Αφηρημένο

Οι συμβατικές χημειοθεραπείες ανοσοενισχυτικό για την κύστη μεταβατική καρκινώματα (TCCS) μπορεί να προκαλέσει έντονη συστημική τοξικότητα και τοπικό ερεθισμό. Μη-τοξικά ρεσβερατρόλη αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων του TCC, αλλά σκοπιμότητας της στην κλινική διαχείριση των TCCS παραμένει ασαφής. Η μελέτη αυτή αποσκοπεί να αξιολογήσει την αποτελεσματικότητα ασφάλειας και αντι-TCC της ρεσβερατρόλης, χρησιμοποιώντας τα πειραματικά μοντέλα πιο κοντά στην κατάσταση κλινικής θεραπείας. Ανθρώπινα κύτταρα TCC EJ εκτέθηκαν σε 100 μΜ, 150 μΜ και 200 ​​μΜ αντίστοιχα ρεσβερατρόλης για 1 ώρα και 2 ώρες για να μιμηθεί ενδοκυστική ενστάλαξη του φαρμάκου και οι απαντήσεις των κυττάρων αναλύθηκαν με πολλαπλούς πειραματικές προσεγγίσεις. Ένα ορθοτοπικό TCC μοντέλο γυμνού ποντικού καθιερώθηκε με την έγχυση των κυττάρων EJ στην υπο-ουροφόρων στρώμα και χρησιμοποιείται για τη βραχυπρόθεσμη ενδοκυστική ρεσβερατρόλη ενστάλαξη. Η ασφάλεια της ρεσβερατρόλης ενστάλαξη αξιολογήθηκε και συγκρίθηκε με εκείνη του MCC. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι 2 ώρες 150 μΜ ή 200 μΜ θεραπεία ρεσβερατρόλη οδήγησαν σε αξιοσημείωτα σύλληψη φάση S και απόπτωση σε 72 ώρες χρονικό σημείο, που συνοδεύεται με εξασθενημένο φωσφορυλίωση, πυρηνική μετατόπιση και μεταγραφή του STAT3, ρύθμιση προς τα κάτω της STAT3 κατάντη γονίδια (survivin, cyclinD1, c-Myc και VEGF) και της πυρηνικής μετατοπίσεις SIRT1 και ρ53. Η σημασία της STAT3 σηματοδότησης στην ανάπτυξη των κυττάρων επιβεβαιώθηκε με κατεργασία των κυττάρων EJ με αναστολέα JAK2 τυρφοστίνης AG490. Η αποτελεσματικότητα και η ασφάλεια της ρεσβερατρόλης ενστάλαξη αποδείχθηκαν με τα ευρήματα από γυμνό ποντίκι ορθοτοπική μοντέλα ξενομοσχεύματος, επειδή αυτή η θεραπεία προκάλεσε καταστολή της ανάπτυξης, των διακριτικών απόπτωση και STAT3 αδρανοποίηση των μεταμοσχευμένων όγκων χωρίς να επηρεάζει την κανονική ουροθήλιο. έτσι αποτελέσματά μας δείχνουν για πρώτη φορά τις πρακτικές τιμών της ρεσβερατρόλης ως ένα ασφαλές και αποτελεσματικό παράγοντα στη μετεγχειρητική θεραπεία του TCCS

Παράθεση:. Wu ML, Li H, Yu LJ, Chen ΧΥ, Κονγκ ΟΥ , Τραγούδι Χ, et al. Προκαλεί (2014) Short-Term ρεσβερατρόλη έκθεσης

In Vitro

και

In Vivo

Αναστολή Ανάπτυξης και απόπτωση κυττάρων του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 9 (2): e89806. doi: 10.1371 /journal.pone.0089806

Επιμέλεια: Ιρίνα Β Λεμπέντεβα, το Πανεπιστήμιο Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Αύγ 2013? Αποδεκτές: 24η Ιανουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 25 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αρ. 81272786, 30971038, 81071971 και 81072063) και Ταμείο Έρευνας για τον διδακτορικό επόπτες από το Εθνικό Υπουργείο Παιδείας της Κίνας (20122105110005). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η συχνότερη κακοήθεια του ουροποιητικού συστήματος, των οποίων το 90% είναι μεταβατικό καρκίνωμα (TCC). Διουρηθρική ακολουθείται από ενδοκυστική χημειοθεραπεία είναι η τυπική φροντίδα των ασθενών TCC [1]. Υποτροπή είναι ο μεγαλύτερος κίνδυνος των ασθενών TCC λόγω της δυσκολίας να αφαιρέσετε ριζικά τους επιθετικούς όγκους [2]. Κατά συνέπεια, επικουρική ενδοκυστική χημειοθεραπείες γίνονται οι κύριες προσεγγίσεις για την πρόληψη της υποτροπής TCC. Bacillus Calmette-Guerin, ιντερφερόνη-α, σισπλατίνη, μιτομυκίνη C (MMC) και οι συνδυασμοί τους χρησιμοποιούνται συμβατικά στην κλινική πρακτική, ενώ αποτελεσματικότητες τους είναι μεταβλητή [3], [4], και συνήθως προκαλούν ισχυρή συστημική τοξικότητα και τοπικές επιπλοκές, όπως αιμορραγικές κυστίτιδα [2]. Ως εκ τούτου, είναι επιτακτική ανάγκη να διερευνηθούν μικρότερο τοξικό και πιο αποτελεσματική προσέγγιση για την καλύτερη διαχείριση των TCCS.

