Αφηρημένο

Η αναστολή της ουβικιτίνης-πρωτεασώματος συστήματος (UPS) της πρωτεϊνικής αποδόμησης είναι έγκυρη στρατηγική κατά του καρκίνου και έχει οδηγήσει στην έγκριση του bortezomib για τη θεραπεία του πολλαπλού μυελώματος. Ωστόσο, η εναλλακτική προσέγγιση για την ενίσχυση της υποβάθμισης των ογκοπρωτεϊνών που συχνά υπερεκφράζεται σε καρκίνους είναι λιγότερο ανεπτυγμένη. Betulinic οξύ (ΒΑ) είναι ένα φυτό που προέρχεται από μικρό μόριο που μπορεί να αυξήσει την απόπτωση ειδικά στον καρκίνο αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα, γεγονός που το καθιστά ελκυστικό αντικαρκινικό παράγοντα. Τα αποτελέσματά μας σε καρκίνο προστάτη πρότεινε ότι η ΒΑ ανέστειλε πολλαπλές deubiquitinases (αποκαλεί), η οποία είχε ως αποτέλεσμα την συσσώρευση του πολυ-ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες, μειωμένα επίπεδα ογκοπρωτεΐνες, και αυξημένη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Σε φυσιολογικούς ινοβλάστες, ωστόσο, η ΒΑ δεν αναστέλλει δραστικότητα DUB ούτε αυξημένη ολική πολυ-ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες, οι οποίες συνδέθηκε με μια έλλειψη επίδρασης επί του κυτταρικού θανάτου. Στο TRAMP μοντέλο διαγονιδιακού ποντικού καρκίνου του προστάτη, η θεραπεία με BA (10 mg /kg) ανέστειλε πρωτογενείς όγκους, αυξημένη απόπτωση, μειωμένη αγγειογένεση και τον πολλαπλασιασμό, και μείωσε υποδοχέα ανδρογόνων και κυκλίνη D1 πρωτεΐνης. θεραπεία BA ανέστειλε επίσης δραστηριότητα DUB και αυξημένη ουμπικιτινομένων πρωτεΐνες στον καρκίνο του προστάτη TRAMP αλλά δεν είχε καμία επίδραση επί της απόπτωσης ή ουβικιτινίωση σε φυσιολογικούς ιστούς ποντικού. Συνολικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η BA-μεσολαβούμενη αναστολή της μεταγλωττίζει και επαγωγή αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου ειδικά στον καρκίνο του προστάτη αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα και τους ιστούς μπορεί να παρέχει μία αποτελεσματική μη τοξική και κλινικά εκλεκτικός παράγοντας για χημειοθεραπεία.

Citation : Reiner T, Parrondo R, de las Pozas Α, Palenzuela D, Perez-Σταθερό C (2013) betulinic οξύ Αυξάνει Επιλεκτικά υποβάθμιση των πρωτεϊνών και ενισχύει τον καρκίνο του προστάτη-απόπτωση: πιθανός ρόλος για την αναστολή της Deubiquitinase δραστηριότητας. PLoS ONE 8 (2): e56234. doi: 10.1371 /journal.pone.0056234

Επιμέλεια: Paul J. Galardy, Mayo Clinic, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12, Απρ 2012? Αποδεκτές: 11 Ιαν 2013? Δημοσιεύθηκε: 12η, Φεβρουαρίου 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Υποθέσεων Βετεράνων Merit Αναθεώρηση 6.996,06 MR https://www.research.va.gov/programs/blrd/merit_review.cfm. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

λόγω της υψηλής πολλαπλασιαστικής ικανότητας τους, τα καρκινικά κύτταρα συχνά ανταποκρίνονται στη συσσώρευση πρωτεϊνών ή ξεδιπλωμένη proteotoxic στρες, ενισχύοντας την ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος συστήματος (UPS), προκειμένου να αντισταθούν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [1]. Η UPS είναι η κύρια κυτταρικό μονοπάτι που αποδομεί πρωτεΐνες ξεδιπλωμένη και ελέγχει τα επίπεδα έκφρασης συγκεκριμένων πρωτεϊνών σημαντική στην κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού, και την απόπτωση [2]. Οι πρωτεΐνες στοχεύονται για UPS μεσολάβηση αποικοδόμησης με την προσθήκη πολλαπλών ουβικιτίνης μονάδων (poly-Ub), η οποία διευκολύνει την αναγνώριση και την υποβάθμιση από το σύμπλοκο της UPS. Η αναστολή της αύξησης UPS και μετέπειτα σε πολλαπλές πρωτεΐνες είναι ένα έγκυρο στρατηγική κατά του καρκίνου που έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη του bortezomib, ένα FDA εγκεκριμένο φάρμακο για τη θεραπεία του πολλαπλού μυελώματος [3]. Κλινικά, ωστόσο, bortezomib μόνη δεν εμφανίζει ουσιαστική δραστηριότητα στο ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) και συνδέεται συχνά με παρενέργειες που περιορίζουν τη δόση όπως η νευροπάθεια [4].

Μια εναλλακτική αλλά λιγότερο αναπτυγμένες θεραπευτική στρατηγική είναι να εκμεταλλευτεί τις UPS ενισχύοντας δραστηριότητα και ειδικότητα της, προκειμένου να αυξηθεί η αποικοδόμηση των πρωτεϊνών πολλαπλασιασμού και προ-επιβίωσης που συχνά υπερεκφράζεται σε καρκίνους, δηλαδή, ογκοπρωτεΐνες. Μια εφικτή και κλινικά σχετική μέθοδος είναι να συνεχίσει την ταυτοποίηση των μικρών μορίων που μπορούν να ενεργοποιήσουν UPS μεσολάβηση υποβάθμιση των πρωτεϊνών, όπως η ανδρογόνων υποδοχέων (AR) στον καρκίνο του προστάτη (PC). Betulinic οξύ (ΒΑ) είναι ένα φυτό που προέρχεται από μικρό μόριο το οποίο μπορεί να αυξήσει την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα, καθιστώντας έτσι ένα ελκυστικό αντικαρκινικό παράγοντα [5]. Προς το παρόν, η ΒΑ είναι ένα από τα μόλις δύο μικρά μόρια που αναφέρθηκαν για να ενεργοποιήσετε άμεσα χυμοθρυψίνη δραστικότητα παρόμοια UPS

in vitro

[6], [7]. Μια άλλη έκθεση καταδεικνύει ότι η ΒΑ αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP PC με επιλεκτική ενεργοποίηση UPS εξαρτώμενη αποδόμηση των AR, καθώς και πρωτεΐνη ειδικότητα (Sp) παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν την έκφραση του VEGF [8]. Πάντως, οι μηχανισμοί με τους οποίους η ΒΑ ενεργοποιεί ειδικά UPS εξαρτώμενη αποδόμηση των AR και άλλοι παράγοντες είναι άγνωστοι.

