Αφηρημένο

CAR είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εκφράζεται σε διάφορα επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα. CAR μεσολαβεί αδενοϊική μόλυνση, καθώς και αδενοϊό μεσολάβηση ογκόλυση των AxdAdB-3, ένα Ε1Α /Ε1Β διπλό περιορίζεται ογκολυτική αδενοϊό, σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Αυτή η μελέτη αξιολόγησε περαιτέρω την θεραπευτική αποτελεσματικότητα των AxdAdB-3 με Arg-Gly-Asp (RGD) τροποποίηση -Fiber (AxdAdB3-F /RGD), η οποία επιτρέπει ιντεγρίνη εξαρτώμενη μόλυνση, στον καρκίνο του προστάτη. Ευαισθησία των κυττάρων καρκίνου του προστάτη LNCaP, PC3 και DU145 σε μόλυνση αδενοϊού συσχετίστηκε με την έκφραση CAR. Όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη που εκφράζονται ιντεγκρίνης α

νβ

3 και α

νβ

5. AxdAdB-3 ήταν πιο κυτταροπαθολογικό στο CAR-θετικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη σε σχέση με το CAR-αρνητικά κύτταρα, ενώ AxdAdB3-F /RGD προκάλεσε ισχυρή ογκόλυσης στις δύο CAR θετικά και αρνητικά CAR-καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Σε αντίθεση, AxdAdB3-F /RGD δεν κυτταροπαθογόνος έναντι φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη, RWPE-1. Η ενδονεοπλασματική ένεση AxdAdB3-F /RGD σε CAR-αρνητικών κυττάρων καρκίνου του προστάτη ξενομοσχεύματα σε γυμνούς ποντικούς ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου. Η τρέχουσα μελέτη καταδεικνύει ότι Ε1Α /Ε1Β διπλό περιορίζεται ογκολυτική αδενοϊού με μια τροποποίηση RGD-ίνα ενισχύει την αποδοτικότητα της μόλυνσης και κατά του όγκου δραστικότητα σε CAR-ελλειμματικά κύτταρα καρκίνου προστάτη, ενώ διαφυλάσσει τα φυσιολογικά κύτταρα. Μελλοντικές μελέτες θα αξιολογήσουν τις θεραπευτικές δυνατότητες των AxdAdB3-F /RGD στον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Shen Υ-Η, Yang F, Wang Η, Cai Ζ-J, Xu Υ-Ρ, Zhao A, et al. (2016) Arg-Gly-Asp (RGD) -τροποποιημένης Ε1Α /Ε1Β διπλή μετάλλαξη αδενοϊού Βελτιώνει δραστικότητα κατά του όγκου κύτταρα καρκίνου του προστάτη

In Vitro

και σε ποντίκια. PLoS ONE 11 (1): e0147173. doi: 10.1371 /journal.pone.0147173

Επιμέλεια: Ilya Ulasov, Σουηδικό Ινστιτούτο Νευροεπιστημών, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: May 10, 2015? Αποδεκτές: 30ης Δεκεμβρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιανουαρίου 2016

Copyright: © 2016 Shen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Zhejiang, Κίνα (# LY12H16031) και από το Γραφείο Υγείας της επαρχίας Zhejiang, Κίνα (# 2012KYA025) .

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνά εμφανιζόμενων κακοήθεια στον κόσμο, ειδικά στις δυτικές χώρες. Εκτιμάται ότι ο καρκίνος του προστάτη, θα προκαλέσει 220.800 νέα κρούσματα και 27.540 θάνατοι σχετίζονται με τον καρκίνο στις ΗΠΑ το 2015. [1] Στην Κίνα, συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του προστάτη αυξάνεται ραγδαία τις τελευταίες δεκαετίες, και περισσότερο από το 70% των ασθενών με καρκίνο του προστάτη έχουν προχωρήσει ή μεταστατική νόσο. [2] μέχρι σήμερα, η θεραπεία ορμονικής εξακολουθεί να είναι η πιο χρήσιμη θεραπεία για τους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, αλλά αυτή χορηγείται για μια περιορισμένη χρονική περίοδο και σχεδόν όλοι οι ασθενείς με καρκίνο του προστάτη οι οποίοι λαμβάνουν ανδρογόνων τελικά να εξελιχθεί σε ανδρογόνων ανθεκτική νόσο, [3] είναι γνωστή ως ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC). Docetaxel χημειοθεραπεία με βάση συχνά χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ασθενών με CRPC, αλλά η επιβίωση χωρίς εξέλιξη διαρκεί μόνο έξι μήνες. [4] Αν και ο αναστολέας μυθιστόρημα υποδοχέα ανδρογόνων (Enzalutamide) και του κυτοχρώματος P450, οικογένεια 17, υποοικογένειας Ένα πολυπεπτίδιο (CYP17) αναστολέας ( abiraterone) έχουν αναφερθεί για τη θεραπεία πιο αποτελεσματικά CRPC ασθενείς, τέτοια θεραπεία μπορεί να βελτιώσει μόνο την επιβίωση για λίγους μήνες. [5, 6] Ως εκ τούτου, νέες και πιο αποτελεσματικές στρατηγικές θεραπείας χρειάζονται επειγόντως να βελτιώσουν την πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη.

