Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ύπαρξη καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με μάζα του όγκου πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για επανεμφάνιση του όγκου, λόγω των εγγενών και εξωγενών χαρακτηριστικά φαρμακευτικής αντίστασης τους. Ως εκ τούτου, στοχευμένη θανάτωση ΚΕΠ θα είναι μια νεότερη στρατηγική για την πρόληψη της υποτροπής και /ή θεραπεία όγκων υπερνικώντας φαρμακευτικής αντίστασης. Έχουμε αναπτύξει μια νέα συνθετική ένωση-CDF, η οποία έδειξε μεγαλύτερη βιοδιαθεσιμότητα σε ζωικούς ιστούς, όπως το πάγκρεας, και επίσης επάγεται αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και της απόπτωσης, η οποία διαμεσολαβείται από απενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ, COX-2, και VEGF στον καρκίνο του παγκρέατος ( PC) κύτταρα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

στην παρούσα μελέτη δείξαμε, για πρώτη φορά, ότι CDF θα μπορούσε να αναστέλλουν σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας (pancreatospheres) των κυττάρων PC συνεπής με αυξημένη αποσύνθεση του pancreatospheres, η οποία συνδέθηκε με εξασθένηση των δεικτών CSC (CD44 και EpCAM), ειδικά σε (MIAPaCa-2) κύτταρα PC γεμσιταβίνης, που περιέχουν υψηλή αναλογία ΚΕΠ συνεπής με αυξημένη miR-21 και μειωμένη miR-200. Σε ένα μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος ανθρώπινου PC, θεραπεία CDF ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου, η οποία σχετίζεται με μειωμένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ DNA δεσμευτική, COX-2, και miR-21 έκφραση, και την αύξηση της ΡΤΕΝ και miR-200 έκφρασης σε κατάλοιπα όγκου.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι η δράση κατά των όγκων του CDF συνδέεται με την αναστολή της λειτουργίας των ΚΕΠ μέσω ρύθμισης προς τα κάτω της CSC που σχετίζονται με μονοπάτια σηματοδότησης. Ως εκ τούτου, CDF θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για την πρόληψη της υποτροπής ή /και τη θεραπεία των PC όγκου με καλύτερη έκβαση της θεραπείας στο μέλλον

Παράθεση:. Bao Β, Ali S, D Κονγκ, Sarkar SH, Wang Ζ, Banerjee S, et al. (2011) Αντι-όγκου δραστηριότητα μίας νέας ένωσης-CDF διαμεσολαβείται από ρύθμιση miR-21, miR-200, και PTEN σε καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (3): e17850. doi: 10.1371 /journal.pone.0017850

Επιμέλεια: Λιν Ζανγκ, University of Pennsylvania, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 του Δεκεμβρίου του 2010? Αποδεκτές: 10η Φεβρουαρίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 9 Μαρτίου, 2011

Copyright: © 2011 Bao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. National Cancer Ινστιτούτο, επιχορηγήσεις NIH 5R01CA131151, 3R01CA131151-02S1 και 5R01CA132794 (FH Sarkar). Ευχαριστούμε Puschelberg και Guido θεμέλια για τη γενναιόδωρη οικονομική συνεισφορά τους. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος (PC) είναι μια από τις πιο θανατηφόρες κακοήθη νοσήματα με χειρότερη πρόγνωση, η οποία κατατάσσεται ως η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Κατά τις δύο τελευταίες δεκαετίες, έχουν πολλές προσπάθειες έχουν γίνει για τη βελτίωση των ασθενών θεραπεία και την επιβίωση PC, αλλά το αποτέλεσμα ήταν απογοητευτικό. Αυτό απογοητευτικό αποτέλεσμα οφείλεται σε πολλούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων

de novo

αντίστασης (εγγενείς) και επίκτητη (εξωγενής) αντίσταση σε συμβατικά θεραπευτικά (χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία), συμπεριλαμβανομένων γεμσιταβίνη μόνο του ή σε συνδυασμό, με άλλα κυτταροτοξικά ή παράγοντες στόχους . Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι η αντίσταση θα μπορούσε στην πραγματικότητα να οφείλεται στην ύπαρξη εμπλουτισμένο των καρκινικών κυττάρων για την έναρξη, ταξινομούνται επίσης ως καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (CSC) σε μία μάζα όγκου [2] – [6]. Τα ΚΕΠ έχουν την ικανότητα της αυτο-ανανέωσης και τη δυνατότητα να αναγεννηθούν σε όλους τους τύπους των διαφοροποιημένων κυττάρων που δημιουργούν ετερογενείς πληθυσμούς κυττάρου όγκου σε έναν μάζας του όγκου, η οποία συμβάλλει στην επιθετικότητα του όγκου [2] – [6]. Έτσι, η αποτυχία να εξαλειφθούν αυτά τα ειδικά κύτταρα θεωρείται ότι είναι μία από τις βασικές αιτίες της κακής έκβασης της θεραπείας με συμβατικά θεραπευτικά μέσα, γεγονός που υποδηλώνει ότι πρέπει να αναπτυχθούν νεότερα και νέων θεραπευτικών στρατηγικών για τη στοχευμένη δολοφονία των ανθεκτικών στα φάρμακα ΚΕΠ προκειμένου να εξαλειφθεί ο κίνδυνος επανεμφάνισης του όγκου για τη βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με PC.