Εκτός από τη διέγερση δραστηριότητας UPS, ένας άλλος πιθανός τρόπος ΒΑ μπορεί να αυξήσει την αποικοδόμηση των συγκεκριμένων πρωτεϊνών είναι με αναστολή deubiquitinases ( αποκαλεί). Αναστρέψιμη ουμπικουιτίνωση αποτελεί ζωτικής σημασίας μηχανισμό στη ρύθμιση του UPS και στη διατήρηση πολλών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου και προ-επιβίωσης [9] – [11]. Πρόσφατα ευρήματα δείχνουν ότι Dubs παίζουν κρίσιμους ρυθμιστικούς ρόλους στις περισσότερες οδούς που περιλαμβάνουν Ub [9] – [11]. Περίπου εκατό ανθρώπινης Dubs εμπίπτουν σε πέντε κατηγορίες, οι καλύτερες χαρακτηριζόμενη ύπαρξη ειδικών-ουβικιτίνης πρωτεασών (USP) και ubiquitin C-τερματικό υδρολάσες (UCH). DUB μεσολάβηση απομάκρυνση της πολυ-Ub από βασικές πρωτεΐνες τα καθιστά λιγότερο ευάλωτες σε αποικοδόμηση από την UPS και κατά συνέπεια αυξάνει τα επίπεδά τους. Στην πραγματικότητα, αρκετές Dubs υπερεκφράζονται στον καρκίνο και θεωρούνται ογκογονίδια [9] – [11]

Επειδή Dubs έχουν ρόλο στην ογκογόνο μετασχηματισμό, πρόσφατη προσοχή εστιάστηκε στην αναγνώριση των μικρού μορίου αναστολείς. αποκαλεί. Η ιδέα είναι ότι η αναστολή αποκαλεί θα ανυψώσει πολυ-Ub για ογκοπρωτεΐνες και να αυξήσει την αναγνώριση και την υποβάθμιση τους από την οδό UPS, με αποτέλεσμα μεγαλύτερη απόπτωση και τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας του φαρμάκου [12]. Αρκετοί αναστολείς μικρού μορίου της δραστικότητας DUB έχουν εντοπιστεί να αυξηθεί η συσσώρευση των πρωτεϊνών πολυ-Ub και να ενισχύσει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι οι αναστολείς DUB ελπιδοφόρα αντικαρκινική παράγοντες [13] – [18]. Στην έκθεση αυτή, δείξαμε ότι η ικανότητα της ΒΑ να αυξήσει την αποικοδόμηση των πρωτεϊνών πολλαπλών πολλαπλασιασμού και προ-επιβίωσης σε κύτταρα PC συσχετίστηκε με την αναστολή της Dubs. Σε αντίθεση με τα κύτταρα PC, η ΒΑ είχε καμία επίδραση στην δραστικότητα και την υποβάθμιση των πρωτεϊνών DUB σε φυσιολογικά κύτταρα, οδηγώντας σε μηδενική τοξικότητα. Τα αποτελέσματα μας πρότεινε ότι η PC-ειδικό αποτέλεσμα που παρέχεται από θεραπεία ΒΑ οφείλεται στην ικανότητά της να αναστέλλει Dubs στον καρκίνο αλλά όχι σε μη καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλες οι μελέτες σε ζώα έχουν διεξαχθεί με την έγκριση της Επιτροπής Θεσμικών Animal Care and Use (πρωτόκολλο # 6.996,06 MR) του Ιατρικού Κέντρου του Μαϊάμι Υποθέσεων Βετεράνων (Ένωση για την Αξιολόγηση και διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα ζώων διαπιστευμένο) και ασκείται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ΝΙΗ για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου

Αντιδραστήρια

BA για πειράματα κυτταρικής καλλιέργειας αγοράστηκε από AG επιστημονική.? διγιτονίνη και πολυβινυλοπυρρολιδόνη (PVP) από την Sigma-Aldrich? MG132, δοξορουβικίνη, και Coomassie μπλε από EMD Biosciences? Ν-αιθυλμηλεϊμίδιο (ΝΕΜ) από την Sigma? και μπλε τρυπάνης (0,4%) από την Invitrogen.

Θεραπεία TRAMP ποντικών με BA

TRAMP διαγονιδιακά ποντίκια (Jackson Laboratories) προσδιορίστηκαν με βιοψία ουράς και PCR χρησιμοποιώντας καθαρισμό Οδηγό SV Genomic DNA (Promega ) και εκκινητές DNA PB-1 προς τα εμπρός 5′-CCGGTCGACCGGAAGCTTCCACAAGTGCATTTA-3 ‘και αντίστροφη Tag 5′-CTCCTTT CAAGACCTAGAAGGTCCA-3’. BA λήφθηκε από Ze-Qi Xu σε προχωρημένους Επιστημών Ζωής και παρασκευάζονται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Τα ποντίκια με ψηλαφητά νεοπλάσματα του προστάτη χωρίστηκαν τυχαία σε πειραματικές και ελέγχου ομάδες και εγχύθηκαν ε.π. 11 φορές πάνω από 14 ημέρες με BA (5 [BA5] ή 10 [BA10] mg /kg σωματικού βάρους? N = 10 η κάθε δόση) ή φορέα ελέγχου (n = 12). Την ημέρα 15, οι πρωτογενείς όγκοι του προστάτη απομακρύνθηκαν και προσδιορίστηκε το βάρος τους. Ένα εξωτερικό τμήμα του πρωτογενούς όγκου του προστάτη σταθεροποιήθηκε σε φορμαλίνη για ανοσοϊστοχημεία. TRAMP αρσενικά χωρίς ψηλαφητά νεοπλάσματα του προστάτη παρομοίως σε επεξεργασία με BA10 ή ελέγχου του οχήματος (n = 3, κάθε ομάδα), προστάτες, σπλήνα, θύμος αφαιρέθηκε, και αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία.