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι μια ογκολυτικού αδενοϊό ήταν σε θέση να επιλεκτικά αναπαράγουν και να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα ενώ διαφυλάσσει τα φυσιολογικά κύτταρα. Αυτή η ογκολυτική ιική θεραπεία θα μπορούσε να είναι κλινικά υποσχόμενη για τη θεραπεία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη. [7-9] προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι ένας Ε1Α /Ε1Β διπλή μετάλλαξη ογκολυτική αδενοϊό, AxdAdB-3, είχαν αντικαρκινική δραστηριότητα σε ένα ορθοτοπικό, SCID καρκίνο του προστάτη (σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια) μοντέλο ποντικού. [10] Ωστόσο, AxdAdB-3 έδειξε ανεπαρκής κυτταροπαθητικά αποτελέσματα σε μερικές καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα του υποδοχέα αδενοϊού ιού coxsackie (CAR). [10] CAR είναι μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εκφράζεται σε διάφορα επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα και λειτουργεί για να μεσολαβήσει αδενοϊική μόλυνση. έχουν καρκινικά κύτταρα με μειωμένη έκφραση CAR έχουν αναφερθεί ότι είναι ανθεκτικά σε ιική μόλυνση και γονιδιακή θεραπεία αδενοϊού μεσολάβηση. [11] Σε καρκίνο του προστάτη, η έκφραση CAR συχνά απουσιάζει, [12, 13], η οποία θα μπορούσε να περιορίσει τη χρήση της γονιδιακής θεραπείας αδενοϊού υπολειπόμενων . Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η εισαγωγή του πεπτιδίου Arg-Gly-Asp (RGD) μέσα στο HI βρόχο της περιοχής λαβής της ίνας ενίσχυσαν την μεσολάβηση αδενοϊού μεταγωγή γονιδίου σε CAR-αρνητικά κύτταρα μέσω της σύνδεσης του RGD πεπτιδίου προς ιντεγκρίνες επί των κυττάρων-στόχων [14]. Έτσι, στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την θεραπευτική αποτελεσματικότητα του διπλού μεταλλάκτη ογκολυτική αδενοϊού Ε1Α /Ε1Β, AxdAdB-3, με Arg-Gly-Asp (RGD) τροποποίηση -Fiber (AxdAdB3-F /RGD) σε προστάτη καρκίνος

in vitro

και σε γυμνά ποντίκια.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές γραμμές και καλλιέργεια

Ανθρώπινο εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή LNCaP (μετάσταση στον λεμφαδένα), ανθρώπινο ανδρογόνου ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη PC3 (μετάσταση στα οστά) και DU145 (μετάσταση στον εγκέφαλο), και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα ενηλίκου προστάτη έχουν μολυνθεί με ένα μόνο αντίγραφο του ιού του ανθρώπινου θηλώματος 18 (που ονομάζεται RWPE- 1) λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA). LNCaP κύτταρα έχουν άγριου τύπου ρ53 και της έκφρασης p16? [15, 16] PC3 κύτταρα έχουν μεταλλαχθεί p53 αλλά μετουσιωμένο άγριου τύπου p16?. [15, 16] και DU-145 κύτταρα έχουν τόσο μεταλλαγμένο p16 p53and [15, 16] Ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά 293 κύτταρα (ΗΕΚ-293) λήφθηκαν από την Τράπεζα κυττάρων της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute ή ελάχιστο βασικό μέσο Eagle (για ΗΕΚ293) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 IU /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε υγροποιημένο 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ΝΤΟ. RWPE-1 διατηρήθηκαν σε Κ-SFM πλήρες μέσο (κυτταρικά συστήματα, Kirkland, WA, USA) και στη συνέχεια συνελήφθησαν στη K-SFM χωρίς αυξητικό παράγοντα ορού πριν ιογενή λοίμωξη.

