Αφηρημένο

Ακτιβίνης και TGFβ μοιράζονται SMAD καρκίνους σηματοδότησης και του παχέος εντέρου μπορούν να αδρανοποιήσουν είτε μονοπάτι μόνο του ή ταυτόχρονα. Τα διαφορικά αποτελέσματα της ακτιβίνης και TGFβ σηματοδότηση σε καρκίνο του παχέος εντέρου δεν έχουν προηγουμένως τεμαχίζεται. Ένα βασικό κατάντη στόχος της TGFβ σηματοδότησης είναι η p21 αναστολέας CDK2 (p21

Cip1 /WAF1). Εδώ, αξιολογούμε ακτιβίνης-ειδικές επιδράσεις στη ρύθμιση του p21 και η προκύπτουσα λειτουργίες. Διαπιστώνουμε ότι TGFβ είναι ένας πιο ισχυρός διεγέρτης της καταστολής της ανάπτυξης, ενώ η ακτιβίνη είναι ένας πιο ισχυρός επαγωγέας της απόπτωσης. Περαιτέρω, η καταστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση από τους δύο συνδέτες εξαρτώνται από Smad4. Ωστόσο, η ακτιβίνη ρυθμίζει προς τα κάτω πρωτεΐνη p21 σε Smad4-ανεξάρτητο τρόπο, σε συνδυασμό με την αυξημένη ουμπικουιτίνωση και η υποβάθμιση του πρωτεασώματος για την ενίσχυση της μετανάστευσης, ενώ TGFβ ρυθμίζει προς τα πάνω p21 σε Smad4-εξαρτώμενο τρόπο να επηρεάσει τη σύλληψη της ανάπτυξης. Ακτιβίνης που προκαλείται από την καταστολή της ανάπτυξης και κυτταρικού θανάτου εξαρτώνται από την p21, ενώ ακτιβίνη που προκαλείται από τη μετανάστευση αντισταθμίζεται από p21. Περαιτέρω, οι πρωτογενείς καρκίνους του παχέος εντέρου δείχνουν την έκφραση του p21 απόκλιση συνεπής με

ACVR2 /TGFBR2

κατάσταση των υποδοχέων τους. Συνοπτικά, αναφέρουμε ρ21 ως επηρεάζονται διαφορετικά ακτιβίνης /στόχου ΤΟΡβ και μεσολαβητής του συνδετήρα-ειδικές λειτουργίες στον καρκίνο του παχέος εντέρου, η οποία μπορεί να αξιοποιηθεί για τη μελλοντική διαστρωμάτωση του κινδύνου και θεραπευτική παρέμβαση

Παράθεση:. Bauer J, Sporn JC , Cabral J, Γκόμεζ J, Jung Β (2012) Επιδράσεις της Ακτιβίνης και TGFβ σε p21 στον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (6): e39381. doi: 10.1371 /journal.pone.0039381

Επεξεργαστής: Ο Carl G. Μάκη, του Πανεπιστημίου Rush Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Ιανουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 21 του Μάη 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Ιουνίου 2012

Copyright: © 2012 Bauer et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται από οι ΗΠΑ Δημόσιας Υπηρεσίας Υγείας DK074019 να BJ, τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας χορηγούν R01CA141057 και ARRA Ρ30 CA060553 να BJ, τις ασθένειες UCSD για το πεπτικό σύστημα Έρευνας Κέντρο Ανάπτυξης DK080506 να BJ, και ο Robert H. Lurie Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου επιχορήγηση υποστήριξη Ρ30 CA060553 να BJ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ακτιβίνη είναι μέλος της υπεροικογένειας ΤΟΡβ που ρυθμίζει κυτταρική διαφοροποίηση, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση σε πολλά επιθηλιακά και μεσεγχυματικά κύτταρα [1]. Παρόμοια με ΤΟΡβ, ακτιβίνη χρησιμοποιεί δύο τύπους υποδοχέων επιφάνειας με ενδοκυτταρικό SMAD2, 3 και 4 για μεταγωγή σήματος. υποδοχέα ακτιβίνης 1 (ACVR1B) και ακτιβίνης υποδοχέα 2 (ACVR2) είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες με δραστικότητα εξωκυτταρικής δέσμευσης συνδέτη και ενδοκυτταρική δραστικότητα κινάσης σερίνης /θρεονίνης. ACVR2B δεν υποκαθιστά τις λειτουργίες και τη σηματοδότηση της ACVR2 [2].

