Αφηρημένο

Η ικανότητα της ιντερλευκίνης-15 (IL-15) για την ενεργοποίηση πολλών ανοσοποιητικό μηχανισμούς αντικαρκινική καθιστά το κυτοκίνης ένα καλό υποψήφιο για την θεραπεία των συμπαγών όγκων, ιδιαίτερα του καρκινώματος νεφρικών κυττάρων. Παρά το γεγονός ότι η IL-15 που χρησιμοποιούνται σήμερα σε κλινικές δοκιμές, η λειτουργία της κυτοκίνης για τα εξαρτήματα νεφρού δεν έχει μελετηθεί εκτενώς? έτσι ερευνήσαμε το ρόλο της IL-15 σε φυσιολογικά και καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα νεφρικών. Στο παρόν, αναλύσαμε την έκφραση και τις βιολογικές λειτουργίες της IL-15 στην φυσιολογική νεφρική εγγύς σωληναρίων (RPTEC) και σε νεοπλασματική ομολόγους τους, των νεφρικών σαφές καρκίνωμα (RCC). Αυτή η μελέτη δείχνει ότι RPTEC εκφράζουν ένα λειτουργικό ετεροτριμερείς συγκρότημα IL-15Rαβγc των οποίων διέγερση με φυσιολογικές συγκεντρώσεις της rhIL-15 είναι επαρκής για την αναστολή επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) δέσμευση διατήρησης της έκφρασης Ε-καδερίνης. Πράγματι, η IL-15 δεν είναι μόνο ένας παράγοντας επιβίωσης για τα επιθηλιακά κύτταρα, αλλά μπορεί επίσης να διατηρήσει τη νεφρική επιθηλιακή φαινότυπο μέσω της οδού γc σηματοδότησης, αποδεικνύοντας ότι η κυτοκίνη διαθέτουν ένα ευρύ φάσμα δράσης σε επιθηλιακά ομοιόσταση. Αντίθετα, σε RCC

in vitro

και

in vivo

μελέτες αποκαλύπτουν ένα ελάττωμα στην έκφραση των γο-υποδοχέα και συνδέεται JAK3 κινάσης, η οποία σε μεγάλο βαθμό τις επιπτώσεις της IL-15 σηματοδότηση. Πράγματι, σε περίπτωση απουσίας του γο /ζευγάρι JAK3 επιδεικνύουμε τη συναρμολόγηση μια άνευ προηγουμένου λειτουργικών υψηλής συγγένειας IL-15Rαβ ετεροδιμερές, ότι σε απάντηση σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις της IL-15, πυροδοτεί μια ανισόρροπη σήμα που προκαλεί την προς τα κάτω ρύθμιση του ογκοκατασταλτικό γονίδιο E-cadherin, που ευνοεί τη διαδικασία RCC EMT. Είναι αξιοσημείωτο ότι η διάσωση του IL-15 /γc εξαρτώμενη σηματοδότηση (STAT5), με συν-επιμόλυνση γc και JAK3 σε RCC, αναστέλλει EMT αναστροφής. Συμπερασματικά, τα δεδομένα αυτά υπογραμμίζουν τον κεντρικό ρόλο της IL-15 και γο-υποδοχέα σηματοδότησης σε νεφρική ομοιόσταση μέσω του ελέγχου της έκφρασης Ε-καδερίνης και διατήρηση των επιθηλιακών φαινοτύπου τόσο στην RPTEC (up-ρύθμιση) και RCC (κάτω ρύθμιση).

Παράθεση: Giron-Michel J, Azzi S, Khawam Κ, Mortier Ε, Caignard Α, Devocelle A, et al. (2012) Η ιντερλευκίνη-15 παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην ανθρώπινη Νεφρού Φυσιολογίας και του καρκίνου μέσω του γο μονοπάτι σηματοδότησης. PLoS ONE 7 (2): e31624. doi: 10.1371 /journal.pone.0031624

Επιμέλεια: Eliane F. Meurs, Institut Pasteur, Γαλλία

Ελήφθη: 15 του Απρίλη του 2011? Αποδεκτές: 16 Γενάρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 21 Φεβρουαρίου 2012 |

Copyright: © 2012 Giron-Michel et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Agence Française de Βιοϊατρική, ARC (Association pour la Recherche sur le Cancer) (Αρ RAC11005LLA), Inca, NRB-Vaincre Καρκίνος le, AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) IG έργου 5642 και ιταλικό υπουργείο Υγείας. Α.Ε. ήταν αποδέκτης της ARC και NRB-Vaincre Καρκίνος le διδακτορικές υποτροφίες. Κ.Κ. Ήταν ένας παραλήπτης των διδακτορικών υποτροφιών από την Société Française de Néphrologie, ARC και NRB-Vaincre Καρκίνος le. Μ.Ο. Ήταν ένας παραλήπτης μιας υποτροφίας από το Fondazione Italiana per la Lotta al νευροβλάστωμα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η ιντερλευκίνη-15 (IL-15) είναι μία πλειοτροπική κυτοκίνη που εμπλέκονται στην έμφυτη ανοσία, καθώς και σε καθήκοντα εκτός του ανοσοποιητικού συστήματος. IL-15 λειτουργική ποικιλομορφία εξηγείται εν μέρει από σύνθετους μηχανισμούς δράσης της [1], [2] που περιλαμβάνει όχι μόνο διαλυτά και μεμβράνης μορφές της κυτοκίνης, αλλά επίσης διαφορετικά IL-15 υποδοχείς (IL-15R) με συγκεκριμένες χημικές συγγένειες και μεταγωγής σήματος πορείες [3], [4]. Πράγματι, η IL-15 συνδέεται με το IL-15Ra ιδιωτική αλυσίδα με υψηλή συγγένεια (Kd≥10

-11 Μ), οι οποίες παρέχουν μια ειδική σηματοδότηση σε απόκριση στην IL-15 (ΝΡ-κΒ, Syk). IL-15 μοιράζεται με IL-2, το IL-2Rβ (CD122) και IL-2Rγ (CD132, γc) υπομονάδες, οι οποίες σχηματίζουν είτε ένα λειτουργικό υποδοχέα υψηλής (IL-15Rαβγ, Kd≥10

-11 Μ) ή ενδιάμεση συγγένεια (IL-15Rβγ, Kd = 4 nM) για την IL-15, επιτρέποντας τη σηματοδότηση μέσω ενός καταρράκτη που περιλαμβάνει την JAK /STAT, ΜΑΡΚ και μονοπάτια μεταγωγής ΡΙ3-Κ.