ανασυνδυασμένου αδενοϊού και τη μόλυνση των κυττάρων

AxCAZ3-F /RGD [17] και AxCAlacZ [18] Δεν Ε1 διαγραφή ελαττωματικό αντιγραφής φορείς αδενοϊού που εκφράζουν

Escherichia coli lacZ

γονίδιο υπό τον έλεγχο του υποκινητή CAG με ή χωρίς ένα πεπτίδιο RGD στην HI βρόχος του τομέως λαβής της ίνας. AxdAdB-3 έχει ένα μεταλλαγμένο με ικανότητα αντιγραφής που περιέχει την Ad5 SXGXE (STGHE) μετάλλαξη αντί του μοτίβου LXCXE (LTCHE) Rb-δεσμευτικός Ε1Α και διαγραφή του E1B55 KD [19]. Για να κατασκευαστεί AxdAdB3-F /RGD με χρήση pWEAxKM-F /RGD, κλωνοποιήσαμε τα RGD-4C αμινοξέα στην HI βρόχο της περιοχής λαβής της ίνας μεταξύ των καταλοίπων αμινοξέων 546 και 547 με μια Ε3 απαλοιφή. Οι αλληλουχίες αμινοξέων της RGD-μετάλλαξη ήταν T 546 CDCRGDCFCP 547. AxdAdB3-F /RGD δημιουργήθηκε με συν-επιμόλυνση κυττάρων ΗΕΚ293 με pWEAxKM-F /RGD κοσμίδιο DNA, το οποίο είχε υποστεί πέψη με

Cla Ι

και

Pac

εγώ, μαζί με το

EcoR

Ι και

Άσε

Ι-πέψη DNA-TPC (τερματικό σύμπλεγμα πρωτεϊνών) της AxdAdB3 [17]. Τα ιικά οχήματα δόθηκαν από τον RIKEN Gene Bank (Tsukuba, Japan) και επιμολύνθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293 να παράγουν αδενοϊούς και ο τίτλος ιού προσδιορίστηκε με μία πρότυπη δοκιμασία πλακός.

Για τη μόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε στήλη 6 -Καλά πλάκα και αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα μολύνθηκαν με AxCAlacZ ή AxCAZ3-F /RGD σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 100 για 24 ώρες. Η έκφραση των αδενοϊικών πρωτεϊνών hexon στα μολυσμένα κύτταρα προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western. Εν τω μεταξύ, τα κύτταρα μολύνθηκαν με AxCAlacZ ή AxCAZ3-F /RGD αδενοϊοί σε ΜΟΙ 100 για 24 ώρες και τα επίπεδα των αδενοϊικών πρωτεϊνών hexon σε μολυσμένα κύτταρα στη συνέχεια αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (που περιγράφονται στην παρακάτω ενότητα) με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι- hexon αντίσωμα (MAB805, Chemicon International, Temecula, CA).

εκχύλιση πρωτεϊνών και

κηλίδος Western

τα κύτταρα λύθηκαν σε 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με την μέθοδο BCA. Στη συνέχεια, ίσες ποσότητες των δειγμάτων πρωτεΐνης στο υπερκείμενο διαχωρίστηκαν με χρήση ηλεκτροφόρησης πηκτής δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) σε ένα 12% πήκτωμα SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) . Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-hexon αντίσωμα (MAB805, Chemicon International, Temecula, CA, USA) και στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα αντι-ποντικού IgG αντίσωμα για 1 ώρα ακολουθούμενο από ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL? Cell Signaling Technology, MI , CA, USA). Η μεμβράνη στη συνέχεια εκτίθεται σε φιλμ ακτίνων Χ και σαρώνονται για ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας Image J Software (National Institute of Heath, Bethesda, MD, USA).

Η κυτταρομετρία ροής για τον προσδιορισμό της έκφρασης των επιπέδων CAR και ιντεγκρίνης στα κύτταρα

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια 6-φρεατίων και αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα. Για την ανίχνευση της έκφρασης του CAR και ιντεγκρίνης α

νβ

3 και α

νβ

5, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα διαχωρισμού χωρίς ένζυμα και στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα μονοκλωνικό ποντικού αντι-ανθρώπινο αντίσωμα CAR (Upstate Biotechnology, Lake Placid, ΝΥ, USA), ένα μονοκλωνικό ποντικού αντι-ανθρώπινης ιντεγκρίνης α

νβ

3 αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), ή ένα μονοκλωνικό ποντικού αντι-ανθρώπινης ιντεγρίνης α

