε την έννοια εμπλουτισμού πληθυσμών και πεθαίνουν κυττάρων που διεγείρεται ζουν την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου ως συνώνυμα σε όλη την μελέτη μας.

Παρά τις γνώσεις μας ότι πεθαίνουν τροφοδοτικά κύτταρα μπορεί να αυξήσει την ανάπτυξη των ζωντανών κυττάρων όγκου, ο μηχανισμός με τον οποίο συμβαίνει αυτό παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Η οδός σηματοδότησης Ηχητικού ακανθόχοιρου (SHH), εντοπίστηκε για πρώτη φορά στη Drosophila melanogaster, εμπλέκεται στην φυσιολογική ανάπτυξη των οργάνων και ομοιόστασης, τα βλαστικά συντήρηση κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό στα σπονδυλωτά και μπορεί επομένως να είναι υποψήφιο για το μηχανισμό πίσω επιζών ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων [3]. Επιπλέον, πολλοί καρκίνοι που σχετίζονται με σηματοδότηση SHH, όπως καρκίνωμα βασικών κυττάρων, του οισοφάγου και του στομάχου, καρκίνος του πνεύμονα μικρού κυττάρου [4] και του παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα [5]. SHH ενεργοποίηση μονοπατιού εκκινείται με δέσμευση της εκκρινόμενης και λιπίδια τροποποιημένος συνδέτης Shh να Patched1 (Ptch1) διαμεμβρανικού υποδοχέα. Κατά συνέπεια, η αναστολή της Ptch1 smoothened (SMO), ένα 7-pass διαμεμβρανική πρωτεΐνη, ανακουφίζεται και το καταρράκτη σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ εκκινεί, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί τους παράγοντες μεταγραφής Gli [6]. Υπάρχουν τρεις Gli πρωτεΐνες που κωδικοποιούν τόσο ενεργοποιητή και τη λειτουργία καταστολέα. Gli1 δρα ως μεταγραφικός ενεργοποιητής, Gli2 είναι ένα σύνθετο των θετικών και αρνητικών ρυθμιστικά πεδία, και Gli3 δρα κυρίως ως μεταγραφικός καταστολέας [7]. Με την παρουσία της Shh, Gli1 ενεργοποιείται μεταγραφικά και η φωσφορυλιωμένη και πρωτεολυτική επεξεργασία του Gli2 και Gli3 να ακρωτηριασμένες μορφές καταστολέα τους αναστέλλεται, οδηγώντας έτσι στην ενεργοποίηση ειδικών σηματοδότησης SHH γονίδια στόχους οδό, όπως Gli1 και Ptch1 [8].

Δεδομένου ότι οι μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω του όγκου επιταχύνεται την αύξηση του πληθυσμού κατά τη διάρκεια της ακτινοθεραπείας δεν είναι καλά κατανοητοί, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει ένα ρόλο για την καθιερωμένη οδό ΕΛΕΡΠΕ στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μετά από διαδικασία ακτινοθεραπεία. Είναι καλά γνωστό ότι η ακτινοθεραπεία προκαλεί απόπτωση η οποία μπορεί να παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο στην ανασύσταση του πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων [9]. Σε προηγούμενες μελέτες μας, έχουμε δείξει ότι πεθαίνουν κύτταρα όγκου χρησιμοποιούν την αποπτωτική διαδικασία για την παραγωγή της κασπάσης 3 μεσολάβηση σήματα ανάπτυξης-διέγερσης να διεγείρει την ανανέωση του πληθυσμού των όγκων που υποβάλλονται σε ακτινοθεραπεία [10]. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης «Phoenix Rising» μονοπάτι μέσω του οποίου κασπασών δήμιος, όπως κασπάσης 3 και 7, σε αποπτωτικά κύτταρα προάγουν την επούλωση των τραυμάτων και την αναγέννηση ιστών σε πολυκύτταρους οργανισμούς [11]. Στον καρκίνο του οισοφάγου, η οδός σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ εκτενώς δραστηριοποιείται στην ξενομοσχεύματα και υπολειπόμενη όγκων μετά την χημειοραδιοθεραπεία και σηματοδότηση αποκλεισμού ΕΛΕΡΠΕ ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα της ακτινοβολίας [12]. Ως εκ τούτου, η οδός «Phoenix Rising» με κασπάση-διαμεσολαβούμενη διέγερση της ανάπτυξης του όγκου και της οδού σηματοδότησης SHH μπορούν και τα δύο να συμμετέχουν σε κύτταρο όγκου ανασύσταση του πληθυσμού μετά την ακτινοθεραπεία.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τους ρόλους του μονοπατιού σηματοδότησης shh στο πεθαίνουν κύτταρο διεγείρεται ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου. Τα δεδομένα μας δείχνουν σαφείς ενδείξεις για ένα ρόλο για την Shh που εκκρίνεται από τα κύτταρα που πεθαίνουν στην προώθηση της ταχείας του σμήνους των όγκων από ένα μικρό αριθμό των ζωντανών κυττάρων του όγκου. Πιστεύουμε ότι αυτό που ανακαλύφθηκαν πρόσφατα μονοπάτι της Shh τόνωσε την αύξηση του πληθυσμού του όγκου παίζει καθοριστικό ρόλο στην ακτινοθεραπεία του καρκίνου. Επιπλέον, με στόχο την οδό ΕΛΕΡΠΕ μπορεί να έχει κλινικές επιπτώσεις για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων του καρκίνου ακτινοθεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυττάρων Προϋποθέσεις Πολιτισμού

Ανθρώπινο παγκρεατικά κύτταρα καρκίνου PANC1 και την ανθρώπινη παχέος εντέρου τα καρκινικά κύτταρα ΗΤ29, αγοράστηκαν από την κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα) και καλλιεργήθηκαν σε Τροποποιημένο Μέσο του Dulbecco Eagles (ϋΜΕΜ) (Θέρμο, Πεκίνο, Κίνα) με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Sijiqing, Hangzhou, Κίνα), 100 U ml

-1 πενικιλίνη, και 100 μg ml

-1 στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2.