Η κοινή αλυσίδα υποδοχέα γο είναι ένα βασικό συστατικό της οικογένειας τεσσάρων ελίκων-πακέτο κυτοκίνες, επιτρέποντας μέσω της σύνδεσής της με την Janus κινάση της τυροσίνης 3 (ΙΑΚ3), την ενεργοποίηση των μορίων STAT (Signal Ανιχνευτές και ενεργοποιητές μεταγραφής) [5]. JAK3 φωσφορυλιώνει διαφορετικά κατάντη STATs, σε σχέση με τον τύπο του συμπλόκου υποδοχέα που εμπλέκονται. Έτσι, η IL-4 σηματοδοτεί κυρίως μέσω STAT-6, ενώ η IL-2, IL-7, IL-9 και IL-21 πράξη μέσω STAT-1 και STAT-3 και IL-15 κυρίως ενεργοποιεί STAT-5 [6], [7], [8]. Τόσο η γc και ΙΑΚ3 είναι ουσιώδη για τη λειτουργία όλων των υποδοχέων κυτοκίνης αυτής της οικογένειας και είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη του συστήματος λεμφοειδές κύτταρο. Πράγματι, τα γενετικά ελαττώματα ή γc JAK3 αποτέλεσμα μια σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID), που χαρακτηρίζεται από την έλλειψη Τ, Β και ΝΚ κυττάρων τόσο στα ποντίκια όσο και σε ανθρώπους [9], [10], [11]. Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι σε ασθενείς με SCID, η διορθωτική γονιδιακή θεραπεία για γο μπορεί να λειτουργήσει ως συμβολή στην γένεση των κυττάρων λεμφωμάτων [9], [11]. Η αλυσίδα IL-2Rγ εκφράζεται επίσης σε μη λεμφοειδή κύτταρα και ανιχνεύεται για παράδειγμα σε ορισμένα καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων [12], [13], [14], όπου η ποσότητα του γc εμπλέκεται στους μηχανισμούς που διέπουν την ανάπτυξη των κυττάρων. IL-2Rγ βρίσκεται επίσης σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα όπου διαμορφώνει τη μεταγωγή σημάτων των διαφόρων μελών της οικογένειας γc ακόμη και αν συγκεκριμένες βιολογικές λειτουργίες του δεν έχουν ακόμα σαφώς καθορισμένη [13], [15], [16].

Τα ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα διαφόρων ιστών παράγουν IL-15, το οποίο δρα όχι μόνο στα κύτταρα του ανοσοποιητικού (π.χ., IELs στο έντερο), αλλά και σε επιθηλιακά κύτταρα, κυρίως μέσω αντι-αποπτωτική δράση της [17], [18] [19], [20]. Ετσι, δείχθηκε ότι η ανθρώπινη και σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα ποντικού νεφρού (RPTEC) ιδιοσυστατικά εκφράζουν τον υποδοχέα IL-15Rαβγ [15] και εκκρίνουν την κυτοκίνη IL-15 [21], η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη νεφρική φυσιολογία ως αυτοκρινής παράγοντας επιβίωσης . Πράγματι, η αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων στην απόπτωση παρατηρείται στο κατεστραμμένο νεφρό του IL-15 – /-, IL-15Ra – /- knockout ποντικούς ή κατά τη διάρκεια της οξείας νεφρικής βλάβης που προκαλείται από τα διαφορετικά πρωτόκολλα που επάγουν μια μείωση στην IL-15 παραγωγή από επιθηλιακά κύτταρα [20], [22]. IL-15 ενισχύει τη λειτουργία του εντερικού φραγμού, με την προώθηση του σχηματισμού σφικτές ενώσεις μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων [23]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο παράγοντας επιβίωσης IL-15 μπορεί να έχει και άλλες λειτουργίες, που μένει να διερευνηθεί σε επιθηλιακά κύτταρα νεφρού [15], [24], [25], [26].

Λόγω της ανοσο της διεγερτική δράση σε πολλά προκλινικά μοντέλα, η χρήση της IL-15 θα μπορούσε να είναι ένα χρήσιμο κυτοκίνη για τη θεραπεία καρκίνων του νεφρού. Παρά το γεγονός ότι η IL-15 αυτή τη στιγμή δοκιμάζεται σε κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία του καρκίνου του νεφρού (NCT01021059 Protocol) [2], οι λειτουργίες της κυτοκίνης σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα καθώς επίσης κύτταρα όγκου παραμένουν ελάχιστα μελετηθεί. Για να κατανοήσουμε καλύτερα τις λειτουργίες της κυτοκίνης, προτείνουμε να μελετήσει το σύστημα IL-15 /IL15R για τα ανθρώπινα νεφρικά κύτταρα του επιθηλίου της κανονικής προέλευσης (RPTEC) και σε κύτταρα προέλευσης όγκου (RCC).

μας τα δεδομένα δείχνουν ότι και οι δύο

in vitro και in vivo

πρωτογενή φυσιολογική νεφρική εγγύς σωληνοειδή κύτταρα (RPTEC) εκφράζουν τον υποδοχέα IL-15Rαβγ, ενώ η έκφραση της αλυσίδας γc και ΙΑΚ3 είναι σοβαρά εξασθενημένη σε ασθενείς με νεφρική σαφή καρκινικά κύτταρα (RCC) . Η διαφορική έκφραση των γc αλυσίδας και JAK3 έχει μία σημαντική επίδραση στη νεφρική ομοιόσταση αφού διαλυτός IL-15 σε RPTEC μέσω της οδού γc σηματοδότησης αλυσίδα διατηρεί την έκφραση του καταστολέα όγκων γονίδιο Ε-καδερίνης, αναστέλλοντας επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) δέσμευσή τους . Αντιθέτως, η απώλεια της αλυσίδας γc και JAK3 σε πρωτογενείς RCC οδηγεί στο σχηματισμό ενός άνευ προηγουμένου λειτουργικής ετεροδιμερούς υψηλής συγγένειας IL-15Rαβ, του οποίου η διέγερση με διαλυτό IL-15 προκαλεί την προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης ευνοώντας την διαδικασία EMT .

