Αφηρημένο

microRNAs (miRNAs) είναι μικρά μόρια που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων μετα-μεταγραφικά. Σε προηγούμενη μελέτη, αναγνωρίσαμε miR-96 πρέπει να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε δείγματα καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικό γειτονικό ιστό και να είναι ανεξάρτητη δείκτη βιοχημικών υποτροπής σε ένα πολυμεταβλητό μοντέλο πρόβλεψης. Συνεπώς, ερευνήσαμε το λειτουργικό ρόλο των miR-96 στην καρκινογένεση προστάτη. LNCaP και DU145 κύτταρα καρκίνου προστάτη επιμολύνθηκαν παροδικά με miR-96 πρόδρομες και φαινοτυπικές αλλαγές αναλύθηκαν. Το miR-96 αυξημένο πολλαπλασιασμό και μειωμένη απόπτωση που επάγεται από camptothecine σε αυτά τα κύτταρα. In silico ανάλυση πρόβλεψης στόχων που προσδιορίζονται FOXO1 ως πιθανά προ-αποπτωτικών στόχο miR-96. miR-96 ήταν σε θέση να δεσμεύονται σε δύο τοποθεσίες δέστρες στο FOXO1 3 ‘UTR σε έναν προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης. Η υπερέκφραση του miR-96 στα κύτταρα LNCaP οδήγησε σε μειωμένη έκφραση FOXO1. Η υπερέκφραση του FOXO1 προκάλεσε μια ισχυρή αποπτωτική φαινότυπο που ήταν εν μέρει διασώθηκε από συνέκφραση miR-96. RT-qPCR και ανοσοϊστοχημεία των 69 δειγμάτων καρκίνου του προστάτη αποκάλυψε μια ρύθμιση προς τα κάτω των FOXO1 και μια αντίστροφη συσχέτιση του miR-96 και πρωτεΐνη FOXO1 έκφρασης. Εν κατακλείδι, θα δείξουμε ότι το miR-96 μπορούν να ρυθμίσουν την απόπτωση στον καρκίνο του προστάτη, αναστέλλοντας τον παράγοντα μεταγραφής FOXO1

Παράθεση:. Fendler Α, Jung Μ, Stephan C, Erbersdobler Α, Jung Κ, Yousef GM (2013 ) αντιαποπτωτικού Λειτουργία του miR-96 στον καρκίνο του προστάτη από την αναστολή της FOXO1. PLoS ONE 8 (11): e80807. doi: 10.1371 /journal.pone.0080807

Επιμέλεια: Kin Mang Lau, Η κινεζική Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 21η του Ιανουαρίου 2013? Αποδεκτές: 16 του Οκτωβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 19, Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Fendler et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο της AF και KJ χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα για Ουρολογικής Έρευνας, το Βερολίνο και το Sonnenfeld Stiftung, Βερολίνο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι μία νέα κατηγορία των μικρών μη κωδικοποιητικού RNA και ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση μετα-μεταγραφικά μέσω αναστολής της μετάφρασης αλλά και μέσω αποικοδόμηση του αντίστοιχου mRNA. Περίπου το 30% όλων των mRNAs προβλέπεται να γίνει στόχος των miRNAs [1]. Ανάλογα με τους στόχους τους, miRNAs λειτουργούν ως tumorsupressors ή ογκογονίδια ελέγχοντας μεγάλα μονοπάτια της καρκινογένεσης, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση και την κυτταρική κινητικότητα [2].

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνή κακοήθης καρκίνος στους άνδρες και η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου στο δυτικό κόσμο [3]. Μηχανισμοί προστάτη ογκογένεσης δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί πλήρως και υπάρχει έλλειψη διαγνωστικών και προγνωστικών δεικτών.

Η απελευθέρωση των miRNAs σε προστάτη έχει αποδειχθεί από πολυάριθμες μελέτες [4-9]. Η έκφραση τους συσχετίζεται με το στάδιο του όγκου και επιθετικότητα [10]. Έχουμε εντοπίσει προηγουμένως miR-96 σε ένα σύνολο απορυθμισμένη miRNAs στην ΣΕΣΣ. Η έκφρασή του συσχετίζεται με το σκορ Gleason και είναι ένας ανεξάρτητος δείκτης της βιοχημικής υποτροπής [6].

Στην πρόβλεψη στόχο silico χρησιμοποιώντας miRecords προσδιορίζονται FOXO1 μεταξύ άλλων ως υποτιθέμενο στόχο του miR-96. FOXO1 είναι μέλος των μεταγραφικών παραγόντων κουτί forkhead. Ασκεί tumorsuppressive λειτουργία του μέσω ρύθμισης της μεταγραφής σημαντικούς ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης [11,12]. FOXO1 μεταγραφική δραστηριότητα ρυθμίζεται μέσω της οδού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ [13]. Σε μαστού και του ενδομητρίου, καθώς επίσης και Hodgkin λεμφώματα FOXO1 έχει προηγουμένως δειχθεί ότι ρυθμίζεται από miR-96 [14-16].