όγκου Ανασύσταση Μοντέλο

In vitro

, κύτταρα ΗΤ29 ή κύτταρα PANC1 καλλιεργούνται σε 10 cm τρυβλίου Petri είχαν ακτινοβοληθεί με ακτίνες Χ είκοσι τέσσερις ώρες αργότερα, αυτοί θρυψινοποιήθηκαν και σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων (Corning, NewYork, USA) σε μια πυκνότητα 2,5 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο εις τριπλούν σε ϋΜΕΜ που περιείχε 2% FBS. Είκοσι-τέσσερις ώρες αργότερα, διακύμανση των επισημασμένο, μη επεξεργασμένα ή κύτταρα ΗΤ29 PANC1 σπάρθηκαν σε πυκνότητα κυττάρων 1.000 κύτταρα ανά φρεάτιο. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 2 ημέρες για 14 ημέρες.

Η ακτινοβόληση των καρκινικών κυττάρων

ακτινοβόληση με ακτίνες Χ κυττάρων διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα γραμμικό επιταχυντή Oncor (Siemens, Amberg, Γερμανία), που βρίσκεται στο τμήμα ογκολογίας ακτινοβολίας στο Shanghai Jiaotong Πανεπιστήμιο συνδεδεμένες Νοσοκομείο Πρώτη Λαϊκής. Ο ρυθμός δόσης για το μηχάνημα είναι περίπου 3,6 Gy /min.

μεταγωγή γονιδίου στα κύτταρα

Είμαστε σε μεταγωγή διαφόρων εξωγενών γονιδίων σε κύτταρα-στόχους με τη χρήση φακοϊό φορέων. Το συνηθέστερα χρησιμοποιούμενο φορέα λεντοϊού είναι το σύστημα pLEX (Thermo Scientific Inc, Πεκίνο, Κίνα), η οποία περιείχε ένα γονίδιο ανθεκτικότητας σε πουρομυκίνη. Τα γονίδια που κλωνοποιήθηκαν σε αυτόν τον φορέα περιλαμβάνουν τα ακόλουθα: πυγολαμπίδα luciferase2 και γονίδιο πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης σύντηξης (διακύμανση των) οδηγείται από CMV προαγωγό, γονίδιο λουσιφεράσης καθοδηγείται από 8 × άγριου τύπου θέση σύνδεσης Gli1 ή 8 × μεταλλαγμένη θέση πρόσδεσης Gli1 (δηλαδή άγριου πληκτρολογήστε 8 × γονίδιο GBS λουσιφεράσης ή μεταλλαγμένο γονίδιο της λουσιφεράσης 8 × GBS), καθώς και shRNA έναντι Gli1. Όλες οι φορείς λεντοϊών συσκευάστηκαν σε κύτταρα 293Τ ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα σταθερώς μετάγονται ΗΤ29 ή PANC1 ελήφθησαν με φακοϊό μόλυνση και επιλογή πουρομυκίνης παρουσία 2 μg /ml πουρομυκίνη για δύο εβδομάδες.

Λουσιφεράσης Δοκιμασία

λουσιφεράσης σύστημα προσδιορισμού E1500 (Promega , Wisconsin, USA) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό λουσιφεράσης πυγολαμπίδας δραστηριότητες σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. κύτταρα ΗΤ29 και PANC1 εκφράζουν άγριου τύπου 8 × γονίδιο της λουσιφεράσης GBS ή το μεταλλαγμένο γονίδιο της λουσιφεράσης 8 × GBS ακτινοβολούνται με 6 Gy ιονίζουσας ακτινοβολίας. Οι λουσιφεράσης δραστηριότητες για την 6 Gy ακτινοβολημένων κυττάρων και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα ελέγχθηκαν. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με ένα φωτόμετρο Berthold (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany), και λουσιφεράση πυγολαμπίδας αξίες των κυττάρων που εκφράζουν το γονίδιο της λουσιφεράσης άγριου τύπου ομαλοποιήθηκαν με λουσιφεράση πυγολαμπίδας τιμές των κυττάρων που εκφράζουν μεταλλαγμένο γονίδιο λουσιφεράσης. Εξομάλυνση ελαχιστοποιεί πειραματική μεταβλητότητα. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και στη συνέχεια επαναλαμβάνεται τρεις φορές.

Η βιοφωταύγεια Imaging

Για την εικόνα των σημάτων λουσιφεράσης που εκπέμπονται από τα κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε το μέσο NC100 από Berthold Technologies (Bad Wildbad, Γερμανία) που βρίσκεται στη Σχολή Βασικών Ιατρικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Fudan. Για PANC1 και κύτταρα ΗΤ29, μετρήσαμε τα σήματα λουσιφεράσης με προσθήκη D-λουσιφερίνη (Promega, Wisconsin, USA) σε PBS σε μια τελική συγκέντρωση των 0.15 mg /ml. Πέντε λεπτά μετά τη χορήγηση του D-λουσιφερίνης, ελήφθησαν οι εικόνες και τα σήματα λουσιφεράσης (φωτόνια /sec) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και αναλύθηκαν ποσοτικά με τη χρήση του κατασκευαστή παρεχόμενο λογισμικό. Οι εικόνες λαμβάνονται πάντα στο ίδιο χρονικό σημείο για να ελαχιστοποιηθεί η μεταβλητότητα. Τα λουσιφεράσης σήματα μετρήθηκαν σε PANC1 και ΗΤ29 κύτταρα σε 14 ημέρες χρονικό σημείο για να μεγιστοποιηθεί η παρατηρούμενη διαφορά μεταξύ των χωρίς τροφοδότη και ελέγχους χωρίς αγωγή από το ακτινοβολημένο τροφοδότη πειραματική ομάδα.

