Abstract

Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι μια καθιερωμένη στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου. τυροσίνης κινάσης του EGFR αναστολείς (ΤΚ), όπως gefinitib και erlotinib, έχουν αναπτυχθεί ως αντικαρκινικά φάρμακα. Αν και μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα με μια μετάλλαξη ενεργοποίησης EGFR, L858R, ανταποκρίνεται καλά στην gefinitib και erlotinib, όγκους με ένα διπλά μεταλλαγμένο EGFR, Τ790Μ-L858R, αποκτούν αντίσταση σε αυτά τα φάρμακα. Η

C. elegans

EGFR ομόλογο LET-23 και κατάντη της οδού σηματοδότησης της έχουν μελετηθεί εκτενώς για να παρέχουν πληροφορίες για τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς συντηρούνται από το

C. elegans

για τον άνθρωπο. Για να αναπτυχθεί ένα

in vivo

σύστημα διαλογής για πιθανά φάρμακα κατά του καρκίνου στοχεύουν συγκεκριμένες μεταλλάξεις EGFR, εκφράσαμε τρία LET-23 χίμαιρες στις οποίες η περιοχή ΤΚ αντικαταστάθηκε με είτε τον τομέα ΤΚ αγρίου τύπου ανθρώπινο (23 LET-: : hEGFR-ΤΚ), μια περιοχή ΤΚ με τη μετάλλαξη L858R (LET-23 :: hEGFR-ΤΚ [L858R]), ή ένα πεδίο ΤΚ με τα Τ790Μ-L858R μεταλλάξεις (LET-23 :: hEGFR-TK [Τ790Μ-L858R ]) στο

C. elegans

αιδοίου κύτταρα χρησιμοποιώντας το

υποστηρικτής ας-23

. Η χιμαιρική πρωτεΐνη άγριου τύπου hEGFR-ΤΚ διασωθεί η

ας 23-

μεταλλαγμένο φαινότυπο, και οι ενεργοποιώντας μεταλλαγμένες χίμαιρες hEGFR-ΤΚ προκάλεσε μια multivulva (MUV) φαινοτύπου σε ένα άγριου τύπου

C. elegans

φόντο. Το gefitinib αντικαρκινικά φάρμακα και ερλοτινίμπη κατέστειλε τον φαινότυπο MUV στο LET-23 :: hEGFR-ΤΚ [L858R] εκφράζοντα διαγονιδιακά ζώα, αλλά όχι σε LET-23 :: hEGFR-TK [Τ790Μ-L858R] διαγονιδιακά ζώα. Ως πιλότος οθόνη, 8.960 μικρά χημικά ελέγχθηκαν για καταστολή MUV, και AG1478 (ένας αναστολέας της ΤΚ του EGFR) και U0126 (αναστολέας ΜΕΚ) ταυτοποιήθηκαν ως πιθανοί αναστολείς του EGFR μεσολάβηση βιολογική λειτουργία. Εν κατακλείδι, τα διαγονιδιακά

C. elegans

εκφράζουν χιμαιρικές πρωτεΐνες LET-23 :: hEGFR-ΤΚ είναι ένα πρότυπο σύστημα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε οθόνες μετάλλαξη ειδικά για νέα φάρμακα κατά του καρκίνου

Παράθεση:. Bae YK, Sung JY, Κιμ YN, Κιμ S, το Χονγκ KM, Kim ΗΤ, et al. (2012) Ένα

In Vivo C. elegans

Μοντέλο Σύστημα Εξέτασης αναστολής EGFR αντικαρκινικά φάρμακα. PLoS ONE 7 (9): e42441. doi: 10.1371 /journal.pone.0042441

Επιμέλεια: Άννα Γ Hart, Πανεπιστήμιο Brown, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Μάρτη, 2012? Αποδεκτές: 9, Ιουλίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 του Σεπτεμβρίου του 2012

Copyright: © Bae et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε μόνο από μια ερευνητική επιχορήγηση από το Εθνικό Κέντρο Καρκίνου (NCC-1110060) της Νότιας Κορέας (www.ncc.re.kr). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ανάπτυξη ενός υψηλής απόδοσης, χαμηλού κόστους

in vivo

σύστημα ελέγχου για μικρό μόριο αντιδραστήρια αντι-καρκίνου στην ιδανική περίπτωση θα είναι σε θέση να ξεπεράσει τα σοβαρά προβλήματα των συμβατικών

in vitro

μεθόδους διαλογής. Λόγω γρήγορο χρόνο γενιάς, μεγάλο αριθμό απογόνων, χαμηλό κόστος, και καλά εδραιωμένη γενετικών εργαλείων, ο νηματώδης

Caenorhabditis elegans

(

Γ. Elegans

) είναι ένα ελκυστικό υποψήφιο για ένα σύστημα ελέγχου μοντέλο ζώου , με πολλά από τα πλεονεκτήματα του

in vitro

συστήματα διαλογής και ζωικά μοντέλα [1].

EGFR υπερεκφράζεται ή ανωμάλως ενεργοποιούνται σε διάφορους τύπους ανθρώπινου καρκίνου, όπως του μαστού, των ωοθηκών, και μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) [2]. EGFR εμπλέκεται σε διάφορα στάδια της ανάπτυξης του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων ογκογένεση, εισβολή, μετάσταση, και την αγγειογένεση [3], και έτσι παρέχει έναν ελκυστικό στόχο για την ανάπτυξη φαρμάκων για τον καρκίνο. Το gefitinib (Εμπορική ονομασία: Iressa) ήταν ο πρώτος EGFR-TK αναστολέας φάρμακο που αναπτύχθηκε για τη θεραπεία των επιθηλιακών καρκίνων όπως NSCLC [4]. Μεταλλάξεις στον τομέα της ΤΚ του EGFR έχουν συνδεθεί με την ευαισθησία gefitinib σε ένα υποσύνολο των καρκίνων του πνεύμονα, και έχουν επίσης βρεθεί για την ενεργοποίηση αντι-αποπτωτικών οδών [5], [6].

