Αφηρημένο

πρωτεάσης-ενεργοποιημένου υποδοχέα 4 (PAR4), ένα μέλος του G-πρωτεΐνες της οικογένειας υποδοχέων, ήταν πρόσφατα αναφερθεί ότι εμφανίζουν μειωμένη έκφραση σε καρκίνο του στομάχου και του οισοφάγου καρκίνο πλακωδών, ακόμη αυξημένη έκφραση κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη. Trefoil παράγοντας 2 (TFF2), ένα μικρό πεπτίδιο που εκφράζεται ιδιοσυστατικά στο γαστρικό βλεννογόνο, παίζει ένα προστατευτικό ρόλο στην αποκατάσταση του γαστρικού βλεννογόνου. Η αλλαγμένη έκφραση TFF2 επίσης σχετίζεται με την ανάπτυξη του καρκίνου του γαστρεντερικού. TFF2 έχει επαληθευθεί για την προώθηση της κυτταρικής μετανάστευσης μέσω PAR4, αλλά οι ρόλοι των PAR4 και TFF2 στην πρόοδο του ορθοκολικού καρκίνου είναι ακόμα άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, το επίπεδο έκφρασης της PAR4 και TFF2 σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς μετρήθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου (n = 38), κηλίδωση Western (n = 38) και μικροσυστοιχίες ιστού (n = 66). Τα επίπεδα mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης του PAR4 και TFF2 είχαν αξιοσημείωτα αυξημένη σε καρκίνο του παχέος εντέρου σε σύγκριση με συμφωνημένα noncancerous ιστούς, ειδικά σε θετικό λεμφαδένα και κακώς διαφοροποιημένο καρκίνων. Το κύτταρο ορθοκολικό καρκίνωμα LoVo έδειξαν αυξημένη απόκριση σε TFF2 όπως αξιολογείται από κύτταρο εισβολή κατά την έκφραση PAR4. Ωστόσο, μετά από παρέμβαση της έκφρασης PAR4, PAR4 κύτταρο θετικό ορθοκολικού καρκινώματος ΗΤ-29 ήταν λιγότερο δεκτικές σε TFF2 στο κελί εισβολή. Γονιδιωματική αλληλούχιση διθειώδους έδειξε την υπομεθυλίωση του PAR4 υποκινητή σε ορθοκολικό καρκίνο και τους ιστούς του υπερμεθυλίωση στην κανονική βλεννογόνο που πρότεινε η χαμηλή μεθυλίωση του υποκινητή συσχετίστηκε με την αυξημένη έκφραση PAR4. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επάνω ρυθμισμένη έκφραση του PAR4 και TFF2 συμβαίνει συχνά σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς, και ότι η υπερέκφραση του PAR4 μπορεί να προκύψει από υπομεθυλίωση υποκινητή. Ενώ TFF2 προάγει δραστικότητα εισβολή των κυττάρων LoVo υπερεκφράζουν PAR4, και αυτό το αποτέλεσμα μειώθηκε σημαντικά όταν PAR4 ήταν knockdowned σε κύτταρα ΗΤ-29. Τα ευρήματά μας θα είναι χρήσιμη για την περαιτέρω έρευνες σχετικά με τις λειτουργίες και μοριακών μηχανισμών της πρωτεϊνάσης-ενεργοποιημένων υποδοχέων (PARs) και παράγοντες τρίφυλλο παράγοντα (TFFs) κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Yu G, Jiang P, Xiang Υ, Zhang Υ, Zhu Ζ, Zhang C, et al. (2015) αύξησε την έκφραση πρωτεάσης-ενεργοποιημένου υποδοχέα 4 και Trefoil Factor 2 στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος. PLoS ONE 10 (4): e0122678. doi: 10.1371 /journal.pone.0122678

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 4 του Ιούνη του 2014? Αποδεκτές: 24, Φεβ 2015? Δημοσιεύθηκε: 13, Απρ 2015

Copyright: © 2015 Yu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα κινεζική Φυσικών Επιστημών (81160302, 31270835), η κινεζική Ακαδημία Επιστημών (KJZD-EW-L03), επαρχία Γιουνάν Επιστήμης και Τεχνολογίας Τμήμα Βασικές Ίδρυμα Ερευνών (2011FZ109) και μέλος Βασικά Εργαστήριο Γενετικής πόρων και Εξέλιξη (GREKF11-13)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο εξέλιξης του ορθοκολικού καρκίνου είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων που εμπλέκονται στην πολυγενετικής μεταβολές στη προογκογόνα ή /και ογκοκατασταλτικά γονίδια, και παρεκκλίνουσα ρύθμιση επιγενετικές γονίδιο μπορεί να οδηγήσει σε μη φυσιολογική ανάπτυξη των κακοηθών όγκων [1,2]. PARs είναι επτά-διαμεμβράνης συζευγμένου με πρωτεΐνη υποδοχέων (GPCR) που περιλαμβάνει τέσσερα μέλη ονομάστηκε PAR1, PAR2, PAR3 και PAR4 [3]. Όπως έχει την ικανότητα αποικοδόμησης πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας, PARs χρησιμεύουν ως μόρια σήματος που εμπλέκονται στην μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, εισβολή και μετάσταση [4]. PAR1, που εκφράζονται ευρέως σε καρκίνους, προωθείται γένεση όγκου και εισβολή των καρκινικών κυττάρων του μαστού και του παχέος κυττάρων [5,6]. PAR2, υπερεκφράζεται στον καρκίνο του προστάτη, που προωθείται προστάτη καρκινική κυτταρική μετανάστευση [7]. Αντιθέτως, PAR2 έδειξε επίσης μια ογκο-προστατευτικό ρόλο στην καρκινογένεση του δέρματος [8]. PAR3 βρέθηκε στο νεφρό και καρκίνο του ήπατος [9,10]. έκφραση PAR4 έντονα ανιχνεύεται σε πνεύμονα, του θυρεοειδούς, του παγκρέατος, του λεπτού εντέρου και των όρχεων με κηλίδα Northern [11]. Εντούτοις, η έκφραση και το δυναμικό ρόλο της PAR4 στην ογκογένεση είναι ακόμη άγνωστες. έκφραση PAR4 ήταν απούσα σε φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου, αλλά εμφανίστηκε προφανής χρώση στα δυσπλαστικές και colorectalous βλεννογόνο. PAR4 mRNA βρέθηκε σε 10 από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ορθοκολικού καρκινώματος 14 (71%) [12].