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοχρώση για αποπτωτικών (διασπασμένη κασπάση-3, Cell Signaling Technology? ApopTag υπεροξειδάσης In Situ απόπτωση Detection, Millipore) και πολλαπλασιασμό (Ki67, NCL-Ki67p, Leica Microsystems? PCNA [PC10], Santa Cruz Biotechnology) κύτταρα διεξήχθη χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά κουνελιού, μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού , δευτερογενή αντισώματα και βιοτινυλιωμένο κατσίκας αντι-κουνελιού /ποντικό (Vector Laboratories), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. πυκνότητα αιμοφόρων αγγείων προσδιορίστηκε με ανοσοχρώση για CD-31 χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα κατσίκας πολυκλωνικό (M20? Santa Cruz Biotechnology) και ένα αντι-κατσίκας δευτερογενές αντίσωμα βιοτινυλιωμένο κουνελιού ή για CD-34 χρησιμοποιώντας ένα πολυκλωνικό αρουραίου (RAM34, BD Biosciences) και γίδινο αντι -αρουραίου δευτερεύον αντίσωμα. Ο αριθμός των διασπασμένης κασπάσης-3 ή θετικά κύτταρα Κί67 και CD-31 θετικά αγγεία προσδιορίστηκαν για BA10 και όχημα ελέγχους (η = 5 εκάστη ομάδα), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Ομοίως, AR (Ν-20), η κυκλίνη D1 (DCS-6), και ουβικιτίνη (P4D1) από την Santa Cruz Biotechnology ανοσοχρωματίστηκαν? ο αριθμός των θετικών κυττάρων AR προσδιορίστηκε για BA10 και ελέγχου του οχήματος όγκους του προστάτη.

Οι κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές PC LNCaP, DU145, PC3 και [21] ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και χρησιμοποιήθηκε εντός 6 μηνών από την ανάνηψη του αρχικού καλλιεργειών. Όλα τα κύτταρα PC διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen) με 5% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone), 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 0,25 μg /ml αμφοτερικίνη (Invitrogen). PrEC φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη ελήφθησαν από Lonza και διατηρούνται σε PrEGM μέσα ενημέρωσης. RWPE-1 φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (ελήφθη από τον Dr. Bal Lokeshwar, Πανεπιστήμιο του Μαϊάμι και αρχικά από την ATCC) διατηρήθηκαν σε κερατινοκύτταρα SFM μέσα (Invitrogen). Ανθρώπινα κύτταρα ακροποσθίας BJ ινοβλαστών (πέρασμα 24) και του εμβρύου ινοβλάστες πνεύμονα (IMR-90, MRC-5) ελήφθησαν από τον Dr. Priyamvada Rai (University of Miami) και αρχικά ελήφθη από την ATCC (CRL-2522, CCL-186, και CCL -171). BJ, IMR-90, και τα κύτταρα MRC-5 διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM (Invitrogen) με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη.

BA δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων

Το CellTiter Υδατικό κυτταρικό πολλαπλασιασμό χρωματομετρική μέθοδος από την Promega χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό κυτταρικής βιωσιμότητας των κυττάρων PC σε μέσα που περιέχουν BA (2,5, 5, 7,5, και 10 μΜ) ή ελέγχου (0.5% DMSO). Η βιωσιμότητα των κυττάρων κανονικοποιήθηκε έναντι του ελέγχου του οχήματος και τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό του ελέγχου από τρία ανεξάρτητα πειράματα γίνονται εις τριπλούν.

θεραπείες Drug

PC κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα που περιέχουν BA (10 μΜ ), MG132 (1 μΜ), docetaxel (1 ηΜ), ή DMSO ελέγχου για διάφορους χρόνους (24-72 h). BJ, IMR-90, MRC-5, PrEC, και RWPE-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα που περιέχουν BA, δοξορουβικίνη (1 μΜ), ή τον έλεγχο DMSO για διάφορους χρόνους (24-72 h). Σε όλα τα πειράματα, τα επιπλέοντα και επεξεργασία με θρυψίνη συνδεδεμένα κύτταρα συλλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

Western ανάλυση κηλίδος

Παρασκευή ολικού προϊόντα λύσης πρωτεΐνης και ανάλυση στυπώματος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: διασπασμένη PARP (9541), CoxIV (4844), ΑΚΤ (9272), και survivin (71G4B7) από την Cell Signaling Technology? κυτόχρωμα c (7H8.2C12), Smac (612.245), Bcl-xL (610.211) και Rb (544.144) από την BD Biosciences? ΟΕΕ (Ε-1), ακτίνη (C-11), την κυκλίνη Α (H432), κυκλίνη Β1 (GNS1), κυκλίνη D1 (DCS-6), Cdk1 (17), Cdk2 (D-12), CDK4 (Μ2) , ρ21 (C-19), ρ27 (C-19), E2F1 (ΚΗ95), AR (Ν-20), Mcl-1 (S-19), Bcl-2 (Ν-19), ΗΑ (Υ-11 ), Ub (P4D1), Rb (C-15), και υπεροξειδάση αρμορακίας δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο από την Santa Cruz Biotechnology. Η προτίμησή μας ήταν να χρησιμοποιήσει Coomassie μπλε χρώση συνολικής πρωτεΐνης ως μάρτυρες φόρτωσης γιατί φαρμακευτικές αγωγές επηρεάζουν συχνά τα επίπεδα των τυπικών πρωτεϊνών καθαριότητας όπως ακτίνης ή τουμπουλίνης.

αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης δοκιμασία

Επεξεργασμένα και ελέγχου PC, BJ, IRM-90, MRC-5, PrEC, ή RWPE-1 κύτταρα συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε PBS, αραιωμένο 1:01 σε 0,4% trypan blue, τα νεκρά μπλε και ζουν μη μπλε κυττάρων που μετρήθηκαν αμέσως χρησιμοποιώντας ένα αιμοκυτόμετρο, και οι% νεκρά κύτταρα μπλε καθορίζεται από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα γίνονται εις διπλούν.