C. elegans

αιδοίου ανάπτυξη είναι ένα καλά οργανωμένο σύστημα μοντέλο που χρησιμοποιείται για τη μελέτη της οδού σηματοδότησης EGFR [7] – [9]. Μεταξύ των έξι αιδοίου πρόδρομα κύτταρα (VPCs), P5.p, P6.p και P7.p εγκρίνει τις 2 ° -1 ° -2 ° μοίρες κυττάρων, αντίστοιχα, και να συνεχίσει τη διαίρεση για να σχηματίσουν την ώριμη αιδοίο. Η μοίρα 1 ° κυττάρου προσδιορίζεται ως αποτέλεσμα του EGFR-Ras-ΜΑΡΚ σηματοδότηση σε P6.p, ενώ το 2 ° κύτταρο μοίρα προσδιορίζεται με LIN-12 /Notch σηματοδότηση σε P5.p και P7.p, η οποία ενεργοποιείται ως ένα αποτέλεσμα του EGFR-Ras-ΜΑΡΚ σηματοδότησης στο γειτονικό κελί. Συστατικά της οδού EGFR, συμπεριλαμβανομένων των EGFR, Ras, Raf, ΜΕΚ, και ΜΑΡΚ, είναι εντόνως διατηρημένες μεταξύ των ανθρώπων και

C. elegans

[8]. Ένας περιορισμένος αριθμός χημικών ενώσεων που στοχεύουν το μονοπάτι EGFR έχουν δοκιμαστεί χρησιμοποιώντας

C. elegans

αιδοίου ανάπτυξη ως μοντέλο. Φαρνεσυλτρανσφεράσης αναστολείς, οι οποίοι αναστέλλουν δραστικότητα Ras, και οι ενώσεις MCP, τα οποία διαταράσσουν τις αλληλεπιδράσεις Ras-Raf βρέθηκαν να δρουν ειδικά επί των ορθολόγων πρωτεΐνες στο

C. elegans

EGFR-Ras οδού [10] – [12]. Η τοξικότητα της κινάσης αναστολέων EGFR BIBU1361 και BIBX1382 αξιολογήθηκε επίσης σε

C. elegans

[13]. Αυτές οι μελέτες δείχνουν τις δυνατότητες για τη χρήση του

C. elegans

ως εργαλείο για την αντι-EGFR διαλογής οδός ναρκωτικών.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναπτύξει και να αναλύσει ένα ανθρώπινο EGFR με γνώμονα

C. elegans

μοντέλο, το οποίο παρουσιάζει τον φαινότυπο MUV. Χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο, ένας πιλότος οθόνη του 8960 χημικών διεξήχθη, και ένας αναστολέας του EGFR και ενός αναστολέα ΜΕΚ απομονώθηκαν ως καταστολείς, υποδηλώνοντας ότι αυτό το

C. elegans

-με βάση το σύστημα μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά στην οθόνη για το νέο EGFR-ανασταλτικών φαρμάκων.

Υλικά και Μέθοδοι

πολιτισμό Worm και στελέχη

Άγρια τύπου Ν2 και μεταλλαγμένα στελέχη καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται από τους Brenner [14]. Μεταλλαγμένα αλληλόμορφα που χρησιμοποιούνται σε αυτό το έργο είναι

ας-23 (SY1), αφήστε-23 (SA62), αφήστε-60 (n1700)

και

lin-15 (n765)

. γραμμές ολοκλήρωσης που χρησιμοποιούνται σε αυτό το έργο είναι

jgIs6

[

ας-23ρ Ιστοσελίδα :: LET-23 :: hEGFR-ΤΚ [L858R],

rol-6 (su1006)

],

jgIs19

[

ας-23ρ Ιστοσελίδα :: LET-23 :: hEGFR,

rol-6 (su1006)

],

jgIs25

[ ,,,0],

ας-23ρ Ιστοσελίδα :: LET-23 :: hEGFR-TK [Τ790Μ-L858R],

rol-6 (su1006), μυο-2P :: mCherry

],

jgIs14

[

EGL-17β Ιστοσελίδα :: EMR-1 :: RFP,

DHS-31P Ιστοσελίδα :: NLS :: GFP,

rol-6 (su1006)

], JJ1136 (HMP-1 :: GFP), PS4657 (AJM-1 :: GFP) και PS3352 (CDH-3 :: GFP).

Κατασκευή LET-23 :: hEGFR χιμαιρικά πλασμίδια

χρησιμοποιείται γονιδιακό DNA του

ας-23

γονιδίων και cDNA που κωδικοποιεί ανθρώπινο EGFR. Κάθε θραύσμα DNA ενισχύθηκε με PCR, κλωνοποιήθηκε εντός του ρΟΕΜ-Τ Easy (Promega Inc., Madison, WI, USA), και επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας. Στη συνέχεια συναρμολογούνται τα θραύσματα DNA με τη χρήση κατάλληλων ενζύμων περιορισμού και των αντίστοιχων θέσεις του φορέα pPD117.01 (Dr. Andrew Fire, Stanford Univ., CA, USA). QuikChange τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση (Cat # 200523, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA) του EGFR-TK cDNA διεξήχθη για να παραχθεί EGFR [L858R], EGFR [Τ790Μ] και EGFR [Τ790Μ-L858R]. Η λεπτομερής διαδικασία και εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη παρέχονται στα συμπληρωματικά υλικά (Εικ. S1B). Για να χρησιμοποιήσετε ως δευτερεύον κυτταρικό δείκτη μοίρα, pJG205 κατασκευάστηκε συνδυάζοντας ένα PCR θραύσμα ενισχύθηκε από το γονιδιωματικό DNA αλληλουχία 4.0 kb ανοδικά του

EGL-17

με

EMR-1

cDNA, DsRed ( RFP, Clontech της TAKARA Βιο Inc.) και pPD95.77 (Α Fire). Η αλληλουχία GFP κωδικοποίηση pPD95.77 αντικαταστάθηκε με DsRed cDNA. Ένας άλλος δείκτης της κυτταρικής τύχης, pJG207, έγινε με κλωνοποίηση του

περιοχή του υποκινητή του DHS-31

σε pPD95.69 (Α Fire), το οποίο περιέχει το σήμα πυρηνικού εντοπισμού SV40 (NLS) και GFP. Όλα τα κατασκευάσματα πλασμιδίου επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση.

μικροέγχυσης και ολοκλήρωση

Η συγκέντρωση έγχυση κατασκευασμάτων DNA και οι δείκτες ήταν 75 μg /ml pRF4 [

rol-6 (su1006)

], 50 ή 25 μg /ml EGFR χιμαιρικά πλασμίδια, 50 μg /ml

ΤΤΧ 3 :: GFP

, 35 μg /ml pJG205 [

EGL-17ρ

:: EMR-1: : RFP], 40 μg /ml pJG207 [

DHS-31P Ιστοσελίδα :: NLS :: GFP], και 5 μg /ml pCFJ90 [

μυο-2P Ιστοσελίδα :: mCherry] (Addgene, Cambridge, ΜΑ, USA). Η συνολική συγκέντρωση DNA του κάθε μίγματος ένεση ήταν 150 μg /ml, με pBluescript SK + DNA προστίθενται όταν είναι αναγκαίο. Όλες οι ολοκληρωμένες σειρές έγιναν με τη χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας και έξω-διέσχισε τέσσερις φορές.

