Αφηρημένο

Ο καρκίνος των ωοθηκών G πρωτεΐνη υποδοχέα συζευγμένου 1 (OGR1) έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα αισθητήριο πρωτονίων υποδοχέα

in vitro

. Δείξαμε ότι OGR1 λειτουργεί ως γονίδιο καταστολής μετάσταση όγκου όταν είναι υπερ-εκφράζεται σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη

in vivo

. Για την εξέταση των φυσιολογικών λειτουργιών του OGR1, δημιουργήσαμε υπό όρους OGR1 ανεπαρκή ποντίκια με ομόλογο ανασυνδυασμό. OGR1 ανεπαρκή ποντίκια ήταν βιώσιμα και μετά το ακαθάριστο επιθεώρηση εμφανίστηκε φυσιολογικό. Συνεπής με το

in vitro

μελέτες που δείχνουν ότι OGR1 εμπλέκεται σε οστεοκλαστών, μειωμένη οστεοκλάστες ανιχνεύθηκαν σε ποντίκια με έλλειψη OGR1. Παρατηρήθηκε επίσης μια εξαρτώμενη από το ρΗ αποτέλεσμα επιβίωσης οστεοκλάστες. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε γενική ανωμαλία στα οστά των ζώων αυτών. Επιπλέον, κυττάρων μελανώματος ογκογένεση ήταν σημαντικά αναστέλλεται σε ποντίκια με έλλειψη OGR1. OGR1 ποντίκια με έλλειψη στο μικτό φόντο παράγεται σημαντικά μικρότερη περιτοναϊκών μακροφάγων όταν διεγείρονται με θειογλυκολικό. Αυτοί οι μακροφάγοι επίσης έδειξαν αλλαγμένες εξωκυτταρικό σήμα

-regulated κινάσες (ERK) ενεργοποίηση και μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) σε απόκριση προς λιποπολυσακχαρίτη. OGR1-εξαρτώμενες αποκρίσεις ρΗ αξιολογείται από την παραγωγή cAMP και την επιβίωση των κυττάρων σε μακροφάγα ή καφέ λιπώδη κύτταρα δεν παρατηρήθηκαν, προφανώς λόγω της παρουσίας άλλων υποδοχέων πρωτονίων αισθητήρια σε αυτά τα κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο ρόλος OGR1 στην οστεοκλαστογένεσης δεν είναι αρκετά ισχυρή για να επηρεάσει τη συνολική ανάπτυξη των οστών και ο ρόλος του στην ογκογένεση εντάλματα περαιτέρω έρευνα. Τα ποντίκια που παράγεται μπορεί να χρησιμοποιηθεί ενδεχομένως για πολλά μοντέλα της νόσου, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων ή ασθενειών των οστεοκλαστών που σχετίζονται με

Παράθεση:. Li H, Wang D, Singh LS, Berk Μ, Tan Η, Zhao Ζ, et al. (2009) Ανωμαλίες σε οστεοκλαστογένεση και Μειωμένη Ογκογένεση σε ποντικούς με έλλειψη για καρκίνο των ωοθηκών συζευγμένου με πρωτεΐνη υποδοχέα 1. PLoS ONE 4 (5): e5705. doi: 10.1371 /journal.pone.0005705

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 2η Απριλίου του 2009? Αποδεκτές: 5 Μαΐου 2009? Δημοσιεύθηκε: May 28, 2009

Copyright: © 2009 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. RO1 HL68804 , RO1-CA89228, και Ralph C. Wilson, ο πρεσβύτερος και Ralph C. Wilson, νεώτερος επιχορήγηση Ιατρικό Ίδρυμα Ερευνών. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Έχουμε κλωνοποιηθεί προηγουμένως OGR1 από μια ωοθηκική κυτταρική γραμμή καρκίνου HEY [1]. Πρόσφατα, έχουμε δείξει OGR1 είναι ένα νέο γονίδιο καταστολέα μετάστασης του καρκίνου του προστάτη [2]. OGR1 και υποδοχέων υποοικογένεια συζευγμένου με πρωτεΐνη της (GPCRs), GPR4, G2A και Τ-κυτταρικό θάνατο που σχετίζεται με γονίδιο 8 (TDAG8), έχουν δειχθεί ότι έχουν την ικανότητα πρωτονίων ανίχνευσης [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Πολλές από αυτές τις δραστηριότητες ανίχνευσης πρωτονίων έχουν ταυτοποιηθεί σε κύτταρα που υπερεκφράζουν μία ή περισσότερες από αυτές τις GPCRs. Πιο πρόσφατα, οι δραστηριότητες ανιχνεύσεως πρωτονίου έχουν ανιχνευθεί σε κύτταρα από GPR4- και TDAG8-, αλλά όχι G2A-ανεπαρκή ποντίκια [8], [10], [11].

Ποντίκια με ανεπάρκεια σε G2A, TDAG8, ή GPR4 έχουν δημιουργηθεί. Αυτά knockout (ΚΟ) ποντικοί είναι βιώσιμα και εμφανίζουν διαφορετικούς φαινοτύπους. G2A KO ποντίκια επιδεικνύουν ένα κανονικό μοτίβο των Τ και Β κυτταρική διαφοροποίηση γενιάς μέσω της ενηλικίωσης. Ωστόσο, ηλικίας G2A ελλειμματικά ζώα (& gt? 1 έτος) αναπτύσσουν δευτερογενή διόγκωση λεμφοειδούς οργάνου που σχετίζονται με μη φυσιολογική διαστολή των δύο λεμφοκυττάρων Τ και Β [12]. Επιπλέον, άλλες φαινοτύπους που σχετίζονται με τα κύτταρα του μυελού των οστών που προέρχονται από, συμπεριλαμβανομένων, μονοκύτταρα /ενδοθηλιακά κύτταρα και μακροφάγα, καθώς επίσης και ηπατικά κύτταρα έχουν αναφερθεί [8], [13], [14], [15], [16], [17]. TDAG8 είναι μεταγραφικά up-ρυθμίζονται από γλυκοκορτικοειδή (GCS) και εμπλέκεται με μελέτες υπερ-έκφραση σε psychosine μεσολάβηση αναστολή της κυτοκίνησης [18], [19]. Αν και η έκφραση TDAG8 μοιάζει με την δυναμική ρύθμιση που περιγράφεται για γνωστές ρυθμιστές του GC-επαγόμενη απόπτωση κατά την ανάπτυξη των θυμοκυττάρων, είναι διαθέσιμο και για psychosine προκαλούμενη σχηματισμό πολυπύρηνων κυττάρων. Επιπλέον, θυμοκύτταρα σε ποντικούς TDAG8 ΚΟ παρουσιάζουν φυσιολογική απόπτωση μετά