παράγοντες Trefoil (TFFs), εκφράζονται ευρέως στον βλεννογόνο του γαστρεντερικού σωλήνα, είναι μικρό και συμπαγές πεπτίδια που περιέχουν ένα ή δύο τομείς τριφύλλι. Τρία στενά συνδεδεμένα TFFs είναι γνωστά στον άνθρωπο, pS2 (TFF1), σπασμολυτικό πολυπεπτίδιο (SP ή TFF2), και εντερικό τρίφυλλο παράγοντα (ITF ή TFF3) [13]. Οι TFFs πεπτίδια πιστεύεται ότι συνεισφέρει στην επούλωση του βλεννογόνου και επιστροφή δυνάμει της προώθησης της μετανάστευσης των κυττάρων και την καταστολή της απόπτωσης [14]. TFFs συμμετέχουν επίσης στην ογκογένεση [15]. TFF2, που περιέχει δύο πεδία σε σχήμα τριφυλλιού, πιστεύεται ότι είναι ο κύριος κυτταροπροστατευτική τρίφυλλο παράγοντα στο στομάχι, και το επίπεδο έκφρασης της TFF2 είχε απελευθερωθεί στο γαστρικό έλκος και καρκινικού ιστού [16]. Σε πρόσφατη έρευνα μας, TFF2 έχει δειχθεί ότι προάγει μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων και την επούλωση των τραυμάτων μέσω PAR4 εμπλέκεται φωσφορυλίωση της ERK1 /2 [17], αλλά οι λειτουργίες λεπτομέρεια και μοριακών μηχανισμών των PAR4 και TFF2 στην εξέλιξη της γαστρεντερικής όγκων δεν έχουν ανακαλυφθεί . Στη μελέτη, δείξαμε τα επίπεδα έκφρασης του PAR4 και TFF2 αυξήθηκαν σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με την συμφωνημένα noncancerous βλεννογόνο, και ο προς τα πάνω ρύθμιση έκφρασης του PAR4 σε ορθοκολικό καρκίνους μπορεί να προκύψει από την υπομεθυλίωση υποκινητή. Επιπλέον, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι TFF2 προωθεί παχέος εισβολή των καρκινικών κυττάρων με την ενεργοποίηση PAR4.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από Κουνμίνγκ Ινστιτούτο Ζωολογίας, η κινεζική Ακαδημία Επιστημών και Κουνμίνγκ Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους ασθενείς πριν από τη λήψη δειγμάτων για την παρούσα μελέτη.

Τα άτομα της μελέτης

Ένα σύνολο των 38 ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, ο οποίος συμφώνησε να συμμετάσχει στη μελέτη μας, η οποία υπεγράφη την εν επιγνώσει συναίνεση αποτελούν και έλαβε τις εργασίες στο πρώτο Affiliated Νοσοκομείο Κουνμίνγκ Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Παχέος δείγματα ελήφθησαν από ορθοκολικό ιστούς όγκων και των γειτονικών περιοχών μη καρκίνου, η οποία ήταν τουλάχιστον 6 εκατοστά μακριά από τον όγκο. Τα συλλεχθέντα ιστοί περαιτέρω επιβεβαιώθηκε με ιστολογία και καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. μικροσυστοιχιών καρκίνο του παχέος εντέρου ιστού που εκπροσωπούν 66 του παχέος εντέρου με μη-νεοπλασματικές περιθώρια εκτομή τους κατασκευάστηκε [18] ήταν από τη Σαγκάη ξεπεράσει Κέντρο Biochip (Σαγκάη, Κίνα).

εκχύλιση RNA και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

εκχύλιση RNA και το πρώτου κλώνου cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [19]. Για ημι-ποσοτική RT-PCR και PCR πραγματικού χρόνου, οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: οι εκκινητές για PAR4 (147 bp προϊόν) ήταν 5′-CCTTCATCTACTACTACTACGTGTCG-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-ACTGGAGCAAAGAGGAGTGG-3′ (αντίστροφης )? για TFF2 (74 bp προϊόν) ήταν 5’-CTGCTTCTCCAACTTCATCT-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CTTAGTAATGGCAGTCTTCC-3′ (αντίστροφο)? και για τον εσωτερικό έλεγχο γλυκεραλδεΰδη 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH, 107 bp προϊόν), ήταν 5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’ (αντίστροφο). Μετά RT-PCR, τα αμπλικόνια του PAR4, TFF2 και GAPDH ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτές αγαρόζης 2%, χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο και παρατηρήθηκαν κάτω από υπεριώδες φωτισμό.

Ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε με έναν ανιχνευτή Συνεχής φθορισμού (Opticon Monitor, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). PCR αντιδράσεις για PAR4, TFF2 και GAPDH πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα SYBR Green PCR πραγματικού χρόνου kit (Takara, Dalian, Κίνα) με την προϋπόθεση της: αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 1 λεπτό, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s, 60 ° C για 15 s, και 72 ° C για 20 s. Κάθε δείγμα εις τριπλούν. Δεν ελέγχους πρότυπο (δεν cDNA σε PCR) διεξήχθησαν για την ανίχνευση μη ειδική ή γονιδιωματική ενίσχυση και αστάρι διμερισμό. ανάλυση καμπύλης φθορισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό Opticon Monitor. Σχετική ποσοτική αξιολόγηση των PAR4 και τα επίπεδα έκφρασης TFF2 διεξήχθησαν με E-μέθοδο και εκφράζεται ως λόγος της μεταγραφής του PAR4 (TFF2) προς GAPDH στον ιστό του όγκου. Οι ταυτότητες των RT-PCR και πραγματικού χρόνου PCR προϊόντα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση του DNA.

Tissue ανοσοϊστοχημεία

Tissue ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Εν συντομία, η ανάκτηση αντιγόνου διεξήχθη με θέρμανση σε αυτόκλειστο στους 121 ° C για 5 λεπτά. Αποκηρωμένες τομές προ-επωάστηκαν με το κλείδωμα του ορού και μετά επωάζονται στους 4 ° C όλη τη νύκτα με αντι-ανθρώπινο αντίσωμα PAR4 (C-20, 1: 1200? Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) και το αντίσωμα αντι-ανθρώπινης TFF2 (Ρ -19, 1: 800? Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), αντίστοιχα. Η ειδική σύνδεση ανιχνεύθηκε με ένα κιτ προσδιορισμού στρεπταβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (Maxim, Fujian, Κίνα). Το τμήμα ήταν αντίθετα με Harris αιματοξυλίνη. Άμεση μικροσκοπική μικρογραφίες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας μια φωτογραφική μηχανή Leica DFC320 ελέγχονται από το λογισμικό Leica IM50 (Leica, Γερμανία). Τμήματα επωάζονται με κανονικό IgG κατσίκας χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Εξειδίκευση των αντισωμάτων για PAR4 και TFF2 επιβεβαιώθηκε με προ-επώαση όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα αντίστοιχα αντιγόνα τους (Santa Cruz) σε 20-πλάσια γραμμομοριακή περίσσεια του αντιγόνου προς αντισώματα. Η προ-επώαση με PAR4 και TFF2 αντιγόνου οδήγησε σε απουσία ανοσοσήμανση.

Η ανοσοϊστοχημική χρώση εκτιμήθηκε ημι-ποσοτικά με μέτρηση και την ένταση της χρώσης (0, 1, 2, ή 3) και την έκταση της χρώσης (0, 0%? 1, 0-10%? 2, 10-50%? 3, 50-100%). Οι βαθμολογίες για την ένταση και την έκταση της χρώσης πολλαπλασιάστηκαν για να δώσουν ένα σταθμισμένο βαθμολογία για κάθε περίπτωση (μέγιστο δυνατό, 9). Για τη στατιστική ανάλυση, οι σταθμισμένες βαθμολογίες ομαδοποιούνται σε δύο κατηγορίες, όπου δεκάδες 0-3 θεωρήθηκαν αρνητικές και θετικές 4-9 [20].

κηλίδας Western

Τα δείγματα ιστού ομογενοποιούνται σε Ρυθμιστικό Radioimmunoprecipitaion Δοκιμασία (Sigma) που περιέχει κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (Sigma). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίζεται με κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Bio-Rad). Δείγματα (που περιέχει 30 μα πρωτεΐνης) φορτώθηκαν σε ένα SDS-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πηκτής (SDS-PAGE) γέλης και στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνη PVDF. Οι μεμβράνες στη συνέχεια αποκλείστηκαν με αλβουμίνη 3% βόειου ορού (BSA) και επωάστηκαν με τις κατάλληλες PAR4 και TFF2 πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα, αντίστοιχα. Οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με αντιδραστήρια Σούπερ Signal (Pierce, Rockford, IL, USA).

Bisulfite αλληλούχιση

Γονιδιωματικό DNA από παχέος εντέρου και μη νεοπλασματικών ιστών απομονώθηκε με την καθολική Γενωμικό DNA Extraction Kit (Takara) και όξινο θειώδες μετατρέπονται χρησιμοποιώντας το CpGenome Kit Τροποποίηση Fast DNA (Chemicon). αλληλουχίες προαγωγού PAR4 ενισχύθηκαν από όξινο θειώδες μετατρέπεται DNA με PCR, καθαρίστηκαν από πηκτώματα αγαρόζης και υποκλωνοποιήθηκε στον pMD19-T Vector (Takara). Για κάθε δείγμα, 19 επιμέρους κλώνοι αλληλουχήθηκαν για να διαπιστώσετε μεθυλιωμένα κατάλοιπα κυτοσίνης. αλληλουχίες εκκινητών PCR (πρόσθιος και αντίστροφος) για PAR4 ήταν 5′-TTTAAGGGTGATTTTAGGAAAGGTTTAGAG-3 ‘και 5′-ACTATAACCTCAAACTTCCTACCTC-3’.