Μικροσκοπίας και Hoechst33342 χρώση

Όλοι οι μικροσκοπικές εικόνες συλλήφθηκαν και επεξεργασία χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή AxioCam HRc συνδέεται με μια φθορισμού Imager M1 μικροσκόπιο και Axiovision Σχετ. 4.6 λογισμικό (Zeiss Inc., Γερμανία). Για Hoechst33342 (Molecular Probes of Life Technologies Co., Grand Island, ΝΥ, USA) χρώση,

jgIs6

σκουλήκια συλλέχθηκαν και πλύθηκαν αρκετές φορές με ρυθμιστικό Μ9. Τα σκουλήκια υποβλήθηκαν στη συνέχεια βυθίστηκε σε 1 μg ml Hoechest33342 διαλύματος /για 30 λεπτά. Μετά το πλύσιμο, τα σκουλήκια ήταν προετοιμασμένοι για παρατήρηση.

Χημική επεξεργασία και στατιστική

Χημικά συμπεριλαμβανομένων gefitinib, erlotinib, U0126, AZD6244, PD0325901 και WZ4002 αγοράστηκαν από Σέλεκ Chemicals LLC. (Houston, ΤΧ, USA), και το 1280 χημική βιβλιοθήκη αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, ΜΟ, USA). Οι άλλες 7.680 χημικές ουσίες που ελήφθησαν από την Κορέα Chemical Bank of KRICT. Χημικές ουσίες διαλύθηκαν σε διάλυμα DMSO 100%, και διατηρήθηκε στους -20 ° C για 1 ή 10 mM αποθέματα για διαλογή. Όλες οι χημικές δοκιμασίες εκτελέστηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων, και ο τελικός όγκος ανά φρέαρ ήταν 100 μΙ συμπεριλαμβανομένου σκουλήκια, χοληστερόλη, και τα νεκρά

E. coli

. Η συγκέντρωση DMSO της ομάδας ελέγχου διατηρήθηκε στο 0,5%, και DMSO συγκεντρώσεις όλων των πειραματικών ομάδων ήταν κάτω από 0,5%. Η τελική χημική συγκέντρωση που χρησιμοποιείται για την οθόνη ήταν 5 μΜ και 20 έως 50 σκουλήκια L1 καλλιεργήθηκαν σε κάθε φρεάτιο της πλάκας 96 φρεατίων. Κάθε χημική δοκιμή περιλαμβάνονται τουλάχιστον τρία φρεάτια ανά χημικών και επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές. Οι γραμμές σφάλματος σε όλα τα γραφήματα αντιπροσωπεύουν SD (τυπική απόκλιση), και

P

τιμές σε σχέση με τον έλεγχο υπολογίστηκαν από αταίριαστα Φοιτητών

t-test

.

Αποτελέσματα

χιμαιρική πρωτεΐνη LET-23 :: hEGFR-ΤΚ είναι λειτουργικό σε

C. elegans

Η

Για να αναπτυχθεί μια

C. elegans

πρότυπο σύστημα για την οθόνη για χημικές ουσίες που αναστέλλουν την ανθρώπινη EGFR (hEGFR) δραστηριότητα, σχεδιάσαμε το πλασμίδιο κατασκευάσματα που εκφράζουν το

C. elegans

ορθόλογο EGFR, LET-23, και η πρωτεΐνη σύντηξης hEGFR, ανταλλάσσοντας την κυτταροπλασματική ή ΤΚ τομέα της LET-23 με κάθε τομέα hEGFR (Εικ. 1Α και Εικ. S1). Επιδιώξαμε να διευκολυνθεί λειτουργική έκφραση του ανθρώπινου ομολόγου σε

C. elegans

διατηρώντας το μεγαλύτερο μέρος του

C. elegans

LET-23 κωδικοποίησης και ρυθμιστικές αλληλουχίες, για παράδειγμα, με τη διατήρηση Ο-τερματικά υπολείμματα σημαντικό για τη σωστή διακίνηση [15]. Οι υποθετικές προϊόντα πρωτεΐνης αυτών των διαγονιδίων έχει 1388 αμινοξέα (LET-23 :: hEGFR) ή 1323 αμινοξέα (LET-23 :: hEGFR-ΤΚ). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α και το Σχήμα S2, LET-23 :: hEGFR περιλαμβάνει 841 αμινοξέα της LET-23 Ν-τερματικό πεδίο, 542 αμινοξέα του C-τερματικού τομέως ανθρώπινο EGFR, και 5 αμινοξέα του LET-23 ΡΟΖ αλληλεπιδρούν μοτίβο. LET-23 :: hEGFR-ΤΚ περιλαμβάνει 841 αμινοξέα της LET-23 Ν-τερματικό πεδίο, 306 αμινοξέα της ανθρώπινης περιοχής EGFR-TK, και 176 αμινοξέα της LET-23 περιοχή C-τερματικό. Για να ελέγξετε αν αυτή η χιμαιρική πρωτεΐνη LET-23 :: hEGFR-ΤΚ είναι λειτουργικό, το κατασκεύασμα μικροενέθηκε στο

ας-23 (SY1)

μεταλλαγμένα. Οι περισσότεροι

ας-23

μεταλλάξεις είναι θανατηφόρα, αλλά

ας-23 (SY1)

είναι βιώσιμο και vulvaless (Vul) λόγω της ανώμαλης διακίνησης των ΑΣ-23 [15] – [17]. Η χιμαιρική LET-23 :: hEGFR-ΤΚ πρωτεΐνη διασωθεί το φαινότυπο Vul του

ας-23 (SY1)

(Εικ. 1Β), υποδηλώνοντας ότι η χιμαιρική πρωτεΐνη είναι λειτουργική στο

C. elegans

. Όταν το

ας-23 (SY1)

μεταλλαγμένο διασώθηκε με

jgIs19

, ένα ολοκληρωμένο στέλεχος που περιέχει το διαγονίδιο LET-23 :: hEGFR, η

ας-23 (SY1)? jgIs19

στέλεχος έδειξε σημαντικά μειωμένη vulvaless πληθυσμού (9,1%) σε σύγκριση με το

ας-23 (SY1)

μεταλλαγμένα (92%) (Εικ. S1c).