Η ρεσβερατρόλη έχει θεωρηθεί ως ένα μη τοξικό πολυφαινολικών ένωση που βρέθηκαν στα σταφύλια, τα μούρα, τα φυστίκια και το κόκκινο κρασί [5 ]. Ένα σώμα στοιχεία δείχνουν ότι η ρεσβερατρόλη είναι σε θέση να αναστέλλουν την ανάπτυξη πολλών καρκίνων όπως η λευχαιμία, ο καρκίνος του μαστού και πρωτογενείς όγκους του εγκεφάλου [6] – [8]. Στην περίπτωση των καρκίνων της ουροδόχου κύστης, η ρεσβερατρόλη μειώνει αποτελεσματικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων και επάγει την απόπτωση των ανθρώπινων και ποντικού κύτταρα καρκίνου της ουροδόχου κύστης [9] – [12]. Παρ ‘όλα αυτά, η πρακτική αξία της ρεσβερατρόλης στη θεραπεία αντι-TCC δεν έχει αντιμετωπιστεί με τη χρήση των πιο κλινικά σχετικές πειραματικό μοντέλο (-α) και με τον τρόπο της τοπικής χορήγηση του φαρμάκου. Στην παρούσα μελέτη, η ανθρώπινη κυτταρική σειρά TCC, EJ [13], υποβλήθηκε σε επεξεργασία με βραχυπρόθεσμα από τη ρεσβερατρόλη για να μιμηθούν την κλινική ενστάλαξη των ναρκωτικών [14]. Οι κυτταρικές και μοριακές αποκρίσεις των κυττάρων EJ στη θεραπεία αναλύθηκαν με πολλαπλές προσεγγίσεις. Εν τω μεταξύ, ένα ορθοτοπικό μοντέλο TCC γυμνού ποντικού καθιερώθηκε με ένεση κυττάρων EJ εντός του υπο-ουροφόρων στρώμα και υποβάλλεται σε αγωγή με ρεσβερατρόλη με τον τρόπο παρόμοιο με ενδοκυστική ενστάλαξη ναρκωτικών [15]. Οι κυτταρικές και μοριακές αντιδράσεις σε αυτές τις κατεργασίες αξιολογήθηκαν στη συνέχεια.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και θεραπείες

Ανθρώπινα κύτταρα TCC EJ [13] καλλιεργήθηκαν σε Eagle τροποποιημένο κατά του βασικό μέσο (DMEM) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco Life Science, Grand Island, ΝΥ, USA) κάτω από 37 ° C και 5% CO

2 συνθήκες. Τα κύτταρα (5 × 10

4 /ml) τοποθετήθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας (Nunc, Denmark) και επωάστηκε για 24 ώρες πριν από τα πειράματα

Η ρεσβερατρόλη (Res?. Sigma Chemical, Inc, St. Louis , ΜΟ) διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO? Sigma) και αραιώνονται με μέσο καλλιέργειας σε συγκεντρώσεις εργασίας λίγο πριν από τη χρήση. Τα κύτταρα υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας, αντιμετωπίζεται με 0,2% DMSO και εκτέθηκαν σε 100 μΜ Res επί 48 ώρες χρησιμοποιήθηκαν σαν κανονικό, το υπόβαθρο και την αποτελεσματικότητα των ελέγχων, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο διάγραμμα (Σχήμα 1Α), τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία EJ από 100 μΜ, 150 μΜ ή 200 μΜ Res για 1 ώρα, 1.5 ώρα ή 2 ώρες σε διαστήματα 24 ωρών. Μετά από 1 ώρα και 2 ώρες θεραπείες, Res μέσα που περιέχουν αντικαταστάθηκαν με κανονικό μέσο κατά 3 πλύσεις. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα EJ εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις Res για 3 φορές (μία φορά την ημέρα) κατά τη διάρκεια του πειράματος 72 h (Σχήμα 1Α). αριθμούς κυττάρων και βιωσιμότητες ελέγχθηκαν σε διαστήματα 12 ωρών. Οι καλυπτρίδες κυττάρων που φέρουν σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή ακετόνη ή 4% παραφορμαλδεΰδη (ρΗ 7.4) για μορφολογική και ανοσοκυτταροχημικές εξετάσεις. Οι πειραματικές ομάδες τέθηκαν εις τριπλούν και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές για να δημιουργήσει εμπιστευτικές συμπέρασμα.

Α. Σχηματικό διάγραμμα της βραχυπρόθεσμης in vitro θεραπεία ρεσβερατρόλη. δοκιμασία Β ΜΤΤ διεξάγεται σε 72 ώρες μετά οι θεραπείες έδειξαν ότι η βραχυχρόνια έκθεση ρεσβερατρόλη μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων και κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων EJ σε δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. *, Σε σύγκριση με το Ν ομάδα,

P

, σύγκριση μεταξύ 1,0 h, 1,5 h ή 2,0 h 150 ομάδες μΜ Res-θεραπεία,

P

& lt? 0,01?

∧∧, σε σύγκριση μεταξύ 1,0 h, 1,5 h ή 2,0 h 200 μΜ Res επεξεργασμένο ομάδες,

P

& lt? 0,01. C. Η &? Ε χρώση και δοκιμασία TUNEL (ένθετο της εναλλάσσονται περιφέρεια) εκτελέστηκε σε 2 h κύτταρα επεξεργασμένα-EJ 200 μΜ ρεσβερατρόλη σε 72 ώρες. Δ ροής διεξήχθη για να προσδιοριστεί κατανομή κύκλου κυττάρου και απόπτωση σε κύτταρα EJ μετά σύντομες επεξεργασίες ρεσβερατρόλη. 150 μΜ και 200 ​​μΜ θεραπείες ρεσβερατρόλης για 2 ώρες θα μπορούσε τόσο διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση S και την αύξηση αποπτωτικών κλάσματα σε 72 ώρες στη δόση-εξαρτώμενο τρόπο.

Η

κυτταρικού πολλαπλασιασμού και θανάτου Αναλύσεις

Οι επιδράσεις της ρεσβερατρόλης στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίστηκαν με 3- [4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] -2,5-διφαινυλ-τετραζολίου (ΜΤΤ) που περιγράφεται αλλού [8]. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ποσοστό της βιωσιμότητας των κυττάρων (OD των δειγμάτων πείραμα /OD του ελέγχου) ή OD τιμές. Τερματική τρανσφεράση δεσοξυνουκλεοτιδίων (TdT) μεσολάβηση dUTP-βιοτίνης nick-άκρο επισήμανση (TUNEL) δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει αποπτωτικά κύτταρα σύμφωνα με τις οδηγίες του παραγωγού (Promega Corporation, USA). Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (/Ε H) χρώση πραγματοποιήθηκε για την παρατήρηση των μορφολογικών αλλαγών των κυττάρων EJ μετά τη θεραπεία.