σε αναζήτηση νέων ακόμη μη-τοξικών παραγόντων, η προσοχή έχει επικεντρωθεί στην φυσική παράγοντες για αρκετά χρόνια. Ένας τέτοιος παράγοντας είναι η κουρκουμίνη (diferuloylmethane), το οποίο προέρχεται από το φυτό Curcuma longa (Linn) καλλιεργείται σε τροπικές Νοτιοανατολική Ασία [7] – [9]. Η κουρκουμίνη έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν την ανάπτυξη μιας ποικιλίας κυττάρων όγκου? Ωστόσο, η κακή βιοδιαθεσιμότητα της κουρκουμίνης περιορίζει την εφαρμογή της στην κλινική. Πρόσφατα, έχουμε αναπτύξει ένα νέο συνθετικό ανάλογο της κουρκουμίνης, 3,4-διφθορο-βενζο-κουρκουμίνη [εμείς ονομάσαμε ως διφθοριώνεται-κουρκουμίνη ή σε σύντομο CDF [10], [11]], η οποία έδειξε μεγαλύτερη βιοδιαθεσιμότητα σε παγκρεατικά ιστούς, και επίσης ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων, το DNA-δεσμευτική δραστικότητα του ΝΡ-κΒ, Akt, COX-2, και η παραγωγή της PGE

2 και VEGF, και προκάλεσε επαγωγή miR-200 και αδρανοποίηση του miR-21 σε κύτταρα PC [ ,,,0],12]. Από miR-200 συνδέεται με την απόκτηση των επιθηλιακών να μεσεγχυματικών μετάβαση (ΕΜΤ), η οποία επίσης πιστεύεται ότι σχετίζεται με ΚΕΠ ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα όμοια, εδώ ερευνήσαμε την επίδραση του CDF επί της λειτουργίας CSC.

Εδώ αναφέρουμε για πρώτη φορά, ότι CDF μπορούσαν να αδρανοποιήσουν πολλές λειτουργίες του ΚΕΠ συμπεριλαμβανομένου του δυναμικού αυτοανανέωσης όπως αποδεικνύεται από την αναστολή της σφαίρας σχηματίζουν (pancreatospheres) ικανότητα των κυττάρων PC ανθεκτικών στα φάρμακα, η οποία ήταν σύμφωνη με αδρανοποίηση της CSC βιοδείκτες, όπως CD44 και EpCAM. Δείξαμε επίσης αντικαρκινική δραστικότητα του CDF μόνο και σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη, η οποία ήταν σύμφωνη με αδρανοποίηση του miR-21, και κατά συνέπεια αυξημένη έκφραση του ΡΤΕΝ, η εξασθένηση της δραστηριότητας πρόσδεσης DNA της αναστολής ΝΡ-κΒ στην έκφραση της COX -2, και ενεργοποίηση στην έκφραση του miR-200 σε υπολείμματα του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού ανθρώπινο PC, όλα εκ των οποίων παρέχουν πειστικά

in vivo

δραστικότητα του CDF η οποία είναι σύμφωνη με το

in vitro

ευρήματα.

Αποτελέσματα

ASPC-1 και MIAPaCa-2 κυτταρικές σειρές και οι κλώνοι τους επιλέχθηκαν για τη μελέτη αυτή, λόγω του σχετικά ανθεκτική φύση τους. Τα χαρακτηριστικά CSC από αυτές τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας Lin28B και Nanog σημειωτές βλαστοκυττάρων »από RT-PCR, και EpCAM και CD44 με κηλίδα western έδειξε αύξηση στο επίπεδο έκφρασης στις κυτταρικές σειρές PC-GTR σε σύγκριση με γονικές κυτταρικές σειρές τους (Σχήμα 1) . Ως εκ τούτου, επιλέξαμε αυτά για να ελέγξετε την υπόθεση μας ότι CDF είναι πιο αποτελεσματική από ό, τι η κουρκουμίνη, ακόμη και σε ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές και επίσης ανθεκτικοί κλώνοι-GTR τους.

Τα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω από την πρωτεΐνη έκφραση της EpCAM και CD44 ( C).

η

CDF αποτρέπει έντονα ικανότητας κλωνισμού και της εισβολής των κυττάρων PC σε σύγκριση με γεμσιταβίνη και κουρκουμίνη

Έχουμε επιλέξει τη συγκέντρωση των 20 nmol /L γεμσιταβίνης και 4 μmol /L της κουρκουμίνης ή CDF για τη διεξαγωγή κλωνογονική δοκιμασία μετά από προηγούμενη δημοσίευση μας [12]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχε σημαντική μείωση στην κλωνογονικότητας του AsPC-1 και MIAPaCa-2 κύτταρα επεξεργασμένα με κουρκουμίνη και CDF, αλλά όχι με γεμσιταβίνη (Σχήμα 2Α). Ωστόσο, η θεραπεία CDF είχε μια πολύ μεγαλύτερη και σημαντική μείωση του σχηματισμού αποικιών σε σύγκριση με κουρκουμίνη. AsPC-1-GTR και κύτταρα MIAPaCa-2-GTR είχε μια μείωση κατά 80% του κλωνογονικότητας με τη θεραπεία CDF, ενώ, μόνο το 20-30% μείωση του κλωνογονικότητας παρατηρήθηκε με gemcitabine ή θεραπεία κουρκουμίνη (Σχήμα 2Α). Συνολικά, η θεραπεία CDF έδειξαν σημαντική μείωση σε κλωνογονικότητας των ανθρώπινων κυττάρων PC, υποδηλώνοντας την ανωτερότητα του CDF.

φθορισμού των κυττάρων εισέβαλαν αναγνώστηκε χρησιμοποιώντας ULTRA αναγνώστη πολλαπλών λειτουργιών μικροπλάκας (TECAN) σε διέγερση μήκη κύματος /εκπομπής 530 /590 nm. Βασικό επίπεδο της έκφρασης ABCG2 δείχνει σχετικά υψηλότερη έκφραση σε ανθεκτικά στα φάρμακα κυτταρικές σειρές (C).