(Α) LET-23 και ΑΣ-23 που βασίζεται σε κατασκευές χιμαιρικών υποδοχέων. Όλα τα κατασκευάσματα έχουν σχεδιαστεί για να εκφράσουν κάθε χιμαιρικό υποδοχέα από το

ας-23

υποκινητή. (Β) Η LET-23 :: hEGFR-ΤΚ χίμαιρα διασώζει την vulvaless φαινότυπο του

ας-23 (SY1)

μεταλλαγμένα. (Γ) Η σύγκριση των διαφόρων μεταλλάξεων MUV και το

jgIs6

διαγονιδιακό στέλεχος που εκφράζει LET-23 :: hEGFR-ΤΚ [L858R].

C. elegans

εκφράζοντας LET-23 :: hEGFR-ΤΚ [L858R] παρουσίασαν μια μεγαλύτερη pseudovulva σε σύγκριση με το

ας-23 (SA62)

και

ας-60 (n1700)

μεταλλάξεις MUV. (D) Hoechst33342 (Η33342) χρώση του pseudovulval περιοχής στο

jgIs6

αποκάλυψε πολλά πυρήνες. Οι εγκιβωτισμένες περιοχή του κάτω πάνελ μεγεθύνεται στο δεξί πλαίσιο. (Ε) Έκφραση ενός δείκτη κυτταρικής 1 °, CDH-3 :: GFP στο σκουλήκι άγριου τύπου και

jgIs6

. CDH-3 :: GFP εκφράζεται έντονα τόσο στο αιδοίο και pseudovulva του

jgIs6

. (F) Έκφραση των 2 ° αιδοίου δείκτες κυτταρικής τύχης στο

lin-15

MUV μεταλλαγμένων και

jgIs6

. γονίδια ρεπόρτερ που ελέγχεται από υποστηρικτές του

EGL-17

και

DHS-31

εκφράστηκαν στο αιδοίο και pseudovulva. Αιχμές βελών δείχνουν κανονική αιδοίου και τα μικρά βέλη δείχνουν pseudovulvae. Κλίμακα μπαρ, 50 μm.

Η

Στη συνέχεια, θα αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της υπερ-εκφράζουν την ενεργοποίηση μεταλλαγμένη μορφή του ΑΣ-23 :: hEGFR-ΤΚ σε ένα

ας-23

( +) υπόβαθρο. Η αυξημένη δραστηριότητα των EGFR-Ras-ΜΑΡΚ μονοπάτι οδηγεί στην υπερ-επαγωγή του αιδοίου κυττάρων, που αναφέρονται ως ένα φαινότυπο MUV, όπως παρατηρείται με την ημι-κυρίαρχο

ας-23 (SA62)

μετάλλαξης και η ουσιαστικά δραστική

ας-60 (n1700)

μετάλλαξη.

lin-15

δρα ανάντη του

ας-23

να ρυθμίζουν αρνητικά την πορεία του EGFR-Ras-ΜΑΡΚ [18]. Αυτή η αρνητική ρύθμιση διαταράσσεται στο

lin-15 (n765)

μεταλλαγμένα, με αποτέλεσμα μια ισχυρή φαινότυπο MUV [18], [19]. Έτσι, αναμένεται ότι οι μεταλλάξεις ενεργοποίησης στην περιοχή ΤΚ του EGFR θα προκαλούσε επίσης ένα φαινότυπο MUV. Δύο ενεργοποίηση μεταλλάξεων EGFR που προσδίδουν gefitinib ευαισθησία σε ορισμένους καρκίνους του πνεύμονα δοκιμάστηκαν: EGFR [L858R] και EGFR [Δ747-752] [20], [21]. Σε πλαίσιο διαγραφές στο εξόνιο 19, συμπεριλαμβανομένων Δ747-749 (44%), και μεταλλάξεις μόνο σημείο στο εξόνιο 21, συμπεριλαμβανομένων L858R (41%) είναι η πιο συχνά βρέθηκε EGFR-TK ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο NSCLC [20],. Το gefitinib ανθεκτικό EGFR [Τ790Μ-L858R] μετάλλαξη δοκιμάστηκε επίσης. Τ790Μ είναι ένα δευτερεύον μετάλλαξη η οποία προσδίδει αντίσταση gefitinib στην αλλοίωση L858R [21]. Χιμαιρικά LET-23 :: hEGFR-ΤΚ που περιέχουν οποιαδήποτε από αυτές τις μεταλλάξεις επάγονται την υπερ-επαγωγή του αιδοίου κύτταρα οδηγώντας σε φαινότυπο MUV (Σχ. 1C και Πίνακας 1). Διαγονιδιακά ζώα που εκφράζουν LET-23 :: hEGFR-ΤΚ [L858R] ή αφήστε-23 :: hEGFR-TK [Τ790Μ-L858R] είχε ένα φαινότυπο παρόμοιο με

lin-15 (n765)

, με 2-4 μεγάλο pseudovulvae. Σε αντίθεση, τα διαγονιδιακά ζώα που εκφράζουν LET-23 :: hEGFR-ΤΚ [Τ790Μ] δεν εμφανίζουν ένα φαινότυπο MUV. Για να διευκολυνθεί η περαιτέρω ανάλυση, έχουμε επιλέξει μια LET-23 :: hEGFR-ΤΚ [L858R] διαγονιδιακών γραμμή για να δημιουργήσει

jgIs6

, ένα στέλεχος με το διαγονιδιακό σειρά ενσωματωθεί στο γονιδίωμα. Ενσωμάτωση του διαγονιδίου βελτιωθεί σημαντικά η διεισδυτικότητα του φαινοτύπου MUV? 49% MUV πριν από την ένταξη έναντι 94,6% MUV μετά την ολοκλήρωση (Πίνακας 1). Η χρώση των πυρήνων με Hoechst33342 αποκάλυψε την παρουσία πολλών πυρήνων στη pseudovulval περιοχή (Εικ. 1 D), και αυτό σημαίνει ότι οι αριθμοί κυττάρων αυξήθηκαν στην pseudovulva διαγονιδιακών στελέχους μας παρόμοια με άλλες μεταλλάξεις MUV όπως

ας-60 ( n1700)

, και

lin-15 (n765)

. Τα διαγονιδιακά ζώα έδειξαν ένα κυλιόμενο φαινότυπο επειδή pRF4 [

rol-6 (su1006)

] χρησιμοποιήθηκε ως ένα διαγονιδιακό δείκτη. Για να διευκολυνθεί η MUV ανίχνευσης φαινότυπο, εισαγάγαμε το

SQT-1 (jg52)

μετάλλαξη στις διαγονιδιακές σειρές. Αυτό το

SQT-1

μετάλλαξη καταστέλλει το κυλιόμενο φαινότυπο του

rol-6

χωρίς εμφανή ελαττώματα [23]. Απροσδόκητα, βρήκαμε ότι το

SQT-1 (jg52)

μετάλλαξη ενισχύεται το φαινότυπο MUV των διαγονιδιακών γραμμών EGFR (Πίνακας 2).

