Αφηρημένο

Σκοπός

Για να διερευνηθεί η βιολογική λειτουργία της HOXB5 στον ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης και να διερευνήσει αν η HOXB5 3′-UTR SNP (1010A /G), το οποίο βρίσκεται εντός της θέσης δέσμευσης microRNA-7, συσχετίστηκε με κλινικά χαρακτηριστικά του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Μέθοδοι

Έκφραση HOXB5 σε 35 ανθρώπινης κύστης καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές γραμμές 8 εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου και ανοσοϊστοχημεία. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε τη βιολογική λειτουργία του HOXB5

in vitro

χρησιμοποιώντας δοκιμασίες κυτταρικού πολλαπλασιασμού, τη μετανάστευση και τον σχηματισμό αποικίας. Χρησιμοποιώντας βιοπληροφορική, ένας SNP (1010A /G) βρέθηκε βρίσκονται εντός της θέσης δέσμευσης microRNA-7 στο 3′-UTR του HOXB5. Real-time PCR χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η έκφραση HOXB5 επηρεάζονται από διαφορετικά αλληλόμορφα. Τέλος, πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσουν τη σχέση μεταξύ SNP (1010A /G) συχνότητα και κλινικά χαρακτηριστικά σε 391 περιπτώσεις.

Αποτελέσματα

HOXB5 ήταν συχνά υπερ-εκφράζεται τόσο σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης ιστούς και κυτταρικές σειρές. Η αναστολή της HOXB5 κατέστειλε την ογκογόνο λειτουργία των καρκινικών κυττάρων. Στη συνέχεια, αποδείξαμε ότι ένα SNP (1010A /G), το οποίο βρίσκεται εντός της θέσης δέσμευσης microRNA-7 στο 3′-UTR του HOXB5, θα μπορούσε να επηρεάσει HOXB5 έκφρασης σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης, κυρίως με δραστικότητα δέσμευσης απόκλιση του microRNA-7 και SNP-συναφών σταθερότητα του mRNA. Τέλος, δείξαμε επίσης η συχνότητα του γονότυπου 1010G ήταν υψηλότερη στην ομάδα του καρκίνου σε σύγκριση με φυσιολογικούς ελέγχους και συσχετίζεται με τον κίνδυνο της υψηλής ποιότητας και υψηλής στάδιο.

Συμπέρασμα

HOXB5 υπερεκφράζεται σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης . Ένα miRNA-δεσμευτική SNP (1010A /G) που βρίσκεται εντός 3′-UTR της HOXB5 σχετίζεται με τη γονιδιακή έκφραση και μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη προγνωστικός παράγοντας για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Luo J, Cai Q, Γουάνγκ W , Huang Η Zeng Η, Ο W, et al. (2012) Μια microRNA-7 θέση δέσμευσης πολυμορφισμός στο HOXB5 οδηγεί σε διαφορική έκφραση γονιδίων στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 7 (6): e40127. doi: 10.1371 /journal.pone.0040127

Επιμέλεια: Lorenzo Chiariotti, Università di Napoli Federico II, Ιταλία

Ελήφθη: 21 Μάρ. 2012? Δεκτές: 1, Ιουνίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 του Ιούν 2012

Copyright: © 2012 Luo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81071688, 30972983, 81172431, 91029742), επαρχία Γκουανγκντόνγκ Επιστημονικό Ίδρυμα Φυσικών (07117366, 6104605), Yat-sen Υποτροφιών για Νέους επιστήμονες (για Tianxin Lin), Κλινική βασικό έργο της Δημόσιας Υγείας Υπουργείο (για Jian Huang), και το Πρόγραμμα για New Century εξαιρετικά ταλέντα στο Πανεπιστήμιο (NCET-10-0852, για Tianxin Lin). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο της ουροδόχου κύστεως είναι η πιο κοινή ουρολογικό όγκου σε China [1]? Ωστόσο, οι μηχανισμοί της ουροδόχου κύστης ογκογένεσης καρκίνου του δεν έχουν καλά απεικονισθεί. Τα δεδομένα δείχνουν ότι οι περισσότεροι από τους καρκίνους της ουροδόχου κύστης επάγονται από καρκινογόνα που βλάπτουν το DNA. Η ευαισθησία της μικροπεριβάλλον του μεταβατικού επιθηλίου μπορεί να είναι ένας άλλος σημαντικός παράγοντας κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης [2]. Τα ογκογονίδια και καταστολείς όγκου έχουν επίσης αναφερθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [3]. Πρόσφατα, γενετικές αλλαγές συμπεριλαμβανομένων SNPs, διαγραφές, παρεμβολές, και οι αλλαγές του αριθμού αντιγράφων του DNA έχουν βρεθεί να εμπλέκονται στην καρκινογένεση κύστη.