Υποθέσαμε ότι miR-96 μπορεί επίσης να έχει ογκογόνο λειτουργία στο PCa. Για να αποδειχθεί αυτή η υπόθεση, εμείς (α) μελέτησαν την επίδραση του miR-96 έκφρασης για τα θεμελιώδη κυτταρικά χαρακτηριστικά όπως ο πολλαπλασιασμός, η απόπτωση και τη μετανάστευση σε κυτταρικές σειρές προστάτη, (β) πραγματοποιείται σε πρόβλεψη στόχο silico, (γ) μελέτησαν δέσμευση του ΜΙΚ 96 έως προβλεπόμενες θέσεις πρόσδεσης στο FOXO1 3 ‘UTR και μεταγενέστερες αλλαγές στο mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης, (δ) μελέτησαν την διάσωση του FOXO1 επαγόμενης απόπτωσης με miR-96 και (ε) συσχετίζεται miR-96 έκφρασης με FOXO1 μεταγραφής και πρωτεΐνες έκφραση σε ανθρώπινο προστάτη και συμφωνημένα φυσιολογικό γειτονικό ιστό. Δείχνουμε ότι miR-96 αναστέλλει την επαγόμενη από καμπτοθεκίνη απόπτωση και ρυθμίζει την έκφραση FOXO1 με σύνδεση στο 3’-UTR. Σε δείγματα προστάτη, εντοπίσαμε μια αρνητική συσχέτιση των επιπέδων της πρωτεΐνης FOXO1 και την έκφραση του miR-96.

Υλικά και Μέθοδοι

ιστούς και κυτταρικές σειρές

Αξιόπιστες δείγματα φυσιολογικό και κακοήθη ιστό των 69 ασθενών προστάτη συλλέχθηκαν μετά από ριζική προστατεκτομή μεταξύ του 2001 και του 2005 στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Charité. Για συλλέχθηκαν κάθε ασθενή δεδομένων κλινικο-παθολογικές (Πίνακας 1). Η μελέτη που ονομάζεται «microRNAs ως διαγνωστικοί και προγνωστικοί υπογραφές σε ουρολογικές όγκους» (EA1 /153/07) εγκρίθηκε από την ηθική του διοικητικού συμβουλίου του Πανεπιστημίου Charite Νοσοκομείο και γραπτή συγκατάθεση έχει ληφθεί.

Η Ασθενείς για RT-qPCR (Ν = 69)

ασθενείς για ανάλυση TMA (Ν = 64)

Η Ν (%)

Η Ν (%)

Η ηλικία, τα έτη Median6363Range50-7246-74Pre-operative PSA

α, ng /mlMedian7.076.24Range1.71-41.92.00-26.0T στάδιο

apT2a2 (3) 1 (2) pT2b11 (16) 3 (5) pT2c30 (43) 39 (61) pT3a20 (29) 18 (28) pT3b6 (9) 3 (5) Ν στάδιο

apN0 /pNx67 (97) pN12 (3) Μ στάδιο

AM0 /Mx69 (100) Μ10 (0) Χειρουργική marginsR041 (60) R127 (39) Rx1 (1) Gleason score53 (4) 1 (2) 620 (29) 24 (37) 728 (41 ) 27 (42) 811 (16) 8 (12) 97 (10) 3 (5) 100 (0) 1 (2) παρακολούθηση, monthMedian50.0035.63Range1-930-86Biochemical επανεμφάνιση

Α10 ( 15) 12 (19) Πίνακας 1. χαρακτηριστικά όγκου και κλινικο-παθολογική δεδομένα ομάδων ασθενών.

aBiochemical υποτροπή ορίστηκε ως η πρώτη μετεγχειρητική PSA μεγαλύτερη από 0,1 ng /ml, όπως επιβεβαιώνεται από τουλάχιστον 1 επακόλουθη αύξηση της αξίας ( επίμονη αύξηση PSA) μετά την επίτευξη μη ανιχνεύσιμο PSA μετεγχειρητικά, που ορίζεται ως όριο ανίχνευσης μικρότερο από 0,04 ng /ml.RT-qPCR, ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου, ΤΜΑ, μικροσυστοιχιών ιστού, PSA, ειδικό προστατικό αντιγόνο, Τ στάδιο, το στάδιο του όγκου, Ν στάδιο, οι μεταστάσεις στους λεμφαδένες στάδιο, Μ στάδιο, μεταστάσεις στάδιο. CSV Λήψη CSV

Οι ιστοί καταψύχθηκαν αμέσως μετά την επέμβαση και τα δείγματα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6]. Εν συντομία, οι περιοχές του όγκου και φυσιολογικό ιστό ταυτοποιήθηκαν με χρώση haematoxilin-ηωσίνη από έναν παθολόγο και διάτρηση-βιοψία με βελόνα συστοιχίας ιστού-micro. Μόνο πυρήνων με περιεκτικότητα όγκου τουλάχιστον 90% θεωρήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

LNCaP, DU-145, PC3 και 22rv-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA,) συμπλήρωμα με 10% ορό εμβρύου μόσχου και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ένα επωαστήρα στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO2. ΒΡΗ-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 20% ορό εμβρύου μόσχου, 20 ng /ml DHT, 5 μg ml τρανσφερίνη, 5 ng /μl σεληνικό νάτριο και /5 ng /μl ινσουλίνη. Οι κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) ή τη Συλλογή γερμανική Μικροοργανισμών και Κυτταρικών Καλλιεργειών (DSMZ). Οι κυτταρικές σειρές εξετάζονται περιοδικά για mycoplasmic μόλυνση με RT-qPCR σύμφωνα με van Kuppeveld κ.ά. [17]. Επιπλέον, η ταυτότητα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη πιστοποιήθηκε από τον γερμανικό Καρκίνος του προστάτη Κοινοπραξίας.

Ιστός μικροσυστοιχιών

φορμόλη-σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη ιστό των 64 ασθενών που χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή ενός μικροσυστοιχιών ιστού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. χρώση Haematoxilin-ηωσίνη έγινε για τον εντοπισμό κακοήθεις και καλοήθεις περιοχές. Τομείς ενδιαφέροντος γροθιά-βιοψία με βελόνα 1,5 χιλιοστά μικροσυστοιχιών ιστού και μεταφέρθηκε στο μπλοκ δέκτη. Κάθε όγκος εκπροσωπείται από έναν πυρήνα. Κανονική ιστού από παχύ έντερο, το πάγκρεας, τα νεφρά και 2 προστάτες και του συνδετικού ιστού χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

απομόνωση RNA

Ολικό RNA από νωπό κατεψυγμένο καλλιέργειες ιστών και κυττάρων απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το miRNeasy MINIKIT (Qiagen , Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών, όπως περιγράφηκε προηγουμένως λεπτομερώς [6].