Υλικά και Μέθοδοι

αντισώματα, κυτοκίνες, και Αντιδραστήρια

Αντισώματα (Abs) έναντι IL-15 (L-20), IL-15Ra (sc-9172) , IL-2Rβ (sc-1046), IL-2Rγ (sc-670), JAK3 (sc-513), και βιμεντίνη (SC-73260) ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Delaware, CA). Αντισώματα έναντι φωσφορυλιωμένης ΕΚΚ (4377), φωσφορυλιωμένο ΙκΒ (4921), STAT5 (9358) φωσφορυλιωμένου STAT5 (9356), και το φθόριο-συζευγμένο μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού Alexa έναντι φωσφορυλιωμένης STAT5 (3939) ελήφθησαν από την Cell Signaling (Beverly, ΜΑ). Αντισώματα κατά της IL-15Ra (AF247), Ε-καδερίνης (AF648) και ΡΕ-συζευγμένα αντι-Ε-καδερίνης (FAB18381P) ελήφθησαν από R &? D Systems Europe Ltd (Abingdon, Οχοη, UK), καθώς επίσης και εξουδετερωτικά αντι- IL-2Rγ (mAb2842) mAb. Το συζευγμένο με FITC αντι-ινοβλαστών ASO2 ήταν από

Dianova

GmbH (Αμβούργο, Γερμανία) και το παν-κυτοκερατίνης (CK) Ab από EXBIO (Πράγα, Τσεχική Δημοκρατία). Ροδαμίνη-συζευγμένο φαλλοειδίνη για F-ακτίνη ανίχνευση και zonula Οοοίιιάεηδ-1 (ΖΟ-1) ελήφθησαν από την Invitrogen (Cergy Pontoise, France). Αντίσωμα έναντι JAK3 (07-1488) ήταν από την Millipore (Saint-Quentin-en-Yvelines, Γαλλία) και αντι-IL-2Rβ (AB364) ήταν από την Δοκιμασία Biotech (Καινοτομίες Interchim BioScience, Γαλλία). Το αντι-β-ακτίνης mAb (A1978) ήταν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη μη γλυκοσυλιωμένη IL-15 (rhIL-15) και εξουδετερωτικών αντι-IL-2Rβ Mikβ1 mAb ελήφθησαν από Immunotools (Friesoythe, Γερμανία) και υπεροξειδάση χράνου (HRP) και φθορίζον-συζευγμένο δευτερεύον Abs ήταν από Jackson ImmunoResearch. αναστολέα JAK3 (CP-690, 550) και ο αναστολέας STAT5 (573108) αγοράστηκαν από την Calbiochem (SD, CA). Αντι-IL-15Ra M161 mAb παρεσχέθη από την Amgen (Thousand Oaks, CA).

Πρωτογενή κύτταρα και κυτταρικές σειρές

Πρωτοβάθμια ανθρώπινη φυσιολογική νεφρική εγγύς σωληναρίου επιθηλιακών κυττάρων (RPTEC) που προέρχεται από ένα μη -cancerous νεφρών (Lonza, Verviers, Βέλγιο) και επεκτάθηκε

in vitro

ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ε.Τ.Γ.Σ. μέσο καλλιέργειας των RPTEC ήταν καθημερινά αλλάξει για να διατηρήσει τα επιθηλιακά χαρακτηριστικά. Πρωτογενή κύτταρα όγκου ελήφθησαν με ενζυματική πέψη των θραυσμάτων νεφρικών καρκινωμάτων σαφής κυττάρων (RCC) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Στη συνέχεια, οι πέψη κυτταρικά εναιωρήματα σπάρθηκαν πάνω σε πλαστικά τρυβλία Petri με τη χρήση RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 1% πυροσταφυλικό ΜΕΜ νάτριο, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Life Technologies). Σε αυτές τις συνθήκες καλλιέργειας, μόνο ένα κλάσμα των κυττάρων προσκολλάται στην πλαστική επιφάνεια και πολλαπλασιάζονται, δημιουργώντας RCC πρωτογενείς καλλιέργειες και στη συνέχεια κυτταρικές γραμμές (RCC5, RCC7, RCC8).

Το νεφρό ανθρώπινου καρκινώματος ACHN (ATCC, CRL- 1611), MCF-7 (ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού) και υ937 (ανθρώπινα μονοκυτταρικά κύτταρα λευχαιμίας) κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Η ερυθρολευχαιμίας κυτταρική γραμμή TF1β διατηρήθηκε σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 5 ng /ml GM-CSF και /ml γενετικίνης G418 250 μg. Λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBL) παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [28]. Ανθρώπινα δείγματα συλλέχθηκαν και διεκπεραιώνονται με τον πλήρη σεβασμό της δήλωσης του Ελσίνκι.

Αντίστροφη μεταγραφή (RT) -PCR ανάλυση.

Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) -PCR ανάλυση πραγματοποιήθηκε ως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Οι ειδικοί εκκινητές RT-PCR που περιγράφεται λεπτομερώς παρακάτω

IL-15Ra F 5′-GGCGACGCGGGGCATCAC.? R 5′-TGCCTGTGGCCCTGTGGATA? IL-2Rβ F 5′-GAATTCCCTGGAGAGATGGCCACGGTCCCA? R 5′-GAATTCGAGGTTTG GAAATGGATGGACCAAGT? γο αλυσίδα F 5′-CCAGGACCCACGGGAACCCA? R 5′-GG TGGGAATTCGGGGCATCG? JAK3 F 5′-CGTTCATGCAGCCTCTTGTTC? R 5′-GCGCA CCGTCCTCCGAATAC? β-ακτίνης F 5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA? R 5′-CTCCTTA ATGTCACGCACGATTTC.