Αντισώματα και Key Chemicals χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη

τα εμπορικά διαθέσιμα αντισώματα έναντι Shh, Gli1, β-ακτίνη, GAPDH (Cell Signaling Technology, Boston, USA) και δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Bio-Rad, California, USA) αγοράστηκαν. SHH σηματοδότησης ανταγωνιστής κυκλοπαμίνη και Gant61 αμφότερα αποκτήθηκαν από την Sigma-Aldrich (Missouri, USA). GDC-0449 αγοράστηκε από Σέλεκ Χημικών Προϊόντων (Τέξας, Η.Π.Α.). SHH αγωνιστή σηματοδότηση SAG ελήφθη από τον Enzo Βιοεπιστημών (NewYork, USA) και ανασυνδυασμένου ποντικού sonic hedgehog Ν-άκρο ελήφθη από R &? D Systems (Minnesota, USA)

αγωνιστή και ανταγωνιστή Θεραπεία

αγωνιστές ή ανταγωνιστές προστέθηκαν όταν ακτινοβολούνται ΗΤ29 ή κύτταρα PANC1 σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων ως τροφοδότες. Οι ακόλουθες συγκεντρώσεις χρησιμοποιήθηκαν: κυκλοπαμίνης για κύτταρα ΗΤ29 (2 μΜ και 5 μΜ), κυκλοπαμίνης για κύτταρα PANC1 (0,5 μΜ, 1 μΜ, 2 μΜ και 5 μΜ), GDC-0449 για τα κύτταρα ΗΤ29 (0,2 μΜ, 0,5 μΜ, 1 μΜ και 2 μΜ), GDC-0449 για κύτταρα PANC1 (0,5 μΜ, 1 μΜ και 2 μΜ), Gant61 για ΗΤ29 κύτταρα (1 μΜ, 2 μΜ και 5 μΜ), Gant61 για κύτταρα PANC1 (2 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ και 20 μΜ), ανασυνδυασμένου ποντικού sonic hedgehog Ν-άκρο για ΗΤ29 και PANC1 κυττάρων (600 ng /ml), SAG για κύτταρα ΗΤ29 (5 ηΜ, 10 ηΜ και 100 ηΜ), SAG για κύτταρα PANC1 (3 ηΜ, 5 ηΜ , 10 ηΜ και 100 ηΜ). Για να επιβεβαιωθεί η επίδραση των αγωνιστών σε ζωντανά κύτταρα όγκου, αγωνιστές προστέθηκαν επίσης σε φρεάτια που περιέχουν ΗΤ29 ή κύτταρα ανταποκριτή PANC1 μόνο. Οι συγκεντρώσεις χρησιμοποιήθηκαν ως: SAG για PANC1 και τα κύτταρα ΗΤ29 (5 ηΜ, 10 ηΜ και 100 ηΜ), ανασυνδυασμένου ποντικού sonic hedgehog Ν-τελικό άκρο του πεπτιδίου για τα κύτταρα ΗΤ29 και PANC1 (600 ng /ml). Το μέσο αλλάχθηκε κάθε σαράντα-οκτώ ώρες και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιείχε ίδια συγκέντρωση αγωνιστές ή ανταγωνιστές. Η ανάπτυξη των κυττάρων ρεπόρτερ παρακολουθήθηκε 14 ημέρες αργότερα από την απεικόνιση.

shRNA Νοκ ντάουν

Οι λεντοϊού πλασμίδια που κωδικοποιούν shRNA έναντι Gli1 γονίδιο (HSH007701-HIVmU6) και τον έλεγχο αγωνίζομαι (CSHCTR001-HIVmU6) αγοράστηκαν από Genecopoeia (Maryland, USA). Η αλληλουχία για shRNA έναντι Gli1 είναι 5′-acgccatgttcaactcgat-3 ‘. Φακοϊούς κωδικοποιεί Gli1 shRNA και ελέγχου αγωνίζομαι παρήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω. ΗΤ29 και PANC1 κύτταρα σπάρθηκαν σε έξι φρεατίων και στη συνέχεια μολύνθηκαν. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με πουρομυκίνη για την επιλογή για εκείνους που εκφράζουν σταθερά shRNA έναντι Gli1 και RNA ελέγχου σκαρφάλωμα. Σίγαση αποδοτικότητα επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας Western blot για Gli1 πρωτεΐνη.

Western Blotting

Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και λύθηκαν χρησιμοποιώντας 120-200 μΙ προτύπου ρυθμιστικού διαλύματος RIPA που περιείχε αναστολείς πρωτεΐνης (Beyotime, Jiangsu, Κίνα ). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του κάθε δείγματος ποσοτικοποιήθηκε και 40-60 μg πρωτεΐνης ανά δείγμα χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση στυπώματος Western. Σε γενικές γραμμές, 40-60 μg πρωτεΐνης σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης θερμάνθηκε στους 100 ° C για 10 λεπτά και στη συνέχεια διαχωρίζεται σε ένα SDS-πολυακρυλαμιδίου με ηλεκτροφόρηση, και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (Bio-Rad, California, USA). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C και στη συνέχεια με δευτερογενή αντισώματα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. ECL Plus (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση των σημάτων στην μεμβράνη.

Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) δοκιμασία για την αξιολόγηση των στατιστικών σημασίας, αντίστοιχα, με τις τιμές των

P & lt?

0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

Αποτελέσματα

Αριθμοί Reporter κυττάρων ήταν Γραμμικά συνδυάζονται με λουσιφεράση Δραστηριότητα Όταν Imaging

Για για να επιβεβαιωθεί η συσχέτιση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης σε εικόνες με τους αριθμούς των κυττάρων ρεπόρτερ, κάναμε μια σειρά αραίωσης για διακύμανση των σημασμένα κύτταρα όγκου (που ονομάζεται «κύτταρα ρεπόρτερ»). 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500 και 10000 κύτταρα όγκου Panc1Fluc ή HT29Fluc ήταν σπόρων σε πλάκες 96 φρεατίων σε 6 αναπαράγει την ημέρα πριν από την απεικόνιση. Η απεικόνιση έγινε 5 λεπτά μετά την προσθήκη D-λουσιφερίνης χρησιμοποιώντας το όργανο NC100. Τα φωτόνια από κάθε φρέαρ συνελέγησαν και στη συνέχεια αναλύθηκαν με αμφίπλευρη ANOVA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα φωτόνια /sec ήταν γραμμικά σχετίζεται με αριθμούς κυττάρων σπάρθηκε σε φρεάτια (Εικ. 1Α, 1Β, R

2 = 0,9967 σε κύτταρα Panc1Fluc και R

2 = 0,9973 σε κύτταρα HT29Fluc αντίστοιχα).

Α. ανάλυση συσχέτισης φωτονίων μετριέται με βιοφωταύγεια απεικόνισης

vs αριθμούς

κυττάρων επιχρυσωμένο. Διακύμανση των σημασμένων κυττάρων PANC1 απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 6 επαναλήψεις κατά τον αριθμό έδειξε την ημέρα πριν από την Imaging. Η μέση φωτόνια /sec από 6 επαναλήψεις κατά κάθε αριθμούς κυττάρων αναλύθηκαν με δύο ουρών ANOVA (R

2 = 0,9967). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ένταση του σήματος εικόνας συσχετίζεται θετικά με αριθμούς κυττάρων απλώνονται. Λευκή γραμμή κλίμακας αντιπροσωπεύει το 1 cm σε μήκος. Β ανάλυση συσχέτισης φωτονίων μετριέται με βιοφωταύγεια απεικόνισης

vs αριθμούς

κυττάρων σε κύτταρα ΗΤ29. Η ανάλυση διαδικασία και το αποτέλεσμα ήταν η ίδια όπως κύτταρα PANC1 αναφέρθηκε παραπάνω (R

2 = 0,9973). μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει το 1 cm. Γ Ανάλυση ένταση του σήματος των κυττάρων Panc1Fluc αναπτύσσονται σε ακτινοβολημένα κύτταρα PANC1. 2,5 × 10

5 ακτίνων Χ ακτινοβολημένα κύτταρα PANC1 απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων ως τροφοδότη. Οι δόσεις ήταν 0 Gy, 2 Gy, 6 Gy, 10 Gy, 14 Gy και 20 Gy αντίστοιχα. 1000 κύτταρα Panc1Fluc απλώθηκαν σε κάθε φρεάτιο με ή χωρίς τροφοδοτικά κύτταρα ως ρεπόρτερ. 14 ημέρες αργότερα πλάκα απεικονίζεται για την ένταση βιοφωταύγεια. Top: λουσιφεράσης ανάλυση δραστηριότητα? Κάτω: εκπρόσωπος βιοφωταύγεια εικόνα, γραμμή κλίμακας αντιπροσωπεύει το 1 cm. Δ Ανάλυση της έντασης του σήματος των κυττάρων HT29Fluc αναπτύσσονται σε ακτινοβολημένα κύτταρα ΗΤ29. Η ανάλυση διαδικασία και το αποτέλεσμα ήταν η ίδια όπως κύτταρα PANC1 αναφέρθηκε παραπάνω. Top: λουσιφεράσης δραστηριότητα? Κάτω:. Αντιπροσωπευτική βιοφωταύγεια εικόνα, γραμμή κλίμακας αντιπροσωπεύει 1 εκατοστό

Η

ακτινοβολημένα Πεθαίνοντας όγκου κυττάρων που διεγείρεται ζωντανό όγκο ανάπτυξη κυττάρων

Πραγματοποιήσαμε μία σειρά πειραμάτων για να εξετάσει τα αποτελέσματα του θανάτου, ακτινοβολημένα κύτταρα όγκου σε διάφορες δόσεις σε ζωντανά κύτταρα του όγκου. Για την προσομοίωση

in vivo

σενάρια όπου η συντριπτική πλειοψηφία των καρκινικών κυττάρων θανατώνονται με ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία, έχουμε σπάρθηκε ένα μικρό αριθμό (10

3) του διακύμανση των επισημασμένου ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος PANC1 ή ανθρώπινο κολονικό καρκίνος ΗΤ29 κυττάρων σε ένα κρεβάτι από έναν πολύ μεγαλύτερο αριθμό (2.5 × 10

