Αφηρημένο

δεακετυλάσης αναστολείς της ιστόνης (HDACi) αντιπροσωπεύουν μια πολλά υποσχόμενη κατηγορία των επιγενετικών παραγόντων με αντικαρκινικές ιδιότητες. Εδώ, αναφέρουμε ότι (S) -2, μία νέα υδροξαμική-based HDACi, δείχθηκε προηγουμένως ότι είναι αποτελεσματικό ενάντια οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας, ήταν επίσης ένας ισχυρός επαγωγέας απόπτωσης /διαφοροποίησης σε ανθρώπινη LNCaP καρκίνου του προστάτη και PC3 κύτταρα. Σε κύτταρα LNCaP (S) -2 ήταν ικανή να ενεργοποιεί H3 /H4 ιστόνης ακετυλίωση, φωσφορυλίωση Η2ΑΧ ως δείκτη της βλάβης του DNA και την παραγωγή G

0 /G διακοπή κύκλου

1 κύτταρο. Σταθερά, (S) -2 οδήγησε σε αυξημένη έκφραση τόσο των επιπέδων ρ21 πρωτεΐνης και mRNA σε κύτταρα LNCaP, αλλά, σε αντίθεση με SAHA, όχι σε φυσιολογικά μη ογκογόνα κύτταρα PNT1A προστάτη. Μηχανιστικές μελέτες έδειξαν ότι (S) -2-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα LNCaP που αναπτύχθηκαν μέσω της διάσπασης του προ-κασπάσης 9 και 3 και του πολυ (ΑΟΡ-ριβόζης) συνοδεύεται από την δοσο-εξαρτώμενη απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Πράγματι, η προσθήκη του παν-κασπάσης αναστολέας Ζ-VAD-fmk μειωθεί σημαντικά φάρμακο απόπτωση που διαμεσολαβείται ενώ η αντιοξειδωτική

N

-ακετυλο-κυστεΐνη ήταν σχεδόν αναποτελεσματικό. Σημαντικά, τα προκαταρκτικά στοιχεία με γυμνά ποντίκια με κύτταρα LNCaP έδειξε ότι (S) -2 προκάλεσε μείωση του όγκου του όγκου και μία αύξηση στη φωσφορυλίωση Η2ΑΧ μέσα στα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, τα υψηλά μεταστατικά κύτταρα καρκίνου του προστάτη PC3 ήταν επίσης ευαίσθητα σε (S) -2 ότι: i) επάγεται διακοπή αύξησης και απόπτωση μέτρια? ii) κατευθύνονται κύτταρα προς διαφοροποίηση και τη συσσώρευση ουδέτερο λιπίδιο? iii) μείωσε δυναμικό διεισδυτικότητα κυττάρων μειώνοντας την ποσότητα της δραστικότητας ΜΜΡ-9 και up-ρύθμιση της έκφρασης ΤΙΜΡ-1? και iv) ανέστειλε κυτταρική κινητικότητα και μετανάστευση μέσω του Matrigel. Συνολικά, (S) -2 έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα ισχυρό HDACi ικανή να επάγει διακοπής της ανάπτυξης, κυτταρικό θάνατο και /ή τη διαφοροποίηση των LNCaP και PC3 κυττάρων καρκίνου του προστάτη και, λόγω της χαμηλής τοξικότητας και της αποτελεσματικότητας του

in vivo

, θα μπορούσε επίσης να είναι κλινικής συμφέρον να στηρίξουν τη συμβατική θεραπεία του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Laurenzana Α, Balliu M, Cellai C, Romanelli MN, Ραοίειίΐ F (2013) αποτελεσματικότητα του αναστολέα απακετυλασών (S) -2 έναντι LNCaP και PC3 Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 8 (3): e58267. doi: 10.1371 /journal.pone.0058267

Επιμέλεια: Chunhong Yan, Albany Medical College, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Απριλίου του 2012? Αποδεκτές: 5 Φεβ του 2013? Δημοσιεύθηκε: 4, Μάρτη του 2013

Copyright: © 2013 Laurenzana et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από MIUR (Υπουργείο Παιδείας, Πανεπιστημίων και Έρευνας ΠΡΙΝ το 2006 έως το FP, # 200606139), το Πανεπιστήμιο της Φλωρεντίας, Ιταλία (πρώην 60% το 2009 και το 2010 για την FP και MNR), Ente Cassa di Risparmio di Firenze 2007- 9 (Φλωρεντία, Ιταλία? # 2007.1019 με FP) και Associazione Italiana contro le Leucemie, Linfomi e Mieloma (ΑΙΙ) Sezione di Firenze για την FP. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιγενετικές μεταβολές είναι αναστρέψιμες χρωματίνη αναδιατάξεις ικανό να ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου εντός του κυττάρου χωρίς να τροποποιηθούν αλληλουχία DNA. Η ακετυλίωση είναι η πιο ευρέως μελετηθεί μετα-μεταφραστική τροποποίηση της ιστόνης πρωτεΐνες [1], λόγω της ισορροπημένης δραστηριότητα των δύο οικογενειών ενζύμων, δηλαδή τα ακετυλτρανσφεράσες ιστόνης (καπέλα) και αποακετυλάσες ιστόνης (HDACs) που καταλύουν της ακετυλίωσης /αποακετυλίωσης των ιστονών, αντίστοιχα και τροποποιώντας έτσι χρωματίνης διάπλαση και την προσβασιμότητα του DNA σε παράγοντες μεταγραφής [2], [3], [4]. Επιπλέον, καπέλα και HDACs συμβάλλει στην ρύθμιση έκφρασης γονιδίου με άμεση αλληλεπίδραση με nonhistone βασικών ρυθμιστικών πρωτεϊνών [5], όπως ρ53, GATA1, GATA2, υποδοχέας ρετινοϊκού οξέος, NF-kB και πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού, όπως α-τουμπουλίνης [6], [7], [8]. Δεν είναι εκπληκτικό, επομένως, ότι παρεκκλίνουσα δραστηριότητες αυτών των ενζύμων μπορεί να καταστέλλουν μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων ογκο-κατασταλτικά και μολύβδου, τελικά, στο σχηματισμό όγκων [9], [10]. Και πράγματι, ιστόνη υποακετυλίωση, λόγω υπερ-έκφραση της HDACs, έχει ένα αναγνωρισμένο ρόλο στην ογκογένεση διαφορετικών καρκίνων που επηρεάζουν το στομάχι [11], του παχέος εντέρου [12], [13], του μαστού [14] και του προστάτη [15], [ ,,,0],16], [17].