IL-15 δοκιμασίες σύνδεσης

ανθρώπινη IL-15 ραδιοσημάνθηκε με ιώδιο (ειδική ραδιενέργεια περίπου 2000 cpm /fmol) χρησιμοποιώντας μια μέθοδο χλωραμίνης-Τ και πειράματα δέσμευσης διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Η μη ειδική δέσμευση προσδιορίστηκε με την παρουσία 100-πλάσια περίσσεια μη επισημασμένου κυτοκίνης. Για τα πειράματα πρόσδεσης IL-15, τα κύτταρα RCC7 επωάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις επισημασμένου rIL-15. Η ανάλυση παλινδρόμησης των δεδομένων δέσμευσης επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας συνδέσεως ισορροπίας μίας θέσεως εξίσωση (Grafit, Erithacus Software, Staines, UK), και τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς στο σύστημα συντεταγμένων Scatchard. Για την αναστολή της IL-15 πειράματα σύνδεσης, τα κύτταρα RCC7 επωάστηκαν, παρουσία αυξημένων συγκεντρώσεων ιωδιωμένης rIL-15, και σταθερές συγκεντρώσεις εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι IL-2Rβ (Mikβ1, 10 μg /ml) ή IL-2Rγ (mAB2842 , 1 μg /ml) αλυσίδες. Η ανάλυση παλινδρόμησης των δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα 4-παραμέτρων λογιστική εξίσωση (Grafit, Erithacus Software).

Πλασμίδια και παροδική επιμόλυνση

pCMV6 φορέα που κωδικοποιεί πλήρους μήκους cDNA Μγο-DDK-tagged ORF του ανθρώπινης γάμμα υποδοχέα της ιντερλευκίνης 2 (IL2Rγ) αγοράστηκε από ΟηΟεηε Technologies Inc (Rockville, MD, USA) και πλήρους μήκους ανθρώπινου cDNA JAK3 υποκλωνοποιήθηκε μεταξύ των θέσεων περιορισμού EcoRI-XhoI του

pcDNA3.1

ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Φρανκ Gesbert (UMR1004, Inserm, Γαλλία). Τα πλασμίδια μετασχηματίζονται σε αρμόδια Top 10 βακτήρια κύτταρα σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen, Carlsbad, CA), εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας ένα κιτ Maxiprep (Qiagen, Valencia, CA), και ενισχύθηκαν με καλλιέργεια σε Luria-Bertani-αμπικιλλίνης ζωμό. cDNAs επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων (0,25 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα σε πλήρες μέσο. Η παροδική μίγμα, το οποίο περιείχε 1,0 μg DNA πλασμιδίου και 6 μΙ Fugene 6 αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ) σε 100 μΐ μέσου DMEM άνευ ορού (Invitrogen), αναμίχθηκε επί 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο με πλήρες μέσο για 48 ώρες. Το κενό

pcDNA3.1

φορέας επιμολυσμένα ως έλεγχος.

κυτταρομετρίας ροής Αναλύσεις

Για όλες τις δοκιμασίες που περιγράφονται παρακάτω, έχουμε αποκτήσει δεδομένα φθορισμού για 10.000 κύτταρα σε ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (BD Biosciences) και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CellQuest (BD Biosciences). Τρεις επαναλήψεις χρησιμοποιήθηκαν για κάθε κατάσταση και το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

έκφραση κυτταρικών αντιγόνων.

Η έκφραση της κυτταρικής επιφάνειας (Ε-καδερίνης) και ενδοκυτταρική (βιμεντίνης, Πανευρω- CK) αντιγόνα αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29], [31], [32]. Εν συντομία, εναιωρήματα ενζυματικά αποκολλημένα κύτταρα διαπερατά ή όχι με το αντιδραστήριο BD Cytofix /Cytoperm (BD Pharmingen, Le Pont De Claix, Γαλλία), και 10

5 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 1% FCS και χρωματίστηκαν με συζευγμένα αντισώματα που κατευθύνονται κατά των προαναφερθέντων δεικτών κυττάρου. Ακολούθως, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με επώαση με 1% παραφορμαλδεϋδη σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

STAT5 ενεργοποίησης.

Ερευνήσαμε ενεργοποίηση STAT5 σε RCCWT (RCC άγριου τύπου) και IL-2Rγ και /ή ΙΑΚ3 επιμολυσμένα RCC με κατεργασία κυττάρων με 10 pg /mL του rhIL-15 κατά την διάρκεια 40 λεπτών. Κατεργασμένα και μη κατεργασμένα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη, πλύθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με επώαση με 1% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα διαπερατά με επαναιώρηση, με στροβιλισμό, σε παγωμένη μεθανόλη και επωάζονται στους 4 ° C για 10 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε 1% BSA σε PBS και επωάστηκαν με Alexa Fluor 488-συζευγμένο μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι φωσφορυλιωμένης STAT5 για 60 λεπτά στους 4 ° C.

Ανοσοκαταβύθιση και ανοσοκηλίδα Αναλύσεις

Όλα ανοσοστύπωμα (WB) διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Για ανοσοκαταβύθιση, PBS-πλυμένο σφαιρίδιο κυττάρου υπέστη λύση σε 1 ml 1% ΝΡ-40 και 0,1% SDS, 50 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου ρΗ 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM AEBSF, απροτινίνη, λευπεπτίνη και πεπστατίνη (5 μg /ml το καθένα). Μετά από 15 λεπτά ανακίνηση στους 4 ° C, το εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε (30 λεπτά στις 14.000 rpm, 4 ° C). Το υπερκείμενο προστέθηκε σε 20 μΐ Sepharose-συζευγμένο-M161 (αντι-IL-15Ra, 2 μg /μΙ). Μετά από 4 ώρες ανάδευση στους 4 ° C, τα ανοσοσύμπλοκα πλύθηκαν 5 φορές με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και εφαρμόστηκε σε ποσοστό 10% PAGE-SDS. Οι κηλίδες υπέστησαν επεξεργασία όπως περιγράφεται προηγουμένως [29].