in vivo

και

in vitro

θεραπεία GC [11]. Επιπλέον, όξινο εξωκυττάριο pH δεν διαφορικά ρυθμίζουν την ευαισθησία του TDAG8 άγριου τύπου (WT) και θυμοκύτταρα ΚΟ με GC-επαγόμενη απόπτωση [11]. Ωστόσο, σε θυμοκύτταρα και σπληνοκύτταρα από ποντικούς εκφυτευμένων υποδοχέα με ανεπάρκεια, TDAG8, αλλά δεν G2A, βρίσκεται να είναι κρίσιμος για την παραγωγή cAMP εξαρτώμενη από το ρΗ [8]. Ενώ αυτό το χειρόγραφο ήταν στο πλαίσιο της προετοιμασίας, Mogi

κ.ά.

έχουν δείξει ότι TDAG8, αλλά δεν OGR1 εμπλέκεται σε ρΗ που προκαλείται από ανασταλτική δράση επί του παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα (TNF-α) παραγωγή σε μακροφάγα [20]. GPR4 εκφράζεται στα περισσότερα ενδοθηλιακά κύτταρα και διαμεσολαβεί sphingosylphosphorylcholine (SPC) προκληθείσα αγγειογενετική δραστηριότητα (11). ανεπάρκεια GPR4 οδηγεί σε διεισδύσει μερικώς αγγειακές ανωμαλίες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και ότι αυτό λειτουργεί υποδοχέα στην ανίχνευση του pH των αιμοφόρων αγγείων σε ένα

ex vivo

δοκιμασία αορτικού δακτυλίου [10].

OGR1 έχει αναγνωριστεί ως ένα έντονα up-ρύθμιση του γονιδίου κατά τη διάρκεια οστεοκλαστογένεσης στο

ΚΠΣ 1

TL /ΚΠΣ 1

TL

αρουραίους (rat ΚΠΣ ανεπάρκεια) που έλαβαν θεραπεία με μακροφάγων παράγοντα διέγερσης αποικιών (M-CSF ή CSF-1) και του υποδοχέα ενεργοποιητή του συνδέτη πυρηνικού παράγοντα κ Β (RANKL, ή TRANCE, TNFSF11) -που προκαλείται από τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών

in vitro

[21]. Το δυναμικό λειτουργική εμπλοκή OGR1 σε οστεοκλαστογένεσης έχει αποδειχθεί χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-OGR1 και με αναστολή OGR1 με μικρό ανασταλτικό RNA (siRNA) [21]. Επιπλέον, η συστηματική οξέωση έχει αρνητικές συνέπειες για το σκελετό και τις τοπικές οξέωση συνδέεται με την καταστροφή των οστών σε φλεγμονώδεις και νεοπλασματικές ασθένειες. Επιβίωση και ασβέστιο σηματοδότηση των οστεοκλαστών ενισχύονται σημαντικά από οξίνιση του μέσου σε ένα τρόπο OGR1 εξαρτώμενου [22]. Η λειτουργική εμπλοκή OGR1 έχει κυρίως εξεταστεί χρησιμοποιώντας είτε OGR1 αντίσωμα, ή ένα μη ειδικό ανταγωνιστή OGR1 Cu

2+, ή siRNAs έναντι OGR1. Από όλα αυτά τα αντιδραστήρια όλα δυνητικά μπορούν να έχουν off-στόχο εφέ, ένα πιο συγκεκριμένο σύστημα είναι απαραίτητη για την αξιολόγηση των φυσιολογικών ρόλων των OGR1.

Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) και αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα από το μυελό των οστών είναι ικανά διαφοροποίησης σε μονοκύτταρα, οστεοκλάστες, οστεοβλάστες, λιποκύτταρα και, μεταξύ άλλων φαινοτύπων κυττάρου. Αυτοί οι τύποι κυττάρων είναι σημαντικές για πολλές βιολογικές λειτουργίες. Υπό κανονικές φυσιολογικές συνθήκες, οι διαδικασίες διαφοροποίησης ελέγχονται αυστηρά. Ανισορροπία διαδικασίες διαφοροποίησης και /ή ενεργοποίηση οδηγούν σε παθολογικές καταστάσεις και ασθένειες.

Προέρχεται από τα μονοκύτταρα του αίματος, μακροφάγων είναι σχετικά μακράς διάρκειας ζωής φαγοκυτταρική κύτταρα των ιστών των θηλαστικών. Τα μακροφάγα εμπλέκονται σε μια ποικιλία διεργασιών συμπεριλαμβανομένης της καταστροφής των παθογόνων, φλεγμονή, επισκευή ιστού και αναδιαμόρφωση. Έχουν μια πολύ πλαστικό φαινότυπο και λειτουργική πόλωση τους καθορίζεται από τις κυτοκίνες και παράγοντες που βρίσκονται μέσα στις τοπικές μικροπεριβάλλοντα [23]. Μία από τις λειτουργίες των μακροφάγων είναι να παράσχει ένα μηχανισμό άμυνας έναντι κυττάρων όγκου. Ωστόσο, οι σχετίζονται με τον όγκο μακροφάγων (ΤΑΜ), που αντιπροσωπεύουν το μεγαλύτερο φλεγμονώδες συστατικό του στρώματος πολλών στερεών όγκων, που συνδέονται με την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση [23].