Α ομοιοακολουθίας (ΗΟΧ) είναι μία αλληλουχία περίπου 180 νουκλεοτιδίων εντός γονίδια που κωδικοποιούν ένας τομέας πρωτεΐνη που ονομάζεται ομοπεδίου. Μελέτες έδειξαν ότι τα γονίδια ΗΟΧ αποτελούν όσο 0,1-0,2% του συνόλου του γονιδιώματος σπονδυλωτό [4]. γονίδια ΗΟΧ είναι εντόνως διατηρημένες σε τεράστιες εξελικτικές αποστάσεις και πυρηνικές πρωτεΐνες κωδικοποιούν τα οποία δρουν ως παράγοντες μεταγραφής (TF) κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής ανάπτυξης οργάνων [5]. Τα τελευταία χρόνια, η οικογένεια γονιδίων ΗΟΧ έχει επίσης συσχετιστεί με ανθρώπινες ασθένειες, ειδικά καρκίνων. Για παράδειγμα, η απώλεια της HOXA5 στον καρκίνο του μαστού [6], η υπερβολική έκφραση της HOXA10 στην οξεία μυελογενή λευχαιμία (AML) [7], γονίδιο μεταλλάξεις HOXD4 στη νεφρική και του παχέος εντέρου [8] και η υπερέκφραση του HOXC4 στον ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης [ ,,,0],9] έχουν αναφερθεί. HOXB5 (NM_002147.3), που βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 17, είναι ένα μέλος της οικογένειας γονιδίων ΗΟΧ που εμπλέκεται σε φυσιολογικό πνεύμονα και το έντερο ανάπτυξη σε ποντικού και ανθρώπου [10]. HOXB5 έχει αναφερθεί ότι σχετίζεται με ασθένειες του ανθρώπου συμπεριλαμβανομένου AML [11], συγγενή κυστική αδενωματώδης δυσπλασία (ΣΕΑΣ) [12] και βρογχοπνευμονική παγίδευσης (BPS) [13]. Επίσης, το γονίδιο HOXB5 βρέθηκε ότι εκφράζεται υψηλά σε καρκίνο των ωοθηκών και θεωρήθηκε ότι είναι ένα σημαντικό δυνητικοί στόχοι στην αγωγή του καρκίνου των ωοθηκών [14]. Η βιολογική λειτουργία του HOXB5 σε ουρολογικές καρκινώματα δεν έχουν αναφερθεί. Σε μια πιλοτική μελέτη, διαπιστώσαμε ότι HOXB5 ήταν συχνά υπερεκφράζεται σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης και κυτταρικές σειρές, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να είναι ένας υποψήφιος ογκογονίδιο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Κατά τα τελευταία δέκα χρόνια, η συμμετοχή των microRNAs (miRNAs) σε ανθρώπινους καρκίνους έχει μελετηθεί ευρέως. MiRNAs καταστέλλουν την έκφραση του mRNA στόχου με πρόσδεση με το 3 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή (3’-UTR) του mRNA. Σε ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης, miRNAs είχε δειχθεί ότι είναι σημαντικοί παράγοντες κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης. Σε προηγούμενη μελέτη, ανέφεραν ότι miRNA-143 και miRNA-125b ενήργησε ως καταστολείς όγκων στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης του ανθρώπου [15], [16]. Σε μία άλλη μελέτη αναφέρθηκε ότι miR-7 ρυθμισμένα προς τα κάτω σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης και μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου μέσω αναστολής της έκφρασης του υποδοχέα αυξητικού παράγοντα και αλλοιώνοντας την αντι-αποπτωτική Akt μονοπάτι [17].