για την εκχύλιση του ολικού RNA από κυτταρική καλλιέργεια, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε τελική συγκέντρωση 3 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και επιμολύνθηκαν όπως περιγράφεται παρακάτω. Μετά από 24 ώρες, 1 χ 10

6 κύτταρα συλλέχθηκαν σε Qiazol (Qiagen).

απόδοση RNA και αναλογία Α260 /280 παρακολουθούνταν με ένα φασματόμετρο Nano Drop ND-100 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) και Αριθμοί RNA Ακεραιότητας (RIN) εκτιμήθηκαν με 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara , CA). Μόνο τα δείγματα RNA με RIN & gt? 6 συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις.

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

επιπέδων mRNA αναλύθηκαν με RT-qPCR. RNA από κύτταρα μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το Omniscript αντίστροφη μεταγραφάση και ολιγο-dT εκκινητές (Qiagen) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Οι αντιδράσεις εκτελέστηκαν σε έναν συνολικό όγκο 20 μΐ χρησιμοποιώντας 1 μα ολικού RNA. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν με ένα Βήμα πρώτο θερμικό ανακυκλωτή (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ποσοτικοποίηση των FOXO1 από κυτταρικές σειρές πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των 2 x Fast SYBRgreen βασικού μείγματος (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας cDNA 1 μΐ σε 20 μΐ συνολικού όγκου. Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον πίνακα S1. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν για να παραχθεί ένα amplicon που εκτείνονται τουλάχιστον 1 ιντρόνιο. Ιδιαιτερότητα της ενισχύσεως εξασφαλίζεται από αμμοβολής εκκινητή και αναλύσεις καμπύλης τήξης.

mRNA από δείγματα ιστού μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το Transcriptor First Strand Synthesis Kit cDNA (Roche, Mannheim, Germany) από 1 μg RNA σε 20 μΐ συνολικού όγκου . Ποσοτικοποίηση της FOXO1 διεξήχθη χρησιμοποιώντας ανιχνευτή UPL # 11 (Roche) και η Universal Probes κύριο βασικού μείγματος (Roche) σε 10 μΐ συνολικού όγκου.

miRNAs ανιχνεύθηκαν με RT-qPCR χρησιμοποιώντας την δοκιμασία TaqMan miRNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6 ].

Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και η μέση τιμή και SD υπολογίστηκαν. έκφραση FOXO1 ομαλοποιήθηκε με TUBA1B [19], ενώ miR-96 ομαλοποιήθηκε με miR-130b [6]. Τυπικές καμπύλες μετρήθηκαν για κάθε γονίδιο για τη διόρθωση της απόδοσης (FOXO1: Ε = 1,95? TUBA1B: Ε = 1,96? MiR-96: Ε = 1,83? MiR-130b: E = 1.83). Η κανονικοποίηση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6].

Κατασκευή λουσιφεράσης φορέων

Στόχευση γονιδίου 3 ‘αλληλουχίες UTR κλωνοποιήθηκαν στον φορέα έκθεσης pMiR (Ambion Austin ΤΧ, USA). αλληλουχίες-στόχοι του FOXO1 3 ‘UTR ενισχύθηκαν από BPH1 cDNA χρησιμοποιώντας AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA) και γονίδιο-ειδικούς εκκινητές (Πίνακας S1), κλωνοποιήθηκε εντός του pCR φορέα 2.1-ΤΟΡΟ (Invitrogen) και ενισχύθηκε σε ΤΟΡ10 χημικώς ικανά κύτταρα (Invitrogen). Το πλασμίδιο DNA από θετικούς κλώνους εκχυλίσθηκε με το QIAprep Spin Miniprep κιτ (Qiagen) και αποστέλλεται στην αλληλούχιση χρησιμοποιώντας Μ13 uni (-21) και Μ13 rev (-29) εκκινητές (MWG Eurofins GmbH, Ebersberg, Germany). πέψεις περιορισμού των θετικών φορέων pCR2.1 και τους φορείς έκθεση pMiR διεξήχθησαν με SacI και SpeI (New England Biolabs, Ίπσουιτς, ΜΑ). Περιορισμένη ένθετα και φορέα έκθεση pMiR συνδέθηκαν χρησιμοποιώντας 1 U Τ4 DNA-λιγάσης (Invitrogen) και ενισχύθηκε σε χημικώς ικανά κύτταρα ϋΗ5α (Invitrogen). Οι θετικοί κλώνοι ταυτοποιήθηκαν με PCR αποικίας. Το πλασμιδιακό DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το QIAprep Spin Miniprep κιτ (Qiagen).

Η διαμόλυνση των κυτταρικών σειρών προστάτη με προ-miRNAs, αναστολείς miRNA και το πλασμίδιο DNA

LNCaP και DU145 κύτταρα επιμολύνθηκαν με προ- πρόδρομοι miRNA, αναστολείς αντι-miRNA ή προ-miR-NC # 1 (Applied Biosystems) σε τελική συγκέντρωση 10 ηΜ ή 500 ng FOXO1 κλώνος πλήρους μήκους (ΟηΟεηε, Rockville MD, USA) χρησιμοποιώντας siPort NeoFX παράγοντα μορφομετατροπής (Applied Biosystems) . Για κάθε δοκιμασία, ένας έλεγχος δεν διαμόλυνση διεξήχθη κατά μήκος. Για λουσιφεράσης προσδιορισμούς γονιδίου αναφοράς κύτταρα επιπλέον επιμολύνθηκαν με 500 ng pMiR φορέα έκθεση και τον έλεγχο β-γαλακτοσιδάσης φορέα.