Όσον αφορά, ειδικότερα του καρκίνου του προστάτη, αυτή είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται μη δερματική κακοήθεια και η τρίτη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες στο δυτικό κόσμο. Αν και είναι διαθέσιμα για πρώιμο καρκίνο του προστάτη μια σειρά από θεραπευτικές επιλογές, σε ασθενείς υποτροπίασαν από πρωτογενή θεραπεία με χειρουργική επέμβαση και /ή ακτινοβολία, ή παρουσίαση μεταστατική νόσο, η στέρηση ανδρογόνου παραμένει ο στυλοβάτης της θεραπείας. Ωστόσο, παρά την εκτομή των ανδρογόνων, σχεδόν όλοι οι όγκοι τελικά προχωρήσει με ευνουχισμό ανθεκτικά ασθένειες [18], [19], [20], η οποία πρέπει να αντιμετωπίζονται με συμβατικά κυτταροτοξικά ή επιγενετικών παραγόντων όπως οι αναστολείς HDAC (HDACi). Η τελευταία έχουν αναδειχθεί ως μια νέα κατηγορία ισχυρών αντικαρκινικών παραγόντων σε θέση να επάγει όγκου σύλληψης της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης και /ή απόπτωσης [16], [17]

in vitro

και ενεργούν ως ευαισθητοποιητές ακτινοβολίας σε καρκινικά κύτταρα με τα κάτω -Ρύθμιση δραστηριότητα επιδιόρθωση του DNA [21], [22], [23]. Ορισμένες από αυτές HDACi έδειξε ωστόσο αρκετούς περιορισμούς

in vivo

λόγω της υψηλής τοξικότητάς τους, η χαμηλή διαλυτότητα και μικρό χρόνο ημιζωής [24], [25]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη νέων HDACi με αντικαρκινικές ιδιότητες και χαμηλές τοξικές προφίλ είναι ένα κρίσιμο στόχο της μεταφραστικής έρευνας.

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ένα νέο σύνολο ισχυρών υδροξαμική-based HDACi χαρακτηρίζεται από 1,4-βενζοδιαζεπίνη δακτύλιο ( BDZ) χρησιμοποιείται ως κάλυμμα και συνδεδεμένο, μέσω ενός τριπλού μονάδα σύνδεσης δεσμό, σε γραμμική αλυσίδα αλκυλίου που φέρει ένα υδροξαμικού λειτουργία όπως το Ζη

++ – χηλικούς ομάδα [26]. Μεταξύ αυτών των υβριδίων, ένα συγκεκριμένα, MC133 (S) -2 [εφεξής

(S) –

2] έδειξε ότι είναι μια πολύ αποτελεσματική προ-αποπτωτικών παράγοντα προς διαφορετικές καλλιεργήθηκαν και πρωτογενείς οξεία μυελοειδή λευχαιμία κυττάρων (AML)

in vitro

και

ex vivo

, και ήταν σχεδόν ασφαλές να ποντίκια

in vivo

έως 150 mg /kg /εβδομάδα [27].

στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε την αντινεοπλασματική δυναμικού του (S) -2 σε δύο από τα πιο ευρέως διερευνηθεί ανθρώπινων επιθηλιακών καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές, δηλαδή η ανδρογόνο-ευαίσθητο LNCaP, και το ανδρογόνο-ευαίσθητη και άκρως μεταστατική PC3, χρησιμοποιώντας το ανθρώπινο μη καρκινογενής προστάτη PNT1A επιθηλιακά κύτταρα ως έλεγχος. (S) -2 πολλαπλασιασμός ανέστειλε κύτταρο καρκίνου του προστάτη, που προκαλείται από μια μεγαλύτερη αποπτωτική απόκριση σε σύγκριση με SAHA (ή Vorinostat? Ένα από τα καλύτερα που εκτελεί την HDACi εγκριθεί από το FDA για τη θεραπεία του δερματικού λεμφώματος Τ-κυττάρων) [28], [29] το LNCaP κύτταρα και σε μικρότερο βαθμό επίσης σε εξαιρετικά μεταστατικά κύτταρα PC3 οποίων η μετανάστευση και διεισδυτικότητα ιδιότητες μειωθούν δραστικά από το φάρμακο. Αντίθετα, τα φυσιολογικά κύτταρα PNT1A επιθηλιακά προστάτη ήταν ουσιαστικά αδρανείς φάρμακο. Σημαντικά, (S) -2-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα LNCaP αναπτύσσονται μέσω μιας κασπάσης-εξαρτώμενο μηχανισμό.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια και θεραπείες