Κυτταρομετρίας Ροής

Τα συλλεχθέντα κύτταρα από τις πειραματικές ομάδες μονιμοποιήθηκαν σε αιθανόλη για χρώση με βαφή DNA και επαναιωρήθηκαν σε 0,5 ml έως 1 ml διαλύματος ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) που περιέχει RNase και επωάζονται στους 37 ° C για 30 λεπτά. προφίλ του κυτταρικού κύκλου και οι κλασματοποιήσεις των αποπτωτικών κυττάρων ελήφθησαν με ένα FACSVantage κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) και τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό ModFit (Verity Software House, USA).

RNA απομόνωση και αντίστροφη μεταγραφή

–

Polymerase Chain

Αντίδραση

Το συνολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας διάλυμα ΤπζοΙ (Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη). Με τη μέθοδο που περιγράφεται αλλού [8], η αντίστροφη μεταγραφή (RT) εκτελέστηκε σε δείγματα RNA, που ακολουθείται από αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) με τους εκκινητές (Πίνακας 1) για STAT3, c-myc, κυκλίνη D1 και survivin [16] – [19]. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε γέλη αγαρόζης 1% που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο (0,5 μg /ml), οπτικοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας UVP Biospectrum Σύστημα Απεικόνισης (UVP, Inc, Upland, CA). Οι β-ακτίνης PCR προϊόντα που παράγονται από το ίδιο διάλυμα RT αναφέρθηκαν ως ποσοτικοί έλεγχοι.

Η

Ανοσοκυτοχημική και ανοσοφθορισμού χρώσης

Ανοσοκυτοχημική χρώση (ΔΠΔ) πραγματοποιήθηκε στις καλυπτρίδες που λαμβάνονται από κάθε των πειραματικών ομάδων με την μέθοδο που περιγράφεται αλλού [20]. Τα αντισώματα κατά της ανθρώπινης STAT3, ρ-STAT3, survivin, cyclinD1, c-myc, VEGF, SIRT1 και ρ53 τα προμηθευτήκαμε από την Santa Cruz Biotechnology, Inc, CA. Η χρωματική αντίδραση αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας 3, 3′-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική (DAB). Σύμφωνα με την ένταση επισήμανση, τα αποτελέσματα χρώσης αξιολογήθηκαν από δύο ανεξάρτητους ερευνητές και βαθμολογήθηκαν ως αρνητικά (-) αν δεν παρατηρήθηκε ανοσοσήμανση στα κύτταρα-στόχους, ασθενώς θετικό (+) εάν η επισήμανση ήταν αμυδρή, μέτρια θετική (++), και έντονα θετική (& gt? ++), όταν η επισήμανση ήταν ισχυρότερη ή σαφώς ισχυρότερη από ό, τι (++). Για χρώση ανοσοφθορισμού (IF), το κύτταρο που φέρει καλυπτρίδες ξεπλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό διάλυμα (PBS? ΡΗ 7,4) για 3 φορές, αποκλείστηκαν με 10% ορό κατσίκας σε PBS (ρΗ 7.4) για 20 λεπτά, επωάστηκαν όλη τη νύκτα με πρωτογενές αντίσωμα έναντι στόχευση πρωτεϊνών και τελικά συν-επωάστηκαν με φθορισμό σημασμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού ή κουνελιού αντι-ποντικού IgG (1:200? Santa Cruz Biotechnology, Inc) στους 37 ° C για 60 λεπτά στο σκοτάδι. Οι πυρήνες επισημάνθηκαν με DAPI (μπλε φθορισμό). Οι καλυπτρίδες παρατηρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (BX53F, της Olympus, Japan).

Protein Παρασκευή και κηλίδωση Western

Σύνολο κυτταρικές πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν από τα κύτταρα κάτω από διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας [20] . Οι πρωτεΐνες του δείγματος (50 μg /φρεάτιο) διαχωρίστηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής δωδεκυλοθειικού-πολυακρυλαμιδίου 10% νάτριο και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Amersham, Buckinghamshire, UK). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε ΤΒδ-Τ (10 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0, 150 mM NaCl και 0,5% Tween 20) σε 4 ° C, ξεπλύθηκαν 10 λεπτά τρεις φορές με ΤΒδ-Τ, που ακολουθείται από 3 ώρες επώασης σε θερμοκρασία δωματίου με το πρώτο αντίσωμα και έπειτα από 1 ώρα επώαση με συζευγμένο με HRP αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού IgG (Zymed Lab, Inc). Το δεσμευμένο αντίσωμα ανιχνεύθηκε με τη χρήση του βελτιωμένου συστήματος χημιφωταύγειας (Roche GmbH, Mannheim, Germany). Μετά την αφαίρεση του σήματος σήμανση με επώαση με ρυθμιστικό απογύμνωσης [8], η μεμβράνη επανανιχνεύθηκαν με άλλα αντισώματα μία-μία μέχρι εξετάστηκαν όλες τις παραμέτρους.

Η αναστολή της STAT3 ενεργοποίηση με AG490

JAK2-ειδικός αναστολέας AG490 (Sigma) [21] διαλύθηκε σε DMSO και αραιώνεται σε τελικές συγκεντρώσεις 50 μΜ και 80 μΜ με μέσο καλλιέργειας. Τέσσερις πειραματικές ομάδες είχαν καθοριστεί ως εξής: Ομάδα1, κανονική πολιτισμό? Ομάδα 2, η θεραπεία με 1,2 ‰ DMSO ως έλεγχος φόντο? Ομάδες 3 και 4, η θεραπεία με 50 μΜ ή 80 μΜ AG490. Οι επιδράσεις της AG490 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίστηκαν με ΜΤΤ, κυτταρομετρία ροής και καλυπτρίδας με βάση μορφολογικά και ICC χρώση για STAT3, ρ-STAT3, cyclinD1, survivin, c-Myc και VEGF. δείγματα RNA και πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν από όλες τις ομάδες για RT-PCR και αναλύσεις Western blot.