Η

Ο φαινότυπος MUV της

jgIs6

οφείλεται σε έκτοπη ενεργοποίηση του LET-23 /οδός EGFR

για να επιβεβαιώσετε ότι ο σχηματισμός pseudovulvae στο

jgIs6

οφείλεται σε συγκεκριμένες ενεργοποίηση του EGFR-Ras-ΜΑΡΚ μονοπάτι από το χιμαιρικό LET-23 :: hEGFR-ΤΚ [L858R] πρωτεΐνη, εκτελέσαμε RNAi γονιδίων στο μονοπάτι EGFR-Ras-ΜΑΡΚ. Συνεπής με έκτοπη ενεργοποίηση της οδού EGFR-Ras-ΜΑΡΚ, knock-down των γονιδίων κατάντη του

ας-23

, συμπεριλαμβανομένων των

ας-60 /Ras, ΜΕΚ-2 /ΜΕΚ

, και

MPK-1 /ΜΑΡΚ

, κατέστειλε το φαινότυπο MUV του

jgIs6

. RNAi του /γονιδίου LET-23 EGFR ανάντη

lin-3 /EGF

επίσης κατέστειλε την φαινότυπο MUV. Ο φαινότυπος MUV άλλου διαγονιδιακών γραμμή,

jgIs25

, η οποία εκφράζει LET-23 :: hEGFR-TK [L858R-T790M], επίσης κατέστειλε με RNAi του

lin-3, αφήστε-60, ΜΕΚ -2

, και

MPK-1

(Εικ. S3A). Από το μονοπάτι Wnt δρα παράλληλα με την

lin-3

να διατηρήσει VPC αρμοδιότητες [24], θα πραγματοποιηθεί επίσης το γονίδιο μονοπατιού Wnt νοκ ντάουν με RNAi για να ελέγξετε αν Wnt δραστηριότητα επηρεάζει τον σχηματισμό MUV στο

jgIs25

. Δύο Wnt γονίδια οδού (

bar-1

και

CWN-2

) ελέγχθηκαν, επειδή τα νοκ ντάουν φαινότυποι τους που συνδέονται με αιδοίου ανάπτυξη [25], [26]. Παρόμοια με

lin-3

νοκ ντάουν, RNAi του

bar-1

ή

CWN-2

οδήγησε στην καταστολή του φαινοτύπου MUV του

jgIs25

( ). Παρατηρήσαμε σπάνια προνυμφών θνησιμότητα από αυτά τα πειράματα επειδή RNAi συγχρονισμένη προνύμφες L1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με RNAi, ίδιο με την ίδια μέθοδο που χρησιμοποιήθηκε για την φαρμακευτική αγωγή που περιγράφεται παρακάτω. Για να επιβεβαιώσετε το θανατηφόρο RNAi επίδραση του EGFR κατάντη γονιδίων, που αντιμετωπίζονται

jgIs25

L4 προνύμφες με

ας-60

ή

MPK-1

RNAi, και μετρήθηκαν οι αριθμοί των F1 απόγονοι. Προνυμφών θνησιμότητα αυξήθηκε σημαντικά από το

ας-60

ή

MPK-1

RNAi (Σχ. S3C).

σύγκριση των δεικτών του αιδοίου της κυτταρικής τύχης στο

jgIs6

και MUV μεταλλάκτες που έχουν την οδό EGFR-Ras-ΜΑΡΚ ενεργοποιούνται. Όταν εξετάστηκε το 1 ° δείκτη κυτταρικής τύχης,

jgIs6

pseudovulvae έδειξε έκφραση του 1 ° δείκτη κυτταρικής τύχης CDH-3 :: GFP (Σχ. 1Ε). CDH-3 είναι ένας καντερίνης που εκφράζονται στα 1 ° vul κύτταρα C, D, E, F και [27]. Για να ελέγξετε για την έκφραση δείκτη 2 ° μοίρας, κατασκευάσαμε ένα ολοκληρωμένο διαγονιδιακά γραμμή που εκφράζει τόσο την GFP

EGL-17β Ιστοσελίδα :: EMR-1 :: RFP και

DHS-31P Ιστοσελίδα :: NLS :: . EGL-17 εκφράζεται στα vul Γ και Δ κύτταρα 2 °, και DHS-31 στο 2 ° vul Β1, Β2 και D κυττάρων στο ενήλικο στάδιο [27], [28]. EMR-1 είναι ένα ομόλογο της ανθρώπινης αναπόσπαστο πρωτεΐνη πυρηνικής μεμβράνης emerin [29], και ως εκ τούτου, προκαλεί εντοπισμός στον πυρηνικό φάκελο. Σε ένα υπόβαθρο άγριου τύπου,

EGL-17β Ιστοσελίδα :: EMR-1 :: RFP και

DHS-31P Ιστοσελίδα :: NLS :: GFP εκφράζονται στον πυρηνικό φάκελο και τον πυρήνα του 2 ° αιδοίου κύτταρα, αντίστοιχα. Τόσο

lin-15 (n765)

και

jgIs6

ζώα είχαν παρόμοια πρότυπα έκφρασης των

EGL-17β Ιστοσελίδα :: EMR-1 :: RFP και

DHS -31p Ιστοσελίδα :: NLS :: GFP (Σχ. 1F). Για την περαιτέρω σύγκριση των

jgIs6

και MUV μεταλλάξεις, εξετάσαμε την έκφραση του AJM-1 :: GFP και HMP-1 :: GFP, που και οι δύο εκφράζονται στη διασταύρωση προσφύσεως και σηματοδοτούν τα όρια των πολλαπλασιαζόμενων και διαφοροποίηση επιθηλιακών κυττάρων [30]. AJM-1 :: GFP και HMP-1 έκφρασης :: GFP παρατηρήθηκε σε κοιλιακή εγκολπώσεις, συμπεριλαμβανομένων των υποθετικών pseudovulval περιοχών

jgIs6

,

ας-60 (n1700)

, και

lin-15 (n765)

μεταλλάξεις στο στάδιο L4. Αυτές οι δύο δείκτες διασταύρωση παρατηρήθηκαν επίσης στην pseudovulva του

jgIs6

στο ενήλικο στάδιο (Εικ. S4). Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματα που περιγράφονται παραπάνω δείχνουν ότι το

jgIs6

διαγονιδιακό στέλεχος που εκφράζει τις χιμαιρικές LET 23-:: hEGFR-ΤΚ [L858R] εμφανίζουν χαρακτηριστικά πρωτεΐνη που είναι συνεπής με υπερ-ενεργοποίηση του μονοπατιού EGFR στην MUV μεταλλάξεις.