5) μη επισημασμένου καρκίνο ομόλογων κυττάρων. Οι τελευταίες καρκινικά κύτταρα ονομάζονται «τροφοδοτικά κύτταρα» είχαν ακτινοβοληθεί στα 2 Gy, 6 Gy, 10 Gy, 14 Gy και 20 Gy, ή χωρίς αγωγή (0 Gy) αντίστοιχα. Η ανάπτυξη του μικρού αριθμού των έμβιων «κύτταρα ρεπόρτερ» παρακολουθήθηκε με επι-μικροσκοπία φθορισμού σε διαστήματα 3 ημερών και με βιοφωταύγεια απεικόνισης επί day14 (Σχ. 1C, 1D). Λουσιφεράσης δραστηριότητες χρησιμοποιήθηκαν ως υποκατάστατα για τον αριθμό των «κυττάρων ρεπόρτερ» που επιβεβαιώθηκε με το πείραμα γραμμική συσχέτιση μας (Εικ. 1Α, 1Β). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα κύτταρα αναφοράς αυξήθηκε σημαντικά γρηγορότερα όταν εμβολιάζονται σε κύτταρα πεθαίνουν από όταν σπέρνονται μόνο. Επιπλέον, τροφοδοτικά κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με 6 Gy έδειξε την υψηλότερη ικανότητα ενίσχυσης από άλλες δόσεις έκανε, με μη-ακτινοβολημένα τροφοδοτικά κύτταρα που δεν δείχνει υποστηρικτικό ρόλο ανάπτυξη. Σε κύτταρα όγκου ακτινοβολούνται με δόσεις υψηλότερες από 6 Gy, ικανότητα διέγερσης ανάπτυξης μειώθηκε με την αύξηση της δόσης ακτινοβολίας (Σχ. 1C, 1D). Αυτές οι παρατηρήσεις ήταν αλήθεια και για τις δύο ΗΤ29 κύτταρα και κύτταρα PANC1.

Ενεργοποίηση της ΕΛΕΡΠΕ μονοπάτι σηματοδότησης συσχετίζεται θετικά με Πεθαίνοντας κυττάρων που διεγείρεται Living ανάπτυξη όγκων κυττάρων

Για να εξεταστεί κατά πόσον η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ συνδέθηκε με διέγερση της αύξησης των κυττάρων όγκου από τα θνήσκοντα κύτταρα, πραγματοποιήσαμε πειράματα κηλίδος Western με δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές, PANC1 (Εικ. 2Α) και ΗΤ29 (Εικ. 2Β). Ενεργοποιημένος σηματοδότηση SHH επιβεβαιώθηκε από τα επίπεδα πρωτεΐνης της Shh και Gli1 οποίες προσδιορίστηκαν ποσοτικά με μέτρηση του σήματος της 19-kD και 160 kD-συγκροτήματα, αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα των πρωτεϊνών Shh και Gli1 ήταν υψηλότερες σε 6 Gy ακτινοβολημένα καρκινικά κύτταρα από ό, τι άλλες δόσεις καρκινικά κύτταρα (Σχ. 2C, 2D) αντιμετωπίζεται. Επιπλέον, σε κύτταρα όγκου ακτινοβολούνται με δόσεις υψηλότερες από 6 Gy, Shh και Gli1 επίπεδα πρωτεΐνης μειώθηκαν με την αύξηση της δόσης ακτινοβολίας. Είναι ενδιαφέρον ότι οι τάσεις στο επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης του μονοπατιού σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ παρουσίασαν την ίδια τάση με αποτέλεσμα την τόνωση της ανάπτυξης μετά την ακτινοβολία, δύο από τα οποία ήταν υψηλότερα για 6 Gy και βαθμιαία με την αύξηση της δόσης ακτινοβολίας.

. αλλαγές Έκφραση προφίλ των πρωτεϊνών Shh και Gli1 σε κύτταρα PANC1 ακτινοβολούνται σε διάφορες δόσεις και ανιχνεύθηκαν με στύπωση Western. Β αλλαγές Έκφραση προφίλ των πρωτεϊνών Shh και Gli1 σε κύτταρα ΗΤ29 ακτινοβολούνται σε διάφορες δόσεις και ανιχνεύθηκαν με στύπωση Western. C. Σχετική ένταση της Shh και Gli1 ζώνες πρωτεΐνης σε κηλίδα Western σε κύτταρα PANC1 ακτινοβολούνται σε διάφορες δόσεις. D. Η σχετική ένταση της Shh και Gli1 ζώνες πρωτεΐνης σε κηλίδα Western σε κύτταρα ΗΤ29 ακτινοβολούνται σε διάφορες δόσεις. δραστηριότητα Ε λουσιφεράσης της Gli1 ρεπόρτερ σε ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα PANC1. ** Αντιπροσωπεύει

P

& lt? 0,01. δραστηριότητα ΣΤ λουσιφεράσης της Gli1 ρεπόρτερ σε ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα ΗΤ29. ** Αντιπροσωπεύει

P

& lt?. 0.01

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ στα κύτταρα τροφοδότη, PANC1 και του καρκίνου ΗΤ29 κύτταρα μετήχθησαν με φακοϊό μεταφέρουν ένα άγριας πληκτρολογήστε 8 × GBS αναφοράς της λουσιφεράσης ή ένα μεταλλαγμένο 8 × GBS αναφοράς της λουσιφεράσης που φιλοξενεί μία σημειακή μετάλλαξη που καταργεί τη σύνδεση του Gli1. Τα κύτταρα που έχουν μολυνθεί από τον φακοϊό επιλέχθηκαν με 2 μg /ml πουρομυκίνη. Τα σταθερά μεταχθέντα PANC1 και ΗΤ29 κύτταρα ήταν χωρίς θεραπεία ή ακτινοβολήθηκαν σε δόση των 6 Gy, και στη συνέχεια μετρήθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης σε 6 Gy ακτινοβολημένα καρκινικά κύτταρα ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε μη ακτινοβολημένα καρκινικά κύτταρα (

P & lt?