Η

CDF ή κουρκουμίνη θεραπεία μείωσε τη μετανάστευση των κυττάρων PC και την εισβολή. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 4 μmol /L της κουρκουμίνης είχε ελάχιστη αναστολή της εισβολής ενώ παρόμοια συγκέντρωση CDF έδειξαν σημαντική αναστολή της εισβολής (Σχήμα 2Β). Το βασικό επίπεδο έκφρασης ABCG2 βρέθηκε σε γονικές κυτταρικές σειρές (

de novo

φάρμακο ανθεκτικά κύτταρα)? Ωστόσο, το επίπεδο έκφρασης του ABCG2 αυξήθηκε περαιτέρω σε φάρμακο ανθεκτικά (επίκτητη ανθεκτικών στα φάρμακα) κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2C).

CDF ανέστειλε βιωσιμότητα των ανθρώπινων κυττάρων PC περισσότερο από κουρκουμίνη και gemcitabine όπως αξιολογείται με τη δοκιμασία ΜΤΤ

Αρχικά δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη να εξετάσει την επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων της γεμσιταβίνης (1 έως 50 nmol /L), και η κουρκουμίνη ή CDF (2-6 mmol /L) στην επιβίωση των κυττάρων μετά από 72 ώρες της θεραπείας (τα δεδομένα δεν απεικονίζεται). Στη συνέχεια, 4 μmol /L CDF ή κουρκουμίνη, και 20 nmol /L γεμσιταβίνης χρησιμοποιήθηκαν για την κατεργασία ξεχωριστά καθώς και σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη για 72 ώρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία CDF σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη προκάλεσε μια αξιοσημείωτη μείωση της επιβίωσης των κυττάρων σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με την κουρκουμίνη και gemcitabine θεραπεία συνδυασμού (Σχήμα 3). Επιπλέον, η ανάλυση της θεραπείας συνδυασμού φαρμάκων έδειξαν ότι ο δείκτης συνδυασμού μετά τη θεραπεία με CDF σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη ήταν μικρότερη από 1,00 (Εικόνα 3), γεγονός που υποδηλώνει την συνεργική δράση των CDF συνδυασμού. Αντίθετα, ο δείκτης συνδυασμό με κουρκουμίνη και gemcitabine ήταν περισσότερο από 1.00 (Εικόνα 3), δείχνοντας μη-συνεργική δράση. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι CDF προκάλεσε μια πολύ περισσότερο σημαντική μείωση της επιβίωσης των κυττάρων σε κύτταρα PC, σε σύγκριση με μόνη gemcitabine /κουρκουμίνη ή συνδυασμούς τους σε σύγκριση με CDF και συνδυασμός γεμσιταβίνης.

ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη σε όλα τα τέσσερα κύτταρο γραμμές μετά 72h της θεραπείας με CDF, κουρκουμίνη, ή ο συνδυασμός του με γεμσιταβίνη. Ανεπεξέργαστα έλεγχος έχει ανατεθεί μια τιμή 100%. Η τιμή ρ εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν συγκρίσεις μεταξύ απλού παράγοντα και συνδυασμούς τους με τη χρησιμοποίηση paired t-test. Ο συνδυασμός Δείκτης (CI) & lt? 1 για συνδυασμό CDF και Τζεμσιταμπίνη δείχνει συνέργεια

Η

CDF εντυπωσιακά αυξημένη αποσύνθεση pancreatosphere των κυττάρων PC

Για να εξεταστεί η επίδραση της θεραπείας στη σφαίρα διαμόρφωσης. ικανότητα των κυττάρων PC (pancreatosphere) και αποσύνθεση του pancreatospheres, πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό σφαίρα διασπάσεως για 10 ημέρες για να προκαλέσει τον σχηματισμό pancreatospheres, που ακολουθείται από 5 ημέρες θεραπείας φαρμάκου. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι υπήρξε μια αξιοσημείωτη αύξηση της σφαίρας αποσύνθεση με κουρκουμίνη και θεραπεία CDF, όχι με θεραπεία γεμσιταβίνη (Σχήμα 4). Ωστόσο, η μεγαλύτερη επίδραση στην αποσύνθεση παρατηρήθηκε σε απάντηση στην θεραπεία CDF (Σχήμα 4), για μια ακόμη φορά υποδηλώνοντας ότι CDF είναι πολύ πιο ανώτερη στην αναστολή των λειτουργιών του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν.

Οι τιμές Ρ υπολογίστηκαν από το αντιστοιχισμένο

t

τεστ.

η

CDF ανέστειλε το σχηματισμό pancreatospheres στα κύτταρα PC

για να εξεταστεί η επίδραση των φαρμάκων στην CSC ικανότητα αυτο-ανανέωσης των κυττάρων PC, πραγματοποιήσαμε δοκιμασία σχηματισμού σφαίρας για 1 εβδομάδα και τέσσερις εβδομάδες (Σχήμα 5Α και Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι CDF σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη εξαλειφθεί εντελώς ο σχηματισμός pancreatospheres μετά από τέσσερις εβδομάδες θεραπείας σε σύγκριση με γεμσιταβίνη και ο συνδυασμός κουρκουμίνη σε κύτταρα PC ακόμα και σε γεμσιταβίνης-ανθεκτικά κύτταρα PC, υποδηλώνοντας ότι CDF μπορεί να κάνει τα pancreatospheres πιο ευαίσθητοι στις γεμσιταβίνη από εκείνη της κουρκουμίνης επεξεργασία, και θα μπορούσε να είναι χρήσιμο για στοχευμένη δολοφονία του ΚΕΠ. Η Εικόνα 5C δείχνει την επίδραση της διαφορετικής συγκέντρωσης της γεμσιταβίνης και CDF στις 2

ος πέρασμα του pancreatospheres σε προ-επεξεργασμένα πρωτογενή pancreatospheres κυττάρων AsPC-1. επεξεργασία CDF ανέστειλε αξιοσημείωτα 2

ου πέρασμα του pancreatospheres σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, CDF-προ-επεξεργασμένα κύτταρα εμφάνισαν μια μεγαλύτερη επίδραση από μη-CDF-προ-επεξεργασμένα κύτταρα.