νβ

5 αντίσωμα (R &? D Systems, Inc., Minneapolis, ΜΝ, USA), όλα σε αραίωση 1: 100 για 1 ώρα επί πάγου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), και στη συνέχεια επωάστηκαν περαιτέρω για 30 λεπτά με ένα δευτερεύον ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη-συζευγμένο αντίσωμα. Μετά τις πλύσεις, τα κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως με ένα κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Καταμέτρηση

Κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων kit-8 (CCK-8) δοκιμασία

τα κύτταρα (3 χ 10

3 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και μολύνθηκαν με AxCAlacZ, AxCAZ3-F /RGD, AxdAdB-3, και AxdAdB3-F /RGD σε ΜΟΙ 30 για 0, 1, 3, 5, και 7 ημέρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας CCK-8 (Dojindo, Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 10 μΐ CCK-8 διάλυμα προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν για 4 ώρες. Η απορρόφηση του χρωματισμένου φορμαζάνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών στα 450 nm.

Τα πειράματα σε ζώα

Οι επιδράσεις κατά του όγκου του AxdAdB3-F /RGD αξιολογήθηκαν σε ένα μοντέλο υποδόριου όγκου σε 6-εβδομάδα- Αρσενικοί ποντικοί ηλικίας BALB /C. Εν συντομία, οι ποντικοί εγχύθηκαν υποδορίως με 5 χ 10

6 PC3 κύτταρα για τον σχηματισμό ξενομοσχεύματος όγκου σε περίπου 6-7 mm σε μέγεθος. Οι ποντικοί στη συνέχεια χορηγείται μια ένεση εντός του όγκου AxCAZ3-F /RGD, AxdAdB-3, ή AxdAdB3-F /RGD (1 Χ 10

8 μονάδες σχηματισμού πλάκας) μία φορά την ημέρα για τρεις διαδοχικές ημέρες. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε στη συνέχεια εβδομαδιαίως χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρονικό παχύμετρο και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: όγκος = μεγαλύτερη διάσταση χ μικρότερη διάσταση

2 x 0,4. Την ημέρα 28 μετά την αγωγή, οι ποντικοί θανατώθηκαν και ελήφθησαν και υπέστησαν επεξεργασία για ανοσοϊστοχημική ανάλυση των αδενοϊικών πρωτεϊνών hexon ξενομοσχεύματα όγκων για να προσδιοριστεί αδενοϊικό αναδιπλασιασμό σε αλλοιώσεις όγκου. Εν συντομία, ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν με αιθανόλη, και στη συνέχεια ανοσοβαφή σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας μια ανοσοϊστοχημική κιτ που περιέχει στρεπταβιδίνη-βιοτίνη τεχνική (kit LSAB, Dako, Japan) και ένα αντι-hexon μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού (# MAB805, Chemicon International).

Η στατιστική ανάλυση

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS για Windows, έκδοση 19 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Τα δεδομένα που συνοψίζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση και τη σημασία των διαφορών μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο δύο-tailed t test. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

CAR και ιντεγκρίνης έκφρασης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη και φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα

Η κυτταρομετρία ροής δεδομένων έδειξε υψηλό επίπεδο έκφρασης CAR σε DU145 κύτταρα, ένα μέτριο επίπεδο σε LNCaP και RWPE-1 κύτταρα, και ένα πολύ χαμηλό επίπεδο σε κύτταρα PC3 (Εικόνα 1). Ιντεγρίνης έκφραση ήταν επίσης διαφορετική σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, αλλά το αυτοκίνητο-αρνητικών PC3 κυτταρική σειρά εξέφραζαν υψηλά επίπεδα ιντεγκρινών α

νβ

5 (Σχήμα 1).

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν και ανοσοχρώση με CAR , ιντεγκρίνη α

νβ

3, ή α

νβ

5 αντίσωμα και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Στήλες, τα ποσοστά των κυττάρων που εκφράζουν CAR, ανβ3 και ανβ5. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± τυπική απόκλιση για τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

τροποποιημένο RGD-ίνα μόλυνση ικανότητα των αδενοϊών

Μετά την μόλυνση 24 ώρες με αδενοϊούς, χρησιμοποιήθηκε ανάλυση στυπώματος Western για την ανίχνευση έκφραση του αδενοϊικού πρωτεΐνη hexon στα μολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2Α). έκφραση της πρωτεΐνης hexon ήταν παρόμοιο στο αυτοκίνητο-θετικές κυτταρικές σειρές DU145, LNCaP και RWPE-1 μετά είτε AxCAlacZ ή AxCAZ3-F /RGD λοίμωξη. Ωστόσο, το αυτοκίνητο-αρνητικά PC3 κυτταρική γραμμή (που εκφράζει ιντεγκρίνης α