Single-νουκλεοτίδιο πολυμορφισμοί (SNPs), η πιο κοινή μορφή γενετικών παραλλαγών στο ανθρώπινο γονιδίωμα, συμβάλλουν στην διαφορετικά ανθρώπινα φαινοτύπους. SNPs έχουν συσχετιστεί με πολλές ανθρώπινες ασθένειες, ειδικά καρκίνων. Τα τελευταία χρόνια, SNPs που βρίσκεται εντός του χώρου miRNA πρόσδεσης του στόχου miRNA (που ονομάζεται επίσης miRNA δέσμευσης SNP) έχουν βρεθεί να είναι σημαντική κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης. Σε μια προηγούμενη μελέτη, η ομάδα μας πρότεινε ότι SNP (1805C /T) στη θέση σύνδεσης miR-181 του γονιδίου Mel-18 που σχετίζονται με ορισμένα κλινικά χαρακτηριστικά του καρκίνου του προστάτη [18]. Σε μια πιλοτική μελέτη, βρήκαμε μια πιθανή miRNA-δεσμευτική SNP (1010A /G) στην 3′-UTR του γονιδίου HOXB5 χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων NCBI SNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) και miRbase (https://www.mirbase.org/).

σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι το γονίδιο HOXB5 ήταν πάνω-εκφράζεται και ενήργησε ως ογκογονίδιο στον ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Βρήκαμε επίσης έναν SNP (1010 Α /G) στην 3′-UTR του γονιδίου HOXB5 η οποία είναι εντός της θέσης δέσμευσης miRNA-7. Δείξαμε ότι αυτή η SNP θα μπορούσε να επηρεάσει την έκφραση του HOXB5 κυρίως παρεμβαίνοντας στη λειτουργία των miRNA-7 και SNP που σχετίζονται με τη σταθερότητα του mRNA? Επιπλέον, η συχνότητα του γονότυπου 1010G ήταν υψηλότερη στην ομάδα του καρκίνου σε σύγκριση με φυσιολογικούς ελέγχους, και βρέθηκε να συσχετίζεται με τον κίνδυνο της υψηλής ποιότητας και υψηλής στάδιο. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη της συμμετοχής των πολυμορφισμών στην miRNA θέση σύνδεσης της HOXB5 στον ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και ιστοί

391 ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης είχαν εγγραφεί στη μελέτη μας. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Ινστιτούτο Έρευνας Ηθικής, η Sun Yat-sen University, την Κίνα. Ενημερωμένη συγκατάθεση γράφτηκε και έλαβε από όλα τα υποκείμενα στη μελέτη μας. Όλοι οι ασθενείς είχαν πρωτογενείς καρκίνους της ουροδόχου κύστης? καμία προηγούμενη θεραπεία είχε διεξαχθεί πριν από τη λειτουργία. Τα δείγματα του καρκίνου ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε εκτομή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Τα δείγματα συλλέχθηκαν μεταξύ 2007 και 2010 στο Τμήμα Ουρολογίας, Memorial Hospital Sun Yat-sen, η Sun Yat-sen University, Guangzhou, η Κίνα και η Ουρολογική Κλινική, Νοσοκομείο Southwest, Chongqing, Κίνα. Όλα τα δείγματα της ουροδόχου κύστης αμέσως καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Ιστολογία των ιστών αξιολογηθεί ανεξάρτητα από δύο παθολόγους, και η κλινική στάδιο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το όγκο-κόμβος-μετάσταση 2002 (TNM) σύστημα ταξινόμησης.

Γραμμές Κυττάρων και Cell Culture

οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται στη μελέτη μας ελήφθησαν από την American Tissue Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)? περιλαμβάνουν Τ24, 5637, TCCSup, ΗΤ-1376, UM-UC-3, J82, RT4, EJ και την SV40 μετασχηματισμένη κυτταρική σειρά νεφρού 293Τ. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα αέρα με 5% CO2 στους 37 ° C, και όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, UT, USA). Τ24 καλλιεργήθηκε σε μέσο McCoy 5Α (τροποποιημένη)? 5637 καλλιεργήθηκε σε RPMI 1640? J82, UM-UC-3, TCCSup και ΗΤ-1376 καλλιεργήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο Eagle (ΕΜΕΜ) (Hyclone)? και RT4, EJ και SV40-μετασχηματισμένα νεφρική κυτταρική σειρά 293Τ καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM) (Hyclone).