Brown και λευκό λιπώδη ιστό (ΒΑΤ και WAT ) αποτελούν βασικούς παράγοντες της παχυσαρκίας και των συναφών με προβλήματα υγείας, όπως ο διαβήτης τύπου 2 και τα καρδιαγγειακά νοσήματα. BAT-εξαρτώμενη μη-ρίγος σημαντικά θερμογένεση επηρεάζει την ενεργειακή ισορροπία του σώματος. Εκτός από την λειτουργία αποθήκευσης ενέργειας, οι λιπώδεις ιστούς εκκρίνουν επίσης μια σειρά από ορμόνες και κυτοκίνες, και εμπλέκονται στον έλεγχο του μεταβολισμού του σώματος και του ενεργειακού ισοζυγίου σε πολλαπλές θέσεις [24], [25]. ΒΑΤ έχει ιδιαίτερη σημασία σε νεογνά, μικρά θηλαστικά (όπως ποντίκια) σε ψυχρά περιβάλλοντα, και τα ζώα που αδρανοποίησης, επειδή μεγάλες φυσιολογική λειτουργία του είναι να διαχέει αποθηκευμένη ενέργεια ως θερμότητα. Σε ανθρώπινα βρέφη ΒΔΤ περιλαμβάνει μέχρι 5% του συνολικού σωματικού βάρους, το οποίο στη συνέχεια μειώνεται με την ηλικία σε σχεδόν ανύπαρκτο επίπεδα από την ενηλικίωση.

Κατά τη διάρκεια της ζωής ενός ζώου, οστικού ιστού είναι σε μια διαρκή κατάσταση του κύκλου εργασιών ως αποτέλεσμα της ο συνδυασμός του διαδοχική απομάκρυνση του ιστού των οστών από τους οστεοκλάστες και τα νέα απόθεση οστού από οστεοβλάστες. Οι οστεοκλάστες είναι επαναρρόφησης οστού πολυπύρηνων γιγαντιαίων κυττάρων που προέρχονται από αιμοποιητικά πρόδρομα κύτταρα μονοπύρηνα υπό τον έλεγχο τόσο της M-CSF και RANKL [21]. . Αυτά τα κύτταρα βοήθεια στην απορρόφηση και απομάκρυνση της περίσσειας ιστούς των οστών στην αναδιαμόρφωση της την ανάπτυξη των οστών, ή κατεστραμμένου οστού στην επισκευή καταγμάτων

Έχουμε παράγεται και χαρακτηρίζεται OGR1-ανεπαρκή ποντίκια να αντιμετωπίσει πολλά κρίσιμα ζητήματα: 1) η φυσιολογικές λειτουργίες του OGR1 σε ποντίκια? 2) ο ρόλος των OGR1 σε οστεοκλαστογένεσης? 3) Η OGR1-εξαρτώμενη από το ρΗ αποκρισιμότητα χρησιμοποιώντας OGR1 ανεπάρκεια κύτταρα? και 4) οι λειτουργίες της OGR1 σε άλλες βιολογικές διαδικασίες οστού όταν οι ποντικοί προκλήθηκαν από εξωγενείς διεγέρσεις, όπως τα κύτταρα του όγκου. Βρήκαμε ότι σε συνέπεια με τα δημοσιευμένα δεδομένα, OGR1 είναι πιθανό να εμπλέκονται στην οστεοκλαστογένεση. Στα χέρια μας, παρατηρήσαμε μειωμένη οστεοκλάστες προέρχονται από κύτταρα μυελού των οστών από ποντίκια με έλλειψη OGR1. Παρατηρήθηκε επίσης Ένα ασθενές ρΗ-εξαρτώμενη επίδραση επιβίωση οστεοκλάστες. Ωστόσο, οι συνολικές δομές των οστών των ποντικών δεν επηρεάστηκαν και μια σημαντική pH-ρυθμίζονται και OGR1 εξαρτώμενη από βιολογικό αποτέλεσμα δεν ήταν γενικά αποδεικνύεται OGR1-κύτταρα που εκφράζουν [συμπεριλαμβανομένων των μακροφάγων και καφέ προέρχεται λιπώδη κύτταρα (BADCs)], γεγονός που υποδηλώνει μια περιττή αποτέλεσμα άλλων GPCRs υποοικογένεια OGR1

in vivo

. Επιπλέον, η επίδραση και η συμμετοχή του κυττάρου-ξενιστή OGR1 στην ογκογένεση των κυττάρων μελανώματος έχει μεγάλο ενδιαφέρον και εγγυάται περαιτέρω διερεύνηση. Δύο επιπλέον ανωμαλίες που σχετίζονται με περιτοναϊκά μακροφάγα και ΒΑΤ παρατηρήθηκαν σε ένα φόντο που εξαρτάται από ποντίκι τρόπο, υποδεικνύοντας εμπλοκή της τροποποίησης γονιδίων σε διαφορετικά υπόβαθρα ποντικού.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Sphingosylphosphorylcholine (SPC) και λυσοφωσφατιδυλοχολίνη (LPC) ήταν από Aventi Polar Lipids (Birmingham, AL) ή του Τορόντο Research Chemicals (Τορόντο, Καναδάς). M-CSF και RANKL ήταν από Peprotech (Rocky Hill, NJ). Anti-FLAG Μ2, H

2O

2, θειογλυκολικό (TG), lipopolysacchride (LPS), χάντρες λατέξ, νιτρώδες νάτριο, αντιδραστήριο Griess, τρυγικό ανθεκτική όξινη φωσφατάση (TRAP) αντιδραστήρια χρώσης και αντιδραστήρια χρώσης τριχρωμία Masson ήταν αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Αντι-φωσφο-ΕΚΚ, αντι-ERK, αντι-φωσφο-ρ38, αντι-ρ38 ήταν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Goat anti-iNOS, TRITC-αντι-κουνελιού ήταν από BD (San Jose, CA). Αντι-F4 /80, αντι-PCNA, κουνέλι anit-αργινάσης και αντι-κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) ήταν από την Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Αντι-CD31 ήταν από την ΕΑΚ (Fitzgerald, Concord, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Κιτρικό ρυθμιστικό, καθολική ορό αλόγου, VECTOR NovaRED και αιματοξυλίνη QS ήταν από VECTOR (Burlingame, CA).