Η ανοσοκυτταροχημεία

Τα κύτταρα διανεμήθηκαν σε οκτώ φρεατίων διαμερίσματα Lab-Tek πλακίδια θαλάμου καλλιέργειας ιστού (1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο ?. Nunc, Naperville, Ιλλινόις) και κατά συρροή, επεξεργασμένο ή όχι με 10 pg /ml του rhIL-15 για 5 ημέρες. Για τη χρώση της μεμβράνης, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με ψυχρή methanol:acetone (1:01) στους -20 ° C για 10 λεπτά, πλύθηκαν, στη συνέχεια αποκλείστηκαν με PBS 3% BSA για 60 λεπτά. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινο Ε-καδερίνης ή ΡΙΤΟ-συζευγμένα αντισώματα αντι-ASO2 όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Ακολούθως, τα κύτταρα πλύθηκαν, επωάστηκαν για 30 λεπτά με ένα αντίσωμα αντι-κατσίκας συζευγμένο με AlexaFluor488 κουνελιού. Για ενδοκυτταρική χρώση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% (β /ο) παραφορμαλδεΰδη σε PBS και κατέστησαν διαπερατά με επώαση για 1 λεπτό με 0.5% Triton Χ-100 σε PBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν με διάλυμα αποκλεισμού (3% BSA σε PBS) και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα διάφορα αντισώματα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με Alexa Fluor 488 συζευγμένο με κουνελιού αντι-ποντικού ή IgG αντι-κατσίκας αραιωμένο εντός διαλύματος αποκλεισμού και επωάστηκαν για 30 λεπτά. οργάνωση F-ακτίνης αποκαλύφθηκε χρώση των κυττάρων με 0.2 μg /mL του ροδαμίνη-συζευγμένα phalloidin για 20 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, τοποθετούνται σε 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ, Invitrogen, Cergy Pontoise, France), και οπτικοποιήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού (Leica, Germany).

Ανοσοϊστοχημεία επί παραφινώδη ενσωματωμένα νεφρική όγκου και φυσιολογικά δείγματα

οι βιοψίες από 3 κανονικό και 10 τμήματα όγκου από νεφρεκτομή νεφρών με νεφροκυτταρικό καρκίνωμα κόπηκαν σε 4 μm πάνω Superfrost συν διαφάνειες. Αποπαραφινωθείσες πλακίδια επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένες αλκοόλες, και υποβλήθηκε σε θερμο-διεγερμένα ανάκτηση επιτόπου με εμβάπτιση τους σε 0,01 mol /L ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού (ρΗ 6.0). Οι τομές επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με αντι-IL-2Rβ (AB364), αντι-IL-2Rγ (sc-670) ή αντι-ΙΑΚ3 (07-1488) Abs, PBS-ξεπλύθηκαν και επωάστηκαν με ΗΚΡ-δευτερεύον Ab για 45 λεπτά. Η ανάλυση διεξήχθη με πρότυπες μεθόδους χρησιμοποιώντας διαμινοβενζιδίνη μετά αντικηλίδωση των τομών με αιματοξυλίνη. Ο αρνητικός έλεγχος υποβλήθηκε σε όλες τις θεραπείες παραλείποντας πρωτογενές αντίσωμα. Διαφάνειες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή Aperio (Vista, CA) και χρώση ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα λογισμικό μορφομετρικών TRIBVN (Montrouge, Γαλλία).

Αποτελέσματα

IL-15R έκφρασης σε RPTEC και RCC πρωτογενείς καλλιέργειες

για να ρίξει φως σχετικά με τη λειτουργία της IL-15 στην νεφρική ανθρώπινο μοντέλο, μελετήσαμε την έκφραση των υπομονάδων του υποδοχέα IL-15 (IL-15Rαβγ) σε πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικών εγγύς νεφροσωληναριακό επιθηλιακών κυττάρων ( RPTEC) και σαφείς κυττάρων νεφρική καρκινώματα (RCC).

ανάλυση RT-PCR (Εικόνα 1Α, άνω πάνελ) δείχνει ότι RPTEC, σε συμφωνία με τον θετικό μάρτυρα PBL, εκφράζουν διαφορετικές μεταγραφές για την αλυσίδα IL-15Ra ( 432 και 531 bp), η μεταγραφή για την IL-15Rβ (542 bp) και της μεταγραφής για την αλυσίδα γc (480 bp). Σε αντίθεση, μόνο το IL-15Ra και αλυσίδων β, αλλά όχι η αλυσίδα γc, ανιχνεύθηκαν είτε σε RCC (RCC5 και RCC7) ή κυτταρική γραμμή ACHN. Από JAK3 κινάσης αλληλεπιδρά ειδικά με συγγενή αλυσίδα γc του υποδοχέα της, και η έκφραση και των δύο μορίων είναι αλληλοεξαρτώμενα [33], μπορούμε αναλύθηκαν περαιτέρω, με RT-PCR, έκφραση JAK3 σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα νεφρών (Σχήμα 1Α, κάτω πάνελ). JAK3 κινάσης ανιχνεύθηκε στο θετικό αιμοποιητικών κυττάρων ελέγχου γραμμής TF1β και RPTEC, ενώ ένα ασθενές ποσό αγγελιοφόρο ή απούσα (RCC8) ανιχνεύθηκε σε RCC αναλύθηκαν. Δεν JAK3 αγγελιοφόρος ανιχνεύτηκε στο κύτταρο ελέγχου MCF-7 [34].