Ηθική Δήλωση

Πριν από τα πειράματα σε ζώα, τα ερευνητικά πρωτόκολλα εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από φροντίδα των ζώων και τη χρήση Επιτροπή των Dalian Medical University. Όλες οι εργασίες που αφορούν πειραματόζωα έγινε σε πλήρη συμμόρφωση με το NIH (National Institutes of Health) Κατευθυντήριες γραμμές για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν υπό αναισθησία με ένυδρη χλωράλη και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

ορθοτοπική TCC Μοντέλο και Ενδοκυστική Θεραπεία

Γυναίκα BALB /c-nude ποντίκια (4 εβδομάδες, 14-16 g σωματικού βάρους) τέθηκαν υπό συγκεκριμένες ελεύθερες παθογόνων () συνθήκες SPF. Για τον καθορισμό των ορθοτοπικό μοντέλο καρκίνου της ουροδόχου κύστης [22], οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με ένυδρη χλωράλη 3,5% (0,1 ml /10 g σωματικού βάρους ποντίκια) [23]. Η κατάσταση της αναισθησίας αξιολογήθηκε από την απώλεια των αντανακλαστικών ισορρόπησης (LORR), και του χρόνου να προκαλέσει LORR ήταν συνήθως μεταξύ 5-10 λεπτά. Στην ελεύθερων μικροοργανισμών μονωτήρα, οι ποντικοί ουροδόχου κύστες εκτέθηκαν μέσω μίας χαμηλής κεντρική τομή? 20 μΙ εναιώρημα EJ κυττάρων (1 χ 10

6 κύτταρα) εγχύθηκε σε υπο-επιθηλιακό στρώμα της και η εμφάνιση του «ημιδιάφανο φούσκες» υποδεικνύεται επιτυχής εμβολιασμός. Τρεις ημέρες αργότερα, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες (10 ποντικοί /ομάδα) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 μΙ 200 μΜ ρεσβερατρόλη ή 50 μl 0.9% NaCl σε διαστήματα δύο ημερών. Μετά την εκκένωση ούρων, μια 24-gauge επενδεδυμένη με τεφλόν καθετήρα εισήχθη στον αυλό της κύστης. Για να αποφευχθεί η διαρροή υγρού, ο καθετήρας στερεώνεται με σύριγγα συγκρατείται στη θέση του για 40 λεπτά. Όλα τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με ασφάλεια και συνήθως ανακτάται από αναισθησία μετά από 2 ώρες. Μέχρι το τέλος του πειράματος 28 ημέρας και η όλη κύστες συλλέχθηκαν, ζυγίστηκαν και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ιστολογική και ανοσοϊστοχημική (IHC) εξετάσεις. Η απόπτωση ανιχνεύθηκε με την δοκιμασία TUNEL και ευρετήρια του ελήφθησαν με απαρίθμηση TUNEL-θετικών κυττάρων έναντι πάνω από 1000 που παρατηρείται κύτταρα στις τομές όγκων [24].

Αξιολόγηση τοπικού ερεθισμού και συστημική τοξικότητα

5-εβδομάδων ICR θηλυκών ποντικών (5 ποντίκια /ομάδα) ενδοκυστικά σε επεξεργασία με 50 μΙ 200 μΜ ρεσβερατρόλης. Η θεραπεία διεξήχθη για 6 φορές σε διαστήματα 2 ημερών. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με 50 μΙ 2 mg /ml MMC (Sigma-Aldrich, διαλυμένη σε 0,9% NaCl) [25] με τον ίδιο τρόπο χορήγησης αναφέρθηκαν ως έλεγχος. Μέχρι το τέλος των θεραπειών, τα σωματικά βάρη μετρήθηκαν και η απόκριση (ες) των ιστών ουροδόχου κύστης με τις επεξεργασίες που εξετάστηκαν από την άποψη της βλεννογόνου ακεραιότητα, τριχοειδή συμφόρηση και αιμορραγία.

Στατιστική Ανάλυση

Οι διαφορές σε συνεχείς μεταβλητές εκτιμήθηκαν με Student

t

δοκιμή ή μονόδρομη ANOVA. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Βραχυπρόθεσμες ρεσβερατρόλη Θεραπεία Καταστολής TCC ανάπτυξη κυττάρων

δοκιμασίας ΜΤΤ αποκάλυψε ότι κυττάρων EJ ανάπτυξη καταστάλθηκε από βραχυπρόθεσμες θεραπείες ρεσβερατρόλη σε δόση και μόδες του χρόνου που σχετίζονται με (Εικόνα 1Β). H /E χρώση και δοκιμασία TUNEL έδειξαν συχνή αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε 2 ώρες 150 μΜ και 200 ​​μΜ ομάδες Res-αγωγή (Σχήμα 1C). Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι 2 ώρες 150 μΜ και 200 ​​μΜ Res θεραπείες που προκαλείται διακοπή φάσης S και την απόπτωση σε πληθυσμούς κυττάρων EJ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, οι G1 και S κλάσματα των κυττάρων EJ ήταν 62,6% και 33% σε κανονικά καλλιεργημένα κύτταρα, η οποία άλλαξε σε 23,9% και 76,1% σε 2 ώρες 150 μΜ Res θεραπεία και 17,7% και 82,3% σε 2 ώρες 200 μΜ Res αγωγή πληθυσμού, αντίστοιχα. Τα ποσοστά της απόπτωσης σε κανονικά καλλιεργημένα, 2 h 150 μΜ ΑΠΕ και 200 ​​μΜ Res αγωγή ομάδες ήταν 0,394%, 4,98% και 11.4% σε 72 ώρες χρονικό σημείο (Σχήμα 1 D). Η ανάπτυξη των κυττάρων EJ ανεστάλη αποτελεσματικά με τη συνεχή αγωγή των 100 μΜ ρεσβερατρόλης.