Μια σημαντική μείωση σε pancreatospheres παρατηρήθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με CDF φαίνεται από αστερίσκο

Η

CDF μειωμένη έκφραση CD44 και EpCAM σε pancreatospheres των κυττάρων PC

Εξετάσαμε την επίδραση των φαρμάκων επί CSC βιοδείκτες, CD44 και EpCAM σε pancreatospheres του AsPC-1 και τα κύτταρα AsPC-1-GTR με συνεστιακή μικροσκοπία (σχήμα 6). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το CDF μειωμένη έκφραση CD44 και EpCAM σε pancreatospheres, υποδηλώνοντας το ανασταλτικό αποτέλεσμα επί του σχηματισμού CDF pancreatosphere μπορεί να σχετίζεται με την αναστολή της CD44 και EpCAM έκφραση.

Η έκφραση σε pancreatospheres του AsPC-1 και AsPC- κύτταρα 1-GTR αξιολογήθηκε με ομοεστιακό μικροσκόπιο (μεγέθυνση Χ250).

η

CDF σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη ανέστειλε παγκρέατος ανάπτυξη όγκων in vivo πολύ περισσότερο από ό, τι ο συνδυασμός κουρκουμίνης

Έχουμε χρησιμοποιήσει μια υποδόρια μοντέλο όγκου ξενομοσχεύματος όπου ο όγκος που προκαλείται από κύτταρα MIAPaCa-2 σε CB17-SCID ποντίκια. θεραπεία CDF σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε MIAPaCa-2 όγκους πολύ περισσότερο από ό, τι η κουρκουμίνη και συνδυασμός γεμσιταβίνης (Σχήμα 7Α), καθώς και σε σύγκριση με είτε χωρίς θεραπεία ελέγχους ή αυτά που έλαβαν θεραπεία με ένα μόνο φάρμακο. Τα ποντίκια δεν έδειξε καμία απώλεια βάρους κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας (30 ημέρες), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά θεραπεία δεν είχε σημαντικές αρνητικές επιπτώσεις στα ζώα.

Αντικαρκινική δράση και οι αλλαγές σε βάρος όγκου από κάθε ομάδα ζώων ( ΈΝΑ). Το βέλος δείχνει ημέρα έναρξης της θεραπείας. NF-κΒ DNA δραστηριότητα των καρκινικών ιστών δεσμευτική? και NF-κΒ μελέτη έλεγχος του ανταγωνισμού με μη επισημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο NF-κΒ (Β). Western blots ανάλυση της COX-2, ΡΤΕΝ και β-ακτίνης έκφραση σε κατάλοιπα όγκου (C)? miR-21, miR-200b και miR-200c έκφραση σε απομεινάρια του όγκου, όπως μετράται με πραγματικού χρόνου RT-PCR (D). Οι τιμές Ρ υπολογίστηκαν με την αντιστοίχιση

t

τεστ.

Η

CDF με Γεμσιταβίνη μειώθηκαν σημαντικά NF-κΒ ενεργοποίησης

in vivo

Η

ΝΡ κΒ προσδιορίζεται στο CDF ή κουρκουμίνη, και /ή υπολείμματα του όγκου θεραπεία γεμσιταβίνης προέρχεται από MIAPaCa-2 κυττάρων που επάγεται όγκων όπως φαίνεται παραπάνω. CDF και κουρκουμίνη ως μονοθεραπεία κάτω-ρυθμίζονται ενεργοποίηση του NF-κΒ, ενώ γεμσιταβίνη ενεργοποιηθεί επίπεδο NF-κΒ, η οποία καταργήθηκε σε συνδυασμένη θεραπεία με CDF. Η θεραπεία συνδυασμού του CDF με gemcitabine έδειξαν μια σημαντική μείωση στο επίπεδο του ΝΡ-κΒ σε σύγκριση με την κουρκουμίνη και θεραπεία γεμσιταβίνη (Σχήμα 7Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αδρανοποίηση του ΝΡ-κΒ θα μπορούσε να είναι ένας από τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους CDF προκαλεί αντινεοπλασματική του δραστικότητα έναντι όγκων PC.

CDF επιδράσεις στην έκφραση της πρωτεΐνης

in vivo

Η

Η COX-2, ΡΤΕΝ, και η έκφραση β-ακτίνης προσδιορίζεται δια στυπώματος Western. Μια σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της COX-2 παρατηρήθηκε τόσο στο συνδυασμό, αλλά το αποτέλεσμα ήταν περισσότερο έντονο στην ομάδα συνδυασμού CDF. Η έκφραση του φωσφατάση και ένταση ομόλογο (ΡΤΕΝ), ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο βρέθηκε να μειωθεί σε κύτταρα MIAPaCa-2? Ωστόσο, η έκφραση της ΡΤΕΝ ήταν ρυθμισμένη όταν έλαβαν θεραπεία με CDF (Σχήμα 7C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι CDF είναι πολύ πιο αποτελεσματική από ό, τι η κουρκουμίνη. Δεδομένου ΡΤΕΝ είναι ένας γνωστός στόχος του miR-21, το οποίο έχει αναφερθεί ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε PC [13] – [15], αξιολογήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του miR-21 σε υπολείμματα του όγκου, όπως φαίνεται παρακάτω