RNA Εκχύλιση και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ολικό RNA εξήχθη από δείγματα της ουροδόχου κύστης του ασθενούς ή κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qPCR) έγινε χρησιμοποιώντας το πράσινο δοκιμασία SYBR (Takara Βιοτεχνολογίας, Dalian, Κίνα) σε Roche LightCycler 480 μηχάνημα (Roche Applied Science, Mannheim, Germany). qPCR διεξήχθη ως ακολούθως: ένα πρώτο βήμα predenaturation για 30 δευτερόλεπτα στους 95 ° C, ακολουθούμενη από ενίσχυση του 40 κύκλους στους 95 ° C για 5 δευτερόλεπτα και στους 60 ° C για 20 δευτερόλεπτα, ανάλυση καμπύλης τήξης διεξήχθη στο τέλος. Όλες οι αντιδράσεις έγιναν σε ένα όγκο αντίδρασης 20 μL εις τριπλούν. Το επίπεδο έκφρασης των HOXB5 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο Ct. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για HOXB5 ήταν: sense, 5′-TGAAGCACAGGGTTATAACGACCA-3 ‘, αντινόημα, 5′- GCAGCGGGATCCCTGTAAGA-3′? και για GAPDH οι εκκινητές ήταν:. έννοια, 5’- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ‘, αντινόημα, 5′- GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

Ανοσοϊστοχημεία

εγκλεισμένα σε παραφίνη, σταθεροποιημένα με φορμαλίνη ιστοί κόπηκαν σε τμήμα 5-μm, τοποθετείται σε ένα επικαλυμμένες με πολυλυσίνη διαφάνεια, αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν χρησιμοποιώντας διαβαθμισμένη αιθανόλη, σβήστηκε για ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3% και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανάκτηση αντιγόνου με θέρμανση μικροκυμάτων σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0) . Οι τομές επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύχτα με πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού HOXB5 (1:100, Abcam, Cambridge, ΜΑ, USA). Η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ChemMate ™ ϋΑΚΟ EnVision Detection Kit ™ (DakoCytomation, Glostrup, Denmark), η οποία οδήγησε σε ένα καφέ ίζημα στη θέση του αντιγόνου. Στη συνέχεια, οι τομές με αιματοξυλίνη (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA) και τοποθετήθηκαν σε υδατώδες μέσο στερέωσης. Το πρωτογενές αντίσωμα παραλείφθηκε για τους αρνητικούς μάρτυρες.

Western Blot

Η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης και κυτταρικές σειρές όπως περιγράφεται [19]. Εν συντομία, 30 μg πρωτεΐνης από κάθε δείγμα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε ένα πηκτώματος δωδεκυλθειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου πριν μεταφερθούν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) για 2 ώρες. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, χρησιμοποιώντας 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) και επωάστηκαν σε TBST (αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα Tris με 0,05% Tween) που περιείχε πολύκλωνα IgG2a κουνελιού αντι-HOXB5 (1:1000, Abcam) ή GAPDH (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA) για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με ανοσοσφαιρίνη συζευγμένο με υπεροξειδάση κατσίκας αντι-κουνελιού (1:5000, Cell Signaling Technology) ως δευτερεύον αντίσωμα και στη συνέχεια οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ ECL (Pierce, Rockford, IL, USA).