μη μεταστατικό LNCaP και μεταστατικών PC3 κυττάρων καρκίνου του προστάτη, και τα ανθρώπινα μη καρκινογενής κύτταρα PNT1A επιθηλιακά προστάτη ήταν ένα είδος δώρο του Π Chiarugi (Τμήμα Biochemical Sciences, Πανεπιστήμιο της Φλωρεντίας), ο οποίος έλαβε τις κυτταρικές σειρές από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Κυτταροκαλλιεργειών [30]. Ανθρώπινα κύτταρα του προστάτη καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C ° σε 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα. (S) -2 και SAHA (ή Vorinostat? Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) [28], [29] διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO? Sigma-Aldrich) σε συγκέντρωση 0,1 Μ και αποθηκεύονται στη σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Δουλεύοντας διαλύματα φαρμάκου ελήφθησαν με κατάλληλη αραίωση του μητρικού διαλύματος με το μέσο καλλιέργειας. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως όχημα σε μία τελική δόση ≤0.1% (ν /ν) σε καλλιέργεια για δύο (S) -2 και SAHA. Σε κασπάσης πειράματα αναστολής Z-VAD-fmk (R Μετά από αυτό τα κύτταρα πλύθηκαν και ο φθορισμός μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Μιτοχόνδρια αποπόλωση υποδεικνύεται ειδικά από τη μείωση του λόγου κόκκινος προς πράσινος ένταση φθορισμού [32].

κασπάσης 3 Ενεργοποίηση Δοκιμασία

κύτταρα καρκίνου του προστάτη (10

5 κυττάρων /ml) ήταν επωάστηκαν με 2,5 μΜ (S) -2 επί 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε δοκιμασία καρβοξυφθορεσκεϊνη FLICA ανίχνευσης απόπτωσης Kit Caspase (κασπάσης 3 FLICA, Immunochemistry Technology, Bloomington, ΜΝ, USA). Τα κύτταρα βάφτηκαν με αντιδραστήριο FAM-DEVD-FMK FLICA διαλυμένο σε PBS για 1 ώρα στους 37 ° C, και πλύθηκαν δύο φορές σε PBS πριν την εκτέλεση της δοκιμασίας κυτταροφθορισμομετρική.

Gel Ζυμογράφημα

Ανάλυση της ζελατινάσης (ΜΜΡ-9) δραστηριότητα διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Εν συντομία, τα κύτταρα PC3 σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυξανόμενη ποσότητα (S) -2 σε μέσα άνευ ορού για 24 ώρες. Δείγματα των ρυθμισμένων μέσων (CM) αναμίχθηκαν με 4 × (ν /ν) ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος (0,25 mol /l Tris-HCl, ρΗ 6,8, 0,4% SDS, 40% γλυκερόλη και κυανούν της βρωμοφαινόλης) και στη συνέχεια φορτώθηκε σε 10% SDS γέλη που περιέχει 1 mg /ml ζελατίνης (Sigma-Aldrich) και να τρέξει κάτω από μη-αναγωγικές συνθήκες στο σταθερή τάση 125 V. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή επωάστηκε σε ρυθμιστικό αναδιάταξης (2,5% Triton Χ-100) σε RT για 30 λεπτά , πλύθηκε δύο φορές με απεσταγμένο νερό (10 λεπτά κάθε φορά), και στη συνέχεια επωάστηκαν με τον αναπτυσσόμενο ρυθμιστικό (50 mmol /l Tris ρΗ 8,0, 5 mmol /l CaCl

2, 0,2 mol /l NaCl και 0.02% Brij-35 ) στους 37 ° C ° για όλη τη νύχτα, χρωματίζονται σε 0.5% Coomassie Blue διάλυμα για 2 ώρες και αποχρωματίσθηκαν με ένα διάλυμα [5% οξικό οξύ, 10% μεθανόλη (ν /ν) σε απεσταγμένο νερό] μέχρι έγιναν ορατά λωρίδες ζελατινολυτική δραστηριότητα και στη συνέχεια μετρήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση με Image J λογισμικού.

επούλωση της πληγής Δοκιμασία

PC3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 6-cm πιάτα μέχρι συρροή και στη συνέχεια η μονοστιβάδα ήταν γδαρμένο χρησιμοποιώντας μια λεπτή μύτη αποστειρωμένη πιπέτα για να παράγουν ένα στενό τραύματος στο υπόστρωμα. Το μέσο και τα θραύσματα αναρροφήθηκαν μακριά και αντικαταστάθηκε με νωπό μέσο με την παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του (S) -2. Εικόνες ελήφθησαν πριν και 24 ώρες μετά τον τραυματισμό με τη βοήθεια ενός Nikon E 4500 photocamera (Nikon) σε μια Nikon TMS-F μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Nikon Instruments, Φλωρεντία, Ιταλία).

Δοκιμασία ικανότητα εισβολής

Για αυτά τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν Boyden θαλάμους στους οποίους τα άνω και κάτω φρεάτια διαχωρίστηκαν με φίλτρα Porus πολυανθρακικό επικαλυμμένα με Matrigel (50 μg /φίλτρο) (Becton Dickinson, BD, New Jersey, USA). Οι καλλιέργειες προ-αγωγή με /χωρίς (S) -2 (2,5-5 μΜ) για 24 ώρες και στη συνέχεια δείγματα κυττάρων PC3 (20 × 10

3) μεταφέρθηκαν στο ανώτερο διαμέρισμα του θαλάμου. Κυττάρων επεμβατική ικανότητα αξιολογήθηκε μετά από 6 ώρες και εκφράστηκε ως ο απόλυτος αριθμός ± SD κυττάρων που υπάρχουν στα φίλτρα? Οι πέντε διαφορετικά μικροσκοπικά πεδία για κάθε κατάσταση εξετάστηκε.