Gefitinib και ερλοτινίμπη αναστέλλει τον φαινότυπο MUV του

jgIs6

η

Για να προσδιορίσετε αν το

jgIs6

διαγονιδιακό στέλεχος που εκφράζει το χιμαιρικό LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] πρωτεΐνη θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε μία οθόνη μεγάλης κλίμακας για αναστολείς ανθρώπινο EGFR-TK, εξετάσαμε τα αποτελέσματα της gefitinib ναρκωτικών και erlotinib. Όταν άγριου τύπου

C. elegans

υποβλήθηκαν σε θεραπεία με gefitinib, ακόμη και υψηλές δόσεις (40 μΜ) δεν επηρέασε την εμβρυογένεση ή προνυμφών ανάπτυξη (Εικ. 2Α). Αυτό έδειξε ότι το gefitinib δεν είναι τοξικό για άγριου τύπου

C. elegans

, και φαίνεται να έχουν μικρή ή καθόλου επίδραση στην LET-23 λειτουργία, η οποία δεν αποτελεί έκπληξη, δεδομένου του χαμηλού ταυτότητα αλληλουχίας με την ανθρώπινη πρωτεΐνη EGFR ή συσχέτιση της απάντησης gefitinib και ενεργοποιώντας μεταλλάξεις του EGFR [31]. Σε αντίθεση, ο φαινότυπος MUV του

jgIs6

ανεστάλη μέχρι το 90% από 1 μΜ gefitinib και αναστέλλεται πλήρως από 5 μΜ gefitinib (Σχ. 2Β και C). Λαμβάνοντας υπόψη ότι 250 ή 500 mg gefitinib στόματος μία φορά ημερησίως συνιστάται για ασθενείς με καρκίνο (περίπου 10 μΜ) [4], [32], η ανασταλτική δράση του gefitinib φαίνεται να είναι παρόμοια σε

C. elegans

και τους ανθρώπους. Για την επαλήθευση του μηχανισμού δράσης των αναστολέων EGFR αναστρέψιμη-ΤΚ (ΤΚΙδ) για LET-23 μας :: hEGFR-ΤΚ-εκφράζουν διαγονιδιακά

C. elegans

, θα αντιμετωπίζονται

jgIs25

με gefitinib. Η μετάλλαξη Τ790Μ μπορεί να οδηγήσει σε μεταβολή της τοπολογίας EGFR που αποκλείει τη δέσμευση του EGFR αναστρέψιμη-TKIs μέσω στερεοχημικής παρεμπόδισης ή Τ790Μ μπορεί να αυξήσει την συγγένεια της περιοχής κινάσης για ΑΤΡ [21], [33] – [35]. θεραπεία Gefitinib δεν ανέστειλε τον φαινότυπο MUV του

jgIs25

(Σχ. 2C). Η erlotinib, ένα άλλο EGFR-ΤΚΙ αντικαρκινικό φάρμακο, που παράγεται παρόμοια ανασταλτικά αποτελέσματα στο gefitinib (Σχ. 2D). Προσπαθήσαμε να συγκρίνει το επίπεδο έκφρασης των δύο χιμαιρικών πρωτεϊνών από το

jgIs6

και

jgIs25

, αλλά ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει ποσοτικά τη χιμαιρική πρωτεΐνη. Υποθέτοντας παρόμοια επίπεδα έκφρασης διαγονιδιακών, η παρατηρούμενη διαφορά στην δραστικότητα είναι πιθανόν να οφείλεται σε μια μείωση στην ευαισθησία φαρμάκου που παρέχει τη μετάλλαξη L858R.

(Α) Μια υψηλή δόση gefitinib (40 μΜ) δεν επηρεάζει την κανονική εμβρυογένεση , προνυμφών ανάπτυξη, ή αιδοίου σχηματισμό του άγριου τύπου

C. elegans

. (Β) Gefitinib ανέστειλε την φαινότυπο MUV του

jgIs6

οποία εκφράζει LET-23 :: hEGFR-ΤΚ [L858R]. (C) Gefitinib ανέστειλε την φαινότυπο MUV του

jgIs6

με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, αλλά δεν ανέστειλε ότι του

jgIs25

, η οποία εκφράζει LET-23 :: hEGFR-TK [Τ790Μ-L858R ]. Αριθμοί των σκουληκιών μετρήθηκαν (

n

) ήταν 159, 96, 130, 85, 87, 125, 108 και 88 από τα αριστερά κατά μήκος του άξονα Χ. (Δ) Η erlotinib παρήγαγε ένα παρόμοιο αποτέλεσμα με gefitinib τόσο

jgIs6

και

jgIs25

μοντέλα. (

n

= 159, 96, 67, 110, 80, 106, 95 και 176). (Ε) Προσδιορισμός της αναπτυξιακό στάδιο του

jgIs6

ότι είναι πιο δεκτικά σε gefitinib. Όπως και στην κανονική αιδοίου ανάπτυξης, πρώιμη προνύμφες (L1-L3) ανταποκρίθηκαν καλά στο gefitinib. (

n

= 128, 224, 134, 116, 139, 167, 99 και 66). Ράβδοι κλίμακας, 50 μm (Α, Β). Χ-άξονα, η συγκέντρωση της gefitinib (C), erlotinib (D) και το στάδιο σκουλήκι της θεραπείας gefitinib (Ε). Υ-άξονας,% των σκουληκιών που δείχνει το φαινότυπο MUV (Ο-Ε). *

P

& lt?. 0.001

Η

Για τον προσδιορισμό του σταδίου ανάπτυξης σκουλήκι κατά την οποία θεραπείας gefitinib είναι πιο αποτελεσματική, θα αντιμετωπίζονται

jgIs6

κάθε στάδιο της προνύμφης με 1 μΜ gefitinib, και σημείωσε το φαινότυπο MUV στο ενήλικο στάδιο. Τα ζώα που εκτίθενται σε gefitinib από τα στάδια L1, L2, L3 ή έδειξαν μία αξιοσημείωτη μείωση στον φαινότυπο MUV, και ο βαθμός της ανταπόκρισης ήταν παρόμοια μεταξύ των τριών σταδίων (Σχ. 2Ε). L4 ζώα δεν ήταν τόσο ευαίσθητα στο gefitinib, υποδεικνύοντας ότι η θεραπεία gefitinib πριν από την πτερόρροια L3 /L4, όταν αιδοίου μυημένους ανάπτυξη, είναι ζωτικής σημασίας για την αποτελεσματική αναστολή της LET-23 :: hEGFR-ΤΚ [L858R] πρωτεΐνη. Από αυτό το αποτέλεσμα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η έγκαιρη προνύμφες από L1 έως L3, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διαλογή νέων αναστολέων έναντι της ενεργοποιημένης μονοπατιού σηματοδότησης EGFR-TK.