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές LoVo και HT- 29 ήταν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα LoVo υπερεκφράζουν PAR4 (LoVo-PAR4) και τα κύτταρα επιμολυσμένα με ένα ψευδο πλασμίδιο (LoVo-mock) επιλέχθηκαν με 800 ug /ml G418 σύμφωνα με προηγουμένως μελέτες μας [17]. κύτταρα LoVo καλλιεργήθηκαν σε μέσο Ham F12 συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 U /ml στρεπτομυκίνη, και αναπτύχθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2 στους 37 ΝΤΟ. Για τη θεραπεία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα-dC? Sigma, 95 Louis, ΜΟ, USA), τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

6 σε ένα πιάτο 60 mm . Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ 5-αζα-DC. DMSO υποβλήθηκε σε επεξεργασία παράλληλα ως έλεγχος. Σύνολο κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 72 ώρες από την προσθήκη 5-Αζα-άΟ και υποβλήθηκαν σε RT-PCR και ανάλυση Western blotting.

εξόντωση PAR4 σε ΗΤ-29 κύτταρα

Lentivirus εκφράζουν shRNA παρήχθησαν με συν-επιμόλυνση PAR4 shRNA πλασμίδια με pCMV-dR8.2 dvpr και pCMV-VSVG συσκευασία πλασμιδίων σε 293FT κύτταρα. ΗΤ-29 κύτταρα επιμολυσμένα με pGIPZ-shPAR4 ή κενό pGIPZ φορέα επιλέχθηκαν με 5 μg /ml πουρομυκίνη για να δημιουργήσει ΗΤ-29-shPAR4 και ΗΤ-29-pGIPZ, αντίστοιχα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 U /ml στρεπτομυκίνη.

Κυττάρων εισβολή

Εισβολή δραστηριότητες του LoVo- mock και LoVo-PAR4 κύτταρα, και ΗΤ-29-pGIPZ και κύτταρα ΗΤ-29-shPAR4 in vitro μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία εισβολή Matrigel [21]. Η InnoCyte Κυττάρων εισβολή Assay Kit (8 μm πόρου, Calbiochem, Merck) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 5 χ 10

4 κύτταρα LoVo-mock, LoVo-PAR4, ΗΤ-29-pGIPZ και ΗΤ-29-shPAR4 αντιστοίχως προστίθενται στον άνω θάλαμο, και μέσο που περιέχει ανασυνδυασμένη TFF2 προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Μετά από επώαση 24 ώρες στους 37 ° C, αιώρημα κυττάρων απορρίφθηκαν και οι άνω ένθετα θαλάμου ήπια τοποθετήθηκε σε διάλυμα χρώσεως των κυττάρων για 30 λεπτά. Μετά τις χαμηλότερες κύτταρα θάλαμο που περιέχει τα εκτοπίζονται κύτταρα επωάστηκαν μία επιπλέον 30 λεπτά στις ίδιες συνθήκες. Τέλος 200μL τα εκτοπίζονται κύτταρα μεταφέρθηκαν διπλά στα φρεάτια μιας πλάκας 96 φρεατίων, και μετρήθηκε ο φθορισμός σε μήκος κύματος διέγερσης 485 ± 10 nm και μήκος κύματος εκπομπής 520 ± 10 nm. Εν τω μεταξύ, τα χαμηλότερα κύτταρα θάλαμο φωτογραφήθηκαν μέσω της ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού λέιζερ.

Η στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) . Η chi τετράγωνο τεστ (Πίνακες 1 και 2) και Mann-Whitney U Κείμενο χρησιμοποιήθηκαν για την σημαντικότητα των συσχετίσεων μεταξύ PAR4 και έκφραση TFF2 και κλινικές παθολογικές παραμέτρους. Οι διαφορές μεταξύ των αριθμητικών δεδομένων μεταξύ των ζεύγη ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία του ζεύγη του Student. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο επίπεδο του

σ

& lt?. 0.05

Η

Αποτελέσματα

Τα επίπεδα έκφρασης του PAR4 και TFF2 mRNA αυξήθηκε σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς

Η έκφραση του PAR4 και TFF2 mRNA σε ιστούς παχέος εξετάστηκαν με RT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε συμφωνημένα φυσιολογικών και καρκινικών δείγματα επιλέγονται τυχαία από τέσσερις ασθενείς και τα αποτελέσματα έδειξαν PAR4 και TFF2 mRNA επίπεδα σημαντικά αυξημένη σε καρκίνους ιστούς σε σύγκριση με τα συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς.

(Α) αντιστοιχισμένη φυσιολογικό (κανονικό) και καρκινικών (καρκίνος) ιστών από ασθενείς κάθε επιλέγονται τυχαία αναλύθηκαν με RT-PCR χρησιμοποιώντας PAR4- και GAPDH- ειδικούς εκκινητές (n = 4). Μετά τα δείγματα ομαλοποιήθηκαν σε επίπεδα GAPDH, τα επίπεδα mRNA του PAR4 και TFF2 αυξήθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με τον καρκίνο στους φυσιολογικούς ιστούς? (Β) στύπωμα Western των προϊόντων λύσης ιστών από τέσσερις περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου (καρκίνος) και τις σχετικές γειτονικές μη νεοπλαστικά βλεννογόνου (κανονικό). Η έκφραση του ακτίνης χρησίμευσε ως μάρτυρας. Η σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση έκφρασης του PAR4 παρατηρήθηκε στα καρκινικούς ιστούς σε αντίθεση με συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς τους (n = 4).