Oil Red Ο χρώση για ουδέτερα λιπίδια

ανιχνεύθηκαν ουδέτερα λιπίδια (i) ιστοχημικά [34] στις κυτταρικές μονοστιβάδες που επιλύονται γρήγορα με; -? 0 ° C μεθανόλη, βάφτηκαν με Οίΐ Red Ο (ORO) (Sigma-Aldrich), και (ii) φασματοφωτομετρικά (Cary 50 Σάρωση, Varian, Victoria, Australia) στα 510 nm με την καταγραφή της απορρόφησης του ORO μετά την εξαγωγή κύτταρο δεσμευμένο με ισοπροπανόλη [35], [36]. συσσώρευση ORO εκφράστηκε ως σχετική μονάδα απορρόφησης /mg κυτταρικής πρωτεΐνης.

Ποσοτική Real Time-PCR Ανάλυση

QRT-PCR πραγματοποιήθηκε με αντίστροφη σε μεταγραφή cDNA των μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων κυττάρων με χρήση του Applied Biosystems 7500HT Σύστημα σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα. Fold του p21, ΜΜΡ-9 και επαγωγή ΤΙΜΡ-1 υπολογίστηκαν από τις αλλαγές του p21 ή ΜΜΡ-9 ή τιμές ΤΙΜΡ-1 Ct στα επεξεργασμένα

έναντι

ακατέργαστα κύτταρα και κανονικοποιήθηκαν προς την 18S rRNA Ct Amplification ήταν εκτελείται με την προεπιλεγμένη ρύθμιση PCR: 40 κύκλοι των 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 60 δευτερόλεπτα χρησιμοποιώντας μία ανίχνευση SYBR Green βάση (SYBR Green κύριο μείγμα? Applied Biosystems) και τους ακόλουθους εκκινητές: για ρ21, προς τα εμπρός 5 ‘ -CTGCCCAAGCTCTACCTTCC-3 ‘; και αντίστροφη 5′-CAGGTCCA CATGGTCTTCCT-3′? για ΜΜΡ-9 προς τα εμπρός 5’-GCTACCACCTCGAA CTTTGAC-3 ‘και αντίστροφος 5′-TGCCGGATGCCATTCAC-3′? για ΤΙΜΡ-1, προς τα εμπρός 5’-CCAACAG TGTAGGTCTTGGTGAAG-3 ‘και αντίστροφος 5′-CTGTGGCTCCCTGGAACA-3’? και για το 18S rRNA, μπροστά 5’CGGCTACCACATCCAAGGAA-3 ‘; και αντίστροφη 5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’.

Προκαταρκτική

in vivo

πειράματα με μυϊκό μοντέλο ξενομοσχεύματος

το πρωτόκολλο και τα αποτελέσματα σχετικά με την παρούσα προκαταρκτική προσέγγιση για

in vivo

πείραμα έχει αναφερθεί στην ενότητα Υποστήριξης πληροφοριών (Σχήμα S1).

Στατιστική Ανάλυση

η Φοιτητών

t-test

ή μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση στατιστικής σημασίας των αποτελεσμάτων. Η διαφορά μεταξύ των τιμών θεωρήθηκε σημαντική σε

P

≤ 0,05.

Αποτελέσματα

(S) -2 Ζητά LNCaP κύτταρα σε G

0 /G

1 κύκλου κυττάρου και αλλαγές στη μορφολογία

LNCaP κύτταρα, καλλιεργήθηκαν χωρίς /με την αύξηση της (S) -2 συγκεντρώσεις (1, 2.5 και 5 μΜ) έως 72 ώρες, υποβλήθηκε σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη διακοπή της ανάπτυξης να φθάσει το 50% της αναστολής μετά από δύο ημέρες επώασης με 1-2,5 μΜ (S) -2? ενώ σε καλλιέργειες που έλαβαν θεραπεία με 5 μΜ, ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μειώθηκε σημαντικά σε επίπεδα πολύ χαμηλότερα από την αρχική πυκνότητα επιμετάλλωσης (Σχήμα 1Α). Η επίδραση του (S) -2 επί LNCaP εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, όπως μετράται με κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι ένα 24 ώρες έκθεση σε 2.5 μΜ του φαρμάκου αυξήθηκε σημαντικά το ποσοστό των κυττάρων σε G

0 /G

1 (από 59 έως 93%) και μειωμένη κυτταρικό πληθυσμό σε S-φάση (από 29 έως 2%) (Σχήμα 1Β, κορυφή). Στο addittion, κατά την κατεργασία, η τυπική μορφολογία των κυττάρων LNCaP άλλαξε σε ένα σχήματος ατράκτου, αρκετά διευρυμένη φαινότυπο για να δώσει μονοστιβάδες που χαρακτηρίζεται από μία μερική απώλεια κυττάρου και μειωμένη επαφών μεταξύ υπολειμματικά κύτταρα (Σχήμα 1Β, μέση). Σταθερά, ο κυτταρικός κύκλος πρωτεΐνη αναστολέα ρ21 – φέρεται να είναι up-διαμορφώνεται από HDACi [37] – επαυξημένη σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο σε απόκριση σε 2.5 μΜ (S) -2? η πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε ξεκινώντας από 6 ώρες θεραπείας, αυξήθηκε μετά από 15 ώρες και κορυφώθηκε σε 24 ώρες (Εικόνα 1Β, κάτω)

(Α) -. Τα κύτταρα (10

5) σπάρθηκαν σε 6- φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα (S) -2 προστέθηκε στις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις (0-5 μΜ) και τα βιώσιμα κύτταρα (trypan Blu-αρνητική) μετρήθηκαν με τη βοήθεια θάλαμο Burker γύρω από τρεις ημέρες. (Β, κορυφή) – (S) -2 επάγεται G