Δοκιμασία

γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης

κύτταρα LNCaP αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή και εμβολιάστηκαν σε 6 -Καλά πλάκες σε τελική πυκνότητα 2 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με ένα ξέστρο και συνολικής πρωτεΐνης εκχυλίστηκε σε 80 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (Applied Biosystems). Λουσιφεράσης και η δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης στα εκχυλίσματα ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας το Dual-Light System συνδυασμένης Reporter Gene Assay (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η έκφραση λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε με β-γαλακτοσιδάση έκφρασης. Κάθε αντίδραση εκτελέστηκε εις διπλούν και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών.

Western Blot

Για την εκχύλιση της συνολικής πρωτεΐνης από κυτταρική καλλιέργεια, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε μια τελική συγκέντρωση 3 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και επιμολύνθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε μετά από 72 ώρες σε 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος στώσα (20 mM TRIS-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2% ΝΡ40, 0,2% SDS, ρΗ 7.5) ή ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ (150 mM NaCl, 1% ΝΡ40, 0,5 % δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS, 50 mM βάσης Tris, 100 μΜ PMSF, 1 μg /ml απρωτινίνη, 10 μg /ml αναστολέα θρυψίνης σόγιας, 2 mM EDTA). Η συνολική πρωτεΐνη αναλύθηκε επί 10% πηκτών SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη 0,45 μm πολυβινυλοδιφθοριδίου. Η Membran μπλοκαρίστηκε από 2% αποβουτυρωμένο γάλα και ανιχνεύθηκαν με τα ακόλουθα αντισώματα: κουνελιού αντι-FOXO1 pAb, ποντικού αντι-ACTB mAB (Sigma Aldrich, Μόναχο, Γερμανία), κουνελιού αντι-Ακί pAb, κουνελιού αντι-pAkt Pab (κυτταρική σηματοδότηση Technologies, Danvers, ΜΑ), και αντι-κουνελιού αιγός, συζευγμένο HRP ή κουνελιού αντι-ποντικού, συζευγμένο με HRP δευτερογενούς Ab (Dako, Αμβούργο, Γερμανία). Οι μεμβράνες βάφτηκαν με ECL (Pierce, Βόννη, Γερμανία) ή προηγμένη λύση ECL (GE Healthcare, Μόναχο, Γερμανία) για 5 λεπτά και αναπτύχθηκε με φθοριο-S multiimager (BioRad, Μόναχο, Γερμανία). Για να προσδιοριστεί η σχετική συγκέντρωση πρωτεΐνης, η ένταση ζώνης ήταν υπολογίζονται με ImageJ 1.43r (https://rsb.info.nih.gov/ij) και ομαλοποιήθηκε ως προς β-ακτίνη.

δοκιμασίας και ανάλυση του κυτταρικού κύκλου

ο πολλαπλασιασμός των προ miR-96-επιμολυσμένα κύτταρα LNCaP αξιολογήθηκε με μεταβολική μετατροπή του 3- [4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο bromid (ΜΤΤ) (Sigma Aldrich). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή και σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε τελική συγκέντρωση 6 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο και επιμολύνθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα αφέθηκαν να ξεκουραστεί για 24 ώρες και στη συνέχεια ήταν άνευ ορού. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν σε 5 mg /ml ΜΤΤ για 4 ώρες και λύθηκαν σε 10% SDS σε 0,01 Μ HCl. Τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν στους 37 ° C όλη τη νύκτα και η απορρόφηση φορμαζάνης μετρήθηκε στα 550 nm. Κάθε αντίδραση διεξήχθη εις τριπλούν και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών. Για τα κύτταρα ανάλυση κυτταρικού κύκλου αναπτύχθηκαν προς 80% συρροή και εμβολιάστηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε τελική συγκέντρωση 1,5 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και επιμολύνθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα αφέθηκαν να ξεκουραστεί για 24 ώρες και στη συνέχεια ήταν άνευ ορού για 24 ώρες. Τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο ml 20 μg /συμπληρωμένο με 200 μg /ml RNAse σε 0,1% Triton Χ-100 και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το FacsScan κυτταρόμετρο ροής και το Λογισμικό CellQuest (BD Biosciences, Mississauga, ΟΝ, Canada). Κάθε δείγμα μετρήθηκε εις διπλούν και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών.

επούλωση της πληγής δοκιμασία

Για να εκτιμήσουν το μεταναστευτικό phenotyp των DU-145 κύτταρα μετά miR-96 επιμόλυνση πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία επούλωση της πληγής. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή, σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επιμολύνθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν προς συρροή και μονοστοιβάδα αποξέσθηκε με ένα ρύγχος πιπέτας 100 μΐ. Remigration των κυττάρων στην πληγή εκτιμήθηκε με απεικόνιση κύτταρο ζωή για 24 ώρες κάτω από ασιτία ορού. Ποσοστό ανοικτή περιοχή μετρήθηκε με το λογισμικό TScratch λογισμικού [20] σε καθορισμένα χρονικά σημεία (0,5,10,15,20 h). Όλες οι τιμές ομαλοποιήθηκαν με το ποσοστό της ανοικτής επιφάνειας σε 0 h. Αναλύθηκαν δύο τυχαία επιλεγμένες περιοχές της κάθε μηδέν. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών.