Διαμόρφωση στην έκφραση του miR-21 και miR-200 οικογένειας

in vivo

η

Έχουμε καθορίσει τα επίπεδα έκφρασης του miR-21, miR-200b και miR-200c σε MIAPaCa-2 όγκων με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Υπερ-έκφραση του miR-21 παρατηρήθηκε σε MIAPaCa-2 όγκους ενώ βρήκαμε μια σημαντική μείωση στην έκφραση του miR-21 σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με είτε CDF μόνο του ή σε συνδυασμό με CDF και gemcitabine (Σχήμα 7D). Έχουμε περαιτέρω προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης του miRNA-200b και miR-200c σε ιστούς όγκων οι οποίοι είναι γνωστοί ρυθμιστές της ΕΜΤ και βρέθηκε να είναι σημαντικά χαμηλό σε κύτταρα MIAPaCa-2 (Σχήμα 7D). Αντίθετα, βρήκαμε ότι η θεραπεία CDF με ή χωρίς συνδυασμό γεμκιταβίνης έδειξε αυξημένη έκφραση τόσο miR-200b, και miR-200c, αλλά το αποτέλεσμα με κουρκουμίνη ή ο συνδυασμός του ήταν ελάχιστη, υποδηλώνοντας την ανωτερότητα του CDF στην καταστολή της έκφρασης του miR -21, με αποτέλεσμα την επανέκφραση του ΡΤΕΝ, και επανέκφραση του miR-200 το οποίο θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για την αναστροφή της ΕΜΤ φαινοτύπου σε κύτταρα κατεργασμένα με CDF. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του MIAPaCa-2 όγκοι είναι συνεπείς με εμπλουτισμένο πληθυσμό των ΚΕΠ και των χαρακτηριστικών EMT, και αυτά τα ανθεκτικά κύτταρα φάρμακο θα μπορούσε να σκοτωθεί είτε από CDF μόνο του ή σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη.

Pancreatospheres ενισχυμένη ανάπτυξη του όγκου

in vivo

Η

Σύμφωνα με τις παραδοσιακές πειραματικές συνθήκες, που συνήθως ένεση ένα εκατομμύριο κύτταρα για την αξιολόγηση της ανάπτυξης του όγκου? Ωστόσο, για τη διερεύνηση της μεγαλύτερο δυναμικό της ανάπτυξης όγκου από pancreatospheres, ενέθηκε μόνο 5.000 κύτταρα σε ποντικούς ως μελέτη απόδειξη της ιδέας. Το βάρος του όγκου σημαντικά αυξάνεται καθώς οι ημέρες προχωρούσε (Σχήμα 8Α). Το επίπεδο του miR-21 αυξήθηκε μεταξύ όγκων που εμφυτεύονται με ένα εκατομμύριο γονικών κυττάρων σε σύγκριση με pancreatospheres (Σχήμα 8Β). Το ζώο υποβλήθηκε σε ευθανασία μετά από 30 ημέρες, λόγω του φορτίου του όγκου, και τα ακαθάριστα όγκων δείχνονται στο Σχήμα 8C δείχνει μεγαλύτερους όγκους, καθώς και τοπική-περιοχική μετάσταση λεμφαδένα ενώ οι όγκοι που προέρχονται από γονικά κύτταρα δεν έδειξαν καμία μετάσταση σε περίοδο 30 ημερών. Τα καρκινικά κύτταρα προερχόμενα έδειξε σημαντική αναστολή της pancreatospheres όταν έλαβαν θεραπεία με CDF (Σχήμα 8D). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι ΚΕΠ (pancreatospheres) μπορεί να καλλιεργηθεί σε ποντίκια και CDF μπορούσε να είναι χρήσιμη για τη θανάτωση αυτών των ανθεκτικών κυττάρων φάρμακο (Σχήμα. 8).

(Α). 5000 pancreatospheres εμβολιάστηκαν σε ποντίκια χρησιμοποιώντας 1:01 matrigel, προοδευτική ανάπτυξη του όγκου επί περίοδο 30 ημερών. Μέτρια αύξηση στην έκφραση του miR-21 όπως μετράται με πραγματικού χρόνου RT-PCR παρατηρήθηκε σε όγκους που προέρχονται από pancreatospheres σε σύγκριση με τους όγκους που προέρχονται από γονικά κύτταρα με ένεση ένα εκατομμύριο κύτταρα και καρκινικά εκτιμήθηκε κατά την ίδια χρονική περίοδο (Β) . Οι φωτογραφίες που δείχνουν την ανάπτυξη του όγκου, βέλος δείχνει προς όγκο και τον αστερίσκο (*) αναφέρεται σε τοπική-περιοχική μετάσταση στους λεμφαδένες, ενώ δεν βρήκαμε καμία μετάσταση, όταν ένα εκατομμύριο γονικά κύτταρα εγχύθηκαν (C). Τα καρκινικά κύτταρα που συλλέγονται από τους όγκους που προέρχονται από pancreatospheres υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CDF έδειξαν σημαντική αναστολή στον σχηματισμό pancreatospheres (D).

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι μια συνθετικό ανάλογο της κουρκουμίνης, CDF, είναι σημαντικά πιο αποτελεσματική σε σύγκριση με κουρκουμίνη στη θανάτωση κυττάρων γεμσιταβίνης ανθεκτικών καρκίνου του παγκρέατος (PC), που αποτελείται υψηλή αναλογία των κυττάρων με καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με χαρακτηριστικά. Η αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης θα μπορούσε εν μέρει να οφείλεται σε καλύτερη κυτταρική πρόσληψη, τη διατήρηση και μειωμένη μεταβολική αδρανοποίηση των CDF από κύτταρα PC, το οποίο είναι σύμφωνο με τα ευρήματα που δημοσιεύτηκαν μας την κυτταρικά και ζωικά δεδομένα φαρμακοκινητικής [10], [11]. προηγούμενες εκθέσεις μας δείχνουν ότι CDF αναστέλλει ΝΡ-κΒ και δραστικότητα COX-2 σε κύτταρα PC

in vitro

[12]. Εδώ μπορούμε να επιβεβαιώσει αυτές τις παρατηρήσεις

in vivo

χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Έτσι, η θανάτωση των γεμσιταβίνης-ανθεκτικών κυττάρων PC με CDF συνδέεται με απενεργοποίηση της ΝΡ-κΒ και COX-2 μονοπατιού σηματοδότησης το οποίο είναι πολύ σημαντικό επειδή αυτές οι οδοί είναι γνωστό ότι συνεισφέρει στην αντοχή στα φάρμακα των PC κυττάρων σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [16] -. [18]