Η ρεσβερατρόλη αναστέλλει STAT3 Μεταγραφή και ενεργοποίηση

Λόγω των κρίσιμους ρόλους των ενεργοποιημένων σηματοδότησης STAT3 σε κύτταρα κύστης TCC [26 ], η επίδραση της ρεσβερατρόλης στην σηματοδότηση STAT3 σε κύτταρα EJ αναλύθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας τα δείγματα RNA που εκχυλίζεται από τα κύτταρα EJ χωρίς και με αγωγή Res. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, STAT3 εκφράστηκε σε κανονικά καλλιεργημένα κύτταρα EJ και ρυθμισμένα προς τα κάτω μετά από 2 ώρες από 200 μΜ θεραπεία Res για 72 ώρες. ICC χρώση πραγματοποιήθηκε στις ίδιες πειραματικές ομάδες αποκάλυψε ισχυρή χρώση STAT3 (& gt? ++) Είτε σε κυτοσολικό χώρο ή πυρήνες κανονικά καλλιεργημένα κύτταρα EJ, η οποία προφανώς αποδυναμωθεί (+) μετά από 72 ώρες από 2 ώρες 200 μΜ θεραπεία Res (Σχήμα 2Β? Πίνακας 2). Διαπιστώθηκε επίσης ότι το ρ-STAT3 ήταν εντοπισμένη κυρίως στους πυρήνες των κυττάρων EJ και ελαττώθηκε μετά από 2 ώρες θεραπεία 200 μΜ Res για 72 ώρες (Σχήμα 2Β? Πίνακας 2). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της RT-PCR και ICC, κηλίδωση Western έδειξε ότι 2 ώρες 200 μΜ θεραπεία Res προκάλεσε διακεκριμένες STAT3 και ρ-STAT3 αναγωγή (Σχήμα 2C). Για να διευκρινιστεί περαιτέρω τα αποτελέσματα του 2 h Res μεταχείριση σηματοδότηση STAT3, τα επίπεδα της STAT3 κατάντη γονιδίων (c-Myc, survivin, cyclinD1 και VEGF) σε κανονικά καλλιεργημένα και 2 ώρες 200 μΜ Res επεξεργασμένα κύτταρα EJ εξετάστηκαν με τις μεθόδους που περιγράφονται παραπάνω . Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, η έκφραση του c-myc, survivin, cyclinD1 και VEGF κατεστάλη σε 2 ώρες 200 μΜ Res-κατεργασμένων κυττάρων EJ (Πίνακας 2). Παρόμοια ευρήματα θα μπορούσαν επίσης να ανιχνευθεί σε κύτταρα EJ αντιμετωπίζεται συνεχώς με 100 μΜ ρεσβερατρόλης για 48 ώρες.

Η

ανασταλτική δράση της AG490 για EJ κύτταρα

Για να προσδιοριστεί η σημασία της ρεσβερατρόλης -οφειλόμενο αναστολή STAT3, AG490, ένας εκλεκτικός αναστολέας της φωσφορυλίωσης STAT3, χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία κύτταρα EJ [21]. Ανοσοκυτταροχημική χρώση έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση STAT3 ανεστάλη σε κύτταρα AG490 κατεργασμένα όσον αφορά τη μείωση της STAT3 και πυρηνικών επισήμανση ρ-STAT3 (σχήμα 3? Πίνακας 2). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων EJ καταστάλθηκε από AG490 σε δόση και το χρόνο που συνδέονται με τη μόδα (Σχήμα 4Α). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι 48 ώρα και 50 μΜ και 80 μΜ AG490 θεραπείες που προκαλείται διακοπή φάσης S χωρίς να προκαλεί διακριτές απόπτωση. Το G1 και τα κλάσματα S ήταν 62,6% και 33% σε κανονικά καλλιεργημένα, 50,4% και 49,6% σε 50 μΜ AG490 θεραπεία και 17,9% και 75,7% σε 80 μΜ AG490 αντιμετωπίζονται EJ κυττάρων (Εικόνα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σε συνέπεια με εκείνες των βραχυπρόθεσμων θεραπείες ρεσβερατρόλη. Τα ποσοστά της απόπτωσης σε κανονικά καλλιεργημένα, 50 μΜ AG490- και 80 μΜ ομάδες AG490 κατεργασία στους 48 h χρονικό σημείο ήταν 0,394%, 0,194% και 1,77%, αντίστοιχα (Σχήμα 4Β). Σε σύγκριση με κανονικά καλλιεργημένα κύτταρα EJ, c-myc, cyclinD1, survivin και VEGF εκφράσεις κάτω-ρυθμίζονται AG490-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3, Σχήμα 4C και D? Πίνακας 2).

Η

A . ΜΤΤ δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε κανονικά καλλιεργημένα κύτταρα EJ και των κυττάρων με AG490 (50 μΜ και 80 μΜ) και σταθερή 100 θεραπείες μΜ ρεσβερατρόλη. *,

P

& lt? 0,01? **

P

& lt? 0,05. B. ροής προσδιορισμός της κατανομής του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε AG490 αντιμετωπίζονται πληθυσμό κυττάρων EJ. επίπεδα C και D. Αξιολόγηση της ρ-STAT3, cyclinD1, survivin, c-Myc και VEGF σε κύτταρα EJ χωρίς και με 50 μΜ ή 80 μΜ AG490 θεραπείες με RT-PCR και στυπώματος Western αναλύσεις.

Η

Ενδοκυστική ρεσβερατρόλη επεξεργασία ανέστειλε ορθοτοπική ανάπτυξη όγκου

χρώση η /Ε διεξήχθη στις εμβολιάζονται sites και επιβεβαίωσε ότι η επιτυχής ποσοστό ορθοτοπική εμφύτευση όγκου ήταν 100% (20/20). Το σχηματικό διάγραμμα της ενδοκυστικής σχέδιο αγωγής ρεσβερατρόλη και δοσολογία δείχθηκε στο Σχήμα 5Α. Τα βάρη του όγκου προσδιορίστηκαν με τη ζύγιση ολόκληρων κύστεις συλλέχθηκαν από όλες τις ομάδες [27], η οποία αποκάλυψε το μεγαλύτερο μέσο βάρος της ουροδόχου κύστης σε NaCl αγωγή ομάδα ελέγχου από ότι στην ομάδα ρεσβερατρόλη φάρμακο (0,03362 g vs 0,01625 g,