Ειδικότερα,

ACVR2

βρέθηκε μεταλλαχθεί στην πλειοψηφία των καρκίνων του παχέος εντέρου με υψηλή συχνότητα μικροδορυφόρων αστάθεια (MSI-H) , κυρίως λόγω της μετατόπισης πλαισίου στην Α

8 οδού του εξονίου 10 [3], [4]. Αποκατάσταση της σηματοδότησης ακτιβίνης, καταστολή της ανάπτυξης, τη σύλληψη της ανάπτυξη και την επαγωγή της μετανάστευσης συμβεί όταν

ACVR2

συμπληρώνεται [5]. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως υψηλή συχνότητα

ACVR2

μεταλλάξεις σε MSI-H δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου, σε συνδυασμό με την απώλεια της έκφρασης πρωτεΐνης ACVR2 [6] και έδειξαν ότι η απώλεια ACVR2 συνδέεται με μεγαλύτερους όγκους του παχέος εντέρου και την κακή ιστολογική βαθμολογία [7 ]. Τόσο

ACVR2

και

TGFBR2

μεταλλάξεις συμβαίνουν συχνά ταυτόχρονα σε MSI καρκίνους [6], και κυτταρικές σειρές, επίσης, μπορεί να χάσει τόσο TGFβ και ακτιβίνης σηματοδότησης [8]. Είναι ενδιαφέρον ότι, και οι δύο υποδοχείς είναι λιγότερο συχνά αδρανοποιούνται σε MSS καρκίνων του παχέος εντέρου, που τείνουν να έχουν χειρότερη πρόγνωση από MSI-H καρκίνων του παχέος εντέρου [9], και οι δύο οδοί μπορούν να στοχευθούν ανεξάρτητα. Μέχρι σήμερα, λίγα είναι γνωστά για την ξεχωριστή συμβολή της σηματοδότησης ακτιβίνης για την ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου και τη μετάσταση και συγκεκριμένα, πως ΤΟΡβ και ακτιβίνης επιδράσεις σηματοδότησης διαφέρουν παρά ταυτόσημες ενδοκυτταρική σηματοδότηση SMAD.

ρ21 (επίσης γνωστή ως ρ21

Cip1 /WAF1) είναι μια εξαρτώμενη από κυκλίνη αναστολέα κινάσης ελέγχου κυτταρικής σύλληψης κύκλου μέσω της CDK1 και 2 αναστολή και είναι ένα κύριο ρυθμιστή των πολλαπλών μονοπατιών ογκοκατασταλτικών μέσω τόσο p53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητους μηχανισμούς [10]. Είναι ένα γνωστό γονίδιο στόχος του ΤΟΓβ στον καρκίνο του παχέος εντέρου [11], και έχει συσχετισθεί με ακτιβίνη επαγόμενη διακοπή αύξησης σε πλασματοκυτταροειδών και του μαστού καρκινικά κύτταρα [12], [13], αλλά τα αποτελέσματα της ακτιβίνης για ρ21 σε καρκινικά κύτταρα κόλου ως και οι μεταγενέστεροι συνέπειες δεν έχουν αξιολογηθεί.

στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τους μηχανισμούς του TGFβ και ακτιβίνης για ρύθμιση του p21 και τις επακόλουθες λειτουργικές επιδράσεις αυτής σε καρκίνους του παχέος εντέρου. Βρήκαμε ότι παρά πανομοιότυπα ενδοκυτταρική σηματοδότηση SMAD, TGFβ και ακτιβίνης ρύθμιση του p21 μέσω ποικίλων μηχανισμών που είναι λειτουργικά σχετικές με τον καρκίνο του παχέος εντέρου που οδηγεί σε πιο απόπτωση ή μείωση στην καταστολή της ανάπτυξης εξαρτάται από την ακτιβίνης /TGFβ κατάσταση με ρ21 σηματοδότησης ως διαφορικά ρυθμιζόμενη στόχο.