ΚΕΠ περιλαμβάνει μόνο ένα πολύ μικρό ποσοστό των κυττάρων σε μια μάζα όγκου και διαθέτουν την ικανότητα να αυτο-ανανέωση και οδηγούν σε διαφοροποιημένα κύτταρα του όγκου [3] – [5], [19] . Η θεωρία CSC έχει θεμελιώδη κλινική σημασία ειδικά επειδή CSC έχει ταυτοποιηθεί σε πολλούς κακοήθεις ιστούς όγκων, συμπεριλαμβανομένων καρκίνων του παγκρέατος και θεωρείται ότι είναι ιδιαίτερα ανθεκτικό στη θεραπεία χημειο-ακτινοβολία από διαφοροποιημένα θυγατρικά κύτταρα [3] – [5], [20]? Ωστόσο, ΚΕΠ που απομονώνεται από ανθρώπινους όγκους είναι συνήθως ανεπαρκής για περαιτέρω μηχανιστικές μελέτες. Η ύπαρξη ΚΕΠ παρέχει μια εξήγηση για την κλινική παρατήρηση ότι υποχώρηση όγκου από μόνη της δεν μπορεί να συσχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών [21], λόγω της επανεμφάνισης του όγκου, η οποία οφείλεται εν μέρει στην παρουσία του ΚΕΠ. Ως εκ τούτου, η στόχευση μονοπάτια αυτο-ανανέωση και η δολοφονία του ΚΕΠ θα μπορούσε να παράσχει πιο συγκεκριμένη προσέγγιση για την εξάλειψη των κυττάρων που είναι η βασική αιτία της επανεμφάνισης του όγκου. Μια πιθανή πρόκληση από αυτή την άποψη είναι η ανάπτυξη θεραπειών που επηρεάζουν επιλεκτικά ΚΕΠ ενώ διαφυλάσσει φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα που μπορούν να βασίζονται σε παρόμοιους μηχανισμούς για την αυτο-ανανέωση. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι CDF όχι μόνο αναστέλλουν την κυτταρική ανάπτυξη των κυττάρων PC, αλλά αναστέλλουν επίσης CSC ικανότητα αυτο-ανανέωσης, όπως εκτιμάται από τον σχηματισμό σφαίρας (pancreatospheres) δοκιμασίες. Ως εκ τούτου, CDF θα μπορούσαν να έχουν μεγαλύτερη δυνατότητα να αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου, όπως τεκμηριώνεται από το μοντέλο μας ξενομοσχεύματος ποντικού ανθεκτικών γκεμσιταμπίνης κυττάρων PC, το οποίο φαίνεται να διαμεσολαβείται μέσω της αναστολής της ικανότητας CSC αυτο-ανανέωση.

Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν το ρόλο των microRNA (miRNA) σε πολλές βιολογικές διεργασίες [22] – [25]. Μεταξύ των πολλών miRNAs, miR-21, συνήθως θεωρείται ως ένα ογκογονίδιο, υπερεκφράζεται σε πολλούς συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων του υπολογιστή και έχει αναφερθεί ότι συνδέεται με την εξέλιξη του όγκου, φτωχή επιβίωση και αντοχής φαρμάκου [13], [14], [26 ], [27]. Στην προηγούμενη έκθεσή μας, έχουμε καταδείξει ότι η έκφραση του miR-21 είναι up-ρυθμίζεται με γεμσιταβίνη-ανθεκτικά κύτταρα PC και ότι η έκφραση του μπορεί να είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται από κατεργασία CDF

in vitro

[12]. Η αυξημένη έκφραση του miR-21 είναι γνωστό ότι σχετίζεται με την απενεργοποίηση του ΡΤΕΝ, ένα γονίδιο καταστολής γνωρίζουν όγκου, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης ΡΙ3Κ /Akt /mTOR, που οδηγεί σε επιθετική ανάπτυξη του όγκου [15], [28]. Σε αυτή τη μελέτη, επιβεβαιώθηκε ότι η αγωγή θα μπορούσε CDF έχει σαν αποτέλεσμα την ρύθμιση προς τα κάτω του miR-21, με αποτέλεσμα την ρύθμιση προς τα πάνω του ΡΤΕΝ

in vivo

, υποδηλώνοντας ότι η αντικαρκινική δραστικότητα του CDF συνδέεται με πάνω ρύθμιση του ΡΤΕΝ που προκύπτει από την αδρανοποίηση του miR-21 έκφρασης.

σε αντίθεση με miR-21, miR-200 οικογένεια είναι γνωστή ως ογκοκατασταλτικό και είναι συνήθως ρυθμισμένα προς τα κάτω σε μερικούς όγκους, συμπεριλαμβανομένων PC και η απώλεια της έκφρασης της οικογένειας miR-200 συμβάλλουν στην απόκτηση της EMT φαινότυπο και αντοχή στα φάρμακα. Κάτω ρύθμιση του miR-200 με την τεχνική siRNA έχει αποδειχθεί ότι συνδέεται με EMT φαινότυπο ενώ εκ νέου έκφραση του miR-200 μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την αντιστροφή του φαινοτύπου ΕΜΤ [29], [30]. Στην προηγούμενη δημοσίευση μας [12], αποδείξαμε ότι η θεραπεία CDF θα μπορούσε εκ νέου εκφράζουν miR-200 σε κύτταρα PC. Εδώ δείξαμε για πρώτη φορά, ότι μπορεί να CDF ρυθμίζουν miR-200b και miR-200c σε κατάλοιπα όγκου

in vivo

, συνεπής με σημαντικά μεγαλύτερη αναστολή της ανάπτυξης όγκου στο μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος όταν CDF ήταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η αντικαρκινική δραστικότητα του CDF διαμεσολαβείται μέσω επανέκφραση του miR-200 το οποίο μπορεί ενδεχομένως να έχει ως αποτέλεσμα την αντιστροφή του ΕΜΤ φαινότυπο και θα μπορούσε επίσης να οδηγήσει σε ξεπεράσει την αντίσταση του φαρμάκου σε PC.