P

& lt? 0,01? Σχήμα 5Β και C). ΤΟΥΝΕΛ δοκιμασία πραγματοποιήθηκε σε ορθοτοπική δείγματα όγκων με και χωρίς βραχυπρόθεσμη ρεσβερατρόλη ενστάλαξη επέδειξε αξιοσημείωτη αποπτωτικό θάνατο (αποπτωτικό δείκτη = 23,2%), στις πρώην περιπτώσεις (Σχήμα 5D και Ε). Ανοσοϊστοχημική χρώση έδειξε ότι STAT3, ρ-STAT3 και κατάντη γονίδια της c-Myc, cyclinD1, survivin και VEGF μπορούσε να ανιχνευτεί είτε κυτταρόπλασμα ή τους πυρήνες των καρκινικών ιστών σε ομάδα ελέγχου NaCl αλλά έγινε προφανώς μειώνεται σε ρεσβερατρόλη αγωγή όγκων (Σχήμα 6 ?. πίνακα 2)

Α. Σχηματικό διάγραμμα του σχεδιασμού της μελέτης και δοσολογικό σχήμα. Θεραπείες ξεκίνησε 3 ημέρες μετά την εμφύτευση (αστερίσκοι). Β Άνω: ουρήθρας καθετηριασμό των άτριχων ποντικών? Κάτω: τα μεγέθη ενός ζεύγους ουροδόχου κύστες που φέρουν όγκο με και χωρίς 2 ώρες 200 μΜ ρεσβερατρόλη ενδοκυστική ενστάλαξη για 13 φορές. Γ Σύγκριση των βαρών όγκου μεταξύ της ομάδας ενστάλαξη ρεσβερατρόλη και το μη επεξεργασμένο μάρτυρα κατά την Ημέρα 28 μετά την εμφύτευση του όγκου. Κανονική γυμνά ποντίκια (τα ίδια εβδομάδων) κύστεις χωρίς την εμφύτευση του όγκου ως έλεγχος. *, Σε σύγκριση με το Ν ομάδα ή ομάδα Res,

P

& lt? 0,01? #, Σε σύγκριση με το Ν ομάδα,

P

& gt? 0,05. D. Η &? Ε χρώση και δοκιμασία TUNEL (τα ένθετα) για ιστολογική και απόπτωση αξιολόγηση της ουροδόχου ιστών ουροδόχου κύστης με ενδοκυστική θεραπεία ρεσβερατρόλη (2 h 200 μΜ ρεσβερατρόλης για 13 φορές σε διαστήματα 2 ημερών). Κανονικό: η κύστη ενός γυμνού ποντικιού? Έλεγχος: η κύστη που φέρει ορθοτοπική μεταμοσχευμένων όγκων χωρίς θεραπεία ρεσβερατρόλη (0,9% θεραπεία NaCl)? Res: η κύστη που φέρει ορθοτοπική μεταμοσχεύονται όγκου με 200 μΜ θεραπεία ρεσβερατρόλη για 2 ώρες και 13 φορές. Ε Αξιολόγηση των αποπτωτικών δεικτών μεταξύ Normal, ομάδες ελέγχου και Res

Η

Η &?. Ε και ανοσοϊστοχημική χρώσεις του STAT3, ρ-STAT3, cyclinD1, survivin, c-Myc και VEGF στα δείγματα ιστού της ουροδόχου κύστης αντιμετωπίζονται κατά 0,9% NaCl (έλεγχος) ή 200 μΜ ρεσβερατρόλη (Res) για δύο ώρες και 13 φορές. Ένθετα, οι διευρυμένη εικόνες των καρκινικών ιστών.

Η

Βραχυπρόθεσμες ρεσβερατρόλη Θεραπεία Προώθησε την Πυρηνική Μετατόπιση της SIRT1 και p53

Η ρεσβερατρόλη είναι γνωστή ως ενεργοποιητής της ρύθμισης πληροφοριών σιωπηλός τύπος ζευγαρώματος 2 ομόλογο (SIRT1) που ρυθμίζει δραστικότητα ρ53 με αποακετυλίωση [28], [29]. Ως εκ τούτου, οι in vitro και in vivo επιδράσεις της ρεσβερατρόλης στην SIRT1 δραστηριότητα των κυττάρων EJ διερευνήθηκαν με τις μεθόδους των ICC, IHC και IF. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, και οι δύο SIRT1 και p53 διανεμήθηκαν σε κυτοσολικό χώρο των κυττάρων EJ και μεταμοσχευμένων όγκων χωρίς θεραπεία ρεσβερατρόλη, οι οποίες προφανώς μετατοπίζεται στους πυρήνες των κυττάρων EJ μετά από in vitro 2 ώρες θεραπεία 200 μΜ Res στις 72 h χρονικό σημείο και 2 ώρες ενδοκυστική έγχυση ρεσβερατρόλης για 13 φορές, υποδηλώνοντας εν δυνάμει λειτουργική σύνδεση αυτών των δύο πρωτεϊνών.

A. Αξιολόγηση της SIRT1 και διανομής p53 στα φυσιολογικά καλλιεργημένα κύτταρα EJ και τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία από 2 μΜ ρεσβερατρόλη σε 72 ώρες χρονικό σημείο από ανοσοκυτταροχημικές και ανοσοφθορισμού χρώσεις (τα ένθετα). Β SIRT1 και p53 προσανατολισμένη ανοσοϊστοχημική χρώση των ιστών ουροδόχου κύστης αντιμετωπίζεται με 0,9% NaCl (έλεγχος) ή 200 μΜ ρεσβερατρόλη (Res) για δύο ώρες και 13 φορές. Ένθετα, οι διευρυμένη εικόνες των καρκινικών ιστών.