Κυττάρων Η επιμόλυνση με SI-HOXB5 και miRNA-7

siRNAs σχεδιάζονται για να HOXB5 και miRNA-7 μιμείται επιμολύνθηκαν μέσα στα καρκινικά κύτταρα κύστης Τ24, 5637 και TCCSup χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη-RNAiMAX (Invitrogen). Οι αλληλουχίες που χρησιμοποιούνται για si-HOXB5 ήταν, νόημα: 5′-GGAUGGACCUCAGCGUCAATT-3 ‘, αντινόημα: 5′-UUGACGCUGAGGUCCAUCCTT-3′? για miR-7 μιμείται, αίσθηση: 5’-CAACAAAUCACAGUCUGCCAUA-3 ‘, αντινόημα: 5′-UAUGGCAGACUGUGAUUUGUUG-3′? και για τον αρνητικό έλεγχο, αίσθηση: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘, αντινόημα: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’. Όλα τα ολιγοριβονουκλεοτίδια RNA αγοράσθηκαν από Genepharma (Σανγκάη, Κίνα). Μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση, 2 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα έξι-φρεατίων. Την επόμενη μέρα, όταν τα κύτταρα έφθασαν 70-80% συρροή, αυτά επιμολύνθηκαν με RNA σε μια τελική συγκέντρωση 100 ηΜ σύμφωνα με το πρωτόκολλο Lipofectamine-RNAiMAX του. Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης μετράται με qPCR, ήταν 70% για Τ24, 72% για 5637 και 75% για TCCSup (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου κύστη Τ24, 5637 και TCCSup απλώθηκαν πάνω σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάστηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% επωαστή CO2 μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση. Μετά την επιμόλυνση με siRNAs (100 ηΜ) ή ένας αρνητικός έλεγχος για 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τοποθετήθηκαν πάνω σε πλάκες 96-φρεατίων για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας του κυττάρου χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία CCK8 (Cell Μετρώντας Kit-8) (Dojindo Laboratories, Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο [20].

In vitro

κυττάρων μετανάστευση Δοκιμασία

Αφού οι καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές Τ24, 5637 και TCCSup επιμολύνονται με si-HOXB5 (100 ναυτικών μιλίων) ή μη ειδικό έλεγχο (NC) siRNA για 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και εναιωρήθηκαν σε 100 μλ μέσου χωρίς ορό και μετά καλλιεργήθηκαν (1 × 10

4 κύτταρα) στο άνω διαμέρισμα πλακών Transwell (Corning, ΝΥ, USA ). Τα ένθετα Transwell τοποθετήθηκαν κατόπιν εντός του κάτω διαμερίσματος μιας πλάκας 24 φρεατίων που περιέχουν 600 μL του μέσου με 20% FBS ως χημειο-προσελκυστικό. Μετά από μια περίοδο επώασης 24 ωρών, τα κύτταρα που παραμένουν στην άνω επιφάνεια της μεμβράνης απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια μονιμοποιήθηκαν σε 100% μεθανόλη για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από χρώση με 0,1% διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους για 30 λεπτά. Κύτταρα που βάφονται μοβ ορίστηκαν ως θετικές και οι εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο (10 Χ) (Όλυμπος, Κέντρο Valley, PA, USA).

Colony Δοκιμασία Σχηματισμού

Μετά την επιμόλυνση με si -HOXB5 (100 ηΜ) ή NC siRNA για 24 ώρες, τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κύστης Τ24, 5637 και TCCSup συλλέχθηκαν και τοποθετήθηκαν πάνω σε μία φρέσκια πλάκα έξι φρεατίων (500 κύτταρα για Τ24, και 1,000 κυττάρων για 5637 και TCCSup). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για περίπου 2 εβδομάδες για να σχηματίσουν αποικίες. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη και χρωματίσθηκαν με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες σε 20% μεθανόλη για 15 λεπτά. Σχηματισμού αποικιών αποτελεσματικότητα υπολογίστηκε ως αποικίες /επιχρυσωμένο κύτταρα × 100%.

Βιοπληροφορική

Η βάση δεδομένων NCBI SNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) χρησιμοποιήθηκε για να βρει SNPs βρίσκονται εντός της 3′-UTR του γονιδίου HOXB5. Τέσσερις διαθέσιμες στο κοινό αλγόριθμους, PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/), TargetScan (https://www.targetscan.org/), Μιράντα (https://www.microrna.org/) και DIANA μΤ (https://diana.pcbi.upenn.edu/) έχουν χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει ποια από τα ανθρώπινα miRNAs σε miRbase (https://www.mirbase.org/) μπορεί να συνδέεται με το 3′-UTR της HOXB5. Τα miRNAs που προβλέφθηκε από τουλάχιστον 2 των αλγορίθμων να δεσμεύουν έγιναν δεκτές ως υποψήφιες για περαιτέρω μελέτη. Το mRNA πρόβλεψη δευτερογενούς δομής εργαλείο MFOLD (https://mfold.rna.albany.edu/) χρησιμοποιήθηκε για να προβλεφθεί η δευτερογενής δομή του mRNA HOXB5. Μικρές ελάχιστη ελεύθερη ενέργεια (MFE) δείχνει υψηλή σταθερότητα της προβλεπόμενης δευτεροταγούς δομής mRNA.