Η απόπτωση

δοκιμασία

LNCaP και DU145 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή και σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε τελική συγκέντρωση 2 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και επιμολύνθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Απόπτωση προκλήθηκε με 10 μΜ καμπτοθεκίνη (CPT) (Sigma Aldrich) σε μέσο ελεύθερο ορού για 24 ώρες. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC (Invitrogen) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (Invitrogen) καλλιέργειες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το FacsScan κυτταρομετρητή ροής και το Λογισμικό CellQuest (BD Biosciences, Mississauga, ΟΝ, Canada). Κάθε δείγμα μετρήθηκε εις διπλούν και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών.

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε επί 2 μm διαφάνειες της μικροσυστοιχίας ιστού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, ο ιστός αποπαραφινοποιούνται σε ξυλόλη και αντιγόνα demasked σε pressur κουζίνα. Τα πλακίδια ανιχνεύθηκαν με κουνελιού αντι-FOXO1 mAb (Cell Signaling Technologies), βιοτινυλιωμένο συνδετήρα-Ab και στρεπταβιδίνη-συζευγμένη δευτερογενή Ab (Dako) και χρωματίστηκαν με Fast Red στην επιθυμητή ένταση. Πυρήνες αντίθετα με haemalaun. Διαφάνειες καλύφθηκαν χρησιμοποιώντας μέσο στερέωσης Aquatex (Merck KGH, Darmstadt, Γερμανία). Χρώση FOXO1 αναλύθηκε σε αδένες όγκου και φυσιολογικών γειτονικό ιστό για κάθε ασθενή εάν ισχύει. Από τη συνολική χρώση για FOXO1 ήταν αδύναμη και μόνο, βαθμολογήθηκε ως παρόν (1) ή απουσιάζει (0) μόνο. ​​

Στην στόχο silico έρευνα

Σε αναζήτηση στόχο silico για miR-96 στόχοι ήταν πραγματοποιήθηκε με τη χρήση miRecords (https://mirecords.biolead.org/). Χρησιμοποιήσαμε το κριτήριο ότι ένας υποθετικός στόχος έπρεπε να ανιχνευθεί από TargetScan, Miranda, PicTar και δύο άλλοι αλγόριθμοι πρόβλεψης. Τοποθεσία των θέσεων σύνδεσης miR-96 στο 3 ‘UTR του FOXO1 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας TargetScan 5.1.

Στατιστικές αναλύσεις

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με GraphPad Prism έκδοση 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA), MedCalc έκδοση 10.3.2 (MedCalc Λογισμικό, Mariakerke, Βέλγιο) ή SPSS 19.0 (IBM, Somers, Νέα Υόρκη). έλεγχος τ, μονόδρομη ή αμφίδρομη ANOVA, τεστ κανονικότητας Kolmogorov-Smirnof, Wilcoxon signed rank test, test McNemar, ανάλυση Kaplan-Meier και Cox παλινδρόμησης αναλογικών κινδύνων έγιναν. Όλες οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν δύο-ουρά και P-τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

Λειτουργικός χαρακτηρισμός του miR-96

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι ΜΙΚ 96 είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω και προβλέπει ως εκ τούτου, βιοχημική υποτροπή στη διαφήμιση του καρκίνου του προστάτη υπέθεσε ένα ογκογόνο λειτουργία του miR-96 στον προστάτη. Η υψηλότερη έκφραση του miR-96 έκφραση σε κύτταρα καρκίνου προστάτη γραμμές σε σύγκριση με τον καλοήθη κυτταρική σειρά προστάτη ΒΡΗ-1 (Σχήμα S1A) περαιτέρω αιχμηρό σε ένα ογκογόνο λειτουργία. Προκειμένου να δημιουργηθεί μια λειτουργικός ρόλος του miR-96, LNCaP και DU145 κύτταρα επιμολύνθηκαν με συνθετικό miR-96 προδρόμου μορίων ή τον αναστολέα αντινόημα. Πρώτα, αξιολογήθηκε ο ρόλος του miR-96 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. LNCaP και DU145 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-96 έδειξε ένα υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τους μάρτυρες διαμόλυνσης (Σχήμα 1Α + Β). Αυτό προ-πολλαπλασιαστική επίδραση αντιστράφηκε εν μέρει με συνδιαμόλυνση με αναστολέα αντινόημα της.

LNCaP και DU145 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 10 ηΜ προ-miR-96, αντι-miR-96, προ-miR-NC # 1 ή συνδυασμός προ-miR-96 και αντι-miR-96. Η επίδραση στο (Α) LNCaP και (Β) DU145 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων κάτω από ασιτία ορού μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ σε διάστημα τριών ημερών. Όλα τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν επί του πολλαπλασιασμού των καλλιεργειών ελέγχου την ημέρα 1 και δείχνονται ως μέση τιμή (± SD) τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών. * P & lt? 0,05, διπλής κατεύθυνσης ANOVA. μετάβαση κύκλος των κυττάρων μετρήθηκε με χρώση ΡΙ σε επιμολυσμένα (C) LNCaP και (D) κύτταρα DU145. Τα κύτταρα στερήθηκαν τον ορό μία ημέρα μετά την επιμόλυνση για άλλες 24 ώρες και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν χρώση. Μαύρο, G1 φάσης? ανοιχτό γκρι, S-φάσης? σκούρο γκρι, G2 /M φάση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών. Απόπτωση σε CPT-αγωγή (Ε) LNCaP και (F) κύτταρα DU145. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ CPT για 24 ώρες. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ. Κλάσματα νωρίς (μαύρες ράβδοι) και αργά (λευκές ράβδοι) αποπτωτικά κύτταρα μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα δείχνονται ως μέση τιμή (+ SD) των τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών. * P & lt? 0,05? Bonferroni post-test (P & lt? 0.001, διπλής κατεύθυνσης ANOVA).