0 /G

διακοπή κύκλου 1 κύτταρο και αυξημένη έκφραση του p21. LNCaP κύτταρα (2 χ 10

5) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,5 μΜ φαρμάκου επί 24 ώρες, στη συνέχεια αποσπάστηκαν και κλάσματα κυτταρικών αιωρημάτων επωάστηκαν με ένα ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διάλυμα για 30 λεπτά και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (DNA ποσό, το Χ-άξονας? συνολικά συμβάντα, Υ-άξονας). Το ποσοστό των κυττάρων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου υπολογίστηκε με το πρόγραμμα ModFit και φαίνονται σε κάθε πάνελ. (Β, μέση) – εικόνες αντίθεσης φάσης των καλλιεργειών σύντροφος έδειξαν ότι (S) -2 επάγεται μορφολογικές αλλαγές και την αξιοσημείωτη μείωση στην πυκνότητα κυττάρου. (Β, κάτω) – Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 2.5 μΜ του φαρμάκου για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία και επίπεδα πρωτεΐνης ρ21 παρακολουθήθηκαν με ανοσοκηλίδωση? GAPDH Εξετάστηκε επίσης να διασφαλιστεί η ίση φόρτωση των δειγμάτων σε κάθε λωρίδα. (Γ) – LNCaP διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων δεν εξαρτάται αυστηρά από την συνεχή παρουσία του φαρμάκου. Τα κύτταρα έχουν σπαρθεί σε πλάκες των 6-φρεατίων (10

5 κυττάρων /φρεάτιο) και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Η ημέρα μετά από καλλιέργειες προστέθηκαν χωρίς /με 2.5-5 μΜ (S) -2 για 3d και στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με μέσο χωρίς φάρμακο για πρόσθετες 3d και σε σύγκριση με καλλιέργειες όπου το φάρμακο ήταν σταθερά διατηρήθηκε μέχρι 6δ όταν μετρήθηκαν βιώσιμων κυττάρων. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο που λαμβάνεται από φρεάτια εις τριπλούν ± SD.

Η

Επιπλέον, διακοπή της ανάπτυξης των LNCaP που εκτίθενται σε (S) -2 δεν ήταν αυστηρά εξαρτώμενη από την συνεχή παρουσία του φαρμάκου. Αυτή η υπόθεση προέρχεται από τον αριθμό των κυττάρων παρακολούθηση σε καλλιέργειες χωρίς αγωγή /με 2.5 ή 5 μΜ (S) -2 για 3d και στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με μέσο χωρίς φάρμακο για πρόσθετες 3d, ενώ σε καλλιέργειες σύντροφος το φάρμακο ήταν σταθερά διατηρήθηκε για 6δ. Τα κύτταρα παρέμειναν σχεδόν συνελήφθη ακόμη και μετά την αντικατάσταση μέσο χωρίς φάρμακο αποδίδοντας τιμές οι οποίες ήταν παρόμοιες με εκείνες των καλλιεργειών συνεχώς εκτίθεται στο φάρμακο (Σχήμα 1 C).

(S) -2-επαγόμενη απόπτωση σε LNCaP κύτταρα Εξαρτάται η ενεργοποίηση του αλληλουχίας κασπάσης και Διατάραξη του μιτοχονδριακού Ακεραιότητας

Μεταξύ των νωρίς HDACi επαγόμενη εκδηλώσεων σε επίπεδο DNA υπήρχαν ο σχηματισμός του διπλού διαλείμματα κλώνου (DSB) και την φωσφορυλίωση του Η2ΑΧ για να δώσει γ-Η2ΑΧ που βοηθά στην επισκευή βλάβης του DNA [38]. Η απόκριση των κυττάρων LNCaP σε (S) -2, όπως προσδιορίζεται με ανοσοκηλίδωση έδειξε ότι 2,5 μΜ του φαρμάκου αυξήθηκε σημαντικά το σήμα γ-Η2ΑΧ εντός 6 ώρες και αυτά τα επίπεδα ήταν αρκετά παρατεταμένη μέχρι 24 ώρες ακολουθώντας ένα μοτίβο παρόμοιο με αυτό του ναρκωτικά επαγόμενη από ακετυλο-H4 (Σχήμα 2Α, κορυφή). Επιπλέον, η έναρξη της απόπτωσης, όπως σημειώνεται με διάσπαση του πολυ υπόστρωμα κασπάσης (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP), ανιχνεύθηκε από 15 ώρες της θεραπείας και αυξάνεται σταθερά έως 48 ώρες (Εικόνα 2Α, κάτω) όταν περίπου 80% των κυττάρων LNCAP έδειξε το: (i) το φάρμακο διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της κασπάσης 3 (Εικόνα 2Β) και (ii) δοσοεξαρτώμενη μετατόπιση στο πράσινο αναλογία JC-1 κόκκινο /φθορισμός για να υποδηλώσει μια προοδευτική διάχυση του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού (ΔΨm ) (Σχήμα 2C)

(Α) -. τα κύτταρα επωάστηκαν με το φάρμακο (2,5, 5 μΜ) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων αναλύθηκαν με Western ανοσοαποτύπωμα για την ανίχνευση: φωσφο-Η2ΑΧ, ότι ενεργοποιείται μετά από βλάβη του DNA? PARP και διασπασμένο θραύσμα του για να υποδηλώσει αποπτωτικά activaction? και ακετυλο-Η4 οφείλεται στην αναστολή της δραστικότητας HDAC. GAPDH και α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης. (Β) – Τα ανεπεξέργαστα ή αγωγή με φάρμακο κύτταρα (2.5 μΜ για 48 ώρες) επωάστηκαν κατά τη διάρκεια της τελευταίας 60 λεπτά με FAM-DEVD-FMK carboxyfluoresceine, κατόπιν ξεπλένονται δύο φορές με PBS και πράσινο φθορισμό τους μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Το ιστόγραμμα συχνότητας του αριθμού των γεγονότων (άξονας Υ)