Αννεξίνη-FITC /ιωδιούχου προπιδίου (PI) κυτταρομετρία ροής

τα επεξεργασμένα και τα κύτταρα ελέγχου PC επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης ακολουθούμενη από την προσθήκη του αννεξίνης V-FITC και ΡΙ (V Kit αννεξίνη sc-4252 AK, Santa Cruz Biotechnology). Μετά από 20 λεπτά., Τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα ροής Coulter XL κυτταρόμετρο και το ποσοστό των αννεξίνη + κυττάρων προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας WinMDI έκδοση 2.8 από δύο ανεξάρτητα πειράματα γίνονται εις τριπλούν.

δοκιμασία απελευθέρωσης πρωτεΐνης μιτοχονδριακού

Επεξεργασμένα και κύτταρα ελέγχου PC επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 100-200 μΜ διγιτονίνης, 20 mM Hepes, ρΗ 7.5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 250 mM σακχαρόζη, και αναστολείς πρωτεάσης (Roche) σε 50 μl /1 × 10

6 κύτταρα. Μετά από 5 λεπτά. επί πάγου, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν 5 λεπτά και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση στυπώματος western. Digitonin είναι ένα απορρυπαντικό που καθιστά διαπερατά προτίμηση μεμβράνη του πλάσματος σε σύγκριση με μιτοχονδριακή μεμβράνη [23].

ροής κυτομετρική ανάλυση κυτταρικού κύκλου

προπίδιο /υποτονικό κιτρικό μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί διανομή του κυτταρικού κύκλου των PC αγωγή BA κύτταρα [24]. Έξι έως 8 δείγματα αναλύθηκαν από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα και τα ιστογράμματα κατανομής DNA που παράγεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22], [25].

Παροδική διαμόλυνση των AR, κυκλίνη D1 άγριου τύπου και μεταλλαγμένου T286A

/AR πλασμίδιο έκφρασης CMV διαμολύνθηκε σε κύτταρα PC3 επί 24 ώρες δια χρησιμοποιήσεως Fugene-HD (Roche) ακολουθούμενη από ΒΑ (24, 48, 72 h) ή ελέγχου (24 ώρες) αγωγή και η πρωτεΐνη AR αναλύθηκαν με western blot. Η κυκλίνη D1 πλασμίδια έκφρασης ρΒΑΒΕ /κυκλίνης D1 άγριου τύπου (9050) και pcDNA /κυκλίνη D1 T286A μετάλλαγμα (11182? Δεν μπορεί να αποικοδομηθεί από την UPS? [26]) ελήφθησαν από AddGene. Αυτά τα πλασμίδια μετήχθησαν μέσα σε κύτταρα LNCaP για 24 ώρες που ακολουθείται από την ΒΑ ή ελέγχου θεραπεία για 24 ώρες. Τα επίπεδα πρωτεΐνης των επιμολυσμένων κυκλίνης D1 πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-ΗΑ και κυκλίνης D1.

δοκιμασία Proteasome

πρωτεασώματος-Glo τύπου χυμοθρυψίνης Κυτταρικός προσδιορισμός (Promega) ήταν χρησιμοποιείται για να καθοριστεί η επίδραση της ΒΑ στη δραστηριότητα του πρωτεασώματος σε κύτταρα PC. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΒΑ, ΒΑ + MG132, ή ελέγχου για 8, 24, 48, και 72 ώρες, οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίζεται, και η δραστικότητα πρωτεοσώματος μετράται με ένα φωτόμετρο (TD-20/20, Turner Designs). Φως μονάδες ομαλοποιήθηκαν σε αριθμό κυττάρων (θεραπεία ελέγχου = 1) και 6-8 δείγματα αναλύθηκαν από τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

δοκιμασία DUB

Το DUB-Glo πρωτεάσης Δοκιμασία (Promega) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η επίδραση της ΒΑ στη δραστηριότητα DUB στο PC, BJ, IRM-90, και τα κύτταρα RWPE-1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΒΑ, 1 ηΜ docetaxel ή ελέγχου για 8, 24, 48, και 72 ώρες, λύθηκαν σε ρυθμιστικό DUB (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7,5, 0,1% ΝΡ-40, 5 mM MgCl

2 , 250 mM σακχαρόζη, 1 mM DTT, 1 mM PMSF), φυγοκεντρήθηκαν 10 λεπτά., και 10 μg πρωτεΐνης χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό DUB δραστηριότητα. Προϊόντα λύσης ελέγχου προεπωάστηκαν με 4 mM ΝΕΜ, ενός γνωστού αναστολέα της DUB, για 1 ώρα πριν από την προσθήκη του υποστρώματος. Μονάδες φωτός (θεραπεία έλεγχος = 1) από 6-8 δείγματα προσδιορίστηκαν από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. DUB δραστηριότητα μετρήθηκε επίσης σε έλεγχο του οχήματος (n = 4) και BA10 (n = 5) όγκους TRAMP προστάτη.

επισήμανση DUB δοκιμασία

Τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω για τη δοκιμασία DUB , 20 μg πρωτεΐνης επωάζονται με 500 ng ΗΑ-Ub βινυλοσουλφόνη (VS), μια μη αναστρέψιμη ειδικός αναστολέας της πιο Dubs (Boston Biochem) επί 1,5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, και τα δείγματα αναλύθηκαν με western blot χρησιμοποιώντας αντι-ΗΑ αντίσωμα για την ανίχνευση DUB επισήμανση.