νβ

5) έδειξαν υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης hexon μετά RGD μόλυνση AxCAZ3-F /σύγκριση με κύτταρα μολυσμένα με AxCAlacZ (Σχήμα 2Α), υποδεικνύοντας ότι RGD τροποποίηση -Fiber ενισχυμένη αδενοϊό (AxCAZ3-F /RGD) ικανότητα μόλυνσης στο CAR-αρνητικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

Α, τροποποιημένη RGD-ινών χωρητικότητας μόλυνση αδενοϊούς. Η ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης πρωτείνης hexon σε ψευδο λοίμωξη (1), ή μόλυνση με AxCAlacZ (2) και AxCAZ3-F /RGD (3) σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Β, Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης πρωτεΐνης hexon σε RGD αδενοϊό μολυσμένα κύτταρα ή κύτταρα μολυσμένα με αδενοϊό AxCAlacZ AxCAZ3-F /. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± τυπική απόκλιση για τρία ανεξάρτητα πειράματα. ** P & lt? 0.01 και N.S., δεν είναι στατιστικά σημαντική. C, κυτοπαθητικά αποτελέσματα των RGD-ινών τροποποιημένο αδενοϊούς σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τα κύτταρα μολύνθηκαν με AxCAlacZ (διαμάντια), AxCAZ3-F /RGD (τετράγωνα), AxdAdB-3 (τρίγωνα) και AxdAdB3-F /RGD (κύκλοι) σε ΜΟΙ 30 για 0, 1, 3, 5, έως 7 ημέρες και στη συνέχεια υποβάλλεται σε μια δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± τυπική απόκλιση για τρία ανεξάρτητα πειράματα. ** P & lt? 0.01 και N.S., όχι στατιστικά σημαντική.

Η

Αξιολογήσαμε επίσης τη μολυσματικότητα από ενεργοποιούμενη με φθορισμό ταξινόμηση κυττάρων για την ανίχνευση της αδενοϊικής hexon πρωτεΐνη σε μολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2Β). CAR-θετική DU145, LNCaP και RWPE-1 κύτταρα έδειξαν παρόμοια έκφραση της πρωτεΐνης hexon μετά είτε AxCAlacZ ή AxCAZ3-F /RGD λοίμωξη. Σε έντονη αντίθεση, το CAR-αρνητική κυτταρική σειρά PC3, που εκφράζουν ανβ5, έδειξε έκφραση πρωτεΐνης hexon σε κύτταρα μολυσμένα με AxCAZ3-F /RGD αλλά όχι με AxCAlacZ, η οποία ήταν σύμφωνη με τα αποτελέσματα του στυπώματος Western.

κυτοπαθητικά αποτελέσματα της αδενοϊούς σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη

AxdAdB-3 ήταν πιο κυτταροπαθολογικό στο CAR-θετικό καρκίνο του προστάτη κύτταρα (LNCaP ή DU145) σε σχέση με το CAR-αρνητικά κύτταρα (PC3). AxdAdB3-F /RGD προκαλείται ισχυρός ογκόλυσης στις δύο καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές CAR θετικά και CAR-αρνητικό (Σχήμα 2C), υποδεικνύοντας ότι RGD-ινών τροποποιημένου αδενοϊού (AxdAdB3-F /RGD) ενισχυμένη αντικαρκινική δραστικότητα σε CAR-αρνητικό καρκίνο του προστάτη κύτταρα . Ωστόσο, AxdAdB3-F /RGD δεν κυτταροπαθογόνος στον HPV-αθανατοποιημένη φυσιολογικό προστάτη RWPE-1 κυτταρική σειρά επιθηλιακών κυττάρων (Σχήμα 2Β).