έναντι

φλουορεσκεΐνη έντασης (άξονας Χ) έδειξε δύο κορυφές: κασπάση-αρνητικά κύτταρα (μη επισημασμένα κύτταρα) στα αριστερά της περιοχής Ρ2? ενώ κασπάσης-θετικών κυττάρων που σημάνθηκαν με Flica συνέβησαν εντός της περιοχής Ρ2. (Γ) – Θεραπεία με (S) -2 οδήγησε σε μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό (ΔΨ) απαγωγή δοσοεξαρτώμενη. Αυτό το αποτέλεσμα εκτιμήθηκε με τη βοήθεια του JC-1 χρωστικής, η οποία αθροίζει σε φυσιολογικά μιτοχόνδρια και εκπέμπει ερυθρό φθορισμό, αλλά δεν μπορεί να συσσωρεύεται σε μιτοχόνδρια που έχουν χάσει διαμεμβρανικό δυναμικό τους, και, ως εκ τούτου εκπέμπει ένα διάχυτο κυτταροπλασματικό πράσινο σήμα σε νεκρά κύτταρα. Μιτοχονδριακή αποπόλωση υποδεικνύεται από μια μείωση στο κόκκινο /πράσινο αναλογία έντασης φθορισμού (/G R) [32]. έχουν τιμές έχουν κανονικοποιηθεί χρησιμοποιώντας το σήμα ελέγχου (μόνο το όχημα) ως μια αυθαίρετη τιμή 100%. Κάθε ράβδος είναι ο μέσος όρος δύο ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. (D) – LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με (S) -2 (2,5-5 μΜ) ή με (S) -2 (5 μΜ) συν 15 mM Ν-ακετυλο κυστεϊνη (NAC), που εφαρμόζεται από 2 ώρες πριν από την προσθήκη του φαρμάκου. Η ενεργοποίηση της απόπτωσης αποκαλύφθηκε από τη διάσπαση της PARP και φωσφορυλίωση Η2ΑΧ και αυτά τα γεγονότα, καθώς και το φάρμακο μεσολάβηση α-τουμπουλίνης ακετυλίωση δεν αντιπαραβάλλεται με NAC. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεΐνη αναφοράς. (Ε) – Ζ-VAD-fmk απέτρεψε την επαγόμενη από φάρμακα διάσπαση της PARP και τη φωσφορυλίωση της Η2ΑΧ. LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως ανωτέρω αλλά, αντί του NAC, οι καλλιέργειες προεπωάστηκαν με 30 μΜ Ζ-VAD-fmk για 2 ώρες πριν από την αγωγή για 24 ώρες με το φάρμακο. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν για την διάσπαση της PARP, η ενεργοποίηση της κασπάσης 3 και 9, φωσφορυλίωση Η2ΑΧ καθώς και ακετυλίωση Η4 και α-τουμπουλίνης? α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Επιπλέον, για τη διερεύνηση του μηχανισμού της (S) -2-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα LNCAP, τα αποτελέσματα του αντι-οξειδωτικού Ν-ακετυλο-κυστεΐνη ( NAC) και του αναστολέα της παν-κασπάσης Z-VAD-fmk εξετάστηκαν ξεχωριστά. Διαφορετικά από ότι αναφέρθηκε για τα κύτταρα AML [27], η παρουσία των 15 mM NAC στο μέσο καλλιέργειας δεν ήταν ικανή μείωσης που προκαλείται από φάρμακα διάσπαση της PARP αποκλείοντας έτσι ένα σημαντικό ρόλο του αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) σε φάρμακο απόπτωση που διαμεσολαβείται (Σχήμα 2D). Αντ ‘αυτού, τα πειράματα που εκτελούνται χωρίς /με 30 μΜ παν-κασπάσης αναστολέας Ζ-VAD-fmk αποκάλυψε ότι αυτή η ένωση ήταν ικανό να εμποδίσει φαρμάκου διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της κασπάσης 9 και 3 καθώς και της διάσπασης PARP και αύξηση των γ-Η2ΑΧ [ ,,,0],39], υποδηλώνοντας έτσι ότι (S) -2-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα LNCaP αναπτύσσονται μέσω μιας κασπάσης-εξαρτώμενο μηχανισμό (Σχήμα 2Ε). Αξίζει να σημειωθεί ότι το φάρμακο που προκαλείται από ακετυλίωση Η4 και α-τουμπουλίνης δεν εμποδιζόταν από Z-VAD-fmk.

(S) -2 Στόχοι LNCaP κύτταρα αλλά όχι φυσιολογικά κύτταρα του προστάτη PNT1A

Η δυνητική αξία μεταφραστική του (S) -2 εκτιμήθηκε με σύγκριση των δραστηριοτήτων των δύο (S) -2 και SAHA σε σχέση με επαγωγή της απόπτωσης και ακετυλίωση ιστονών σε κύτταρα LNCaP και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη αθανατοποιημένα PNT1A. (S) -2 προκάλεσε αξιοσημείωτη αύξηση στα επίπεδα του θραύσματος διασπασμένης ΡΑΚΡ, γ-Η2ΑΧ και ακετυλο-Η3 σε κύτταρα LNCaP με πολύ μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα από SAHA (Σχήμα 3Α, αριστερά). Επιπλέον, (S) -2 φάνηκε να είναι σχετικά ασφαλής για τα φυσιολογικά κύτταρα PNT1A που, αντίθετα, ήταν μια ευαίσθητη στόχο SAHA όπως αποκαλύφθηκε από τη διάσπαση του ΡΑΚΡ κατά την αγωγή με 5 μΜ φαρμάκου (Σχήμα 3Α, δεξιά) ενώ τα επίπεδα ακετυλο-H3 σε PNT1A κύτταρα παρέμεινε σχετικά σταθερή ανεξάρτητα είτε των επαγωγέων