η στατιστική ανάλυση

οι στατιστικές διαφορές μεταξύ φάρμακο και έλεγχοι προσδιορίζονται από δύο-tailed του Student

t-test

(άνιση διακύμανση) με

P

& lt?. 0,05 θεωρείται σημαντική

Αποτελέσματα

BA αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων του προστάτη TRAMP με την αύξηση της απόπτωσης και μείωση της αγγειογένεσης και του πολλαπλασιασμού

Έχουμε ήδη χρησιμοποιηθεί BA (Εικ. 1) ως ένας παράγοντας που μπορεί να ενισχύσει την ευαισθησία των κυτταρικών σειρών PC σε κυτταρικό θάνατο όταν συνδυάζεται με αντιμιτωτικά μέσα από την αύξηση της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ, εν μέρει λόγω της ενισχυμένης αποδόμησης των ΙκΒα [27], [28]. Για να αξιολογηθεί η

in vivo

θεραπευτική αποτελεσματικότητα της ΒΑ, χρησιμοποιήσαμε το TRAMP μοντέλο διαγονιδιακού ποντικού της PC [29], [30]. TRAMP ποντικών περιέχουν τον προαγωγό probasin ειδικού προστατικού συνδέεται με το ογκογονίδιο του αντιγόνου Τ του SV40, η οποία οδηγεί στην ανάπτυξη των επιθετικών μεταστατικών PC. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ΒΑ (5 και 10 mg /kg) μείωσε σημαντικά τις τελικές βάρη των όγκων του προστάτη πρωτογενούς σύγκριση με όγκους ελέγχου του οχήματος (Σχ. 2Α). Δεν υπήρχαν διαφορές στα τελικά βάρη σώματος μεταξύ ΒΑ και από συγκριτικούς ποντικούς (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ανοσοϊστοχημεία (IHC) του διασπασμένου (ενεργό) κασπάσης-3, ένας δείκτης για αποπτωτικά κύτταρα, έδειξε μια σημαντική αύξηση σε σύγκριση με BA10 όγκους ελέγχου του οχήματος (Σχ. 2Β και Συμπληρωματικό Σχ. S1 Α). IHC του CD31, ενός δείκτη για τα αιμοφόρα αγγεία, και Ki67, έναν δείκτη για πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, έδειξε μια σημαντική μείωση στην BA10 σε σύγκριση με τους όγκους ελέγχου του οχήματος. Περαιτέρω επιβεβαίωση χρησιμοποιώντας TUNEL για απόπτωση, CD34 για αγγειογένεση, και PCNA για πολλαπλασιασμό παρουσιάζεται στο συμπληρωματικό σχήμα. S1B. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η BA απόπτωση που επάγεται και ανέστειλαν την αγγειογένεση και τον πολλαπλασιασμό σε όγκους του προστάτη ΤΡΑΜΡ.

Η

(Α) Βάρη των πρωτογενών όγκων του προστάτη ήταν σημαντικά λιγότερο σε BA (5, 10 mg /kg) σε σύγκριση με όχημα ελέγχου [C] αντιμετωπίζεται ποντίκια TRAMP (*,

P

& lt? 0,03? **,

P

& lt? 0.002). θεραπεία (Β) BA10 αυξημένη διασπασμένη κασπάση 3 + κύτταρα και μειωμένη CD31 και Ki67 + κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο όγκων του προστάτη. (C) Αντιπροσωπευτική ανοσοβαφή για κυκλίνη D1 και AR (χ 200) έδειξαν λιγότερη πρωτεΐνη σε BA10 συγκρίσει προς όγκους του προστάτη (PT). τα επίπεδα πρωτεΐνης AR ήταν παρόμοια σε φυσιολογικούς προστάτες (Pr) από ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ΒΑ ή ελέγχου (χ 200). (D) μειώθηκε σημαντικά τον αριθμό των AR + κυττάρων σε BA10 σε σύγκριση με τον έλεγχο των όγκων του προστάτη (*,

P

& lt? 4 × 10

-7).

Η

BA μειώσεις τα επίπεδα των AR σε όγκους του προστάτη TRAMP αλλά όχι σε φυσιολογικό προστάτη

στη συνέχεια προσπάθησε να προσδιοριστεί αν η ΒΑ μπορεί να μειώσει τα επίπεδα έκφρασης των AR και κυκλίνης D1 πρωτεΐνες σε όγκους του προστάτη ελεύθερα φορτηγά πλοία. IHC και καταμέτρηση AR + κυττάρων έδειξαν μια σημαντική μείωση στην BA10 σε σύγκριση με όγκους ελέγχου του οχήματος (Σχ. 2C, D). IHC της κυκλίνης D1 έδειξε επίσης μια σημαντική μείωση στην BA10 σε σύγκριση με τους όγκους ελέγχου του οχήματος, συσχετίζοντας με τη μείωση των δεικτών πολλαπλασιασμού Κί67 και PCNA (Σχ. 2Β, C). Εμείς δίπλα επιδίωξαν να καθορίσουν εάν η BA-διαμεσολαβούμενη μείωση στην AR σημειώθηκε επίσης σε μη καρκινικό ιστό προστάτη. Σε αντίθεση με τα αποτελέσματα σε όγκους του προστάτη, τα επίπεδα του AR σε φυσιολογικό προστάτη ήταν παρόμοιες σε BA10 σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος, γεγονός που υποδηλώνει ότι η BA-μεσολαβούμενη αποικοδόμηση του AR συνέβη μόνο σε καρκινικά κύτταρα (Εικ. 2C).

BA αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και αυξάνει την απόπτωση των κυττάρων PC