Εν κατακλείδι , CDF έδειξαν πολύ πιο έντονη επίδραση ανασταλτική ανάπτυξης, ανέστειλε CSC αυτο-ανανέωση συνεπής με αδρανοποίηση της CSC βιοδείκτες (CD44 και EpCAM) σε κύτταρα PC ειδικά σε γεμσιταβίνη ανθεκτικά PC κυττάρων σε σύγκριση με κουρκουμίνη. Στο μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος ανθρώπινων όγκων PC που επάγεται από κύτταρα MIAPaCa-2, CDF εμφανίζει δραστικότητα κατά του όγκου με τον έλεγχο του COX-2, ΡΤΕΝ, miR-21, miR-200, και NF-κΒ

in vivo

. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι CDF θα μπορούσε να είναι ένας νέος παράγων για την θεραπεία της PC γενικά αλλά γεμσιταβίνης ανθεκτικά PC ιδίως με την εξασθένηση της συμπεριφοράς των ΚΕΠ.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Κάθε ζώο που βρέθηκε ανθυγιεινό ή άρρωστα έγιναν αμέσως ευθανασία. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Πολιτειακού Πανεπιστημίου Γουέιν θεσμική επιτροπή χρηστών Φροντίδα Ζώων (Αριθμός Άδειας: A-03.10.08).

Cell Culture, τα ναρκωτικά και Αντιδραστήρια

Ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές AsPC-1 και MIAPaCa-2 αγοράσθηκαν από την ATCC (Manassas, VA). Αυτές οι δύο κυτταρικές σειρές AsPC-1 και MIAPaCa-2 εκτέθηκαν σε 200 nmol /L γεμσιταβίνης και 5 μmol /L Tarceva (erlotinib) κάθε δεύτερη εβδομάδα για περίπου 6 μήνες για να δημιουργήσει gemcitabine και Tarceva ανθεκτικά (GTR) κυτταρικές γραμμές, με το όνομα ως AsPC-1-GTR και MIAPaCa-2-GTR, αντίστοιχα. Ως αποτέλεσμα, AsPC-1, AsPC-1-GTR, MIAPaCa-2 και MIAPaCa-2-GTR επιλέχθηκαν για αυτή τη μελέτη με βάση την απόκλιση ευαισθησίες τους να gemcitabine. Όλες οι κυτταρικές σειρές έχουν επικυρωθεί (Applied Genomics Technology Center στο Wayne State University) στις 13 Μαρτίου 2009 και αυτές επικυρώνονται κύτταρα καταψύχονται για μετέπειτα χρήση. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για τις δοκιμές ήταν σύντομη διαδοχική επανάληψη προφίλ χρησιμοποιώντας το Σύστημα PowerPlex 16 από την Promega. Η γεμσιταβίνη και η κουρκουμίνη αγοράστηκαν από την Eli Lilly (Indianapolis, ΙΝ) και την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ), αντιστοίχως. CDF συντέθηκε όπως περιγράφεται στην προηγούμενη δημοσίευση μας [10], [11]. Η γεμσιταβίνη διαλύθηκε σε νερό, ενώ CDF και κουρκουμίνη διαλύθηκαν σε DMSO με τελική συγκέντρωση 0.1% DMSO σε μέσο.

Αντισώματα

Αντισώματα έναντι ABCG2, και ΡΤΕΝ αγοράστηκαν από Santa Cruz ( Santa Cruz, CA). Αντίσωμα έναντι της COX-2 και β-ακτίνη αποκτήθηκε από την Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI), και Sigma Chemicals (St. Louis, ΜΟ).

Κλωνογόνος

δοκιμασία

Κλωνογόνος δοκιμασία διεξήχθη να εξετάσει την επίδραση των φαρμάκων επί της κυτταρικής ανάπτυξης σε κύτταρα PC, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. 5 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μια έξι-φρεατίων. Μετά από 72 ώρες έκθεσης σε 20 nmol /L gemcitabine, 4 μmol /L CDF ή κουρκουμίνης, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και 1.000 μονά βιώσιμα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 100-mm τρυβλία Petri. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 10 έως 12 ημέρες στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2/5% O

2/90% N

2 θερμοκοιτίδα. Οι αποικίες βάφτηκαν με 2% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν.

Εισβολή δοκιμασία

Η επεμβατική δραστηριότητα των κυττάρων ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας BD Biocoat Tumor Σύστημα Εισβολή Assay (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, όπως περιγράφεται προηγουμένως [31]. Εν συντομία 5 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν με μέσο χωρίς ορό συμπληρωμένο με κουρκουμίνη ή CDF εντός του άνω θαλάμου και κάτω φρεάτια πληρώθηκαν με πλήρες μέσο στο σύστημα. Ο, φθορισμός διαβάστηκε χρησιμοποιώντας Microplate Reader (TECAN) στα 530/590 nm και φωτογραφήθηκαν.

Η επιβίωση των κυττάρων δοκιμασία

δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη χρησιμοποιώντας AsPC-1, AsPC-1-GTR, MIAPaCa-2 και MIAPaCa-2-GTR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12] μετά από 72 ώρες της θεραπείας. δείκτη συνδυασμού και Ισοβολόγραμμα για θεραπεία συνδυασμού επίσης υπολογίστηκαν και σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο) για να προσδιοριστεί η συνέργεια με βάση τη μέθοδο των Chou και Talalay [32].