Δοκιμασία λουσιφεράσης

Κατασκευάζουμε λουσιφεράσης πλασμίδια ανταποκριτές με τον HOXB5 3′-UTR θραύσμα που περιείχε την υποτιθέμενη δεσμευτική θέσεις για τον υποψήφιο miRNA και τους υποκλωνοποιήθηκε στον psiCHECK-2 (Promega, Madison, WI, USA) για να παραχθεί το πλασμίδιο psiCHECK-2-3′-UTR-WT. Το μεταλλαγμένο HOXB5 3′-UTR δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο PCR σύντηξης και στη συνέχεια υποκλωνοποιήθηκε επίσης στο psiCHECK-2 φορέα για να παραχθεί το πλασμίδιο psiCHECK-2-3′-UTR-MUT. Ανάλυση της αλληλουχίας του DNA χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί η αλληλουχία των κατασκευασμένων πλασμιδίων.

Για τη δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης, τα κύτταρα ΗΕΚ-293Τ (2 × 10

4) τοποθετήθηκαν πάνω σε μία πλάκα 24 φρεατίων μία ημέρα πριν από διαμόλυνση. Την επόμενη ημέρα 0.5 μg είτε της psiCHECK-2-3′-UTR-WT ή το psiCHECK-2-3′-UTR-MUT, και είτε το miRNA ή αρνητικού ελέγχου συνδιαμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ-293Τ χρησιμοποιώντας Lipofectamine2000 ( Invitrogen). Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με χρήση του Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega). Η δραστικότητα λουσιφεράσης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης GloMax-πολυ (Promega). Τα σήματα λουσιφεράσης Renilla ομαλοποιήθηκαν για τον εσωτερικό έλεγχο επιμόλυνσης της λουσιφεράσης πυγολαμπίδα. Οι επιμολύνσεις έγιναν εις τριπλούν σε ανεξάρτητα πειράματα.

DNA Εκχύλιση και HOXB5 Ανάλυση γονοτυπικός

ολικό DNA εκχυλίστηκε από δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης του ασθενούς και κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο QIAamp (QIAGEN, Germantown, MD , USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. HOXB5 γονοτυπική εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία αλληλούχισης DNA. Ένα θραύσμα DNA 334 bp που περιέχει τον SNP στο 3′-UTR του γονιδίου HOXB5 ενισχύθηκε από γονιδιωματικό DNA. Οι εκκινητές PCR που χρησιμοποιήθηκαν ήταν, προς τα εμπρός 5′-GCGCATGAAGTGGAAGAAGG-3 ‘, αντίστροφος 5′-TTGGGACAAGCAGAAGGGAG-3’. Το ενισχυμένο θραύσμα DNA αλληλουχήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό GENESCAN (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Μέτρηση της έκφρασης του mRNA HOXB5

Το επίπεδο του mRNA HOXB5 μετρήθηκε σε 3 καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές γραμμές (5637, J82 και RT4) και 13 ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Συγκεκριμένη περιοχή Taqman ανιχνευτές σχεδιάστηκαν για να ανιχνεύσουν τον SNP στην 3′-UTR του mRNA HOXB5. Το cDNA από τις κυτταρικές σειρές και καρκινικούς ιστούς υποβλήθηκαν σε qPCR και ο φθορισμός (VIC για 1010A, FAM για 1010G) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας LightCycler 480 Probes κύριο (Roche Applied Science, Mannheim, Germany).

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε επίσης από κυτταρικές σειρές και καρκινικούς ιστούς όπως αναφέρθηκε. Ως εσωτερικός έλεγχος, qPCR διεξήχθη για τον προσδιορισμό των επιπέδων γονιδιωματικού DNA του HOXB5 χρησιμοποιώντας τα ίδια περιοχή-ειδικοί ανιχνευτές Taqman.