Για την αντιμετώπιση των μηχανισμών της ΒΑ ως μονοθεραπεία σε PC, χρησιμοποιήσαμε LNCaP και τον ευνουχισμό ανθεκτικά DU145 και PC3 κύτταρα ανδρογόνο-εξαρτώμενη. Χρησιμοποιώντας ένα προσδιορισμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού τριήμερο, βρήκαμε ότι 10 μΜ ΒΑ ανέστειλε την ανάπτυξη όλων των κυττάρων PC, συμπεριλαμβανομένου του πιο χημειοθεραπείας ανθεκτικά DU145 και PC3 κύτταρα (Σχ. 3Α). Όλα τα επακόλουθα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 10 μΜ ΒΑ. Η επίδραση κύτταρο BA αντι-ΡΟ οφειλόταν στην αυξημένη θάνατο αποπτωτικών κυττάρων, όπως προσδιορίζεται με trypan blue δοκιμασία αποκλεισμού, ανάλυση western blot των διασπασμένης PARP (υπόστρωμα για ενεργοποιημένη κασπάσες), και αννεξίνη V-FITC /ΡΙ κυτταρομετρία ροής (Σχ. 3Β , C). BA έχει αναφερθεί να στοχεύσει τα μιτοχόνδρια για την κίνηση της ενδογενούς οδού της απόπτωσης με την αύξηση της απελευθέρωσης των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών όπως κυτόχρωμα c, το οποίο ενεργοποιεί τον καταρράκτη κασπάσης [5]. Τα αποτελέσματά μας σε κύτταρα PC3 έδειξε ότι η ΒΑ αύξησε την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, Smac (μπλοκ αναστολέας της απόπτωσης [ΙΑΡ] οικογένεια? [31]), και ο παράγοντας που επάγει την απόπτωση (ΟΕΕ? μετατοπίζεται στον πυρήνα για την αύξηση του κατακερματισμού του DNA? [32] ) από τα μιτοχόνδρια (Σχ. 3D). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε LNCaP και DU145 κύτταρα αντιμετωπίζονται BA (Συμπληρωματικές Εικ. S2). Έτσι, η BA-μεσολαβούμενη απελευθέρωση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών από τα μιτοχόνδρια συνέπεσε με την παρατηρούμενη αύξηση στην απόπτωση σε κύτταρα PC.

δοκιμασίας (Α) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων έδειξαν ότι η αύξηση των συγκεντρώσεων του BA (2,5 έως 10 μΜ) ανέστειλε LNCaP, DU145, PC3 και τα κύτταρα. (Β) Trypan blue δοκιμασία αποκλεισμού έδειξαν ότι 10 μΜ ΒΑ (Β) αύξησε τον συνολικό κυτταρικό θάνατο σε LNCaP (48 ώρες), DU145 (72 ώρες), και PC3 (72 ώρες) σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (C). Ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι η BA αυξημένη διασπαστούν τα επίπεδα (cl) -PARP στα κύτταρα PC. Coomassie κυάνωση της συνολικής πρωτεΐνης φορτώνει ελέγχου. (C) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε υψηλότερη αννεξίνη-FITC βάφονται ΒΑ σε σχέση με τον έλεγχο επεξεργασμένα κύτταρα PC. (D) δοκιμασία απελευθέρωσης Μιτοχονδριακή πρωτεΐνη και κηλίδος western έδειξε αυξημένα επίπεδα του κυτοχρώματος c, Smac, και AIF σε κύτταρα PC3 που έλαβαν θεραπεία με BA σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Cox IV πρωτεΐνη ήταν αρνητική ένδειξη δεν μιτοχονδριακό μόλυνσης και ακτίνη ήταν ο θετικός έλεγχος. + C ήταν λύμα παρασκευάζεται με τη χρήση της τυποποιημένης μεθόδου για το σύνολο των πρωτεϊνών.

Η

BA αυξάνει G1 /S κύκλου κυττάρου στα κύτταρα PC

Για να διερευνήσουν τις επιδράσεις κυτταρικού κύκλου της BA στα κύτταρα PC , χρησιμοποιήσαμε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Θεραπεία της PC κυττάρων με ΒΑ για 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντικά αυξημένη G1 και μειωμένη φάση S του κυτταρικού κύκλου, υποδεικνύοντας μια σημαντική μπλοκ σε G1 /S (Συμπληρωματική εικ. S3A). Μετά μακρύτεροι χρόνοι θεραπείας ΒΑ, υπήρξε μια σημαντική αύξηση στην φάση του κυτταρικού κύκλου υπο-G1 σε όλα τα κύτταρα PC, το οποίο ήταν αντανακλαστική μεγαλύτερης υποβάθμισης του DNA που συνέβησαν σε αποπτωτικά κύτταρα (Συμπληρωματική εικ. S3b). Σε DU145 και PC3, αλλά όχι σε LNCaP υπήρχε σημαντική αύξηση στη G2 /M μετά από 72 ώρες θεραπείας ΒΑ. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΒΑ προκάλεσε σημαντικές διαταραχές στο φυσιολογικό κυτταρικό κύκλο των κυττάρων PC.

BA αυξάνει την αποδόμηση των πρωτεϊνών πολλαπλών κυτταρικού κύκλου και προ-επιβίωσης σε κύτταρα PC

Δεδομένου ότι η ΒΑ έχει αναφερθεί ότι να αυξήσει την αποικοδόμηση των πολλαπλές πρωτεΐνες, διερευνήσαμε την επίδραση της ΒΑ στις πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου και προ-επιβίωσης σε κύτταρα PC με ανάλυση κηλίδος Western. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης πολλαπλών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου, συμπεριλαμβανομένων κυκλινών Α, Β1, D1? Cdks1, 2, 4? E2F1, και Rb μειώθηκε μετά τη θεραπεία BA ξεκινώντας στις 24 ώρες σε LNCaP και PC3 κύτταρα (Σχ. 4Α). Σε κύτταρα LNCaP, ο αναστολέας ρ21 Cdk μειώθηκε επίσης μετά τη θεραπεία αλλά σε ΒΑ PC3, πρωτεΐνη ρ21 αυξήθηκε στις 24 ώρες και επέστρεψαν στα βασικά επίπεδα από 48 και 72 ώρες. Αντίθετα, ο αναστολέας ρ27 Cdk αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία ΒΑ, υποδηλώνοντας ένα ρόλο στην G1 /μπλοκ κύκλου κυττάρου S. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε κύτταρα DU145 (Συμπληρωματική εικ. S4).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western

έδειξαν ότι η θεραπεία ΒΑ μείωσε τα επίπεδα πρωτεΐνης του κυκλινών, Οι cdks, E2F1, και Rb σε LNCaP και PC3 κύτταρα. Αντίθετα, η θεραπεία ΒΑ αύξησε τα επίπεδα πρωτεΐνης του αναστολέα ρ27 Cdk. (Β) θεραπεία της ΒΑ μειώθηκε πρωτεΐνες προ-επιβίωσης AR, ΑΚΤ, survivin, και Mcl-1, η οποία συσχετίζεται με αυξημένη CL-PARP σε LNCaP και PC3. AR σε PC3 ήταν από παροδική επιμόλυνση