Η

Δεν Εμφανή τοπικό ερεθισμό της ρεσβερατρόλης που έλαβαν ουροδόχου κύστης βλεννογόνου

ενδοκυστική έγχυση ρεσβερατρόλη διεξήχθη στις δύο θηλυκά άνευ όγκου ποντικοί ICR και το θηλυκό που φέρουν όγκο γυμνούς ποντικούς. Μέχρι το τέλος του πειράματος, το σύνολο κύστες απομακρύνθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη για H /E χρώση με βάση εξέταση κυστίτιδα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8Α, η μεταβατική επιθήλια της ουροδόχου τοιχώματα της ουροδόχου κύστης ήταν άθικτα, και ούτε διακριτά τριχοειδή συμφόρηση ούτε φλεγμονώδη διήθηση των λεμφοκυττάρων παρατηρήθηκε στην υπο-βλεννογόνου χώρο της ρεσβερατρόλης επεξεργασμένου χωρίς καρκίνο ποντικούς ICR. Παρόμοια κατάσταση βρέθηκε επίσης στον όγκο περιβάλλοντες ιστούς κύστη γυμνών ποντικών που φέρουν όγκο θεραπεύονται με ενδοκυστική ενστάλαξη ρεσβερατρόλη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντίθετα, σοβαρή βλάβη των επιθηλιακών, τριχοειδή συμφόρηση και αιμορραγία θα μπορούσε να παρατηρηθεί στα MMC επεξεργασμένου ουροδόχους κύστεις των ICR ποντικιών (Σχήμα 8Α). Η διακριτή απώλεια σωματικού βάρους βρέθηκε στην ομάδα MMC φάρμακο (18,1 g κατά μέσο όρο) σε σύγκριση με εκείνη στην ομάδα Res φάρμακο (27,2 g κατά μέσο όρο?

P

& lt? 0,01? Εικόνα 8Β και 8C).

NaCl, ICR ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ενδοκυστική ενστάλαξη 0,9% NaCl? Res, 200 μΜ ρεσβερατρόλη? MMC, 2 mg /ml μιτομυκίνη C. Αυτές οι επεξεργασίες διεξήχθησαν για 6 φορές σε διαστήματα 2 ημερών. Σοβαρή βλάβη του επιθηλίου, τριχοειδή συμφόρηση και αιμορραγία μπορεί να παρατηρηθεί στις MMC επεξεργασμένα, αλλά όχι σε NaCl και Res που έλαβαν κύστεις. Ένθετα, εικόνες υψηλής μεγέθυνσης των ουροφόρων περιοχές βέλους που υποδεικνύεται. *

P

& lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο της ουροδόχου κύστης /TCC είναι υπεύθυνη για πάνω από 130 000 ετήσιους θανάτους σε όλο τον κόσμο [30] οφείλεται σε μεγάλο βαθμό την επανάληψη και τη μετάσταση [2]. Ενδοκυστική χορήγηση αντικαρκινικών παραγόντων έχει θεσπιστεί για την εξάλειψη υπολειμματικών καρκινικών κυττάρων [3], [4]. Ωστόσο, οι συμβατικές θεραπείες δεν μπορεί να διαρκέσει πολύ, λόγω της συστημικής τοξικότητας και τοπικό ερεθισμό [2]. Δεδομένου ότι η ρεσβερατρόλη είναι μη τοξικό [5] και ασκεί ανασταλτικά αποτελέσματα σε κύτταρα TCC [9] – [12], θα ήταν μία εναλλακτική υποψήφιος για τη διαχείριση των TCCS εάν αντι-TCC ικανότητα του μπορεί να αποδειχθεί περαιτέρω υπό τις πειραματικές συνθήκες στενότερης με τις κλινικές καταστάσεις. Για να μιμηθούν ενδοκυστική ενστάλαξη φάρμακο, τα καλλιεργημένα κύτταρα EJ TCC υποβλήθηκαν σε αγωγή με 100 μΜ, 150 μΜ ή 200 μΜ ρεσβερατρόλη παροδικά αντί για σταθερά. Τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι 150 μΜ και 200 ​​μΜ θεραπείες ρεσβερατρόλη για 1,5 ώρα ή 2 ώρες ήταν αρκετά για να καταστείλει την ανάπτυξη και να επάγει απόπτωση κυττάρων EJ, υποδηλώνοντας ότι η βραχυπρόθεσμη θεραπεία ρεσβερατρόλη μπορούσαν να επιτύχουν παρόμοια αποτελέσματα αντι-TCC ως εκείνη των συμβατικών φάρμακα [14]. Αυτή η αντίληψη υποστηρίχθηκε περαιτέρω από την μειορύθμιση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου STAT3 και STAT3 και τη μείωση του ρ-STAT3 πυρηνική μετατόπιση σε κύτταρα EJ ρεσβερατρόλη-θεραπεία, επειδή η ενεργοποιημένη σηματοδότηση STAT3 σχετίστηκε με αύξηση TCC και επιβίωση κυττάρου [26]. Αυτά τα ελπιδοφόρα in vitro αποτελέσματα μας ενθαρρύνουν να καταθέσουν, είτε είναι βραχυπρόθεσμα ρεσβερατρόλη ενστάλαξη μπορεί επίσης να οδηγήσει σε παρόμοια θεραπευτική συνέπεια σε κατάλληλο ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος.

Αν και έχουν αποδεικνύεται αντικαρκινικές επιδράσεις της ρεσβερατρόλης, αυτός ο παράγοντας δεν έχει ακόμη εφαρμοστεί στην κλινική πρακτική σε μεγάλο βαθμό λόγω της χαμηλής ενδοκυτταρικής βιοδιαθεσιμότητα των συστημικά χορηγούνται ρεσβερατρόλης [31], [32]. Σε αντίθεση με συμπαγείς όγκους στην πλειονότητα των οργάνων, TCCS μεγαλώνουν προς τα έξω στην κοιλότητα της ουροδόχου κύστης. Επιπλέον, το φάρμακο ενσταλάζεται μπορεί εύκολα να συγκρατείται στην ουροδόχο κύστη και ασκεί άμεσα αποτελέσματά της επί του όγκου των ιστών /κυττάρων. Ως εκ τούτου, ένα ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος ιδρύθηκε το ουροδόχο κύστη γυμνού ποντικού, το οποίο στη συνέχεια κατεργάζεται με ρεσβερατρόλη στις ίδιες δοσολογίες όπως εκείνη του in vitro πείραμα και με τον τρόπο παρόμοιο με την κλινική πρακτική [14]. Διαπιστώθηκε ότι η ανάπτυξη του όγκου κατεστάλη σημαντικά και κύτταρα όγκου υποβλήθηκε σε εκτεταμένες απόπτωση. Δεδομένου ότι το πείραμα πραγματοποιήθηκε για τους όγκους στο εσωτερικό της ουροδόχου κύστης, τα αποτελέσματα που ελήφθησαν ήταν πιο κοντά στην πραγματικότητα των ασθενών και, ως εκ τούτου, θα ήταν μεταφραστικής αξιών.