Η αντικαρκινική δράση του AxdAdB3-F /RGD

in vivo

καθιερώθηκε για πρώτη φορά ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη PC3 κυττάρων σε γυμνά ποντίκια και στη συνέχεια απευθείας εγχέεται AxdAdB3-F /RGD ή ελέγχου ιού AxdAdB-3 σε αλλοιώσεις όγκου μία φορά την ημέρα για τρεις ημέρες. Οι ποντικοί θανατώθηκαν την ημέρα 28 και AxdAdB3-F /RGD αντικαρκινική δράση. καμπύλη ανάπτυξης όγκου, και ο όγκος του όγκου μετρήθηκαν (Σχήμα 3). ξενομοσχεύματα όγκου αναλύθηκαν επίσης για την έκφραση της ιικής πρωτεΐνης hexon (Σχήμα 4). Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι AxdAdB3-F /RGD ανέστειλε σημαντικά την αύξηση των ξενομοσχευμάτων όγκου

σε vi vo

σε 4 εβδομάδες μετά τη θεραπεία σε σύγκριση με AxdAdB-3 (Ρ & lt? 0,005? Σχήμα 3).

κύτταρα προστάτη PC3 καρκίνου του εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. Μετά αλλοιώσεις όγκου έφθασε περίπου 6-7 mm σε μέγεθος ιός εγχύθηκε μέσα στην αλλοίωση του όγκου μία φορά την ημέρα για τρεις ημέρες και τα ποντίκια θανατώθηκαν την ημέρα 28. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε μετά από ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ιούς (n = 5 ανά ομάδα) . Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση μάζα όγκου ± τυπική απόκλιση. ** P & lt? 0.005.

Η

AxdAdB3-F /RGD θεραπεία οδήγησε σε πιο εκτεταμένη νέκρωση των όγκων από AxdAdB-3 (ΗΕ χρώση, αρχική μεγέθυνση χ 200 σε πάνω πίνακα, x 400 στη μέση του πίνακα). Ανοσοϊστοχημική χρώση των όγκων AxdAdB3-F /RGD-αγωγή ανιχνεύεται αδενοϊική πρωτεΐνη hexon (κάτω πάνελ, αρχική μεγέθυνση χ 400).

Η

Συζήτηση

τρέχουσα μελέτη μας δείχνει ότι η RGD ινών είναι σε θέση να τροποποιήσει δραστικότητα κατά του όγκου της Ε1Α /Ε1Β διπλή μετάλλαξη αδενοϊού AxdAdB3-F /RGD σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη

in vitro

και στο γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. τρέχοντα δεδομένα μας δείχνουν ότι AxdAdB3-F /RGD έχει μια ισχυρή θεραπευτική δράση στον καρκίνο του προστάτη. AxdAdB3-F /RGD προκάλεσε ισχυρές κυτταροπαθητικά αποτελέσματα σε όλες καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, ανεξάρτητα της έκφρασης CAR. AxdAdB3-F /RGD ανέστειλε επίσης την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων καρκίνου του προστάτη σε γυμνούς ποντικούς. Ωστόσο, χωρίς RGD τροποποίηση, AxdAdB-3 ιού έδειξε μόνο αντικαρκινική δράση στο CAR-θετικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να αξιολογηθεί η συνολική ασφάλεια αυτών των αδενοϊών πριν από τη χρήση σε ανθρώπους ασθενείς.

αδενοϊική μόλυνση απαιτεί προσκόλληση του ιού στην επιφάνεια των στοχευόμενων κυττάρων δια συνδέσεως του τομέως πόμολο της ίνας να CAR, και στη συνέχεια μετέπειτα εσωτερικοποίηση μέσω της αλληλεπίδρασης του RGD μοτίβα της πεντονίου βάσης με υποδοχείς ιντεγκρίνης α

νβ

3 και α

νβ

5. [14, 20] Έτσι, CAR διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη διαμεσολάβηση και την προώθηση της αδενοϊική μόλυνση. Συνήθως, τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν πολύ χαμηλά επίπεδα της πρωτεΐνης CAR και να αντισταθούμε αδενοϊική μόλυνση, και ως εκ τούτου ανθεκτική στην ιική θεραπεία αδενοϊό μεσολάβηση. [11] Στην παρούσα μελέτη, επιβεβαίωσε ότι η μόλυνση AxdAdB-3 ήταν σε θέση να μειώσει τη βιωσιμότητα του καρκίνου του προστάτη κυτταρικές σειρές DU145 και LNCaP, που εκφράζουν υψηλά ή μέτρια επίπεδα CAR, αλλά είχε περιορισμένες επιπτώσεις των κυττάρων PC3, που εκφράζει πολύ χαμηλά επίπεδα CAR. Στην πραγματικότητα, ο καρκίνος του προστάτη κυτταρικές σειρές και ιστούς όγκων συχνά έχουν μειωμένη ή απώλεια της έκφρασης CAR. [12] Για την ενίσχυση της μολυσματικότητας των ογκολυτικού αδενοϊό στο CAR-αρνητικό καρκίνο του προστάτη, τροποποιήσαμε τον ιό με RGD για την παραγωγή ενός AxdAdB3-F /RGD ιό, η οποία ενίσχυσε σημαντικά ογκολυτική αδενοϊικοί δράση στον καρκίνο του προστάτη.