Δημιουργία OGR1 νοκ-άουτ (KO) ποντίκια

κατασκεύασμα

OGR1 στόχευση έχει δημιουργηθεί μέσα από μια σύμβαση με AnTeq διαγονιδιακά ποντίκια (Αυστραλία). Εν συντομία, το Α 13,2 kb Bam ΗΙ γενωμικό θραύσμα που περιέχει γονίδιο OGR1 υποκλωνοποιήθηκε από ένα βακτηριακό τεχνητό χρωμόσωμα (BAC) κλώνος (ένα ευγενές δώρο από το εργαστήριο Dr. Owen Witte κατά UCLA) σε PBS (KS) φορέα II (πλασμίδιο # 182) . Η περιοχή 5 ‘ομολογία του τόπου OGR1 ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εναύσματα OGR1 # 1 και # 2 και το πλασμίδιο # 182 ως μήτρα. Primer # 2 δημιουργήθηκε μία νέα θέση Νοο1 στην αρχή του OGR1 (άλλαξε το πρώτο κωδικόνιο από ΑΤΟ σε CTC). Το θραύσμα PCR υποκλωνοποιήθηκε σε pCR2.1.TOPO (Invitrogen) για να δώσει το πλασμίδιο # 183. Εξόνιο 1 του OGR1 ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές # 7 και # 8, ενώ ο εναρκτήρας # 7 εισήγαγε μια θέση XbaI για περαιτέρω βήματα κλωνοποίησης. Το θραύσμα PCR υποκλωνοποιήθηκε σε pCR2.1.TOPO για να δώσει το πλασμίδιο # 188. Αυτή η πλήρης σειρά OGR1 επιβεβαιώθηκε με αναλύσεις αλληλουχίας. Ένα 6.2 kb γονιδιωματικό θραύσμα του 3 ‘αμετάφραστη περιοχή του τόπου OGR1 υποκλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο # 182 για να δώσει το πλασμίδιο # 189. Ένα 1.4 kb floxed-neo-κασέτας στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο # 189 γραμμικό με Stu Ι για να δώσει το πλασμίδιο # 208. Stu Ι κόβει στο 5 ‘άκρο της περιοχής 3’ Hind III OGR1. Οι 3xFLAG περιοχή κωδικοποίησης τρία γειτονικά επιτόπια FLAG ενισχύθηκε με PCR από το πλασμίδιο p3xFLAG CMV-19 χρησιμοποιώντας εναύσματα # 3 και # 4 και η δεύτερη αρχικό τεμάχιο περιελάμβανε μια θέση XhoI για περαιτέρω κλωνοποίηση. Το προϊόν PCR 353 bp υποκλωνοποιήθηκε σε pCR2.1.TOPO (πλασμίδιο # 185). Ένα 400 bp Ken Ι και Xho Ι θραύσμα από το # 185 περαιτέρω υποκλωνοποιήθηκε σε PBS (KS) II για να πάρετε το πλασμίδιο # 196. Ένα 2.6 kb Κρη-ΝοοΙ θραύσμα (5 ‘περιοχή homoloy) από το πλασμίδιο # 183 μετά υποκλωνοποιήθηκε σε πλασμίδιο # 196 μπροστά από την περιοχή 3 × FLAG (πλασμίδιο # 199). Η θέση ΙοχΡ στο 5 ‘περιοχή του εξονίου 1 κλωνοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανοπτημένων εκκινητών # 5 και # 6 και συνδέθηκε εντός του πλασμιδίου # 199 στις θέσεις Xho Ι και Xba Ι. Αυτό οδήγησε στο πλασμίδιο # 204, το οποίο αλληλουχήθηκε για να επιβεβαιωθεί η ακεραιότητα της συνδέσεως 3xFLAG-ΙοχΡ-εξόνιο 1. Ένα 1.8 kb Xba I-Sac Ι θραύσμα συμπεριλαμβανομένων OGR1 εξόνιο 1 και «3 ‘αμετάφραστη περιοχή από το πλασμίδιο # 188 υποκλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο # 203 για να δημιουργήσει το πλασμίδιο # 209. Ένα θραύσμα Hind III 7,7 kb του πλασμιδίου # 208 που φιλοξενεί το νεο-κασέτα πλευρίζεται από θέσεις ΙοχΡ και την περιοχή 3 ‘OGR1 ομολογία υποκλωνοποιήθηκε σε πλασμίδιο # 209 για να δώσει την OGR1 φορέα στόχευσης # 218. Η λειτουργικότητα των χώρων ΙοχΡ επιβεβαιώθηκαν σε μια

Ε. coli

στέλεχος BNN123 συστατικά που εκφράζουν ανασυνδυασμένο Cre. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν:

# 1: 5 ‘GGT ACC GGA GGA CGT GAG CAA CAA CT

# 2: 5′ ATG TTC CCC ATG Γ.Ο.Σ. GGG CCA ΟΑΑ

# 3: 5 ‘TCC TAC TTG GCA GTA CAT CT

# 4: 5′ ATC ΤΕΕ AGC TTG TAC TCG TCA TCC TTG

# 5: 5 ‘TCG AGA ΤΑΑ CTT CGT ΑΤΑ GCA TAC ΑΤΤ ΑΤΑ CGA AGT ΤΑΤ

# 6: 5 ‘CTA GAT AAC TTC GTA ΤΑΑ TGT ATG CTA TAC GAA GTT ATC

# 7: 5′ ACT TCT AGA GGG AAC ATC ACA GAA AAC TC

# 8: 5 ‘ΑΓΓ AAC TTG GCT ΑΑΟ GAC

η

Οι κατασκευές στόχευσης OGR1 ενέθηκαν σε κύτταρα ES στη διευκόλυνση διαγονιδιακό ποντίκι πυρήνα στο Case Western University Research (Cleveland, ΟΗ). Τα χιμαιρικά ποντίκια με βλαστικής FLAG-tagged γονίδια OGR1 πλαισιώνεται από δύο θέσεις ΙοχΡ δημιουργήθηκαν. Μέσω της αναπαραγωγής σε ποντικούς C57 /BL6, αυτοί οι ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν ετερόζυγα ποντίκια με ένα αντίγραφο του FLAG-tagged OGR1. Μεταγενέστερες αναπαραγωγής ετερόζυγη OGR1

fl /+ ποντίκια που δημιουργούνται ομόζυγη OGR1

fl /fl ποντίκια. Όλες οι απόγονοι από την εκτροφή των ετερόζυγο OGR1

fl /+ ποντίκια γονότυπος με ανάλυση του DNA του κλιπ ουρά. Αρχικά και οι δύο αναλύσεις blot και PCR Southern διεξήχθησαν για να επιβεβαιωθεί γονότυπο. Μεταγενέστερες γονοτυπική ήταν κατά κύριο λόγο διεξάγεται χρησιμοποιώντας αναλύσεις PCR. Ομόζυγα ποντίκια με OGR1 floxed (OGR1

fl /FL) εκτράφηκαν σε βλαστική ποντίκια Cre Zp-3 (ένα διαγονιδιακό γραμμή του ποντικιού για την αδρανοποίηση των ΙοχΡ-πλαισιωμένη γονιδίων στόχων ειδικά στο γυναικείο βλαστικής [26]? Jackson Labs , Bar Harbor, Maine). Επιπλέον, είχαν εκτραφεί για να Prm (Πρωταμίνης-Cre, ένα διαγονιδιακό ποντίκι γραμμή για την αδρανοποίηση των ΙοχΡ-πλαισιωμένη γονιδίων στόχων ειδικά στο αρσενικό βλαστική σειρά ποντικών [27]? Ευγενικά από τον Dr. Guangbin Luo, Πανεπιστημίου Case Western Reserve ) για τη δημιουργία OGR1