Η

Στη συνέχεια, εξετάσαμε τα επίπεδα του PAR4 και TFF2 mRNA σε 38 παχέος δείγματα καρκίνου με PCR πραγματικού χρόνου. Το επάνω ρυθμισμένη του PAR4 και TFF2 σε όγκους παχέος εντέρου ήταν 58% (22 από 38) σε σύγκριση με το συμφωνημένα μη νεοπλασματικά βλεννογόνο. Εξετάσαμε περαιτέρω την κλινική σημασία των up-ρύθμιση της έκφρασης στην κλινική παθολογική δεδομένων. Υπήρχε σημαντική διαφορά της έκφρασης PAR4 και TFF2 mRNA σε λεμφαδένες επεμβατικές όγκους σε σχέση με μη επεμβατικές όγκους (

σ

= 0.016 και

σ

= 0.002, Chi τετράγωνο κειμένου). Η διαφορά παρατηρήθηκε επίσης σε κακή διαχωριζόμενες όγκου έναντι καλά /moderated- διαφοροποιημένοι όγκοι (

σ

= 0.002 και

σ

= 0.020, Chi τετράγωνο κείμενο) (Πίνακας 1). Σε λεπτομέρειες, PAR4 mRNA αυξήθηκε κατά 2,2 (1,8, 4,7) (τεταρτημόριο 25, τεταρτημόριο 75) διπλώνει σε 14 λεμφαδένες επεμβατικές όγκους και από 1,0 (0,4, 2,0) διπλώνει σε 24 μη επεμβατικές όγκους (

p

= 0,008, Mann-Whitney U κειμένου)? TFF2 mRNA αυξήθηκε κατά 3,2 (2,2, 7,6) διπλώνει σε 14 λεμφαδένα επεμβατική όγκων και κατά 0,8 (0,3, 1,5) διπλώνει σε 24 μη επεμβατικές όγκους (

σ

= 0,001, Mann-Whitney U κειμένου) (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, PAR4 mRNA αυξήθηκε κατά 2,3 (2,0, 3,8) διπλώνει σε 16 φτωχές διαφοροποιημένοι όγκοι και από 0,9 (0,5, 1,2) διπλώνει σε 22 καλά /moderated- διαφοροποιείται καρκίνους (

σ

= 0,001, Mann -Whitney U κειμένου)? TFF2 mRNA αυξήθηκε κατά 2,2 (1,8, 5,8) διπλώνει σε 16 φτωχή διαφοροποιούνται όγκων και κατά 0,8 (0,3, 1,5) διπλώνει σε 22 καλά /μετριάστηκε διαχωριζόμενες καρκίνους (

σ

= 0,002, Mann-Whitney U κειμένου) (Σχήμα 2Β).

η έκφραση του PAR4 και TFF2 μετρήθηκε σε 38 ασθενείς με καρκίνο του παχέος με πραγματικού χρόνου PCR. (Α) PAR4 mRNA αυξήθηκε σε 86% (12 από 14) λεμφαδένα επιθετικοί όγκοι και το 42% (10 από 24) μη επεμβατική όγκων. TFF2 mRNA αυξήθηκε σε 93% (13 από 14) λεμφαδένα επιθετικοί όγκοι και 38% (9 από 24) μη επεμβατική όγκων. Υπήρξε σημαντική διαφορά του PAR4 (p = 0.008) και TFF2 (p = 0.001) έκφραση mRNA μεταξύ λεμφαδένα επεμβατικές όγκους και μη επεμβατική όγκων? (Β) PAR4 mRNA αυξήθηκε σε 88% (14 από 16) κακή διαχωριζόμενες καρκίνων και 36% (8 από 22) καλά /μετριάστηκε διαχωριζόμενες καρκίνους. TFF2 mRNA αυξήθηκε σε 81% (13 από 16) κακή διαχωριζόμενες καρκίνων και 46% (9 από 22) καλά /μετριάστηκε διαχωριζόμενες καρκίνους. Επίσης, υπάρχει μια σημαντική διαφορά της PAR4 (p = 0,001) και TFF2 (p = 0,002), η έκφραση του mRNA μεταξύ των φτωχών-διαφοροποιημένο και καλά /μετριάστηκε διαχωριζόμενες καρκίνους? Η μέση φορές αύξηση στον ιστό του όγκου σε σχέση με μη νεοπλασματικά ορθοκολικό ιστό δείχθηκε. Διάμεση (τεταρτημόριο 25, τεταρτημόριο 75) χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει πτυχώσεις του PAR4 αύξηση (TFF2) σε λεμφαδένα επεμβατικές όγκους και μη επεμβατική όγκων, και η κακή διαχωριζόμενες καρκίνους και καλά /μετριάστηκε διαχωριζόμενες καρκίνους. Οι αυξημένες πτυχές του «& gt? 1» ορίστηκαν ως «αυξημένη», ενώ αυξημένη πτυχές της «≤1» ορίστηκαν ως «δεν αυξήθηκε»

Η

επίπεδα πρωτεΐνης του PAR4 και TFF2 αυξήθηκαν. οι παχέος καρκινικούς ιστούς

πρωτεϊνών PAR4 και TFF2 ήταν χαμηλά ή απαρατήρητα στην κανονική του παχέος βλεννογόνο με κηλίδωση Western ανάλυση (Σχήμα 1Β). Ωστόσο, σε ιστούς ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, αφού τα δείγματα ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη επίπεδα, μια σημαντική αυξημένη έκφραση του PAR4 και TFF2 παρατηρήθηκε σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τα συμφωνημένα μη κακοήθεις ιστούς (Σχήμα 1 Β).

στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική χρώση για να αναλύσει τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του PAR4 και TFF2

in vivo

. Δεν υπήρχε σχεδόν καμία έκφραση του PAR4 και TFF2 σε μη νεοπλασματικά ορθοκολικού επιθηλιακά κύτταρα, αλλά η έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη σε κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα του παχέος. Επιπλέον, η πλειονότητα της χρώσης PAR4 και TFF2 σε κακοήθη παχέος δείγματα καρκίνος ήταν εντοπισμένες στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 3). Σε 66 δείγματα που αναλύθηκαν, η έκφραση PAR4 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε 57 (86,1%) του παχέος δείγματα καρκίνου όταν συγκρίνεται με την συμφωνημένα φυσιολογικού βλεννογόνου. έκφραση TFF2 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε 46 (69,7%) του παχέος δείγματα καρκίνου. Επιπλέον, οι διαφορές στην έκφραση της πρωτεΐνης PAR4 και TFF2 μεταξύ των φτωχών διαχωριζόμενες και καλά /moderated- διαφοροποιημένοι όγκοι ήταν σημαντική (

σ

= 0.017 και

σ

= 0.022, Chi τετράγωνο κείμενο) (Πίνακας 2).

(Α) ανοσοϊστοχημική χρώση για PAR4. (Α) κανονική του παχέος βλεννογόνου? (Β) τον ορθοκολικό καρκίνο ιστού του υπ ‘αριθμόν ένα ασθενή. (Γ) τον ορθοκολικό καρκίνο ιστό του νούμερο δύο ασθενών? (Β) ανοσοϊστοχημική χρώση για TFF2. (Δ) την κανονική του παχέος βλεννογόνου? (Ε) τον ορθοκολικό καρκίνο ιστού νούμερο ένα ασθενή? (Στ) τον ορθοκολικό καρκίνο ιστό του νούμερο δύο ασθενών. Μπαρ, 100 μm για κάθε πίνακα, και 50 μm για ένθετα.

Η

Η υπερέκφραση του PAR4 αυξημένη δραστηριότητα εισβολή των κυττάρων LoVo προκαλείται από TFF2

προηγούμενα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι TFF2 προωθεί κυττάρων μετανάστευση μέσω PAR4 [17]. Για να διερευνήσουν το ρόλο της PAR4 σε TFF2 επαγόμενη κυτταρική εισβολή, εξετάσαμε την επίδραση της TFF2 για LoVo-παρωδία και LoVo-PAR4 δραστηριότητες κύτταρα εισβολή. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α, 200 ηΜ TFF2 δεν προκάλεσε δραστικότητα εισβολή σε LoVo-mock κύτταρα με προσδιορισμό Matrigel. Ωστόσο, αυξήθηκε σημαντικά τη δραστικότητα εισβολή στα κύτταρα LoVo-PAR4. Η συνεστιακή μικροσκοπία έδειξε επίσης ότι η δραστηριότητα εισβολή των κυττάρων LoVo-PAR4 ήταν 2 διπλώνει υψηλότερη από LoVo-mock κύτταρα όταν διεγείρονται από TFF2 (Σχήμα 4Β).

(Α) Cell εισβολή διεγείρεται από TFF2 δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας ένα InnoCyte δοκιμασία κυττάρων εισβολής. Εισβολή των LoVo-παρωδία και LoVo-PAR4 κύτταρα που διεγείρονται από 200ηΜ TFF2 ελέγχθηκε, με BSA και 10 ηΜ EGF ως μάρτυρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική διαφορά των 200ηΜ TFF2 για LoVo-παρωδία και τη δραστηριότητα των κυττάρων εισβολή LoVo-PAR4. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσοι ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * P & lt? 0,05? (Β) Εισβολή των LoVo-παρωδία και τα κύτταρα LoVo-PAR4 διεγείρεται από 200ηΜ TFF2 ερευνήθηκαν από Confnocal μικροσκοπία φθορισμού laser.

Η

PAR4 νοκ ντάουν στον ΗΤ-29 κύτταρα μειωμένη δραστηριότητα εισβολή των κυττάρων σε ανταπόκριση προς TFF2

επόμενο προσδιοριστεί η επίδραση της TFF2 σχετικά με τη δραστηριότητα των κυττάρων εισβολή στην PAR4- knockdowned ΗΤ-29 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, 200 ηΜ TFF2 αύξησε σημαντικά τη δραστικότητα εισβολή των κυττάρων ΗΤ-29-pGIPZ με δοκιμασία Matrigel, αλλά δεν είχε καμία επίδραση επί των PAR4-knockdowned κύτταρα. Ομοεστιακή αποτελέσματα μικροσκοπία έδειξε επίσης ότι η εισβολή των ΗΤ-29-pGIPZ είναι περισσότερο από 3-4 πτυχώσεις των κυττάρων ΗΤ-29-shPAR4 όταν τα κύτταρα διεγείρονται από TFF2 (Σχήμα 5Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι TFF2 επαγόμενη εισβολή ήταν PAR4-εξαρτώμενη.

(Α) Cell εισβολή διεγείρεται από TFF2 ελέγχθηκε με τη χρήση μίας ανιχνεύσεως InnoCyte κύτταρο εισβολή. δραστηριότητα Εισβολή των ΗΤ-29-pGIPZ και κύτταρα ΗΤ-29-shPAR4 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 200 ηΜ TFF2 για την αξιολόγηση της δραστηριότητας εισβολή, BSA και 10 ηΜ EGF χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Υπήρχε σημαντική διαφορά των 200ηΜ TFF2 για HT-29-pGIPZ και ΗΤ-29-shPAR4 κύτταρα εισβολής. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσοι ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων, * ρ & lt? 0,05? (Β) Εισβολή κύτταρα ΗΤ-29-pGIPZ και ΗΤ-29-shPAR4 διεγείρεται από 200ηΜ TFF2 ερευνήθηκαν με Confnocal μικροσκοπία φθορισμού laser.