(Α) -. LNCAP και PNT1A κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με αυξανόμενες ποσότητες είτε (S) -2 και SAHA. Κυτταρικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση Western για την ανίχνευση φωσφο-Η2ΑΧ, PARP και διασπασμένο θραύσμα του και ακετυλο-H3? α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) – τα επίπεδα του mRNA p21 από LNCAP και PNT1A κύτταρα επωάστηκαν με /χωρίς (S) -2 ή SAHA για 24 ώρες μετρήθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Τα φυσιολογικά κύτταρα PNT1A ήταν εμφανώς λιγότερο ευαίσθητα σε (S) -2, σε σύγκριση με SAHA. Στήλες, ο μέσος όρος των τριών ανεξάρτητων δειγμάτων: μπαρ ± SD? σημαντική διαφορά (

P

≤0.05). (Γ) -. PARP διάσπαση και τα επίπεδα γ-Η2ΑΧ επάγεται σε LNCaP και κυττάρων PNT1A από h-θεραπείας 24 χωρίς /με (S) -2 συγκρίθηκαν στην ίδια κηλίδα

Η

Επιπλέον, η αύξηση του σύλληψη σε (S) -2-επεξεργασμένα κύτταρα LNCAP συσχετίστηκε με σημαντική δοσο-εξαρτώμενη αύξηση (7-13 φορές) σε mRNA επίπεδα ρ21 τα οποία επίσης ενισχύεται με SAHA αν και με λιγότερο εξαρτώμενο από την δόση εξέλιξης (Σχήμα 3Β, αριστερά) . Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η έκφραση p21 σε κύτταρα PNT1A δεν επηρεάστηκε από (S) -2, ενώ εντυπωσιακά up-ρυθμίζεται από 5 μΜ SAHA (Σχήμα 3Β, δεξιά). Επιπλέον, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με σύγκριση στην ίδια κηλίδα τα αποτελέσματα της (S) -2 σε κύτταρα LNCaP και PNT1A έχουν αποδείξει σαφώς ότι LNCaP ήταν σίγουρα πιο ευαισθησία από τα φυσιολογικά κύτταρα PNT1A από την άποψη της διάσπασης της ΡΑΚΡ και τα επίπεδα γ-Η2ΑΧ (Σχήμα 3C) .

(S) -2 Προκαλεί κυτταρικού κύκλου σύλληψης, απόπτωση και διαφοροποίηση των κυττάρων PC3

Η επίδραση του (S) -2 επί του πολλαπλασιασμού των υψηλά μεταστατικών κυττάρων καρκίνου του προστάτη PC3 έχει επίσης αξιολογούνται. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί τρεις ημέρες χωρίς /με αυξανόμενες ποσότητες (S) -2 υποβλήθηκαν σε δοσοεξαρτώμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού (Σχήμα 4Α) σύμφωνα με την σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που συνελήφθησαν το G

0 /G

1 φάση (από 46 σε 75%) και η μείωση (από 40 σε 15%) των κυττάρων στη φάση S (Σχήμα 4Β). Σταθερά, ρ21 ήταν σημαντικά επάνω ρυθμισμένη στα 15 και 24 ώρες της θεραπείας (Σχήμα 4C). Ενδιαφέροντος, (S) -2-επαγόμενη επίπεδα ακετυλο-H3 είχαν ήδη ενισχυθεί σε 24 ώρες και αυξήθηκε περαιτέρω σε 48 ώρες, μόνο όταν η επίδραση του SAHA άρχισε να μειώνεται (Σχήμα 4D).

(Α) – τα κύτταρα (10

5) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Η ημέρα μετά (S) -2 προστέθηκε στις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις και ο αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε κατά μήκος των επόμενων τριών ημερών. (Β) – Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με 2,5 μΜ (S) -2 για να προσδιοριστεί η% των κυττάρων ΡΙ-χρώση σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου, όπως προσδιορίζεται με κυτταρομετρία ροής. Εικόνες της είτε χωρίς θεραπεία και να αντιμετωπίζονται οι καλλιέργειες που λαμβάνονται με τη βοήθεια ενός μικροσκοπίου αντίθεσης φάσης. (Γ) – επίπεδα του mRNA p21 σε κύτταρα PC3 από καλλιέργειες που κατεργάζονται χωρίς /με (S) -2 μετρήθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. (D) – Συγκριτική ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων ακετυλο-H3 σε κυτταρικά εκχυλίσματα από PC3 αγωγή είτε με (S) -2 ή SAHA? α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Ωστόσο, τα κύτταρα PC3, παρά την ευαισθησία τους σε (S) -2-μεσολάβηση κυτταρόσταση, φάνηκε να είναι πιο ανθεκτικά από τα κύτταρα LNCaP στο φάρμακο απόπτωση ως καταδεικνύεται από το γεγονός ότι ένα παρόμοιο μοτίβο διασπασμένη PARP, γ-Η2ΑΧ και ακετυλο-α-τουμπουλίνης στις δύο κυτταρικές σειρές θα μπορούσαν να επιτευχθούν μόνο με κατεργασία των κυττάρων PC3 με το διπλάσιο της δοσολογίας που χρησιμοποιείται για τα κύτταρα LNCaP (Σχήμα 5Α). Επιπλέον, η φθορίζουσα δοκιμασία για κασπάσης 3 ενεργοποίηση από 2,5 μΜ (S) -2 έδειξε ότι περίπου 23% των κυττάρων PC3 υπέστησαν απόπτωση μετά από 48 ώρες θεραπείας (Σχήμα 5Β)