+/- Cre ποντίκια, τα οποία είχαν εκτραφεί περαιτέρω για τη δημιουργία OGR1

– /- (KO ή ανεπαρκή) ποντίκια. Η OGR1

fl /fl ποντίκια οριστεί OGR1 FL. OGR1

– /-. Έχουν ποντίκια στο μικτό φόντο αναδιασταυρωθεί σε C57 /BL6 για 10 γενιές, η OGR1

+ /+ 10

ου ποντίκια γενιάς ορίστηκαν OGR1 άγριου τύπου (OGR1 WT)

Φαινότυπος αναλύει

OGR1 KO ποντίκια ήταν βιώσιμα και γόνιμα. Μια πλήρης ανάλυση φαινότυπος ποντικού διεξήχθη σε δύο ζεύγη OGR1 ΚΟ και FL ποντίκια (ηλικίας 8 εβδομάδων, ένα αρσενικό και ένα θηλυκό σε κάθε ομάδα) στο ποντίκι φαινότυποι κοινόχρηστο πόρο, Πανεπιστήμιο του Οχάιο, Columbus, OH. Για τον προσδιορισμό του δείκτη παχυσαρκία, χρησιμοποιήθηκε μία προηγουμένως δημοσιευμένη μέθοδο [28].

δοκιμασίες κατανομής ιστού

Τα όργανα αποκόπηκαν από ποντικούς και σταθεροποιήθηκαν σε ψευδάργυρο (BD, Franklin Lakes, NJ) για 12 -24 ώρες, στη συνέχεια φυλάσσονται σε 70% αιθανόλη πριν να ενσωματωθεί σε παραφίνη και έπειτα τομές των 5 μm. Δημοσίευση αποπαραφινώσεως και επανυδάτωση, τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κιτρικό ρυθμιστικό για 20 λεπτά και με H

2O

2 (0,3%) σε αιθανόλη για 15 λεπτά. Καθολική ορό αλόγου χρησιμοποιήθηκε για να εμποδίσει τον ιστό που ακολουθείται από αντι-FLAG αντίσωμα (1:200 αραιώσεις) θεραπεία. VECTOR NovaRED χρησιμοποιήθηκε ως το υπόστρωμα και QS αιματοξυλίνη ως μετρητής λεκέ.

απομόνωση RNA, αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (RT-PCR)

Οι ιστοί αποκόπηκαν από ποντικούς και κονιοποιημένο μετά κατάψυξη σε θραύση υγρό άζωτο. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας RNeasy μίνι κιτ (Qiangen, Maryland) και αντίστροφη μεταγραφή από την M-MLV (Invitrogen, Carlsbad, CA). Παράγωγα cDNA ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας PCR κύριο μείγμα (Promega, Madison, WI). Primer αλληλουχίες για OGR1 ήταν ως εξής: 5′-CTCAATGACCTCCTTGTGATTG-3 ‘και 5′-CTACCAGAAAACTCCTCACTATC-3’. β-ακτίνη ενισχύθηκε ως γονίδιο housekeeping με εκκινητές 5′-ACCGCTCGTTGCCATTAGTGATGA -3 ‘και 5′-AAGGCCAACCGTGAAAAGATGACC-3’.

Brown λιπώδη ιστό απομόνωση και τον πολλαπλασιασμό του καφέ που προέρχεται λιπώδη κύτταρα (BADCs)

Brown λίπος αποκόπηκε από τη ραχιαία πλευρά του θώρακα μεταξύ των ωμοπλατών και φορμαλίνη (10%) σταθερό & amp? τότε παραφίνη ενσωματωμένο, ακολουθούμενη από Η &? Ε χρώση. Για BADCs καλλιέργεια, καφέ λίπος κόπηκε σε μικρά κομμάτια και τοποθετήθηκε σε ίδιο όγκο διαλύματος κολλαγενάσης (DMEM, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, 1% BSA, 1 mg /mL κολλαγενάση τύπου Ι, διηθείται). Αυτό το εναιώρημα τοποθετήθηκε σε έναν αναδευτήρα 37 ° C στις 200 rpm για 60 λεπτά. Μετά από αυτό, μέσο DMEM (10 mL) που περιέχει 10% FBS, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, 2% γλουταμίνη, 1% μη απαραίτητα αμινοξέα και 1/1000 β-μερκαπτοαιθανόλη προστέθηκε στα καφέ λιπώδη κύτταρα. Μετά από φυγοκέντρηση στις 2000 rpm για 5 λεπτά, το λευκό στρώμα απομακρύνθηκε και τα σφαιρίδια του κυττάρου επανααιωρήθηκαν σε 10 mL μέσου καλλιέργειας, και διηθείται μέσω ενός κυττάρου σουρωτήρι. Τα κύτταρα στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας και αφέθηκαν να φθάσουν σε συρροή. Για τους προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού /επιβίωσης, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής για 24 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές ερέθισμα για 24 και 48 ώρες [3]. 10 μι 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ, 5 mg /ml) προστέθηκε στα κύτταρα 3 ώρες πριν από τη συγκομιδή. Η απορρόφηση του διαλύματος στα 550 nm προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φορέα

3 φασματοφωτόμετρο (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ).