Ανάλυση του IL-15R και η έκφραση ΙΑΚ3 διεξήχθη με RT-PCR (Α) και ανοσοκηλίδωση (Β) σε πρωτογενείς κανονικό (RPTEC) και όγκων (RCC5, RCC7, RCC8) επιθηλιακά κύτταρα και η κυτταρική γραμμή ACHN. Τα δεδομένα δείχνουν ότι RPTEC εκφράζουν τις τρεις αλυσίδες του IL-15R (αβγ) και ΙΑΚ3 ενώ γc και ΙΑΚ3 πρωτεΐνες δεν ανιχνεύθηκαν σε RCC. Ειδικοί εκκινητές ή Abs κατά της IL-15Ra (AF247), IL-2Rβ (sc-1046), IL-2Rγ (sc-670) και ΙΑΚ3 χρησιμοποιήθηκαν (sc-513). PBL, TF1β, MCF7 και ΙΡΝγ-ενεργοποιημένα κύτταρα U937 χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Καθαριότητας β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Για να επιβεβαιωθεί η διαφορική έκφραση των υπομονάδων υποδοχέα και της κινάσης ΙΑΚ3 στο επίπεδο πρωτεΐνης, ανοσοκηλίδωση διεξήχθη τόσο στα φυσιολογικά όσο και καρκινικών κυττάρων. Η ανάλυση επιβεβαίωσε ότι RPTEC, RCC και κυττάρων TF1β εκφράζουν δύο κύριες ζώνες των 46 και 56 ειδικές kDa για το IL-15Ra (Σχήμα 1Β, άνω φωτογραφία) και μια ζώνη 75 kDa για την αλυσίδα IL-15Rβ (Σχήμα 1Β, μεσαίο πλαίσιο) . Η απουσία της αλυσίδας γc σε RCC επιβεβαιώθηκε δεδομένου ότι η ζώνη 64 kDa ανιχνεύεται αποκλειστικά σε θετικές κυτταρικές γραμμές ελέγχου (TF1β και U937 κατεργασία IFN-γ) και RPTEC (Σχήμα 1Β, μεσαίο πλαίσιο). JAK3 μόριο (116 kDa) ανιχνεύθηκε σε TF1β και κυττάρων RPTEC, ενώ ανοσοστύπωμα δεν ανίχνευσαν την κινάση σε RCC, καθώς επίσης και σε MCF-7 και ΙΡΝ-γ σε επεξεργασία κυτταρικές γραμμές ελέγχου U937, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [34], [35] (Σχήμα 1Β, κάτω πάνελ). Σε όλες τις προαναφερθείσες πειραμάτων, μελετήσαμε επίσης τη νεφρική ATCC-CRL-1611 κυτταρική σειρά (ACHN) ότι η οθόνη IL-15R και ομόλογα έκφραση ΙΑΚ3 με εκείνες που παρατηρήθηκαν στην RCC πρωτογενή δείγματα.

Απώλεια της αλυσίδας γο σε ασθενείς με νεφρική δείγματα ιστών σαφές καρκίνωμα

για να επιβεβαιώσετε

in vitro

δεδομένων μας, IL-2Rβ αλυσίδα, γο αλυσίδα και JAK3 ανοσοϊστοχημικές χρώσεις έγιναν σε κανονικό και όγκου τμήματα της νεφρεκτομή νεφρών με νεφρικών κυττάρων καρκίνωμα. Αιματοξυλίνης χρώση σε τομές παραφίνης τομές ανθρώπινου νεφρού αποκάλυψαν υπό μικροσκοπία φωτός της παρουσίας σπειράματα (Gl) και αρκετά άπω (DT) και εγγύς (Pt) σωληνάρια στα φυσιολογικά δείγματα ιστού (Σχήμα 2). Αντίθετα, αυτές οι δομές του νεφρού δεν είναι πλέον παρόντες στο τμήμα νεφρικό καρκίνωμα, που δείχνει τα καρκινικά κύτταρα με σαφή μορφολογία κυττάρων, που χαρακτηρίζεται από οπτικά σαφές κυτταρόπλασμα και απότομα περιγράφονται κυτταρικής μεμβράνης.

αιματοξυλίνης χρώση βιοψιών από 2 φυσιολογικά δείγματα αποκαλύπτει η παρουσία των κανονικών δομών των νεφρών (σπείραμα (ΓΠ), περιφερική (DT) και εγγύς (Pt) σωληνάρια), ενώ η ανάλυση των δύο διαφορετικών δειγμάτων καρκίνου δείχνει ότι η κανονική αρχιτεκτονική ιστού είναι εντελώς χαμένο και αντικαθίστανται από κύτταρα όγκου με σαφείς κύτταρο μορφολογία, που χαρακτηρίζεται από οπτικά διαυγές κυτταρόπλασμα και απότομα περιγράφονται κυτταρικής μεμβράνης. Λαμβάνοντας υπόψη ότι δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά στην IL-2Rβ μεταξύ φυσιολογικού και όγκων δειγμάτων ιστών, η χρώση IL-2Rγ, εντοπίζεται σε τόσο εγγύς και άπω σωληνάρια σε φυσιολογικά δείγματα ιστού, δεν βρίσκεται στα δείγματα του όγκου. Μια ισχυρή χρώση JAK3 εντοπίζεται σε δύο εγγύς και άπω σωληνοειδούς κύτταρα των φυσιολογικών ιστών, ενώ ένα πολύ αχνό έκφραση πρωτεΐνης ΙΑΚ3 ανιχνεύεται σε δείγματα όγκων. Δύο αντιπροσωπευτικά δείγματα από ένα σύνολο δέκα παρουσιάζονται για κάθε χρώση. Αρνητικός έλεγχος υποβλήθηκε σε όλες τις θεραπείες παραλείποντας πρωτογενές αντίσωμα. Ράβδοι κλίμακας, 50 μm. Η χρώση ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα λογισμικό μορφομετρικά TRIBVN (Montrouge, Γαλλία) και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ιστογράμματα.