Η

θεραπεία ΒΑ αύξησε τα επίπεδα της διασπασμένης PARP με το χρόνο στα κύτταρα PC, υποδηλώνοντας ανυψωμένα επίπεδα ενεργοποιημένων κασπασών και την απόπτωση (Σχήμα 4Β?.. Συμπληρωματική Εικόνα S4). . Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία BA μειωθεί δραματικά τα επίπεδα της πρωτεΐνης του AR σε LNCaP και AR επιμολυσμένα κύτταρα /DU145 PC3. Επιπλέον, η θεραπεία BA μείωσε τα επίπεδα των πρωτεϊνών προ-επιβίωσης ΑΚΤ, survivin, και Mcl-1. Αντίθετα, η θεραπεία BA δεν μειώνει τα επίπεδα των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και Bcl-xL (Σχήμα 4Β?.. Συμπληρωματική Εικόνα S4). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΒΑ αύξησε επιλεκτικά την υποβάθμιση αρκετών πρωτεϊνών πολλαπλασιασμού και προ-επιβίωσης.

BA μεσολάβηση πρωτεϊνικής αποδόμησης εξαρτάται από την UPS

Προηγούμενες μελέτες προτείνουν ότι η BA-διαμεσολαβούμενη αύξηση της δραστηριότητας UPS είναι ένας λόγος για την αυξημένη πρωτεϊνική αποδόμηση [6], [8]. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν ότι στα κύτταρα LNCaP, τα UPS αναστολέα MG132 μπλοκάρει την BA-μεσολάβηση μείωση του AR, ΑΚΤ, και πρωτεΐνες Mcl-1. Επιπλέον, MG132 ανταγωνίστηκε την BA-διαμεσολαβούμενη αύξηση σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, όπως προσδιορίζεται με trypan αποκλεισμό και ανάλυση κηλίδας Western των διασπασμένης PARP (Εικ. 5Α). Ένα μεταλλαγμένο κυκλίνη D1, που δεν μπορεί να αποικοδομηθεί από το UPS ήταν ανθεκτική σε αποικοδόμηση BA-διαμεσολαβούμενη, περαιτέρω προτείνοντας ένα ρόλο για το UPS (Εικ. 5Β). Ωστόσο, τα αποτελέσματα της ανάλυσης του πρωτεασώματος μας έδειξε ότι η ΒΑ δεν είχε άμεση επίδραση στη δραστηριότητα της UPS σε κύτταρα LNCaP (Εικ. 5C). Σε αντίθεση με τα κύτταρα LNCaP, θεραπεία ΒΑ της DU145 και τα κύτταρα PC3 οδήγησε σε σημαντικά αυξημένη δραστηριότητα UPS (Συμπληρωματικές Εικ. S5). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η BA μεταβλητά αυξημένη δραστηριότητα UPS σε κάποιο (DU145 και PC3), αλλά όχι όλα (LNCaP) κύτταρα PC.

(Α) μπλε Τρυπάνης δοκιμασία αποκλεισμού έδειξε ότι 1 μΜ MG132 ανταγωνίστηκε κυτταρικό θάνατο στην BA επεξεργασμένα κύτταρα LNCaP (24 ώρες? *,

P

& lt? 0,02). Ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι MG132 μπλοκάρει την BA-μεσολάβηση αύξηση του CL-PARP και μείωση του AR, ΑΚΤ, και πρωτεΐνες Mcl-1. (Β) ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι επιμολυσμένα κυκλίνη D1 T286A μεταλλαγμένο αλλά όχι κυκλίνης D1 πρωτεΐνη άγριου τύπου ήταν ανθεκτική σε αποικοδόμηση BA-μεσολαβούμενη (24 ώρες) σε κύτταρα LNCaP. (Γ) δοκιμασία δραστικότητας πρωτεασώματος δεν έδειξε σημαντική επίδραση στα κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με ΒΑ για 8, 24, και 48 ώρες. Εκτός του MG132 (MG) για να BA οδήγησε σε μειωμένη δραστηριότητα.

Η

BA αναστέλλει πολλαπλούς αποκαλεί με αποτέλεσμα την αύξηση των ολικών πρωτεϊνών πολυ-Ub στα κύτταρα PC

Στα κύτταρα LNCaP, μία δυνατό τρόπο ΒΑ μπορεί να αυξήσει την επιλεκτική αποδόμηση των πρωτεϊνών, χωρίς άμεσα ενεργοποιώντας το UPS είναι αναστέλλοντας την αποκαλεί. Στην περίπτωση αυτή, η αναστολή της Dubs θα πρέπει να οδηγήσει σε μια συσσώρευση των ολικών πρωτεϊνών πολυ-Ub και να αυξήσουν την αποδόμησή τους από την UPS. Τα αποτελέσματά μας στύπωμα Western έδειξε ότι η θεραπεία ΒΑ των κυττάρων LNCaP αυξημένη συνολική πρωτεΐνες πολυ-Ub, παρόμοια με θεραπεία MG132 (Σχ. 6Α). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε DU145 και τα κύτταρα PC3 (δεν φαίνεται). Παρά την αύξηση της πολυ-Ub, δεν είναι σαφές γιατί θεραπεία ΒΑ δεν έχει καμία επίδραση στην δραστικότητα UPS σε κύτταρα LNCaP (Εικ. 5C). Σε όγκους του προστάτη TRAMP, θεραπεία BA αυξήθηκε επίσης Ub πρωτεΐνες, όπως καθορίζεται από την IHC και μειωμένη δραστηριότητα DUB (Συμπληρωματικές Εικ. S6). Τα αποτελέσματά μας δοκιμασία DUB έδειξαν ότι η θεραπεία ΒΑ των κυττάρων LNCaP μειωμένη δραστικότητα DUB ξεκινώντας στις 24 ώρες. Σε αντίθεση, η αγωγή των LNCaP με 1 ηΜ docetaxel, μια δόση η οποία αυξήθηκε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [28], είχε μικρότερη επίδραση στη δραστικότητα DUB (Εικ. 6Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κατεργασία ΒΑ των DU145 και κυττάρων PC3 με την εξαίρεση ότι η ΒΑ ανέστειλε δραστηριότητα DUB ξεκινώντας σε μεταγενέστερο χρόνο (48 ώρες) και docetaxel είχε ισχυρότερη ανασταλτική επίδραση DUB σύγκριση με κύτταρα LNCaP (Συμπληρωματικές Εικ. S7). Συνολικά, η ικανότητα των 10 μΜ για την αναστολή της ΒΑ DUB δραστικότητα συσχετίζεται με την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (που δεν φαίνονται).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western