AxdAdB3-F /RGD είναι ένας ιός που περιέχει ένα πεπτίδιο RGD, η οποία μπορεί να μεσολαβήσει, όχι μόνο εξαρτημένο από το αυτοκίνητο την είσοδο του ιού, αλλά και CAR-ανεξάρτητη και RGD-ιντεγκρίνης (α

νβ

3 και α

νβ

5) εξαρτώμενη από την είσοδο του ιού στα κύτταρα στόχους. Ως εκ τούτου, καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν CAR ή ιντεγκρίνη θα είναι ευπαθή σε AxdAdB3-F /RGD μόλυνση. Έτσι, αν και η απώλεια ή μειωμένη έκφραση CAR συμβαίνει συχνά στον καρκίνο του προστάτη, άφθονη έκφραση της ιντεγκρίνης α

νβ

3 και α

νβ

5 θα πρέπει να διευκολύνει λοίμωξη από τον ιό. [21] τρέχουσα μελέτη μας επιβεβαίωσε η υπόθεση αυτή και έδειξε ότι AxCAZ3-F /RGD ενισχυμένη ικανότητα μόλυνσης σε σύγκριση με AxCAlacZ (χωρίς RGD) σε κύτταρα PC3 CAR-αρνητικό. Επιπλέον, AxdAdB-3 ήταν πιο κυτταροπαθολογικό στο CAR-θετικά κύτταρα σε σύγκριση με το CAR-αρνητικά κύτταρα? Ωστόσο, AxdAdB3-F /RGD προκάλεσε ισχυρές κυτταροπαθητικά αποτελέσματα τόσο στο CAR-θετικά κύτταρα και CAR-αρνητικά κύτταρα. Επίσης, AxdAdB3-F /RGD ανέστειλε την ανάπτυξη ξενομοσχεύματος στο γυμνό μοντέλο ποντικού. Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι το RGD ίνα τροποποιημένος αδενοϊός ενισχύει αδενοϊική μόλυνση ικανότητα και αποτελεσματικότητα ογκόλυσης μέσω ιντεγκρίνης (ανβ3 και ανβ5) -εξαρτώμενη εισόδου. Λόγω της αυξημένης χωρητικότητας λοίμωξη του, AxdAdB3-F /RGD σε χαμηλότερη δόση ιών θα μπορούσαν δυνητικά να αποφευχθούν κάποιες ανεπιθύμητες παρενέργειες, αυξάνοντας παράλληλα την αποτελεσματικότητα της ιικής θεραπείας.

τρέχοντα δεδομένα μας δείχνουν ότι τα επίπεδα της Κεντροαφρικανικής και ιντεγκρίνης α

νβ

3 έκφραση είναι πλούσια σε DU145 και χαμηλή σε κύτταρα PC3, το οποίο είναι παρόμοιο με τα ευρήματα σε μια προηγούμενη μελέτη από τον Adams

et

.

al

. [22]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η τρέχουσα μελέτη μας διαπίστωσε ότι οι ιντεγκρίνης α

νβ

5 έκφραση ήταν υψηλή σε DU145 και τα κύτταρα PC3. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με Adams «μελέτη [22], η οποία έδειξε ότι η ιντεγκρίνη α

νβ

5 έκφραση είναι υψηλή σε DU145, αλλά χαμηλή σε κύτταρα PC3. Ωστόσο, σύμφωνα με τα αποτελέσματα μας, τα επίπεδα της ιντεγκρίνης α

νβ

5 ήταν υψηλότερη από ιντεγκρίνης α

νβ

3 σε κύτταρα PC3 σε έκθεση Adams ». [22]. Ωστόσο, τα ποσά της ιντεγκρίνης α

νβ

5 ποικίλη. Μια άλλη προηγούμενη μελέτη [23] κατέδειξε επίσης ότι PC3 και LNCaP κύτταρα εξέφρασαν ιντεγκρίνη α

νβ

5 σε παρόμοια επίπεδα, η οποία είναι σύμφωνη με τις ισχύουσες αποτελέσματα μας. Έτσι, η περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη για την επαλήθευση των στοιχείων αυτών και των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών τους.