μακροφάγων και των οστεοκλαστών παραγωγή και ο χαρακτηρισμός

Για περιτοναϊκών μακροφάγων, τα ποντίκια ένεση ip με 1 mL TG (4%). Τα μακροφάγα συλλέχθηκαν τέσσερις ημέρες μετά την ένεση. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με περιτοναϊκή πλύσεις με RPMI. Μετά το πλύσιμο, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI με 10% FBS για 2 ώρες. Τα μη-προσκολλημένα κύτταρα αφαιρέθηκαν και πάνω από 80% των προσκολλημένων κυττάρων ήσαν μακροφάγοι [29]. προέρχονται μακροφάγα του μυελού των οστών (BMMs) ελήφθησαν από τα μηριαία οστά των 6-10 εβδομάδων ποντικούς [30]. Εν συντομία, τα άκρα των οστών κόπηκαν και ο μυελός ξεπλύθηκε από ακρωτηριαστεί μηριαία οστά χρησιμοποιώντας σύριγγα 1 mL για να ληφθεί ένα εναιώρημα, το οποίο στη συνέχεια διέρχεται μέσω μιας βελόνας 27-gauge για διασπορά. Μυελού κυτταρικά εναιωρήματα (500 μΙ_? 1 × 10

6 κύτταρα) απλώθηκαν σε χαμηλό M-CSF [3% L 929 κυττάρων-ρυθμισμένο μέσο (L-CM) ως πηγή του Μ-CSF] σε RPMI που περιέχει 20% FBS. L-CM παρήχθη με σπορά 2,5 × 10

5 κυττάρων σε ένα εκατοστό 175-

φιάλη καλλιέργειας 2 ιστού με 50 mL βασικού μέσου έως ότου τα κύτταρα ήταν συρρέοντα. Το υπερκείμενο ακολούθως συλλέχθηκε, διηθήθηκε μέσω ενός φίλτρου 0.2 μm, και καταψύχθηκαν σε δείγματα στους -80 ° C. Αφού αφέθηκε στρωματικών κυττάρων να προσκολληθούν όλη τη νύκτα, μη προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και τοποθετήθηκαν σε υψηλής Μ-CSF (30% L-CM). Μετά από τρεις ημέρες, το μέσο απομακρύνθηκε μαζί με μη-προσκολλημένα κύτταρα, και νέο μέσο που περιείχε προστέθηκε 30% L-CM. Προσκολλημένα μακροφάγα ήταν ομοιογενείς πληθυσμούς μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας. Τα κύτταρα βάφτηκαν με Diff-Quick και μετρήθηκαν. Για να διαφοροποιηθούν σε οστεοκλάστες μακροφάγα, φρέσκο ​​μέσο με το RANKL (50 ng /mL) προστέθηκε από την τρίτη ημέρα και σημείωσε τρεις ημέρες αργότερα μετρώντας TRAP-θετικών κυττάρων.

δοκιμασίες παραγωγής φαγοκυττάρωση και μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ)

περιτοναϊκά μακροφάγα (1 χ 10

4 κύτταρα /300 μL) επωάστηκαν σε τρυβλία 48 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σφαιρίδια λάτεξ (1 × 10

6) για 3 ώρες. Οι δοκιμασίες τερματίστηκαν με πλύση των κυττάρων με παγωμένο PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε μεθανόλη για 30 λεπτά. Η φαγοκυττάρωση ποσοτικοποιήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού με απαρίθμηση του αριθμού των εσωτερικεύονται σφαιριδίων σε τουλάχιστον 200 κύτταρα, τα οποία καταγράφηκε ως φαγοκυτταρική δείκτης από τον τύπο: 100 × αριθμός (των κυττάρων με ένα σφαιρίδιο + 3,5 × αριθμός των κυττάρων με 2-5 χάντρες + 8 × αριθμός των κυττάρων με 6-10 χάντρες + 20 αριθμός × κυττάρων με πάνω από 10 χάντρες) /συνολικό αριθμό των κυττάρων. Για παραγωγής ΝΟ, περιτοναϊκά μακροφάγα (5 × 10

5) σε 100 μL RPMI που περιέχει 10% FBS, καλλιεργήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων για 2 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντικατάσταση με μέσο (0,5% FBS σε 100 μί) και LPS (50 μΙ 1 μg /mL) για 18 ώρες. Τα επίπεδα του ΝΟ στο υπερκείμενο προσδιορίστηκαν με ανάμειξη του ίδιου όγκου υπερκειμένων (100 μL) και αντιδραστήριο Griess σε μια νέα πλάκα 96 φρεατίων. Οι πλάκες επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και αναγνώστηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός. Η συγκέντρωση του νιτρώδους στο υπερκείμενο καλλιέργειας υπολογίστηκε από μία πρότυπη καμπύλη που δημιουργείται από την αραίωση νιτρώδες νάτριο σε νερό σε μία κλίμακα συγκεντρώσεων 0.01-100 μΜ.

παραγωγή προσταγλανδίνης και COX-2 έκφρασης

95% συρρέοντα κύτταρα σε πλάκες 24-φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικά ρυθμιστικά του ρΗ επί 9 ώρες ή 25 ώρες [31], [32]. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν για ανάλυση προσταγλανδίνης χρησιμοποιώντας HPLC-φασματομετρία μάζας (API-4000, Applied Biosystems). Εν συντομία, οι προσταγλανδίνες εκχυλίσθηκαν από υπερκείμενα κυττάρων (500 μL σε κάθε δείγμα) υπό την παρουσία 14:00 λυσοφωσφατιδικού οξέος (Ι_ΡΑ, 10 pmol) ως εσωτερικό πρότυπο, χρησιμοποιώντας χλωροφόρμιο (2 mL), μεθανόλη (2 mL), και HCl (6 Ν, 10 μL). Τα ιόντα με το m /z σε 351 (η μητρική ιόν) και 271 (το ιόν κόρη) χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των προσταγλανδινών. Ένα TARGA C18 5 μm, 2,1 mm ΙΟ x 10 mm TR-0121-C185 (Higgins Analytical, Southborough, ΜΑ USA) στήλη HPLC χρησιμοποιήθηκε, και η κινητή φάση ήταν μεθανόλη /νερό /ΝΗ

4OH (90:10: 0,1, ν /ν /ν), 6 λεπτά /δείγμα. Οι σβώλοι κυττάρων συλλέχθηκαν για την ανάλυση της έκφρασης COX-2.

αναλύσεις κηλίδος Western

μακροφάγα (10

6) καλλιεργήθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων ξεπλύθηκαν με PBS και διεγείρεται από LPS ( 100 ng /mL), SPC ή LPC (2,5 μΜ) για 30 λεπτά. Τα κύτταρα λύθηκαν σε 100 μι του Laemmli ρυθμιστικό δείγματος (Bio-Rad, Hercules, CA), εκχύλισμα διαχωρίστηκαν σε πήκτωμα 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 2 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με δεικνυόμενες πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Μετά την επώαση με τα αντίστοιχα δευτερεύοντα αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν με χρήση ECL plus δυτικό σύστημα ανίχνευσης στύπωσης (GE Healthcare, Buckinghamshire UK). Φόρτωση πρωτεΐνης επαληθεύτηκε με απογύμνωση και της ανιχνεύσεως των κηλίδων με αντισώματα εναντίον της β-ακτίνης

.