Η

Η ανοσοϊστοχημική χρώση για δύο διαφορετικά δείγματα φυσιολογική νεφρική αποκαλύπτει ότι η IL-2Rβ αλυσίδα, γc αλυσίδα και μια ισχυρή έκφραση ΙΑΚ3 ανιχνεύονται σε εγγύς και άπω σωληνοειδούς κύτταρα. Αντίθετα, η ανάλυση των διαφόρων δειγμάτων όγκων αποκάλυψε την απουσία χρώσης γc αλυσίδας (Ρ & lt? 0,01) με ένα πολύ εξασθενημένο έκφρασης πρωτεΐνης ΙΑΚ3 (Ρ & lt? 0,01), ενώ, δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές (Ρ & gt? 0,05) στην έκφραση της IL-2Rβ αλυσίδα παρατηρήθηκαν μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών ιστών, επομένως, επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα που ελήφθησαν

in vitro

σε πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων.

Διαλυτό IL-15 ενεργοποιεί ένα σήμα διαφορικό κελί στο RCC και RPTEC

Για τις γνώσεις μας, το ετεροδιμερές IL-15Rαβ περιγράφηκε μόνο σε IL-2Rγ – /- knockout ποντίκια, που επιδεικνύει ένα αποτελεσματική σύνδεση και ενδοκυττάρωση του ραδιοεπισημασμένου IL-15 [36]. Ωστόσο, οι συγγραφείς δεν διερευνηθεί αν υπάρχει η ετεροδιμερές IL-15Rαβ ως προσχηματισμένο σύμπλεγμα ή σχηματίζεται μετά από την IL-15 δεσμευτικό δημιουργώντας έτσι ένα λειτουργικό ετεροδιμερές.

Για την αξιολόγηση της IL-15 δεσμεύει γο-αρνητικό RCC, αναλύσαμε πρώτα ραδιοεπισημασμένη ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IL-15 (rhIL-15) σύνδεση με κύτταρα RCC7 με ανάλυση διαγράμματος Scatchard (Εικόνα 3Α). Τα δεδομένα αποκαλύπτει την παρουσία μιας μόνο κατηγορίας υποδοχέων υψηλής συγγένειας (Kd = 375 ρΜ, 413 IL-15 θέσεις πρόσδεσης ανά κύτταρο). Ειδικά IL-15 πρόσδεση εντελώς καταργήθηκε από τον αντι-IL-2Rβ mAb Mikβ1 (Σχήμα 3Α, ένθετο), ενώ εξουδετερωτικών αντι-IL-2Rγ mAb δεν είχε καμία επίδραση σε συγκεκριμένες IL-15 δέσμευσης, υποδηλώνοντας ότι η σύνδεση πράγματι αντανακλούσε την παρουσία ενός συμπλόκου IL-15Ra /IL-2Rβ

Α) ανάλυση διάγραμμα Scatchard του:. Επιδράσεις της αντι-IL-15Rβ και γc mAbs επί IL-15 πρόσδεση σε RCC. Για τα πειράματα πρόσδεσης IL-15, τα κύτταρα RCC7 επωάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις με ραδιενεργό ιώδιο rIL-15 σε παρουσία ή όχι των ακόλουθων εξουδετερωτικά mAbs: αντι-IL-2Rβ και IL-2Rγ. Η μη ειδική κυτταρική δέσμευση προσδιορίστηκε με την παρουσία του με ραδιενεργό ιώδιο rhIL-15 και 100-πλάσια περίσσεια μη επισημασμένου rhIL-15. Cell-bound (Β) και μη δεσμευμένο (ελεύθερο, F) κλάσματα μετρήθηκαν, και η ειδική δεσμευμένο κλάσμα υπολογίστηκε με αφαίρεση της μη ειδικής σύνδεσης από το κύτταρο δεσμευμένο κλάσμα. Στην τεταγμένη σχεδιάζεται ο λόγος του ειδικού δεσμευμένου κλάσματος (που εκφράζεται σε θέσεις ανά κύτταρο) επί της συνολικής συγκέντρωσης (δεσμευμένο συν ελεύθερη) ραδιοϊωδιωμένης rIL-15 (που εκφράζεται σε ρΜ). Στο δεσμευμένο κλάσμα τετμημένη (που εκφράζεται σε θέσεις ανά κύτταρο). Η υψηλή συγγένεια ειδική IL-15 δέσμευσης (Kd = 375 ρΜ, 413 IL-15 θέσεις πρόσδεσης ανά κύτταρο), το οποίο ήταν εντελώς καταργηθεί με εξουδετερωτικό αντίσωμα κατά της IL-2Rβ (ένθετο), αλλά όχι την αλυσίδα γc, πρότεινε την παρουσία επί RCC ενός συμπλόκου IL-15Ra /IL-2Rβ. Β) Ανίχνευση συμπλόκου IL-15Rαβ με ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) με αντι-IL-15Ra (M161) ή πρωτεΐνη IgG ποντικού G-Sepharose-συζυγούς στο συνολικό προϊόν λύσης (TL) του RCC7. Ανοσοκαταβυθισμένες σύμπλοκα κηλιδώθηκαν είτε με αντι-IL-2Rβ (sc-1046) και αντι-IL-15Ra (sc-9172). Γ) διέγερση για 10 και 40 λεπτά με φυσιολογική (10 pg /mL) και υπερ-φυσιολογική (10 ng /mL) συγκεντρώσεις rhIL-15 επάγει την φωσφορυλίωση του ΜΑΡΚ ΕΚΚ1 /2 και ΙκΒα σε RPTEC και RCC7, ενώ η ενεργοποίηση STAT5 ήταν παρατηρήθηκαν μόνο σε RPTEC. Ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν σύγκριση πυκνότητας του κάθε παράγοντα ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη σε 3 διαφορετικά RCC (RCC5, RCC7, RCC8) και 3 παρτίδες RPTEC. * P & lt? 0,05 έναντι ελέγχου, δοκιμή Mann-Whitney. αντιπροσωπευτικό Ένα πείραμα από ένα σύνολο τριών δείχνεται.