έδειξαν ότι η θεραπεία ΒΑ των κυττάρων LNCaP (24 h) αύξησε τον συνολικό πολυ- Ub πρωτεΐνες παρόμοιες με MG132 επεξεργασμένα κύτταρα. (Β) DUB δοκιμασία έδειξε ότι η θεραπεία ΒΑ των κυττάρων LNCaP μειώθηκε σημαντικά δραστηριότητας DUB στις 24 και 48 ώρες σε σχέση με τον έλεγχο των κατεργασμένων κυττάρων (= 1) (*,

P

& lt? 5 × 10

-5 ). Docetaxel (έγγρ, 1 nM) μειωμένη δραστηριότητα DUB πολύ λιγότερο από ό, τι σε σύγκριση με BA (*,

P

& lt? 6 × 10

-5). λύματα ελέγχου προ-αγωγή με 4 mM ΝΕΜ για 1 ώρα είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη δραστικότητα DUB. (Γ) DUB επισήμανση με ΗΑ-UbVS και ανάλυση κηλίδας Western με αντι-ΗΑ έδειξε ότι BA (10 μΜ), αλλά όχι Doc (1 ηΜ) ανέστειλε πολλαπλές μεταγλωττίζει σε κύτταρα LNCaP στις 24 και 48 ώρες. Οι ζώνες πρωτεΐνης 1-6 έδειξαν μία μείωση στην δραστηριότητα με αγωγή BA ενώ μπάντα 7 δεν το κάνει. Προϊόντα λύσης ελέγχου χωρίς προσθήκη του ΗΑ-UbVS ή προ-επωάστηκαν με ΝΕΜ για 1 ώρα ήταν τα στοιχεία ελέγχου. Οι δείκτες μοριακού βάρους (kDa) φαίνονται στα αριστερά. Coomassie κυάνωση της συνολικής πρωτεΐνης φόρτωση των ελέγχων.

Η

Για να καθοριστεί περαιτέρω αν η ΒΑ μπορεί να εμποδίσει την αποκαλεί στα κύτταρα LNCaP, χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία επισήμανση DUB με HA-UbVS, ένα ισχυρό, μη αναστρέψιμη, και ειδικός αναστολέας από τα πιο αποκαλεί [33]. Από HA-UbVS συνδέεται μόνο προς ενεργό αποκαλεί, η ετικέτα ΗΑ επιτρέπει την επισήμανση των ενεργών Dubs υπάρχει στα κύτταρα LNCaP μετά την επεξεργασία ΒΑ και ανάλυση με στύπωμα western. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η θεραπεία ΒΑ των κυττάρων LNCaP μειώθηκε πολλαπλές Dubs στις 24 και 48 ώρες σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχ. 6C). Αντίθετα, η θεραπεία των κυττάρων LNCaP με docetaxel δεν είχε επίδραση στην δραστικότητα DUB. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε DU145 και τα κύτταρα PC3 (Συμπληρωματικές Εικ. S8A, Β). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΒΑ ανέστειλε πολλαπλές αποκαλεί, με αποτέλεσμα την αύξηση πρωτεΐνες πολυ-Ub, οι οποίες πιθανόν αποικοδομείται ταχέως από την οδό της UPS.

ΒΑ δεν έχει καμία επίδραση στην δραστικότητα DUB σε μη καρκινικά κύτταρα

ΒΑ αναφέρεται ότι είναι ένας περισσότερο εκλεκτικός παράγων κατά του καρκίνου σε σύγκριση με φυσιολογικά κύτταρα αλλά οι μηχανισμοί του πώς αυτό συμβαίνει δεν έχουν προσδιοριστεί [34], [35]. Επειδή τα αποτελέσματα μας σε TRAMP ποντικούς έδειξε ότι η θεραπεία ΒΑ δεν μειώνει τα επίπεδα πρωτεΐνης AR σε μη καρκινικές προστάτη, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί η επίδραση της ΒΑ σε μη καρκινικά κύτταρα με τη χρησιμοποίηση BJ ανθρώπινης ακροποσθίας ινοβλάστες. κύτταρα BJ σε επεξεργασία με ΒΑ για 72 ώρες δεν αύξησε κυτταρικού θανάτου ή διασπώνται-PARP σύγκριση με τους μάρτυρες επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 7Α). Αντίθετα, η θεραπεία των κυττάρων BJ με 1 μΜ δοξορουβικίνη (α DNA βλάπτει φάρμακο) είχε ως αποτέλεσμα σημαντική κυτταρικό θάνατο και διασπάστηκε-PARP. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η περαιτέρω κατεργασία ΒΑ δεν μειώνουν τα επίπεδα του AR ή αυξήσει τη συνολική πρωτεΐνες πολυ-Ub σε κύτταρα BJ όπως στο LNCaP κύτταρα (Σχ. 7Β, C). Τέλος, δείξαμε ότι η ΒΑ είχε καμία επίδραση στην δραστικότητα DUB σε κύτταρα BJ, σε αντίθεση με ό, τι παρατηρήθηκε σε κύτταρα PC (Σχ. 7D και Συμπληρωματικό Σχ. S8C). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ανθρώπινα IMR-90 και MRC-5 εμβρυϊκά κύτταρα ινοβλαστών πνεύμονος (Συμπληρωματικές Εικ. S9).

(Α) Trypan blue δοκιμασία αποκλεισμού έδειξαν ότι η ΒΑ δεν αύξησε τον κυτταρικό θάνατο σε BJ ινοβλάστες μετά από 72 h. Αντίθετα, η θεραπεία των κυττάρων BJ με δοξορουβικίνη (Dox) αυξημένο κυτταρικό θάνατο. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι Dox αλλά δεν BA αυξημένη CL-PARP. (Β) στύπωμα Western έδειξε ότι η ΒΑ δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα της πρωτεΐνης σε κύτταρα AR BJ. Δρχ.