Η

Στη συνέχεια, εξετάστηκε το ερώτημα εάν αυτή η ενισχυμένη πολλαπλασιασμός μπορεί να οφείλεται σε ένα δελτίο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου ή μειωμένη απόπτωση. Για να προσδιοριστεί η επίδραση του miR-96 για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, ο αριθμός των κυττάρων LNCaP και DU145 σε G1, S ή G2 /M φάση αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από διαμόλυνση με miR-96 σε κύτταρα άνευ ορού. Η πλειονότητα των κυττάρων LNCaP ήταν στην G1 υπό ασιτία ορού (71.0 να 76,7%) και μικρότερα κλάσματα σε φάση S (4,8 έως 5,3%) ή σε G2 /M (18,6% να 23,7, Σχήμα 1 C). Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές (δεύτερο-Way ANOVA? Ρ = 0.12) σε μεταβατικό στάδιο του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα επιμολυσμένα με miR-96 προδρόμων και αναστολέων σε σύγκριση με τους ελέγχους. DU145 είχαν μεταπίπτουν γρηγορότερα μέσω του κυτταρικού κύκλου, με αποτέλεσμα μια αύξηση του αριθμού των κυττάρων σε G2 /M (30,1 να 34,4%) και S-φάση (19,2 να 22,7%) και λιγότερο κύτταρα σε G1 (43.9 να 50,7, σχήμα 1Δ). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στη μετάβαση του κυτταρικού κύκλου παρατηρήθηκαν κατά την επιμόλυνση, επιβεβαιώνοντας έτσι τις παρατηρήσεις σε κύτταρα LNCaP (δεύτερο-way ANOVA, ρ = 0.2).

Καθώς η ενισχυμένη πολλαπλασιασμός δεν θα μπορούσε να εξηγηθεί από την αυξημένη μετάβαση του κυτταρικού κύκλου, διερευνήσαμε την επίδραση της miR-96 διαμόλυνση επί της απόπτωσης. LNCaP και DU145 κύτταρα επιμολύνθηκαν με προ-miR-96, miR-96 αναστολέων ή ομελέτα ελέγχου και απόπτωση προκλήθηκε με 10 μΜ καμπτοθεκίνη (CPT). CPT επαγόμενη απόπτωση σε καλλιέργειες ελέγχου LNCaP με 13,2% νωρίς αποπτωτικά κύτταρα και 5,6% αργά αποπτωτικά κύτταρα και σε κύτταρα DU145 (24,2% νωρίς και 5,9% αργά αποπτωτικά κύτταρα) (Σχήμα 1 Ε + F). Παροδική επιμόλυνση με προδρόμους miR-96 μειώνεται το κλάσμα πρώιμων αποπτωτικών και αργά αποπτωτικά κύτταρα κατά 28% (LNCaP) και 25% (DU145) (δεύτερο-way ANOVA, Ρ & lt? 0.001). Η εξειδίκευση του παρατηρούμενη επίδραση του miR-96 επιβεβαιώθηκαν με miR-21, η οποία χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος [22] και επέδειξε μία παρόμοια αναστολή της απόπτωσης και miR-16, η οποία χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος και δεν επηρέασε την απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Ερευνήσαμε περαιτέρω μετανάστευση των DU-145 κύτταρα μετά από επιμόλυνση με miR-96. DU-145 έδειξε ένα μεταναστευτικό φαινότυπο και ήταν σε θέση να remigrate στο 60% της έκτασης του αρχικού τραύματος μέσα σε 20 ώρες (Εικόνα S2). Η επιμόλυνση με miR-96 προδρόμου ή miR-96 αναστολέα είχε καμία επίδραση στην κυτταρική μετανάστευση σε σύγκριση με την επιμόλυνση κωδικοποιημένο ελέγχου ή μη επιμολυσμένα ελέγχου (δεύτερο-Way ANOVA? Ρ = 0,71).