Σφαίρα σχηματισμός δοκιμασία /αποσάθρωσης

Ενιαία κυτταρικά εναιωρήματα των κυττάρων απλώθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλής προσκολλημένα τα φρεάτια της πλάκας 6-φρεατίων σε 1000 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο σχηματισμού σφαίρα [33]. Μετά από 7 ημέρες, οι σφαίρες ονομαστεί ως «pancreatospheres» συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και μετρήθηκαν [33]. Για τη δοκιμασία αποσάθρωσης σφαίρα, 1000 κύτταρα /φρεάτιο επωάστηκαν για 10 ημέρες, μετά από 5 ημέρες θεραπείας φαρμάκου, η οποία εξέτασε την επίδραση της θεραπείας φαρμάκου επί αποσύνθεση του pancreatospheres όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Οι pancreatospheres συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο.

Ομοεστιακή μικροσκόπιο

Ενιαία κυτταρικά εναιωρήματα κυττάρων AsPC-1 και AsPC-1-GTR απλώθηκαν χρησιμοποιώντας εξαιρετικά χαμηλές πηγάδια προσκολλημένη 6- φρεατίων σε 3000 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο σχηματισμού σφαίρας. Μετά από 7 ημέρες θεραπείας, τα pancreatospheres συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, πλύθηκαν με 1 xPBS και μονιμοποιήθηκαν με 3,7% παραφορμαλδεϋδη. CD44 και EpCAM αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοχρώση δοκιμασία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Οι CD44 ή EpCAM-επισημασμένο pancreatospheres φωτογραφήθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία (Leica TCS SP5) με τη χρήση του λογισμικού LAS AF 1.2.0 Build 4316.

εκχύλιση πρωτεϊνών και ανάλυση Western blot

Οι πρωτεΐνες που προέρχονται από όλες τις τέσσερις κυτταρικές γραμμές και επίσης από ζωικούς ιστούς όγκου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Σχετική στάθμη της ABCG2 αξιολογήθηκε για τις τέσσερις κυτταρικές σειρές. Οι επιδράσεις επί της COX-2, ΡΤΕΝ και έκφραση β-ακτίνης αξιολογήθηκαν σε ιστούς όγκων με ανάλυση κηλίδος Western. όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12].

Πειράματα σε ζώα

Το πρωτόκολλο ζώων εγκρίθηκε από την επιτροπή των ζώων Διερεύνηση, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne, Detroit, MI. Θηλυκά CB17 SCID ποντίκια κάθε 4 εβδομάδες παλιά αγοράστηκαν από την Taconic Farms (Germantown, ΝΥ) και τρέφονται Lab δίαιτα 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, ΙΝ). Μικρά θραύσματα του MIAPaCa-2 ξενομοσχεύματος εμφυτεύθηκαν υποδορίως και διμερώς σε ποντίκια για τις δοκιμές φαρμάκων-αποτελεσματικότητας. Μόλις τα ποντίκια ανέπτυξαν ψηλαφητούς όγκους, αυτοί επιλέχθηκαν τυχαία στις ακόλουθες ομάδες θεραπείας (η = 5 /ομάδα): (1) χωρίς θεραπεία ελέγχου? (2) CDF (5 mg /ποντίκι /ημέρα), ενδογαστρική μία φορά την ημέρα για 12 ημέρες? (3) κουρκουμίνη (5 mg /ποντίκι /ημέρα), ενδογαστρική μία φορά την ημέρα για 12 ημέρες? (4) γεμσιταβίνης (1 mg /ποντικό /ημέρα), ενδοφλεβίως κάθε τρίτη ημέρα για ένα σύνολο τριών δόσεων? (5) CDF και gemcitabine χρησιμοποιώντας τις δόσεις που υποδεικνύονται παραπάνω? (6) κουρκουμίνη και gemcitabine χρησιμοποιώντας τις δόσεις, όπως αναφέρεται παραπάνω. Οι μετρήσεις του όγκου και αλλαγές στο βάρος διεξήχθησαν και ιστός αποθηκεύθηκε στους -70 ° C για RNA και πρωτεΐνη εκχύλισης.

Κινητικότητα ηλεκτροφορητικής Shift Assay (EMSA) δοκιμασία για την εκτίμηση της δραστικότητας πρόσδεσης DNA του ΝΡ-κΒ

πυρηνικές πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν από όγκους ιστού χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή Dounce με 400 μΙ παγωμένου ρυθμιστικού διάσπασης εκχυλίζεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. EMSA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Σύστημα Οδύσσεια υπέρυθρη απεικόνιση με ΝΡ-κΒ IRDye σημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο από LI-COR, Inc. (Lincoln, ΝΕ). Δέκα μg του εκχυλίσματος πυρηνικής πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε ως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Η μελέτη του ανταγωνισμού έλεγχος ΝΡ-κΒ διεξήχθη χρησιμοποιώντας μη σημασμένο ΝΡ-κΒ συναίνεση ολιγονουκλεοτίδιο. Τα δείγματα φορτώθηκαν και τρέχει σε 30 mA για 1 ώρα. Η γέλη σαρώθηκε χρησιμοποιώντας Οδύσσεια Infrared System απεικόνισης (LI-COR, Inc.)

TaqMan miRNA Real-Time ανάστροφης μεταγραφάσης-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Για να προσδιοριστεί η έκφραση. των miRNAs (miRNA-200b, miR-200c, και miR-21) σε MIAPaCa-2 όγκων, χρησιμοποιήσαμε κιτ TaqMan microRNA Δοκιμασία (Applied Biosystems) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. 5 ng ολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα και σε πραγματικό χρόνο PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε νωρίτερα [30], με τη χρήση Smart Cycler II (Cepheid).