Pilot οθόνη για αναστολείς που καταστέλλουν το φαινότυπο MUV του

jgIs6

Η

με βάση τα πρώτα αποτελέσματα μας, σχεδιάσαμε ένα πρωτόκολλο για μεγάλης κλίμακας διαλογή υψηλής απόδοσης των αναστολέων του EGFR χρησιμοποιώντας το

jgIs6

. Για την παρασκευή ενός μεγάλου αριθμού προνυμφών συγχρονισμένη,

C. elegans

αναπτύχθηκαν μέχρι οι πλάκες γεμίζουν με αυγά, και οι προνύμφες και οι ενήλικες απομακρύνθηκαν με απλό πλύσιμο με ρυθμιστικό Μ9. Μετά από 12 ώρες, έχουν εκκολαφθεί προνύμφες συλλέχθηκαν και πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό Μ9. Εμείς διανέμεται προνύμφες L1 σε πλάκες 96-φρεατίων που περιείχε ένα μείγμα των νεκρών

E. coli

και οι χημικές ουσίες που δοκιμάζεται. Μετά από 3-4 ημέρες, ο φαινότυπος MUV παρατηρήθηκε σε ανατομικό μικροσκόπιο (Εικ. 3Α). Χρησιμοποιώντας αυτό το πρωτόκολλο, πραγματοποιήσαμε μια οθόνη των 1.280 μικρών μορίων με γνωστούς μοριακούς στόχους και την αποτελεσματικότητα. Μεταξύ των 1.280 χημικές ουσίες, AG1478 και U0126 ανέστειλε την φαινότυπο MUV του

jgIs6

. AG1478 είναι ένας αναστολέας του EGFR που χρησιμοποιούνται συχνά στην

in vitro

πειράματα, με μια δομή παρόμοια με gefitinib (Σχ. 3Β). U0126, η οποία είναι γνωστή ως αναστολέας της ΜΕΚ, ανέστειλε την

jgIs6

MUV φαινότυπο στα 5 μΜ, αλλά όχι σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (Σχ. 3C). Όταν

jgIs25

εξετάστηκαν οι επιπτώσεις της AG1478 και U0126 στο gefitinib ανθεκτικό [Τ790Μ-L858R] μοντέλο LET-23 :: hEGFR-ΤΚ, μόνο U0126 είχε ανασταλτικό αποτέλεσμα, ενώ AG1478 ήταν αναποτελεσματική (Εικ. 3D).

(Α) μέθοδος διαλογής, συμπεριλαμβανομένων συγχρονισμό των

C. elegans

και υγρή καλλιέργεια χρησιμοποιώντας την πλάκα 96 φρεατίων για την οθόνη αναστολέα. (Β) Χημικές δομές των gefitinib, AG1478 και U0126. (C) Τόσο AG1478 και U0126 αναστέλλουν τον φαινότυπο MUV του

jgIs6

κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο. (

n

= 295, 193, 381, 133, 254, 304 και 415 από τα αριστερά κατά μήκος του άξονα Χ). (D) Επίδραση της gefitinib, erlotinib, AG1478 και U0126 στο

jgIs25

. Gefitinib, erlotinib, και AG1478 δεν αναστέλλει το φαινότυπο MUV του

jgIs25

, αλλά U0126 αναστέλλεται. (

n

= 81, 99, 106, 90 και 81). Χημική συγκέντρωση, 5 μΜ. *

P

& lt?. 0.001

Η

ΜΕΚ αναστολείς μπορούν δυνητικά τη θεραπεία του καρκίνου του gefitinib ανθεκτικά

Η παρατήρηση ότι U0126 ανέστειλε την φαινότυπο MUV του

jgIs25

πρότεινε ότι ορισμένοι αναστολείς ΜΕΚ μπορεί να έχουν τη δυνατότητα να αναστείλουν gefitinib ανθεκτικές μορφές μεταλλάξεων EGFR. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε τις επιδράσεις του άλλου αναστολέα ΜΕΚ, PD0325901, καθώς και ένα Raf [V600E] αναστολέα (AZD6233), και ένα EGFR [Τ790Μ] αναστολέα (WZ4002) στο σύστημα μοντέλο μας. Καμία από αυτές τις χημικές ουσίες ανέστειλαν τον φαινότυπο MUV του

jgIs6

ζώα, σε δόσεις αποτελεσματικές για U0126 (1 μΜ ή 5 μΜ) (Σχ. 4Α). Ωστόσο, σε υψηλότερες δόσεις (5 μΜ ή 20 μΜ), ο αναστολέας ΜΕΚ PD0325901 ανέστειλε ελαφρώς τον φαινότυπο MUV του

jgIs25

(Εικ. 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε ένα side-by-side δοκιμή, όπου

jgIs6

και

jgIs25

ζώα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 100 μΜ του κάθε χημικού να τηρούν τις επιδράσεις στο φαινότυπο MUV. WZ4002, η οποία είναι ένας αναστολέας έναντι του EGFR [T790M] μετάλλαξη φύλακα [36], ανέστειλε την φαινότυπο MUV του

jgIs25

καλύτερη από εκείνη του

jgIs6

. Παρόμοια με U0126, PD0325901 ανέστειλε πλήρως τον φαινότυπο MUV των δύο

jgIs6

και

jgIs25

(Εικ. 4C). Δοκιμάσαμε επίσης το κατά πόσον αυτές οι χημικές ουσίες στόχος

C. elegans

γονίδια από τη θεραπεία το

lin-15

MUV μετάλλαξη με U0126 και PD0325901. Τόσο U0126 και PD0325901 κατέστειλε το φαινότυπο MUV του

lin-15

σε υπερβολική συγκέντρωση (Εικ. 4D). Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι

ΜΕΚ-2

, ένα από τα ΜΕΚ στο

C. elegans

που σχετίζεται με αιδοίου ανάπτυξης, είναι ένας από τους πιθανούς υποψηφίους στόχο U0126 και PD0325901.