Επιπλέον, τα τρέχοντα δεδομένα μας δείχνουν ότι AxdAdB3-F /RGD έχει λιγότερες κυτταροπαθολογικές επιδράσεις στα επιθηλιακά κύτταρα του φυσιολογικού προστάτη HPV-απαθανάτισε. Adams

et

.

al

., [22] ανέφεραν ότι η ογκολυτική αδενοϊικό μετάλλαγμα AdΔΔ σε μοντέλα καρκίνου του προστάτη (AdΔΔ έχει μία μετάλλαξη του Ε1Α στον CR-2) απαλείφονται σύνδεση με pRb, και διαγραφή του 19 KD Ε1Β ενισχύεται η ογκολυτική δραστικότητα. Ωστόσο, οι δημοσιευμένες μελέτες έχουν δείξει ότι είτε Ε1Α ή Ε1Β μονό μετάλλαγμα ήταν σε θέση να αντιγράφεται σε φυσιολογικά κύτταρα. [24,25] προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι Ε1Α /Ε1Β διπλή μετάλλαξη ογκολυτική αδενοϊό, AxdAdB-3, δεν προκάλεσε σημαντικά τοξικότητα σε σύγκριση για Ε1Α ή Ε1Β ενιαία μεταλλαγμένος αδενοϊός σε κανονικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από τον προστάτη. [10] παρούσα μελέτη μας είναι συνεπές με τις προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι η Ε1Α /Ε1Β διπλή μετάλλαξη ογκολυτική αδενοϊός ήταν λιγότερο τοξικές σε σύγκριση με Ε1Α ή Ε1Β μονά μεταλλάγματα σε κανονική κύτταρα, αλλά είχε παρόμοια ογκολυτική επίδραση σε καρκινικά κύτταρα. [19, 26] Πρόσφατα, κλινικές δοκιμές ογκολυτικού αδενοϊούς που παραδίδονται εντός του όγκου, ενδοπεριτοναϊκώς, και ενδοφλεβίως για τη θεραπεία ασθενών με υποτροπιάζον ή προχωρημένο χημειοθεραπεία ανθεκτικούς στερεούς όγκους αναφέρθηκε ότι είναι ασφαλής και δυνητικά αποτελεσματική. [27] Έτσι, αυτές οι μελέτες ενθαρρυντικά και υποστηρίζει τη χρήση των AxdAdB3 /F-RGD ως θεραπευτικός παράγοντας για τον καρκίνο του προστάτη. Επιπλέον, ο καρκίνος του προστάτη είναι κατάλληλη για ογκολυτική αδενοϊική θεραπεία λόγω της εύκολης χορήγησης του αδενοϊού στην ενδο-προστάτη, επιτρέποντας υψηλοί τίτλοι αδενοϊού να μολύνει κύτταρα όγκου χωρίς διάχυση σε άλλους δικτυακούς τόπους. [9] αποτελέσματα αντιγραφή Ο αδενοϊός στην απελευθέρωση των απογόνων ιοί για να μολύνουν γειτονικά κύτταρα όγκου, που οδηγεί σε ενίσχυση του ιού εισόδου. Και πάλι, Ε1Α /Ε1Β διπλή μετάλλαξη ογκολυτική αδενοϊός είναι ικανός να αναδιπλασιαστεί σε στοχευόμενα κύτταρα και καρκινικά κύτταρα λύονται που έχουν ανωμαλίες σε ρ53 ή /και ρ16 /Rb /E2F οδούς. [19] Ο καρκίνος του προστάτη έχει συχνά ένα ευρύ φάσμα γενετικών μεταλλάξεων, συμπεριλαμβανομένων η p53, pRb, και p16 οδών, [28] και θα ήταν μια ιδανική τοποθεσία όργανο για την ογκολυτική θεραπεία αδενοϊό.

τρέχουσα μελέτη μας παρέχει απόδειξη της αρχής, και χρειάζεται περισσότερη δουλειά πριν από τα ευρήματά μας μπορεί να είναι μεταφραστεί σε κλινική εφαρμογή. τρέχοντα δεδομένα μας δείχνουν ότι Ε1Α /Ε1 Β διπλό περιορίζεται ογκολυτικού αδενοϊό με τροποποίηση RGD-ινών αυξάνει ιογενής λοίμωξη ικανότητα και αντικαρκινική δράση και στις δύο CAR-θετικά και αρνητικά κύτταρα καρκίνου του προστάτη

in vitro

και σε ξενομοσχεύματα γυμνού ποντικού, ενώ φειδωλοί φυσιολογικά κύτταρα.