Η

Αποκατάσταση της έκφρασης PAR4 με κατεργασία του 5-Αζα-doxy σε παχέος κύτταρα LoVo

Όπως αναφέρεται στην ερευνητική εργασία του Zhang, PAR4 δεν εκφράστηκε στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου των LoVo [17]. Για να διαλευκανθεί το δυναμικό μοριακός μηχανισμός υποκείμενα PAR4 επάνω ρυθμισμένη έκφραση σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς, τα κύτταρα LoVo έλαβαν θεραπεία με 5-Αζα-dC, έναν παράγοντα απομεθυλίωσης. Στο Σχ 6Α και 6Β, RT-PCR και κηλίδωση Western έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης της PAR4 αποκαταστάθηκε μετά από 3 ημέρες θεραπείας με 5-Αζα-dC, και τα ανθρώπινα ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές ΗΤ-29 εκφράζουν PAR4 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

LoVo, ένας μη PAR4 εκφράζοντα κύτταρα, επωάστηκαν με 5-Αζα-dC (10 μΜ) ή DMSO για 72 ώρες, και τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση mRNA και πρωτεΐνης. (Α) Το επίπεδο έκφρασης του mRNA PAR4 εξετάστηκε με RT-PCR? (Β) Το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης PAR4 εξετάστηκε από κηλίδα western. Το ορθοκολικό καρκίνο κυτταρική σειρά ΗΤ-29 που εκφράζεται PAR4 χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος.

Η

επίπεδο ανάλυση μεθυλίωσης της περιοχής προαγωγού του PAR4 σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς

Επειδή απομεθυλίωση με 5- Αζα-dC οδηγεί στην αποκατάσταση της έκφρασης PAR4 σε κύτταρα LoVo, συγκρίναμε το επίπεδο μεθυλίωσης του υποκινητή PAR4 μεταξύ ορθοκολικού καρκίνου και της αντιστοιχισμένης φυσιολογικούς ιστούς. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο γονιδιωματική αλληλούχιση όξινο θειώδες, εξετάσαμε 19 CpG θέσεις σε μια περιοχή 380 bp του υποκινητή PAR4. Τρεις παχέος δείγματα καρκίνου με υψηλή έκφραση PAR4 εμφανίζεται έντονη hypomethylations, και το μέσο επιτόκιο μεθυλίωση τους 19 δικτυακούς τόπους CpG είναι 22,1%. Ωστόσο, η υπερμεθυλίωση βρέθηκε σε συμφωνημένα ιστούς μη καρκινικά το οποίο είχε χαμηλή έκφραση του PAR4, και μέσα ποσοστά μεθυλίωσης τους ήταν 41.6% (Σχ 7Α). Υψηλής PAR4-έκφραση ΗΤ-29 κύτταρα εμφάνισαν υπομεθυλίωση στην προώθηση του ενώ τα μη PAR4 έκφραση κυττάρων LoVo εμφανίζεται υπερμεθυλίωση (Σχήμα 7Β).

(Α) μεθυλίωση προαγωγού PAR4 αναλύθηκε σε DNA από τρία καρκίνο του παχέος εντέρου και συμφωνημένα τους μη-νεοπλασματικών ιστών. (Β) μεθυλίωση προαγωγού PAR4 σε DNA από κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου γραμμές, LoVo και ΗΤ-29. Μέση μεθυλίωσης σε κάθε αναλύονται ιστοσελίδα CpG στον υποκινητή PAR4 υποδεικνύεται βασίζεται σε όξινο θειώδες αλληλουχία των 19 ξεχωριστών κλώνων.

Η

Συζήτηση

Η έκφραση διαφορά της PAR4 και TFF2 ανιχνεύθηκε σε διάφορους όγκους , όπως ο καρκίνος του παγκρέατος, καρκίνο του πνεύμονα και καρκίνου του στομάχου, και η έκφραση αυτή διαφορά σχετίζεται με την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, η μετανάστευση, εισβολή και την αγγειογένεση [11,22-24]. Επειδή PARs παίζουν σημαντικούς ρόλους σε διάφορους καρκίνους και έχουν γίνει ελκυστική για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στόχων [25]. Στη μελέτη, παρουσιάσαμε ορισμένα θεμελιώδη στοιχεία ότι τα επίπεδα έκφρασης του PAR4 και TFF2 αυξήθηκαν σημαντικά σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τα συμφωνημένα noncancerous ιστούς, ειδικά στα μεταστατικά θετικούς λεμφαδένες και χαμηλή διαφοροποίηση όγκων. Η πλειοψηφία των PAR4 και TFF2 σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς είναι εντοπισμένες στο κυτταρόπλασμα, όπως φαίνεται με ανοσοχρώση. Η αύξηση της έκφρασης PAR4 σε καρκίνο του παχέος εντέρου ήταν σύμφωνη με τα αποτελέσματα Gratio ερευνητικά [12], στο οποίο PAR4 ήταν απούσα σε φυσιολογικό κολικό βλεννογόνο και επιθηλιακά κύτταρα, αλλά υψηλή σε ιστούς αδενοκαρκίνωμα κόλον και 71% ανθρώπινου ορθοκολικού κυτταρικές σειρές δείχνουν ισχυρή ανοσοχρώση PAR4 [12]. Αντιθέτως, η έκφραση PAR4 μειώθηκε σε καρκίνο του στομάχου, του οισοφάγου πλακώδους καρκίνου και αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα ιστών συγκρίνοντας με τη σχετική κανονική βλεννογόνο [17,26,27]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η λειτουργία του PAR4 ήταν διαφορετική στις προόδους όγκων. Δεδομένου ότι οι άγνωστοι παράγοντες θα μπορούσαν να εμπλέκονται στην ανώμαλη έκφραση του PAR4, υπάρχουν πολύ έργα πρέπει να κατανοήσουν το μηχανισμό ρύθμισης PAR4 πριν να μπορεί να είναι ένας πιθανός στόχος φαρμάκου για θεραπεία καρκίνου.