Η κυκλική ΑΜΡ (cAMP) την παραγωγή και την κυτταρική επιβίωση σε διαφορετικά pH

περιτοναϊκή μακροφάγα απλώθηκαν σε 24 -Λοιπόν πλάκες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικά ρυθμιστικά του ρΗ που περιέχει το ισοβουτυλομεθυλοξανθίνη αναστολέας φωσφοδιεστεράσης (ΙΒΜΧ, 1 mM) για 30 λεπτά, και στη συνέχεια υπέστησαν λύση με 0.1 Μ HCl (60 μL). Τα κυτταρολύματα χρησιμοποιήθηκαν για την δοκιμασία cAMP σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ (κυκλική ΑΜΡ ΕΙΑ Kit, από την Cayman, Cat # 581001). Για τις αναλύσεις επιβίωσης, μακροφάγα ή οστεοκλαστών που προέρχονται από μυελό των οστών καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων για 2 ώρες στους 37 ° C με 5% CO

2 και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε μέσο σε διαφορετικά pHs σε 37 ° C με 0% CO

2 για 20 ώρες.

Bone Ιστομορφομετρική και ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις

δείγματα οστών από 8 εβδομάδων τα ζώα σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα Βουίη όλη τη νύκτα, απασβεστώθηκαν σε EDTA (14%) για 12 ημέρα, και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Οι τομές στη συνέχεια χρωματίστηκαν με τρίχρωμη χρώση Kit του Masson για μορφολογική παρατήρηση.

Μελάνωμα ογκογένεση

Β16-Ρ10 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI με 10% FBS. 1 × 10

7 και 5 × 10

5 κύτταρα σε 100 μΙ PBS εγχύθηκαν υποδορίως σε λαγόνες του μικτού υπόβαθρο και τα καθαρά ποντίκια φόντο C57 /BL6, αντίστοιχα. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν όταν εμφανίστηκαν ετοιμοθάνατοι (9-14 ημέρες μετά την ένεση). Η έρευνα σε ζώα συμμορφωθεί με όλες τις σχετικές ομοσπονδιακές οδηγίες και τις πολιτικές του Κέντρου Πόρων Εργαστήριο Ζώων στο Indiana University School of Medicine.

Στατιστικές αναλύσεις

Όλα τα δεδομένα σε αυτήν την μελέτη εκφράστηκε ως μέση τιμή ± SD της τρία ή περισσότερα ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων θεραπείας αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Φοιτητών

t

δοκιμής και δίπλευρη κατανομή στο Microsoft Excel.

Αποτελέσματα

Δημιουργία ανεπαρκή ποντίκια OGR1 και έκφραση OGR1 στους ιστούς

Για τη μελέτη του φυσιολογικού ρόλου του OGR1, έχουμε δημιουργήσει ένα OGR1 στέλεχος ανεπάρκεια του ποντικιού. Δημιουργία ανεπάρκεια OGR1 ποντικών περιγράφεται λεπτομερώς στα Υλικά και Μέθοδοι. Η συνολική στρατηγική για την κατασκευή του φορέα στόχευσης OGR1 δείχθηκε στο Σχήμα 1Α. Τα αποτελέσματα από OGR1 γονοτύπησης δείχθηκαν στο Σχήμα 1Β. OGR1 εκφράστηκε στον πνεύμονα, όρχεις, καρδιά, εγκέφαλο, σπλήνα, θύμο, καφέ λίπος, λεπτό έντερο, κόλον, λευκοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBL), μακροφάγα, στομάχου, ωοθηκών, και το λευκό λίπος, αλλά όχι στο ήπαρ, τους νεφρούς, και των σκελετικών μυών των ποντικών OGR1 FL, όπως ανιχνεύεται με RT-PCR. έκφραση OGR1 στον προστάτη ήταν αδύναμη, αλλά ανιχνεύσιμη (Εικόνα 2Α). Η πλήρης έλλειψη έκφρασης OGR1 σε OGR1 ΚΟ ποντίκια επιβεβαιώθηκε σε όλους τους ιστούς που εξετάστηκαν. Έχουμε εισαχθεί μια ετικέτα τριών FLAG μπροστά από OGR1 στο κατασκεύασμα knock-in, έτσι ώστε η ενδογενής έκφραση OGR1 στο επίπεδο της πρωτεΐνης μπορεί να ανιχνευθεί σε ιστούς χρησιμοποιώντας αντι-FLAG Μ2 αντίσωμα. Η ανοσοϊστοχημική χρώση του πνεύμονα του OGR1 FL ποντικούς έδειξε ότι OGR1 εκφράστηκε στο κυβοειδές /columar επιθηλιακά κύτταρα που καλύπτουν τους μεγάλους αεραγωγούς του πνεύμονα και στα αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα που περιβάλλουν ένα μεγάλο αιμοφόρο αγγείο (Σχήμα 2Β). Αυτό το πρότυπο έκφρασης ιστού OGR1 ήταν παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε σε ανθρώπινους ιστούς, όπως καταδεικνύεται προηγουμένως [1], [33].

(Α) στρατηγική για την κατασκευή του φορέα στόχευσης OGR1. (Β) γονοτυπικός διενεργήθηκε προκειμένου να προσδιοριστούν floxed (FL), – /- (KO) και + /+ (WT) ποντίκια

Η

(Α) OGR1 έκφραση σε διάφορους ιστούς από FL και ΚΟ ποντίκια. ανιχνεύεται με RT-PCR. Το πρόγραμμα PCR ήταν 94 ° C, 2 λεπτά? 25 κύκλους για ακτίνη και 35 κύκλους για OGR1 (94 ° C, 30 s? 55 ° C, 1 λεπτό? 72 ° C, 1 λεπτό)? 72 ° C, 10 λεπτά, εκτός από τα δύο ακτίνης και OGR1 σε μακροφάγα ενισχύθηκαν με 30 κύκλους. BAT, καφέ λιπώδη ιστό? BM, του μυελού των οστών? PBL, λευκοκύτταρα περιφερικού αίματος. Τα βέλη υποδεικνύουν σκάλες DNA με 500 bp. (Β) κατανομή OGR1 στον πνευμονικό ιστό από την FL και C57 /BL6 ποντίκια. Anti-FLAG Μ2 αντίσωμα (1:200) χρησιμοποιήθηκε. Αντιπροσωπευτικά θετικά χρωματισμένα κύτταρα υποδεικνύονται με βέλη. μπαρ κλίμακα = 100 μm.