Αποτελέσματα

Με την παρουσία της Smad4, TGFβ είναι πιο ισχυρός επαγωγέας του καταστολή ανάπτυξης, ενώ η ακτιβίνη είναι ένας πιο ισχυρός επαγωγέας απόπτωσης

Για να δοκιμάσετε και να συγκρίνετε τα αποτελέσματα της ακτιβίνης και ΤΟΡβ επί της κυτταρικής ανάπτυξης, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου με διαφορετικά καθεστώτα Smad4 όπως περιγράφεται αλλού [22], [23] εκτός από Smad4 knockdown. Η

ACVR2

/

TGFBR2 /Smad4

άγριου τύπου μικροδορυφόρων σταθερή παχέος εντέρου FET κυτταρική σειρά καρκίνου και

ACVR2 /TGFBR2

άγριου τύπου /

Smad4

-null SW480 κόλον καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με ακτιβίνη ή αξιολογήθηκε TGFβ και κυτταρική ανάπτυξη. Ως πρόσθετο έλεγχο, Smad4 χτυπήθηκε κάτω μέσω siRNA σε FET κύτταρα τα οποία υποβλήθηκαν σε θεραπεία και αναλύονται αναλόγως. Ενώ και οι δύο ακτιβίνης και θεραπεία TGFβ οδήγησε σε σημαντική καταστολή της ανάπτυξης στο

Smad4

FETs άγριου τύπου, η επίδραση ήταν εντονότερη μετά τη θεραπεία TGFβ. Σε αντίθεση, ούτε συνδέτη ήταν κατασταλτική της ανάπτυξης στην απουσία Smad4 στο

ACVR2 /TGFBR2

άγριου τύπου /

Smad4

-null SW480 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου ή μετά Smad4 νοκ ντάουν στον

Smad4

άγριου τύπου FET κύτταρα (Εικόνα 1Α).

Α) Μετά από

-wild τύπου ACVR2 /TGFBR2 /Smad4

FET, τα κύτταρα FET μετά από παροδική νοκ ντάουν Smad4, και

ACVR2 /TGFBR2

-wild τύπος /

Smad4

-null κύτταρα SW480 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα (έλεγχος), ακτιβίνη ή TGFβ για 24 ώρες, εκτιμήθηκε η μεταβολική δραστηριότητα μέσω δοκιμασίας ΜΤΤ-ανάπτυξη. καταστολή της ανάπτυξης συνέβη μόνο με την παρουσία του Smad4 εξής δύο ακτιβίνη και θεραπεία ΤΟΡβ (*** ρ & lt? 0.001). Περαιτέρω, ΤΟΡβ οδήγησε σε σημαντική αύξηση στην καταστολή της ανάπτυξης σε σύγκριση με ακτιβίνη (*** ρ & lt? 0.001). Β) Για τον προσδιορισμό του ποσοστού της απόπτωσης, μια δοκιμασία TUNEL διεξήχθη στο

-wild τύπου Smad4

FET,

Smad4

-KD FET, και

Smad4

-null κύτταρα SW480 αγωγή με φορέα ελέγχου (C), ακτιβίνη (Α), ή ΤΟΡβ (Τ). Η απόπτωση προσδιορίστηκε με TUNEL-σήμανση των αποπτωτικών σωμάτων. Γ) Η κανονικοποίηση [% αποπτωτικών σωμάτων /πυρήνες] αποκάλυψε ότι activin- και TGFβ απόπτωση συνέβη κυρίως στην

-wild τύπου Smad4

FET και όχι στο

Smad4

-KD FET ή

Smad4

-null καρκίνου παχέος εντέρου SW480 κύτταρα. Στα κύτταρα που εκφράζουν Smad4, ακτιβίνη επαγόμενη απόπτωση σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, ΤΟΡβ (* ρ & lt? 0,05). Δ) ενδοκυτταρικό θραύσματα DNA BrdU-επισημασμένο, ενδεικτική της απόπτωσης, προσδιορίστηκαν 24 ώρες μετά ακτιβίνης ή θεραπεία TGFβ του

Smad4

-wild τύπο καρκίνου του παχέος εντέρου FET κύτταρα, FET κύτταρα με ρ21 KD, FET κυττάρων με Smad4 KD και

Smad4

-null καρκίνου παχέος εντέρου SW480 κύτταρα. Αύξηση κατάτμηση DNA σημειώθηκε μετά ακτιβίνης και θεραπεία ΤΟΡβ μόνο στα κύτταρα άγριου τύπου Smad4, με ακτιβίνη επάγουν περισσότερο κατακερματισμό σε σύγκριση με ΤΟΡβ. Με την παρουσία του Smad4, p21KD οδηγούν σε βασική αύξηση στην απόπτωση, ενώ ο μόλυβδος θεραπεία ακτιβίνη σε καμία επαγωγή της απόπτωσης. Smad4 νοκ ντάουν είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια της απόπτωσης σε κύτταρα FET παρόμοια με αποτελέσματα που παρατηρούνται στο

Smad4

-null κύτταρα SW480 (* p & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001)

.