0.01), υποδεικνύοντας ότι Gli1 δραστηριότητα μεταγραφικού παράγοντα αυξήθηκε σε 6 Gy ακτινοβολημένα καρκίνο κύτταρα. Τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν και στα δύο κύτταρα PANC1 (Εικ. 2Ε) και κύτταρα ΗΤ29 (Σχ. 2F) ήταν παρόμοιες και συνεπή με τα αποτελέσματα από την απεικόνιση bioluminence φαίνεται παραπάνω.

SHH Σηματοδοσίας ανταγωνιστές αναστέλλουν Πεθαίνοντας Tumor κυττάρων που διεγείρεται Living Tumor Growth κυττάρων

Δεδομένου σημαντικά επάνω ρυθμισμένη δραστηριότητα μονοπάτι SHH σε ακτινοβολημένα κύτταρα, εξετάσαμε κατά πόσο το χειρισμό του μονοπατιού SHH θα αναστέλλει ή να προωθήσει πεθαίνουν κυττάρου όγκου διεγείρεται ζουν την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου. Περίπου 2,5 × 10

5 6 Gy ακτινοβολημένων κυττάρων PANC1 σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε μέσο που περιέχει ανταγωνιστή Smo (GDC-0449) στα 0,5 μΜ, 1 μΜ, 2 μΜ ή ελέγχου του οχήματος, αντίστοιχα. 1000 διακύμανση των επισημασμένα ζώντα κύτταρα PANC1 σπάρθηκαν πάνω στο ακτινοβολημένα με ή χωρίς τροφοδοτικό στρώμα αγωγή φαρμάκου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3A GDC-0449 μειώνεται PANC1 ανάπτυξη κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε σύγκριση με ελέγχους που περιείχαν όχημα, το σήμα σε φρεάτια τα οποία περιείχαν 1 μΜ GDC-0449 ή 2 μΜ GDC-0449 ήταν σημαντικά μειωμένη (

P

& lt? 0,05). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η GDC-0449 θα μπορούσε να αναστείλει το θάνατο των καρκινικών κυττάρων διεγείρεται ζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

Α. GDC0449, ένας αναστολέας προκλινικές ΕΛΕΡΠΕ οδού, αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων που προκαλείται από Panc1Fluc πεθαίνουν PANC1 κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επάνω: Ανάλυση ένταση του σήματος από βιοφωταύγεια εικόνα? Κάτω: αντιπροσωπευτικό εικόνες βιοφωτισμός? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm. * Αντιπροσωπεύει

P

& lt? 0,05. B. Gant61 αναστέλλει Panc1Fluc ανάπτυξη κυττάρων που επάγεται από τα θνήσκοντα κύτταρα PANC1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επάνω: Ανάλυση ένταση του σήματος από βιοφωταύγεια εικόνα? Κάτω: αντιπροσωπευτικό εικόνες βιοφωτισμός? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm. ** Αντιπροσωπεύει

P

& lt? 0,01. Γ Cyclopamin αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων που προκαλείται από HT29Fluc θνήσκοντα κύτταρα ΗΤ29 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επάνω: Ανάλυση ένταση του σήματος από βιοφωταύγεια εικόνα? Κάτω: αντιπροσωπευτικό εικόνες βιοφωτισμός? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm. * Αντιπροσωπεύει

P

& lt? 0,05, ** αντιπροσωπεύει

P

& lt? 0,01. Δ Gant61 αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων που προκαλείται από HT29Fluc θνήσκοντα κύτταρα ΗΤ29 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επάνω: Ανάλυση ένταση του σήματος από βιοφωταύγεια εικόνα? Κάτω: αντιπροσωπευτικό εικόνες βιοφωτισμός? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm. ** Αντιπροσωπεύει

P

& lt? 0,01. Ε GDC0449 αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων ΗΤ29 διακύμανση των επάγεται από θνήσκοντα κύτταρα ΗΤ29 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επάνω: Ανάλυση ένταση του σήματος από βιοφωταύγεια εικόνα? Κάτω: αντιπροσωπευτικό εικόνες βιοφωτισμός? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm.

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τους ρόλους της σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ για το θάνατο των καρκινικών κυττάρων διεγείρεται ζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, δοκιμάσαμε ένα άλλο ανταγωνιστή Gli1 (Gant61). Η προϋπόθεση ήταν πανομοιότυπη με την προαναφερθείσα προϋπόθεση για GDC-0449 εκτός από το ότι η συγκέντρωση Gant61 ήταν είτε 5 μΜ, 10 μΜ ή 20 μΜ. Παρατηρήσαμε μια παρόμοια μείωση του ρυθμού αύξησης Gant61 αντιμετωπίζονται πηγάδια σε σύγκριση με τα φρεάτια ελέγχου θεραπεία με όχημα (

P

& lt? 0.01, Σχήμα 3Β.). Εντούτοις, κύτταρα PANC1 κατεργάζεται με έναν άλλο ανταγωνιστή Smo (κυκλοπαμίνη) δεν έδειξε μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Παρόμοια πειράματα διεξήχθησαν σε κύτταρα ΗΤ29. Περίπου 2,5 × 10

5 6 Gy ακτινοβολημένα ΗΤ29 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε μέσο με ή χωρίς κυκλοπαμίνη σε 2 μΜ, 5 μΜ ή όχημα ελέγχου αντίστοιχα, πάνω στο οποίο 1.000 διακύμανση των επισημασμένα ζώντα κύτταρα ΗΤ29 σπάρθηκαν. Σε σύγκριση με ομάδα που υπέστη αγωγή ελέγχου του οχήματος, κυκλοπαμίνη μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων ΗΤ29 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 3C). Τα κύτταρα ΗΤ29 καλλιεργούνται σε έλεγχο του οχήματος έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη δραστηριότητα λουσιφεράσης από εκείνα τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε 2 μΜ κυκλοπαμίνη (

P & lt?