HOXB5 mRNA Half-ζωής

qPCR χρησιμοποιήθηκε επίσης για τη μέτρηση της μισό -Life του mRNA HOXB5. 1 × 10

6 Τ24 και TCCSup καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης απλώθηκαν σε ένα δίσκο των 10 cm μία ημέρα πριν ακτινομυκίνη D (5 μg /ml), η οποία αναστέλλει γενετική μεταγραφή, προστέθηκε στα κύτταρα. Μετά από κατεργασία με ακτινομυκίνη D, τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ σε διαφορετικά χρονικά σημεία, 0 ώρες, 4 ώρες, 8 ώρες, 12 ώρες, 24 ώρες και 48 ώρες. Ολικό RNA εκχυλίστηκε και το επίπεδο mRNA HOXB5 ποσοτικοποιήθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας την δοκιμασία Taqman όπως περιγράφηκε προηγουμένως ανωτέρω.

Στατιστικά

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM από τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα . Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας t δοκιμή Student όταν συγκρίθηκαν μόνο δύο ομάδες, ή, με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) όταν συγκρίθηκαν περισσότερες από δύο ομάδες. Ο λόγος ηλικία-ρυθμισμένες αποδόσεις (AOR) και 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI) για τη σχέση μεταξύ των HOXB5 3′-UTR συχνότητες γονοτύπου και κλινικά ή ιστολογικά χαρακτηριστικά προσδιορίστηκαν από πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας SPSS 17.0 με την ηλικία θεωρείται ως παράγοντας . Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε ρ Είναι ενδιαφέρον ότι, το επίπεδο έκφρασης του mRNA HOXB5 με το Α αλληλόμορφο μειώθηκε κατά πολύ περισσότερο από ό, τι το επίπεδο του mRNA με το αλληλόμορφο G (Σχήμα 5C), υποδεικνύοντας ότι η δέσμευση του miR-7 προς το mRNA HOXB5 με το Α αλληλόμορφο ήταν μεγαλύτερη από το mRNA με το αλληλόμορφο G.

Για να επικυρώσετε την υπόθεσή μας, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία λουσιφεράσης. Η σχετική δραστηριότητα λουσιφεράσης κατεστάλη πολύ περισσότερο στον ρεπόρτερ που περιέχει το 1010A επιμολυσμένα με miR-7 από το ότι περιέχει το αλληλόμορφο 1010G (Σχήμα 5D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δραστηριότητα σύνδεσης του miR-7 είτε με την 1010A ή 1010G αλληλόμορφο μπορεί να είναι ένας άλλος σημαντικός μηχανισμός που εμπλέκονται στα διάφορα επίπεδα έκφρασης HOXB5 επηρεάζονται από την SNP.

Η Σύνδεσης μεταξύ της 1010A /G HOXB5 Γονότυπος συχνότητα και καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Στη συνέχεια, εξετάσαμε τη συσχέτιση μεταξύ 1010A /G HOXB5 συχνότητα του γονότυπου και τα κλινικά χαρακτηριστικά του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. DNA εκχυλίστηκε από 391 ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης που επιβεβαιώθηκε από παθολόγους, και από 391 φυσιολογικούς ελέγχους, και οι SNP (1010A /G) γονότυπους για κάθε δείγμα αναλύθηκαν. Βρήκαμε ότι το G αλληλόμορφο (AG + GG) γονότυπους συσχετίστηκαν με τον κίνδυνο υψηλού βαθμού (βαθμός 2 και 3, AOR = 4,25, p & lt? 0.001, Πίνακας 1) και υψηλό στάδιο (Τ2-Τ4, των μυών επεμβατική τύπου, AOR = 2.25, ρ = 0.003, Πίνακας 2) καρκίνους έναντι χαμηλού βαθμού (βαθμός1) και χαμηλή στάδιο (Τ1, μη επεμβατική μυς τύπου) καρκίνων. Δείξαμε επίσης ότι η συχνότητα των γονότυπων G (AG + GG) ήταν υψηλότερη στην ομάδα καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς μάρτυρες (AOR = 1.48, ρ = 0.017) (Πίνακας 3).

Η