Η

Γενική φυσιολογικές αναλύσεις των ποντικών OGR1 ΚΟ και του καφέ λιπώδους ιστού (ΒΑΤ) ανωμαλία στο μικτό φόντο

OGR1 KO ποντίκια ήταν βιώσιμα και γόνιμα. Μια πλήρης ανάλυση φαινοτύπου ποντικού διεξήχθη σε δύο ζεύγη OGR1 ΚΟ και OGR1 FL ποντίκια (ηλικίας 8 εβδομάδων, ένα αρσενικό και ένα θηλυκό στη κάθε ομάδα). σωματικά βάρη δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ των ποντικιών που εξετάστηκαν. Σε αυτά τα δύο ζεύγη των ποντικών, οι σπλήνες των ποντικών OGR1 ΚΟ φαίνεται να είναι κάπως μικρότερα από εκείνα των ποντικών FL, ενώ το ήπαρ και την καρδιά των ποντικών ΚΟ ήταν κάπως μεγαλύτερα από εκείνα των ποντικών FL. Ωστόσο, πρόσθετη ανάλυση με περισσότερες ποντίκια δεν κατέδειξαν στατιστικές διαφορές σε αυτά τα βάρη οργάνων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι ιστολογικές αναλύσεις στο FL και ΚΟ δεν αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στην πλειονότητα των ιστών, και αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνεται στο Σχήμα 3.

Ο εκπρόσωπος της H & amp? Ε χρώση του ήπατος, των νεφρών, των όρχεων, του προστάτη, των ωοθηκών και της μήτρας παρουσιάστηκαν. μπαρ κλίμακα = 100 μm.

Η

Η αρχική ανάλυση αποκάλυψε επίσης ότι η ωμοπλάτη κατάθεση ΒΔΤ ήταν βαρύτερο στα ποντίκια ΚΟ (0,35 και 0,28 g) από το FL (0,10 και 0,11 g), το οποίο μπορεί να είναι που σχετίζονται με την αλλαγμένη παχυσαρκία στα ποντίκια ΚΟ. Συνεπής διαφορές στα βάρη και τα μεγέθη ΒΑΤ παρατηρήθηκαν σε επιπλέον ζεύγη FL και ΚΟ (Σχήμα 4Α). H & amp? χρώση Ε έδειξε ότι ενώ τα λευκά τους λιπώδεις ιστούς (WAT) από FL και ΚΟ ήταν παρόμοια, η ΒΑΤ από ποντικούς ΚΟ ήταν λιγότερο πυκνά όταν συγκρίνονται με αυτά από FL ποντικούς (Σχήμα 4Β), η οποία μπορεί να σχετίζεται, εν μέρει, στην διευρυμένη μέγεθος των ΒΔΤ σε ποντίκια OGR1 ΚΟ.

(Α) Μπράουν λιπώδεις ιστούς στα ποντίκια ΚΟ ήταν μεγαλύτερες από εκείνες στα ποντίκια FL. (Α) Βάρη των ΒΔΤ (9 ποντίκια από FL και 9 ποντίκια από KO). (Β) Εκπρόσωπος εμφάνιση των ΒΔΤ από FL και ΚΟ ποντίκια. (B) H & amp? Ε χρώση των ΒΔΤ και WAT στο FL και ΚΟ ποντίκια. * Αντιπροσωπεύει ένα

P

αξία των & lt? 0,05 και *** αντιπροσωπεύει ένα

P

αξία των & lt? 0.001. Κλίμακα ράβδου = 100 μm.

Η

OGR1 έχει αποδειχθεί ότι έχει πρωτονίων αίσθησης δραστικότητα σε διάφορα κύτταρα [3], [6], [9], [34]. Επιπλέον, SPC μπορεί να ρυθμίζει τις δράσεις OGR1 [6], [9]. SPC έχει δειχθεί ότι επάγει πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων λιπώδους μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων που προέρχονται από ιστούς μέσω ενεργοποίησης του c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) [35]. Για να ελέγξετε αν ΒΔΤ από FL και ΚΟ ποντίκια ανταποκρίνονται διαφορετικά σε pH ή /και SPC, απομονώσαμε BADCs και εξέτασαν τα αποτελέσματα της ΕΚΠ ή μεταβολές του pH στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. SPC (2.5 μΜ) που διεγείρεται μετρίως κυτταρικό πολλαπλασιασμό στις 24 ώρες και αυτό το αποτέλεσμα δεν ήταν σημαντικά διαφορετική σε BADCs από FL έναντι ΚΟ ποντικούς (Σχήμα 5Α). Όξινο ρΗ που προκαλείται από χαμηλότερα επίπεδα πολλαπλασιασμού από το φυσιολογικό ρΗ (7,4), και πάλι στατιστική διαφορά παρατηρήθηκε σε BADCs από FL

vs.

ΚΟ ποντικούς (Σχήμα 5Β). Έχουμε αναδιασταυρώθηκαν OGR1 ποντίκια με ανεπάρκεια σε C57 /BL6 φόντο (10 γενεές). Όταν εξετάσαμε ΒΑΤ σε ποντικούς WT και ΚΟ στο παρασκήνιο C57 /BL6, δεν παρατηρήθηκε διαφορά (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι η ανωμαλία ΒΑΤ σχετίζεται με το φόντο του ποντικιού.

(Α) SPC διεγείρεται πολλαπλασιασμός δεν ήταν σημαντικά διαφορετικό σε ΒΔΤ από FL

vs.

ποντίκια ΚΟ. SPC (2.5 μΜ) ή LPC (2,5 μΜ) χρησιμοποιήθηκε. (Β) Η επίδραση του pH στον πολλαπλασιασμό δεν ήταν σημαντικά διαφορετική σε FL

vs.

KO. Τα αποτελέσματα σε αυτό το σχήμα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. H & amp? (ΣΙ).