(Α) U0126, PD0325901 (αναστολέας ΜΕΚ), AZD6244 (RAF [V600E] αναστολέα) και WZ4002 (EGFR [T790M] αναστολέα) προστέθηκαν στο

jgIs6

. (

n

= 86, 94, 116, 64, 88, 66, 79, 110 και 98 από τα αριστερά κατά μήκος του άξονα Χ). (Β) Χημικές ουσίες προστέθηκαν στο gefitinib ανθεκτικά

jgIs25

. αναστολείς ΜΕΚ, U0126 και PD0325901, ανέστειλε την φαινότυπο MUV του

jgIs25

, αλλά οι άλλες χημικές ουσίες δεν το έκανε. (

n

= 64, 100, 128, 113, 89, 64, 63, 79 και 98). (C) Οι υπερβολικές δόσεις (100 μΜ) των χημικών ουσιών προστέθηκαν στο

jgIs6

και

jgIs25

. Δύο ΜΕΚ αναστολείς ανέστειλε πλήρως τον φαινότυπο MUV του

jgIs6

και

jgIs25

. WZ4002 ανέστειλε την φαινότυπο MUV του

jgIs25

καλύτερη από εκείνη του

jgIs6

. (

n

= 160, 213, 186, 312, 195, 323, 192 και 237). (Δ) Ο φαινότυπος MUV του

lin-15

κατεστάλη από U0126 και PD0325901? χημική συγκέντρωση, 100 μΜ (Χ-άξονας). (

n

= 119, 89, 90 και 143). *

P

& lt? 0.001

Η

Όλα τα διαγονιδιακά στελέχη που εκφράζουν τα ενεργοποιημένα χίμαιρες EGFR, συμπεριλαμβανομένων των

jgIs6

και

jgIs25

, αναπτύσσονται αργά (. Το Σχ. 5Α και Σχ. S5) παρόμοια με διαγονιδιακά στελέχη που εκφράζουν εκτοπικά LIN-3 /EGF [37]. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι αναστολείς του EGFR-TK επισκευαστεί το ρυθμό ανάπτυξης του

jgIs6

στο επίπεδο του άγριου τύπου, και U0126 και PD0325901 διασωθεί το ρυθμό ανάπτυξης των δύο

jgIs6

και

jgIs25

(Εικ. 5Β).

(Α) αναλογίες των ενηλίκων σε 3 ημέρες μετά την τοποθέτηση των εμβρύων στο πιάτο. Όλα τα στελέχη άγριου τύπου ήταν ενήλικες, αλλά οι περισσότεροι

jgIs6

και

jgIs25

διαγονιδιακά στελέχη ήταν νεότεροι από το στάδιο L4. Πέντε ενήλικες μεταφέρθηκαν σε κάθε πλάκα και αφαιρέθηκαν μετά από 6 ώρες ωοτοκία. Τρεις ημέρες μετά την αφαίρεση σκουλήκια P0, παρατηρήθηκαν F1 σκουλήκια. Τέσσερις πλάκες μετρήθηκαν για κάθε στέλεχος. (

n

= 488, 313, 104 και 94 από τα αριστερά κατά μήκος του άξονα Χ). *

P

& lt? 0.001 και **

P

& lt? 0,05. (Β) U0126 και PD0325901 κατέστειλε το φαινότυπο βραδείας ανάπτυξης των

jgIs6

και

jgIs25

. Gefitinib και AG1478 κατέστειλε το φαινότυπο βραδείας ανάπτυξης των

jgIs6

, αλλά όχι

jgIs25

. στάδιο προνυμφών L1 επωάστηκαν με κάθε χημικό για 4 ημέρες σε πλάκες 96 φρεατίων, και ανακτήθηκαν σε ένα φρέσκο ​​πιάτο για 6 ώρες πριν από τη λήψη φωτογραφιών.

C. elegans

αυξήθηκε αργά όταν καλλιεργούνται σε τρυβλία 96 φρεατίων. Ελέγχου (0,5% DMSO) και χημική συγκέντρωση (50 μΜ). μπαρ κλίμακα, 500 μm.

Η

Συζήτηση

Κατασκευάσαμε διαγονιδιακά

C. elegans

περιέχουν αρκετά διαφορετικά κατασκευάσματα EGFR. Διαγονιδιακά γραμμές που εκφράζουν LET-23 :: hEGFR χιμαιρικών υποδοχέων επέδειξε μια πολύ ισχυρότερη φαινότυπο από εκείνα που εκφράζουν LET-23 :: hEGFR-ΤΚ χιμαιρικών υποδοχέων (Πίνακας 1). Δυστυχώς, δεν καταφέραμε να πάρετε τις γραμμές ένταξης για αυτές τις δομές και έχουν μόνο τα δεδομένα που παράγονται από τις γραμμές ένταξη των ΑΣ-23 :: διαγονιδιακές σειρές hEGFR-ΤΚ. Η κυτταροπλασματική ουρά του hEGFR μπορεί να έχουν εξελιχθεί για να μεταδώσει τα ενεργοποιημένα σήματα πιο αποτελεσματικά από ό, τι LET-23,

C. elegans

EGFR, ακόμη και σε VPCs.

Για τη δημιουργία του συστήματος μας μοντέλο, το χιμαιρικό διαγονίδιο LET-23 :: hEGFR-ΤΚ εκφράστηκε σε

ας-23

(+) παρασκήνιο . Το δυναμικό σχηματισμό ετεροδιμερών της ενδογενούς LET-23 με το χιμαιρικό LET-23 :: hEGFR-ΤΚ πρωτεΐνη μπορεί να εξηγήσει ορισμένες παρατηρήσεις που έγιναν κατά τη διάρκεια της μελέτης μας. Έχουμε κατά καιρούς παρατηρηθεί ότι οι υψηλές δόσεις του gefitinib ανέστειλε την κανονική αιδοίου ανάπτυξη στο

jgIs6

. Επίσης, RNAi του γονιδίου ανάντη EGFR,

lin-3 /EGF

, κατέστειλε τον φαινότυπο MUV του

jgIs6

και

jgIs25

(Εικ. S3A), που μπορεί να είναι