Η

Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία ενός IL-15Ra /IL-2Rβ συγκρότημα ετεροδιμερές, οι πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αλυσίδων IL-15Ra και IL-2Rβ σε RCC ερευνήθηκαν εκτελούν συν-ανοσοκαταβύθιση πειράματα σε λύματα RCC7 κυττάρου με ανοσοπροσρόφηση με Sepharose-συζευγμένο αντι-IL-15Ra (M161) (Σχήμα 3Β). Αντι-IL-2Rβ ανοσοκηλίδωση αποκαλύπτει την παρουσία μιας ειδικής πρωτεΐνης 75 kDa (άνω πάνελ) ενώ τα αντι-IL-15Ra κηλίδα, που εκτελούνται στην ίδια μεμβράνη, δείχνει την έκφραση συγκεκριμένων ζωνών των 56 και 46 kDa (κάτω πίνακας) που δείχνει ότι υπομονάδες υποδοχέα IL-2Rβ και IL-15Ra είναι ιδιοσυστατικά συνδεδεμένα, σχηματίζοντας ένα ετεροδιμερές IL-15Rαβ απουσία κυτοκίνης.

για να προσδιοριστεί κατά πόσον το σύμπλοκο IL-15Rαβ εκφράζεται επί RCC είναι λειτουργική, ερευνήσαμε ενεργοποίηση του σήματος μεταγωγή σε φυσιολογικά και καρκινικά νεφρικά κύτταρα σε επεξεργασία με φυσιολογικό (10 pg /mL) και υπερ-φυσιολογική (10 ng /mL) συγκεντρώσεις rhIL-15 (Σχήμα 3C). Η διέγερση με rhIL-15 (10-40 min) που επάγεται σε RCC7 η φωσφορυλίωση του ΜΑΡΚ ΕΚΚ1 /2 και στις δύο συγκεντρώσεις, ενώ δεν φωσφορυλίωση STAT5 παρατηρήθηκε ακόμη και με την παρουσία 10 ng /mL rhIL-15 (Σχήμα 3Β, άνω πάνελ ). Αντίθετα, σε RPTEC που εκφράζουν το σύμπλοκο υποδοχέα ετεροτριμερή, η ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ ΕΚΚ1 /2 και STAT5 προκλήθηκε σε απόκριση 10 pg /mL και 10 ng /mL του rhIL-15. Επιπλέον, υπάρχει μια ταχεία φωσφορυλίωση των ΙκΒα, ένα γεγονός κλειδί στην ενεργοποίηση του παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ, σε RPTEC και RCC7 σε απόκριση σε φυσιολογική συγκέντρωση rhIL-15 (Σχήμα 3Β, κάτω πλαίσιο), υποδεικνύοντας ότι η IL-15Rαβ σύμπλοκο δεσμεύει την IL-15 με υψηλή συγγένεια και είναι λειτουργική.

Διαλυτό IL-15 συγκριτικά εκφράσεως Ε-καδερίνης σε επιθηλιακά κύτταρα νεφρικών

Ε-καδερίνης είναι υπεύθυνη για τη διατήρηση των αλληλεπιδράσεων των επιθηλιακών κυττάρων και είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου [37]. Έτσι, ερευνήσαμε την επίδραση του rhIL-15 επί της έκφρασης Ε-καδερίνης και στις δύο RCC7 και RPTEC με ανάλυση ανοσοφθορισμού (Σχήμα 4Α) και ανοσοκηλίδωση (Εικόνα 4Β). Για να αξιολογηθεί η επίδραση του rhIL-15 για την κανονική RPTEC, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο κελί όπου η στέρηση των κορτικοστεροειδών, τα οποία είναι ισχυρά επαγωγείς της Ε-καδερίνης [38], σε συνδυασμό με την απουσία της καθημερινής ανανέωσης μέσου οδηγεί εντός πέντε ημερών στη μείωση του Ε-καδερίνη έκφραση, χωρίς να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων (97%, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ανάλυση ανοσοφθορισμού (Σχήμα 4Α) δείχνει ότι φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα RPTEC στα πρώτα περάσματα (Ρ2) εμφανίζει μια επιθηλιακή μορφολογία παρόμοια χαρακτηρίζεται από ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης μεμβράνης Ε-καδερίνης (βασική D0) σε αντίθεση με πέντε ημερών RPTEC (βασικοκυτταρικό d5 ) που εμφανίζουν χαμηλή έκφραση Ε-καδερίνης σε απουσία της καθημερινής ανανέωσης μέσου. Η προσθήκη 10 pg /mL του rhIL-15 επί πέντε ημέρας διατηρεί το αρχικό επίπεδο Ε-καδερίνης και κατά συνέπεια ένα επιθηλιακό-όπως μορφολογία. Σε αντίθεση με RPTEC, RCC7 την ημέρα 0 και την ημέρα 5 οθόνη ένα ασθενές έκφραση Ε-καδερίνης, η οποία εξαφανίζεται μετά από 5 ημέρες rhIL-15 αγωγή (Σχήμα 4Α). Ανάλυση ανοσοκηλίδωσης (Σχήμα 4Β) δείχνει σαφώς το αντίθετο αποτέλεσμα των rhIL-15 για την έκφραση της ώριμης μορφής 120 kDa Ε-καδερίνης σε RPTEC έναντι RCC (ημέρα 5).

ανάλυση ανοσοφθορισμού (Α) και ανοσοκηλίδος ( Β) δείχνουν ότι 5 ημέρες rhIL-15 (10 pg /mL) διατηρεί μεμβράνη έκφραση Ε-καδερίνης σε πρωτογενή φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα RPTEC, ενώ προκαλεί ρύθμιση προς τα κάτω της στην RCC7. Το μέσο καλλιέργειας των RPTEC δεν άλλαξε με σκοπό να προκαλέσει την μείωση της έκφρασης Ε-καδερίνης. Η θεραπεία με rhIL-15 ανανεώθηκε την ημέρα 3. ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν σύγκριση πυκνομετρία ανοσοκηλίδων Ε-καδερίνης ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνης σε 3 διαφορετικά RCC (RCC5, RCC7, RCC8) κύτταρα και 3 παρτίδες RPTEC.