δηλαδή

λιγότερο από το ένα τρίτο σε σχέση να αντιμετωπίζονται LNCAP κύτταρα. Επιπλέον, PC3 κύτταρα που παραμένουν πάνω στο τρυβλίο μετά από επώαση για 72 ώρες με αυξανόμενες ποσότητες του φαρμάκου έγινε μεγαλύτερα σε μέγεθος σε σχέση με τους ελέγχους και την συσσωρευμένη στις ουδέτερες κυτταρόπλασμα σταγονίδια λιπιδίων, που χρωματίζονται θετικά με το πετρέλαιο-Red Ο (ORO) ως το αποτέλεσμα του φαρμάκου επαγόμενη αδιπογονική διαφοροποίηση (Σχήμα 5C), η οποία είχε ήδη αναφερθεί σε αυτά τα κύτταρα [40]

(Α) -. δείγματα από PC3 και LNCaP κύτταρα αντιμετωπίζονται με /χωρίς (S) -2 (2,5 και 5 μΜ) για 24 ώρες αναλύθηκαν με κηλίδα Western και ανοσοανιχνεύτηκε για: PARP και διασπασμένο θραύσμα του, γ-Η2ΑΧ και ακετυλο-α-τουμπουλίνης, ενώ α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) – Τα κύτταρα είτε μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με 2.5 μΜ (S) -2 για 48 ώρες επωάστηκαν μόλις 1 ώρα πριν να συγκομιστεί με FAM-DEVD-FMK carboxyfluoresceine και στη συνέχεια ξεπλένονται δύο φορές με PBS και πράσινο φθορισμό τους μετρήθηκε με ροή κυτταρομετρία (βλέπε το σχόλιο του σημείου Β στο Σχήμα 2). (Γ) – Μικροσκοπική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων του (S) -2 για τη συσσώρευση του ουδέτερου σταγονίδια λιπιδίων εντός των κυττάρων PC3 σε θεραπεία για τρεις ημέρες. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ένα διάλυμα ORO? ποσοτικοποίηση της χρώσης ORO διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

(S) -2 Μειώνει επιθετικότητα μετανάστευση και την κινητικότητα των PC3 Κύτταρα

μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) που απελευθερώνεται από καρκινικά κύτταρα στο εξωκυτταρικό περιβάλλον είναι ζωτικής σημασίας για την αποικοδόμηση των ιστών του καρκίνου-προωθείται και εισβολή μαζί με τη μεταστατική διαδικασία [41], [42], [43]. ΜΜΡ-9 από το ρυθμισμένο μέσο των καλλιεργειών PC3 υποβλήθηκε ζυμογραφία ζελατίνης και έδειξε μία εξαρτώμενη από τη δόση μείωση της δραστικότητας ΜΜΡ-9 (Σχήμα 6Α) που συνοδεύτηκε από μια ελαφρά, αλλά όχι σημαντική, μείωση της MMP-9 έκφρασης (Εικόνα 6Β, αριστερά). Αντ ‘αυτού, η έκφραση του αναστολέα ιστού μεταλλοπρωτεϊνάσης-1 (ΤΙΜΡ-1) – που είναι γνωστό ότι ασκούν αντι-μεταστατική επιδράσεις συγκρίνοντας την δραστικότητα του ΜΜΡ-9 και άλλα MMPs [44], [45] – ήταν εντυπωσιακά ενισχυμένη μετά από 24 ώρες της θεραπείας (Σχήμα 6Β, δεξιά)

(Α) -. Δείγματα των ρυθμισμένων μέσων από καλλιέργειες PC3 επωάσθηκαν χωρίς /με (S) -2 απουσία FCS υποβλήθηκαν ζυμογραφία ζελατίνης και πυκνομετρική ανάλυση των ΜΜΡ -9 δραστηριότητα (ποσοστό ελέγχου). (Β) – MMP-9 και TIMP-1 mRNA επίπεδα από κύτταρα PC3 αγωγή χωρίς /με (S) -2 για 24 ώρες προσδιορίσθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. (C) – (S) -2 ανέστειλε κινητικότητα PC3 κυττάρων

in vitro

. Συρρέουσες καλλιέργειες «τραυματίστηκαν» με τη βοήθεια ενός αποστειρωμένου πλαστική μύτη και διατηρούνται χωρίς /με αυξανόμενες ποσότητες του φαρμάκου για 24 ώρες. Ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης χρησιμοποιήθηκε για να πάρει τις εικόνες των μονοστοιβάδων. (D) – (S) -2 μειωμένη διεισδυτικότητα του PC3. Οι καλλιέργειες προ-αγωγή με /χωρίς (S) -2 (2,5-5 μΜ) για 24 ώρες και στη συνέχεια δείγματα κυττάρων PC3 (20 × 10

3) μεταφέρθηκαν στο ανώτερο διαμέρισμα του θαλάμου. Τα κύτταρα μετανάστευσαν μέσω της Matrigel επί των φίλτρων των θαλάμων Boyden μετρήθηκαν μετά από 6 ώρες και εκφράστηκε ως ο αριθμός απόλυτων κύτταρο ± SD? πέντε διαφορετικά μικροσκοπικά πεδία (μεγέθυνση: x200) για κάθε συνθήκη εξετάστηκαν και σημαντική διαφορά μεταξύ των δειγμάτων ιδρύθηκε στο

P

≤0.05

Η

Επιπλέον, τα αποτελέσματα της «επούλωσης πληγών».