TFF2, ως ένα κύριο κυτταροπροστατευτικό τριφυλλοειδούς παράγοντα, εκφράστηκε κυρίως στο στομάχι, και η έκφραση απορυθμίζεται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του γαστρικού [16,23,28]. Στη μελέτη του Jiang, η έκφραση TFF2 ήταν σημαντικά μειωμένη σε γαστρικό καρκίνο, υποδηλώνοντας το ρόλο της TFF2 ως καταστολέας όγκων σε γαστρικό καρκινογένεση και μετάσταση [29]. Στο βλεννογόνο του παχέος εντέρου, TFF2 εκφράστηκε με χαμηλή ένταση, αλλά η έκφραση του TFF2 στην πρόοδο του καρκίνου του παχέος εντέρου δεν ήταν σαφές [30]. Στην έρευνά μας, ήταν ενδιαφέρον να βρουν έκφραση TFF2 ήταν επίσης αυξημένη σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τη σχετική κανονική ορθοκολικό βλεννογόνου. Furthermor, τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη TFF2 μπορούσε να ενεργοποιήσει PAR4 για την προώθηση LoVo-PAR4 και δραστηριότητα των κυττάρων εισβολής ΗΤ-29-pGIPZ, αλλά δεν είχε καμία σημαντική επίδραση εισβολή σε κύτταρα LoVo-mock και ΗΤ-29-shPAR4. Τα αποτελέσματα συνίστανται με προηγούμενο εύρημα μας ότι TFF2 ενεργοποιείται PAR4 για την προώθηση της μεταναστεύσεως των επιθηλιακών κυττάρων μέσω /2 φωσφορυλίωση ERK1 [17]. Φωσφορυλίωση των ERK1 /2 απαιτείται για τη μετανάστευση των κυττάρων και είναι κεντρικής σημασίας για TFF μεσολάβηση σηματοδότηση [14,31]. Ως εκ τούτου τα γεγονότα ότι η προς τα πάνω ρύθμιση έκφρασης του PAR4 και TFF2 σε καρκίνο του παχέος εντέρου, η συν-εντοπισμένη ομιλίες έκφραση κυτταρόπλασμα τους, και TFF2 προώθηση κυτταρική μετανάστευση και εισβολή μέσω PAR4, γεγονός που υποδηλώνει την αλληλεπίδραση του PAR4 και TFF2

in vivo

και

in vitro

μέσω του άγνωστου μηχανισμού που πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω.

η μεταγραφική σίγηση από υπερμεθυλίωση προαγωγού έχει πρόσφατα αναδειχθεί ως ένας από τους σημαντικούς μηχανισμούς στην ανάπτυξη γαστρικού καρκίνου [32]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η 5-Αζα-dC, έναν παράγοντα απομεθυλίωσης, αποκαταστάθηκε έκφραση PAR4 σε κύτταρα LoVo. Αναλύσαμε περαιτέρω την κατάσταση μεθυλίωσης της κυτοσίνης σε CpG δινουκλεοτίδιο που βρίσκονται εντός μη CpG νησίδων στην περιοχή προαγωγού PAR4 χρησιμοποιώντας παχέος καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές με διαφορετικό επίπεδο έκφρασης PAR4. Υποστηρικτής υπερμεθυλίωση επιβεβαιώθηκε στην κανονική του παχέος βλεννογόνο με χαμηλή έκφραση του PAR4. Ωστόσο, υπομεθυλίωση προαγωγός βρέθηκε σε ορθοκολικό καρκίνο με ιστούς υψηλή έκφραση του PAR4. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπομεθυλίωση προαγωγός μπορεί να προάγει τη μεταγραφή του PAR4. Zhang et al βρήκαν ότι η απώλεια της έκφρασης PAR4 σε γαστρικών καρκίνων μπορούν να προκύψουν από υπερμεθυλίωση του προαγωγού PAR4 [33]. Αλλά PAR4 μειωμένη έκφραση στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα δεν είχε σχέση με μεθυλίωση υποκινητή [2727]. Τα γεγονότα αυτά πρότειναν ότι το επίπεδο μεθυλίωσης υποστηρικτής ήταν μόνο ένας παράγοντας που οδηγεί στη διαφορά της έκφρασης PAR4, και η έκφρασή του ήταν ρυθμίζεται από πολλούς παράγοντες.

Εν κατακλείδι, η έρευνα έδειξε ότι PAR4 και η έκφραση TFF2 ήταν συχνά up-ρυθμίζονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου και την αυξημένη έκφραση συσχετίστηκε με κλινικά επιθετικό φαινότυπο. DNA υπομεθυλίωση οδηγεί στο επάνω ρυθμισμένη έκφραση του PAR4 σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς. Δείξαμε επίσης PAR4 προωθείται εισβολής καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων σε ανταπόκριση προς TFF2. Τα αποτελέσματα αυτά θα μας βοηθήσουν να κατανοήσουν μοριακό μηχανισμό της TFFs και PARs στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του παχέος εντέρου.

Ευχαριστίες

Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα κινεζική Φυσικών Επιστημών (81160302, 31270835 ), η κινεζική Ακαδημία Επιστημών (KJZD-EW-L03), επαρχία Γιουνάν Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας του Ιδρύματος Έρευνας Basic (2011FZ109) και μέλος Βασικά Εργαστήριο Γενετικής πόρων και Εξέλιξη (GREKF11-13).