0.05) και 5 μΜ κυκλοπαμίνη (

P

& lt? 0.01).

Θα δοκιμαστεί περαιτέρω την Gli1 ανταγωνιστή Gant61 (Εικ. 3D) και του ανταγωνιστή του ΠΕΑ GDC-0449 (Σχ. 3Ε). Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, παρατηρήθηκαν παρόμοια αποτελέσματα. Η Gli1 ανταγωνιστής Gant61 ανέστειλε ΗΤ29 ανάπτυξης στην πεθαίνουν σημαντικά κύτταρα τροφοδότη. Ωστόσο, η διαφορά μεταξύ της ομάδας ελέγχου του οχήματος και των GDC-0449 αγωγή ομάδων δεν ήταν σημαντική (

P

& gt? 0,05).

Gli1 νοκ ντάουν από shRNA Μειώνει Πεθαίνοντας όγκου κυττάρων που διεγείρεται ζωντανό όγκο κυττάρων ανάπτυξη

Εμείς επιβεβαίωσε περαιτέρω τον ρόλο της ΕΛΕΡΠΕ σηματοδότησης σε πεθαίνει των καρκινικών κυττάρων διεγείρεται ζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με τη χρήση shRNA σε νοκ ντάουν έκφραση Gli1 στα κύτταρα τροφοδότη. ΗΤ29 και PANC1 κύτταρα μολυσμένα με φακοϊό μεταφέρουν Gli1 shRNA επιλέχθηκαν σε μέσο με 2 μg /ml πουρομυκίνη, και ανάλυση στυπώματος Western για έκφραση Gli1 χρησιμοποιήθηκε για να επαληθεύσει την ορθή επιλογή. Τα επίπεδα πρωτεΐνης Gli1 τόσο PANC1 και τα κύτταρα ΗΤ29 (Εικ. 4Α, 4Β) έχουν αισθητά μειωμένη. PANC1 ή ΗΤ29 κύτταρα που μετατρέπονται από Gli1 shRNA ή αγωνίζομαι shRNA ακτινοβολούνται με 6 Gy και χρησιμοποιούνται ως τροφοδοτικά κύτταρα, αντίστοιχα. Η ανάπτυξη των διακύμανση των επισημαίνονται ζουν PANC1 ή ΗΤ29 κύτταρα εμβολιάζονται πάνω Gli1 κύτταρα νοκ ντάουν τροφοδότη ήταν σημαντικά εξασθενημένο όπως αποδεικνύεται από τα σημαντικά χαμηλότερο δραστηριοτήτων λουσιφεράσης σε φρεάτια με Gli1 νοκ ντάουν PANC1 ή ΗΤ29 κύτταρα από τα φρεάτια με αγωνίζομαι shRNA μετάγονται PANC1 ή ΗΤ29 κύτταρα (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 4Α, 4Β)

Ένα… Η μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης Gli1 σε Gli1 shRNA μεταδιηγερμένα PANC1 κυττάρων ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western (άνω πάνελ). Η μειωμένη ανάπτυξη Panc1Fluc κελί πεθαίνουν Gli1 shRNA κύτταρα που μετατρέπονται PANC1. * Αντιπροσωπεύει

P

& lt? 0,05? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm. B. Η μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης Gli1 σε Gli1 shRNA μεταδιηγερμένα κύτταρα ΗΤ29 ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western (άνω πάνελ). Η μειωμένη ανάπτυξη HT29Fluc κελί πεθαίνουν Gli1 shRNA κύτταρα που μετατρέπονται ΗΤ29. κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm.

Η

ΕΛΕΡΠΕ Σηματοδοσίας Αγωνιστές Ενεργοποίηση όγκου Ανάπτυξης Κυττάρων

επόμενο ρώτησε αν ο αγωνιστής της πορείας σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ, SAG, η οποία δρα άμεσα δεσμευτική για τους μεταγενέστερους λειαίνονται, θα την προώθηση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων. PANC1 και ΗΤ29 κύτταρα ακτινοβολήθηκαν στις 6 Gy και σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων ως τροφοδότες σε μέσο με ή χωρίς 3 ηΜ, 5 ηΜ, 10 ηΜ ή 100 ηΜ SAG αντίστοιχα. θεραπεία SAG οδήγησε σε αυξημένη κυτταρική ανάπτυξη ρεπόρτερ με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 5Α, 5Β). Για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με SAG, προσθέσαμε μια ενεργή μορφή της Shh, δηλ ανασυνδυασμένη Ν-τερματικά θραύσματα της Shh στα 600 ng /ml στο μέσο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ανασυνδυασμένη Ν-τερματικό θραύσμα της Shh ενίσχυσε σημαντικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων επί πεθαίνουν τροφοδοτικά κύτταρα σε σύγκριση με τον έλεγχο οχήματος (

P

& lt? 0,01). (Εικ. 5C, 5D)

Ένα. Η ενεργοποίηση του SHH σηματοδότησης με αγωνιστή σηματοδότηση SHH SAG ενισχύει την ανάπτυξη των κυττάρων Panc1Fluc επί ακτινοβολημένα κύτταρα που πεθαίνουν PANC1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επάνω: Ανάλυση ένταση του σήματος από βιοφωταύγεια εικόνα? Κάτω: αντιπροσωπευτικό εικόνες βιοφωτισμός? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm. * Αντιπροσωπεύει

P

& lt? 0,05, ** αντιπροσωπεύει

P & lt?