Ένα από τα σοβαρές παρενέργειες της ενδοκυστικής χημειοθεραπείας με συμβατικά αντικαρκινικά φάρμακα είναι αιμορραγική κυστίτιδα [33]. Αν και η μη-τοξικότητα της ρεσβερατρόλης σε φυσιολογικά κύτταρα έχει περιγραφεί σε ορισμένα όργανα [32], η επίδραση (-ες) της ρεσβερατρόλης στην φυσιολογικό ιστό ουροδόχου κύστης παραμένει άγνωστη. Ως εκ τούτου, μία αποτελεσματική δόση αντι-TCC της ρεσβερατρόλης (200 μΜ) ενσταλάχτηκε μέσα στα κύστεις του καρκίνου χωρίς ποντικούς και σε σύγκριση με εκείνη αγωγή με 2 mg /ml μιτομυκίνη C. Εν τω μεταξύ, η απόκριση (-ες) μεταμοσχευμένων όγκων και των γύρω τους βλεννογόνου σε ρεσβερατρόλη συγκρίθηκαν. Βρήκαμε ότι τόσο η χωρίς καρκίνο και ο βλεννογόνος του όγκου που περιβάλλει έδειξε σχεδόν άθικτο μεταβατική επιθήλια χωρίς διακριτά τριχοειδή συμφόρηση και φλεγμονώδης διήθηση λεμφοκυττάρων, ενώ σοβαρό ερεθισμό και βλάβη των επιθηλιακών συνέβη με το C-αγωγή βλεννογόνο μιτομυκίνη. Τα στοιχεία μας παρέχουν έτσι in vivo ένδειξη καρκίνου στόχευσης ιδιοκτησία της ρεσβερατρόλης στην ουροδόχο κύστη και την περαιτέρω δείχνουν την καταλληλότητα της ρεσβερατρόλης στην κλινική θεραπεία της ανθρώπινης TCCS.

Η ρεσβερατρόλη διαθέτει πολύπλευρη μοριακά συμπεριλαμβανομένης της αναστολής της STAT3 σηματοδότησης [20 ] και ενεργοποίηση του SIRT1 αποακετυλίωσης [28]. ενεργοποίηση STAT3 είναι συχνή σε TCCS και η αναστολή της μπορεί να οδηγήσει σε διακοπή αύξησης και απόπτωση [26]. Βρήκαμε ότι η σηματοδότηση STAT3 ενεργοποιείται επίσης σε κύτταρα EJ TCC και βραχυπρόθεσμες in vitro και in vivo θεραπείες ρεσβερατρόλη μπορεί να αναστέλλει την ενεργοποίηση STAT3 και ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση της STAT3 και κατάντη σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια της. Αυτά τα αποτελέσματα μαζί με τα παρόμοια ευρήματα από άλλες μορφές καρκίνου [20], [32], [34] δείχνουν ότι η STAT3 είναι ένα σημαντικό μοριακό στόχο της ρεσβερατρόλης. Το κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων EJ AG490 επεξεργασμένο υποστηρίζει περαιτέρω τους κρίσιμους ρόλους των ενεργοποιημένων σηματοδότησης STAT3 στην προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του TCC. Η έλλειψη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε AG490 αγωγή πληθυσμού EJ δείχνει ότι η ρεσβερατρόλη μπορεί να τροποποιήσει άλλα μηχανήματα κυτταρική επιβίωση πέρα ​​σηματοδότησης STAT3. Μέχρι στιγμής, ο ρόλος της SIRT1 στο σχηματισμό και την εξέλιξη TCC παραμένει ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, SIRT1 πυρηνική μετατόπιση αποδεικνύεται σε κύτταρα EJ ρεσβερατρόλη-θεραπεία, παράλληλα με την ρ53 πυρηνικής μετατόπισης. Έχει αναφερθεί ότι SIRT1 πυρηνοκυτταροπλασματικής παλινδρόμηση παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της δραστικότητας SIRT1 [35]. Επιπλέον, οδός ενεργοποιείται SIRT1-p53 μπορεί να επάγει γήρανση αυξητικός σύλληψη των καρκινικών κυττάρων [36]. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν έτσι ένα σύνθημα για να εξερευνήσετε πρόσθετος μηχανισμός αντι-TCC της ρεσβερατρόλης και να διαφωτίσει τις βιολογικές επιπτώσεις της πυρηνικής συνεργασίας μετατόπιση της SIRT1 και πρωτεΐνες p53.

Στα συμπεράσματα, η ασφάλεια και η αποτελεσματικότητα της ρεσβερατρόλης στην κλινική θεραπεία οι της ουροδόχου κύστης TCCS έχουν επικυρωθεί από εδώ λίγο εκθέτοντας τα καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα TCC EJ και ορθοτοπική μεταμοσχευμένων όγκων σε ρεσβερατρόλη. Δύο ώρες 200 μΜ θεραπεία ρεσβερατρόλη είναι επαρκής για να καταστείλει in vitro και in vivo την ανάπτυξη και να επάγει διακριτές απόπτωση κυττάρων EJ, προφανώς μέσω αναστολής της ενεργοποίησης STAT3 και επαγωγή SIRT1 και p53 πυρηνικής μετατόπισης. Επιπλέον, η ρεσβερατρόλη ασκεί ούτε επιβλαβείς επιδράσεις στην κανονική ουροφόρων κύτταρα ούτε προκαλεί κύστης αιμορραγική κυστίτιδα και την απώλεια σωματικού βάρους.