Προσδιορισμός των ΜΙΚ 96 γονίδια-στόχους

για την αναγνώριση ρυθμιζόμενη στόχους, που ενδεχομένως ευθύνονται για τα αποπτωτικά αποτελέσματα, πραγματοποιήσαμε σε αναζήτηση στόχων silico στην miRecords και θεωρείται η πρόβλεψη ισχύει μόνο αν ο στόχος αναγνωρίστηκε από Miranda, TargetScan και PicTar, και δύο επιπλέον αλγόριθμους πρόβλεψης. Έτσι, εντοπίσαμε 209 στόχους για miR-96 (πίνακας S2). Το σύνολο των προβλεπόμενων γονιδίων στόχων αναλύθηκε περαιτέρω σχετικά με το γονίδιο οντολογία τους (GO) τους όρους για την αναγνώριση γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση. 21 από 209 προβλέψει miR-96 στόχοι είχαν απόπτωση που σχετίζονται GO όρος αποδίδεται (πίνακας S2). Ερευνήσαμε επίσης τον αριθμό των θέσεων δέσμευσης και εξελικτική διατήρηση τους σε TargetScan 5.1. και διενήργησε βιβλιογραφική έρευνα για τον εντοπισμό στόχων με μια γνωστή tumorsuppressive λειτουργία του προστάτη. Ένας από τους στόχους προβλεφθεί, FOXO1 επιλέχθηκε για περαιτέρω επικύρωση οφείλονται σε γνωστά tumorsuppressive λειτουργία του στον καρκίνο του προστάτη. Συσχέτιση του miR-96 και FOXO1 μεταγραφή έκφρασης σε LNCaP και τα κύτταρα DU145 δείχνει μια αντίστροφη συσχέτιση της έκφρασης (Σχήμα S1 Α + Β). Η FOXO1 3 ‘UTR φιλοξενεί δύο 8-Mer miR-96 θέσεις πρόσδεσης στη θέση 264-270 και θέση 2138-2145. Ενώ η πρώτη θέση δέσμευσης είναι εξαιρετικά διατηρημένη, η δεύτερη θέση δέσμευσης miRNA δεν είναι. Κατασκευάσαμε λουσιφεράσης-δημοσιογράφους που περιέχει 200-300 bp μακρές ακολουθίες που περικλείει τις προβλεπόμενες θέσεις στόχους. Η συνεπιμόλυνση των δύο FOXO1 3 ‘UTR ρεπόρτερ λουσιφεράσης με προ-miR-96 σε κύτταρα LNCaP παρουσίασαν μείωση κατά 40% της δραστηριότητας της λουσιφεράσης σε σύγκριση με τον έλεγχο του μετεμβολιασμού (One-way ANOVA, Ρ & lt? 0,01), ενώ επιμόλυνση με το ΜΙΚ 96 αναστολέα ή ομελέτα ελέγχου δεν επηρέασε σημαντικά την δραστηριότητα της λουσιφεράσης (Εικόνα 2Α). Η προσθήκη των αλληλουχιών αντινόημα miR-96 απελευθερώνεται αναστολή της μόνο ελαφρά. Αν και η δεύτερη θέση σύνδεσης miR-96 στο FOXO 3 ‘UTR μόνο μερικώς διατηρημένη, μια παρόμοια δραστικότητα δέσμευσης με μείωση 42% του λουσιφεράσης δραστηριότητας (ANOVA, Ρ & lt? 0,05) παρατηρήθηκε σε σύγκριση με το μάρτυρα (Σχήμα 2Β). Η προσθήκη της αλληλουχίας αντινόημα miR-96 μειώθηκε μερικώς αυτό το αποτέλεσμα, ενώ η αλληλουχία αντινόημα μόνη της δεν επηρέασε δραστικότητα λουσιφεράσης. Το περιπλεγμένο αλληλουχία miRNA οδήγησε σε μια μικρή, αλλά όχι σημαντική αναστολή της δραστηριότητας της λουσιφεράσης.

LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με 10 ηΜ προ-miR-96, αντι-miR-96, προ-miR-NC # 1 ή συνδυασμός προ-miR-96 και αντι-miR-96 καθώς και 500 ng έκθεση pMiR πλασμίδιο ελέγχου β-γαλακτοσιδάση και 500 ng pMiR έκθεση πλασμίδιο για FOXO1 3 ‘UTR Α) θέση πρόσδεσης 1 στην θέση 264 έως 270 και Β) δέσμευσης τοποθεσία 2 στη θέση 2138-2145. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, One-way ANOVA και η σύγκριση μετά τη δοκιμή πολλαπλές κατά Tukey

Η

Μείωση του miR-96 έκφρασης του γονιδίου στόχου in vitro

miRNAs. πρότεινε να αναστέλλουν κυρίως μετάφραση πρωτεΐνης, αλλά μερικοί miRNAs έχουν επίσης δειχθεί να οδηγήσει σε τουλάχιστον μερική αποικοδόμηση του αντίστοιχου mRNA [23]. Για να καθοριστεί το κύριο μηχανισμό με τον οποίο miR-96 αναστέλλει FOXO1 στην ΣΕΣΣ και να αποδείξει ότι η μηχανιστική σύνδεση του miR-96 στο 3-UTR μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη έκφραση FOXO1, εμείς επιμολυσμένα LNCaP και DU145 κύτταρα με πρόδρομο miR-96 ή /και ο αναστολέας. επίπεδα miR-96 σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές ήταν 400 φορές υψηλότερη σε ΜΙΚ-96 επιμολυσμένα κύτταρα και στα κύτταρα συνδιαμολύνθηκαν σε σύγκριση με τις καλλιέργειες ελέγχου (ANOVA, Ρ & lt? 0,001? Σχήμα 3Α + Β). Αντίστοιχα, FOXO1 mRNA μειώθηκε περισσότερο από δύο φορές σε miR 96 επιμολυσμένα κύτταρα (ANOVA, Ρ & lt? 0,01, Σχήμα 3C + D), ενώ η διαμόλυνση με την αλληλουχία αντινόημα miR-96 και το ανακατωμένο miRNA δεν έδειξε καμία επίδραση επί FOXO1 επίπεδα έκφρασης (Σχήμα 3C + D). Πρόσθετα προς τη μείωση της μεταγραφής FOXO1, παρατηρήσαμε μια 1.6-φορές και 2,6 φορές μείωση του FOXO1 πρωτεΐνης σε LNCaP και κυττάρων DU145 κατόπιν έκτοπη υπερέκφραση της προδρόμου miR-96, ενώ τα επίπεδα της πρωτεΐνης δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά σε κύτταρα επιμολυσμένα με το miR -96 αναστολέα ή η ομελέτα ελέγχου (Σχήμα 3Ε + F, Εικόνα S3A + Β). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι miR-96 αναστέλλει την έκφραση FOXO1.

Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα επιμολύνθηκαν με 10 ηΜ προ-miR-96, αντι-miR-96, προ-miR-NC # 1 ή συνδυασμός προ-miR-96 και αντι-miR-96. miR-96 έκφραση στο (Α) LNCaP και (Β) κύτταρα DU145 και έκφραση FOXO1 στο (C) LNCaP και (D) κύτταρα DU145. Τα δεδομένα δείχνονται ως μέση τιμή (+ SD) των τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών. ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001, One-way ANOVA. FOXO1, έκφραση πρωτεΐνης ΑΚΤ, και ρΑΚΤ σε (Ε) LNCaP και (F) κύτταρα DU145 οπτικοποιήθηκε με κηλίδωση Western. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

δραστηριότητα FOXO1 άμεσα ρυθμίζεται από φωσφορυλίωση από Akt μετά από εξωτερικά σήματα ανάπτυξης, με αποτέλεσμα translocalization από τον πυρήνα. Για να ελέγξετε αν miR-96 υπερέκφραση μεταβάλλει σημαντικά ανάντη σηματοδότησης Akt, αξιολογήσαμε Akt και φωσφορυλιωμένη Akt έκφραση σε miR-96 κύτταρα που υπερεκφράζουν. Ούτε Akt ούτε φωσφορυλιωμένη Akt επίπεδα ήταν σημαντικά μεταβληθεί μετά την επιμόλυνση με πρόδρομες ουσίες ή αναστολείς miR-96 (Σχήμα 3Ε + F), αποδεικνύοντας ότι η δραστηριότητα της FOXO1 δεν επηρεάστηκε από τις αλλαγές στο Akt έκφραση ή δραστηριότητα.

Για να υποστηρίξει περαιτέρω την υπόθεση ότι το miR-96 ελέγχους FOXO1 στον καρκίνο του προστάτη και έτσι προστατεύει τα κύτταρα από την απόπτωση, που επιμολύνονται LNCaP και DU145 κύτταρα με ένα πλήρους μήκους cDNA FOXO1. Η έκτοπη έκφραση του FOXO1 αποτέλεσμα μια ισχυρή ρύθμιση προς τα πάνω του FOXO1 ως επικυρωθεί από RT-PCR και westernblotting τόσο LNCaP και κυττάρων DU145 (Σχήμα 4Α-D). Λόγω της ισχυρής έντασης χρώση FOXO1 σε επιμολυσμένα κύτταρα, FOXO1 σε κύτταρα ελέγχου δεν είναι ακόμα ορατή στο στύπωμα και μόνο έγινε ορατή μετά μεγαλύτερους χρόνους έκθεση. Συνμορφομετατροπή με miR-96 μείωσε τα επίπεδα FOXO1 mRNA με 2.5- και 1.7-φορές σε LNCaP και κυττάρων DU145 (One-way ANOVA, ρ & lt? 0.001), ενώ τα επίπεδα της πρωτεΐνης μειώθηκαν κατά 2.8- και 2.1- φορές (Σχήμα 4C + D, Σχήμα S3C + D).

LNCaP και DU145 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 500 ng FOXO1 πλήρους μήκους κλώνου ή κενό φορέα, 10 ηΜ προ-miR-96 ή προ-miR-NC 1 #. έκφραση FOXO1 σε κύτταρα (Α) LNCaP και (Β) DU145. Τα δεδομένα δείχνονται ως μέση τιμή (+ SD) των τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών. *** P & lt? 0.001, One-way ANOVA. έκφραση της πρωτεΐνης FOXO1 στο (C) LNCaP και (D) κύτταρα DU145 οπτικοποιήθηκε με κηλίδωση Western. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Απόπτωση σε CPT-αγωγή (Ε) LNCaP και (H) DU145 κύτταρα. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ CPT για 24 ώρες. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ. Κλάσματα νωρίς (μαύρες ράβδοι) και αργά (λευκές ράβδοι) αποπτωτικά κύτταρα μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα δείχνονται ως μέση τιμή (+ SD) των τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών. ns, P & gt? 0,05, * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001, διπλής κατεύθυνσης ANOVA, μετά τη δοκιμή Bonferroni του). μετάβαση κύκλος των κυττάρων μετρήθηκε με χρώση ΡΙ σε επιμολυσμένα (F) LNCaP και (Ι) κύτταρα DU145. Τα κύτταρα στερήθηκαν τον ορό μία ημέρα μετά την επιμόλυνση για άλλες 24 ώρες και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν χρώση. Μαύρο, G1 φάσης? ανοιχτό γκρι, S-φάσης? σκούρο γκρι, G2 /M φάση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών. *** P & lt? 0.001, One-way ANOVA. Ανάλυση των κορυφών subG1 σε (G) LNCaP και (J) κύτταρα DU145. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών. *** P & lt? 0.001, One-way ANOVA

Η

Στο επόμενο βήμα, θα εκτιμηθεί, αν FOXO1 έχει μια αντίθετη ρόλο στην miR-96 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη και αν το αποτέλεσμα θα μπορούσε να διασωθεί. με συνδιαμόλυνση με miR-96. FOXO1 επάγεται ισχυρά απόπτωση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Αμφίδρομο ANOVA, ρ & lt? 0.001, Εικόνα 4Ε + Η). Η θεραπεία με CPT είχε μόνο μία ήπια επιπλέον επίδραση στα κύτταρα. Ταυτόχρονη υπερέκφραση του miR-96 διασωθεί εν μέρει την επαγόμενη FOXO1 απόπτωση σε μη επεξεργασμένα, καθώς και CPT-επεξεργασμένα κύτταρα, αν και η επίδραση ήταν μικρή και όχι σημαντική σε όλες τις θεραπείες (Σχήμα 4Ε + Η).

Ο πολλαπλασιασμός επίσης έντονα μειωμένη σε FOXO1 επιμολυσμένα LNCaP και DU145 κύτταρα, αλλά miR-96 δεν ανέστρεψε σημαντικά την επίδραση (Σχήμα S4A + Β). Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση που προκαλείται FOXO1 για τη μετάβαση του κυτταρικού κύκλου.