0.01. B. Η ενεργοποίηση του SHH σηματοδότησης με SAG ενισχύει την κυτταρική ανάπτυξη HT29Fluc επί ακτινοβολημένα κύτταρα που πεθαίνουν ΗΤ29 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επάνω: Ανάλυση ένταση του σήματος από βιοφωταύγεια εικόνα? Κάτω: αντιπροσωπευτικό εικόνες βιοφωτισμός? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm. ** Αντιπροσωπεύει

P & lt?

0.01. C. Η ενεργοποίηση της SHH σηματοδότησης με αγωνιστές σηματοδότησης SHH, Ν-τερματικό θραύσμα της Shh, ενισχύει την ανάπτυξη των κυττάρων Panc1Fluc επί ακτινοβολημένα κύτταρα πεθαίνουν PANC1. Επάνω: Ανάλυση ένταση του σήματος από βιοφωταύγεια εικόνα? Κάτω: αντιπροσωπευτικό εικόνες βιοφωτισμός? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm. * Αντιπροσωπεύει

P

& lt? 0,05. D. Η ενεργοποίηση του SHH σηματοδότησης με Ν-τερματικό θραύσμα της Shh ενισχύει την κυτταρική ανάπτυξη HT29Fluc επί ακτινοβολημένα κύτταρα πεθαίνουν ΗΤ29. Επάνω: Ανάλυση ένταση του σήματος από βιοφωταύγεια εικόνα? Κάτω: αντιπροσωπευτικό εικόνες βιοφωτισμός? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm. * Αντιπροσωπεύει

P

& lt?. 0.05

Η

ΕΛΕΡΠΕ Σηματοδοσίας Αγωνιστές Ενίσχυση Ζώντας Ανάπτυξης Reporter κύτταρο απουσία των ακτινοβολημένων τροφοδότης κύτταρα

Από την έκφραση Shh και Gli1 αυξήθηκε σε ακτινοβολημένα PANC1 και τα κύτταρα ΗΤ29 και SHH αγωνιστές σηματοδότησης ενισχυμένη πεθαίνουν κυττάρου όγκου διεγείρεται ζουν την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου, υποθέσαμε ότι η ενισχυμένη κυτταρική ανάπτυξη ρεπόρτερ προκλήθηκε από σήμα SHH απελευθερώνεται από τα θνήσκοντα κύτταρα, ενεργοποιώντας έτσι την οδό σηματοδότησης SHH στα ζωντανά κύτταρα ανταποκριτή θα πρέπει επίσης να προκαλέσει κυτταρική ανάπτυξη. Προκειμένου να εξακριβωθεί η υπόθεσή μας προσθέσαμε την SHH σηματοδότησης αγωνιστές SAG και την ανασυνδυασμένη Ν-τερματικό θραύσμα της Shh σε φρεάτια που περιέχουν μόνο PANC1 ή ΗΤ29 ανταποκριτή. Τόσο SAG και η δραστική μορφή της Shh αυξήθηκε σημαντικά PANC1 ή ανάπτυξης ΗΤ29 ρεπόρτερ κυττάρων (Εικ. 6). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το σήμα SHH απελευθερώνεται από τα θνήσκοντα κύτταρα είχε σαν αποτέλεσμα την ανάπτυξη των κυττάρων αναφοράς που οφείλεται στην ενεργοποίηση της οδού SHH στα κύτταρα ανταποκριτή.

A. αγωνιστής σηματοδότηση SHH SAG ενισχύει την ανάπτυξη των κυττάρων Panc1Fluc με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επάνω: Ανάλυση ένταση του σήματος από βιοφωταύγεια εικόνα? Κάτω: αντιπροσωπευτικό εικόνες βιοφωτισμός? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm. ** Αντιπροσωπεύει

P

& lt? 0,01. B. SHH αγωνιστή σηματοδότησης SAG ενισχύει την ανάπτυξη των κυττάρων HT29Fluc με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επάνω: Ανάλυση ένταση του σήματος από βιοφωταύγεια εικόνα? Κάτω: αντιπροσωπευτικό εικόνες βιοφωτισμός? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm. * Αντιπροσωπεύει

P

& lt? 0,05, ** αντιπροσωπεύει

P

& lt? 0,01. κύτταρα C. Panc1Fluc επεξεργασία με Ν-τερματικό θραύσμα Shh εμφανίζουν αυξημένη ανάπτυξη. Επάνω: Ανάλυση ένταση του σήματος από βιοφωταύγεια εικόνα? Κάτω: αντιπροσωπευτικό εικόνες βιοφωτισμός? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm. * Αντιπροσωπεύει

P

& lt? 0,05. κύτταρα Δ HT29Fluc επεξεργασία με Ν-τερματικό θραύσμα Shh εμφανίζουν αυξημένη ανάπτυξη. Επάνω: Ανάλυση ένταση του σήματος από βιοφωταύγεια εικόνα? Κάτω: αντιπροσωπευτικό εικόνες βιοφωτισμός? κλίμακα μπάρα αντιπροσωπεύει το 1 cm. ** Αντιπροσωπεύει

P

& lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

ανανέωση του πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων είναι μια βασική διαδικασία που προκαλεί υποτροπή του όγκου κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας του καρκίνου ή ακτινοθεραπεία [13]. Ανασύσταση των επιζώντων κυττάρων του όγκου μπορεί να συμβεί μεταξύ των κλασμάτων δόση είτε ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία και μπορεί να οδηγήσει σε αποτυχία της θεραπείας [14].