συνέχεια συγκρίνεται επαγωγή απόπτωσης είτε συνδέτη με την παρουσία και απουσία του Smad4 ή ρ21. Η ακτιβίνη επαγόμενη απόπτωση σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι ΤΟΡβ, και την απόπτωση συνέβη μόνο με την παρουσία του Smad4 (Σχήμα 1Β, C). Smad4 /ρ21 εξάρτηση επιβεβαιώθηκε με μία εναλλακτική δοκιμασία απόπτωσης προσδιορισμό σήμανσης BrdU του ενδοκυτταρικού DNA θραυσμάτων. Η απόπτωση αυξήθηκε εξής ακτιβίνη και θεραπεία ΤΟΡβ σε Smad4 κύτταρα θετικά FET, με ακτιβίνη επαγωγή μεγαλύτερο βαθμό απόπτωσης. Αριθ επαγωγή απόπτωσης με συνδέτη είτε παρατηρήθηκε σε

Smad4

-null κύτταρα SW480 ή κύτταρα FET εξής Smad4 knockdown παραλληλισμού των πειραμάτων TUNEL (Σχήμα 1Β, C). p21 νοκ ντάουν στο

Smad4

κύτταρα FET άγριου τύπου είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια της επαγωγής απόπτωσης (Εικόνα 1D).

Εν κατακλείδι, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι, αν και ακτιβίνης και TGFβ μοιράζονται ενδοκυτταρική σηματοδότηση SMAD, κάθε ευνοεί διακριτές κατάντη φυσιολογικές επιδράσεις σε συνεπείς δόσεις. Επιπλέον, δείχνουμε ότι τόσο η καταστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση που επάγεται είτε με συνδέτη είναι Smad4-εξαρτώμενη.

Ακτιβίνη Ρυθμίζει Πυρηνική ρ21 σε ένα Smad4 τρόπο ανεξάρτητο

Ένα από τα γνωστά γονίδια στόχους ανάπτυξης κατασταλτική του ΤΟΡβ είναι ρ21, η οποία ρυθμίζεται προς τα πάνω μετά από θεραπεία ΤΟΡβ σε FET καρκινικά κύτταρα κόλου [11]. Η επίδραση της ακτιβίνης για ρ21 σε καρκίνο του παχέος εντέρου δεν έχει αξιολογηθεί. Για να αναλυθούν οι επιδράσεις των κατάντη Smad4 εξαρτώμενη σηματοδότηση ακτιβίνης, προσδιορίσαμε έκφραση ρ21 μετά από αγωγή με ακτιβίνη σε σύγκριση με θεραπεία ΤΟΡβ. Σε αντίθεση με τα προηγουμένως γνωστά αποτελέσματα ΤΟΡβ επί p21, βρήκαμε καμία αύξηση στην ρ21 μετενεργοποίηση και μόνο μια μέτρια αύξηση στη μεταγραφή εξής ακτιβίνη κατεργασία παρουσία του Smad4, ενώ ΤΟΡβ αισθητά επάγεται τόσο ρ21-ειδική μετενεργοποίηση και μεταγραφή όταν Smad4 ήταν παρούσα (Εικόνα 2Α). Όσον αφορά την έκφραση της πρωτεΐνης ρ21, διαπιστώσαμε ότι σε αντίθεση με ΤΟΡβ, ακτιβίνη θεραπεία μείωσε τα πυρηνικά και συνολική ρ21 ανεξάρτητα από την παρουσία του Smad4, ενώ κυτοσολική ρ21 παρέμεινε σχετικά σταθερή (Σχήμα 2Β). Να αναλύσει περαιτέρω την ρύθμιση της πρωτεΐνης p21 από ακτιβίνης, πραγματοποιήσαμε μια χρονική πορεία δείχνει ότι μετά από μικρή αρχική ρύθμιση προς τα άνω, η πρωτεΐνη ρ21 ρυθμίζεται προς τα κάτω από 24 ώρες μετά τη θεραπεία ακτιβίνη (Σχήμα 2C, δύο γειτονικών δεξιά λωρίδες).

)

-wild τύπου Smad4

FET και

Smad4

-null καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου SW480 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα (έλεγχος), ακτιβίνη, ή TGFβ για 24 ώρες. ρ21-ειδική τρανσενεργοποίηση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης με pWWP-Luc και ρΡΙ_-ΤΚ (αριστερό πάνελ) και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της ρ21 ποσοστώθηκαν με qPCR και ομαλοποιήθηκε ως προς L19 (δεξί πάνελ). Ενώ ΤΟΡβ αισθητά επάγεται τόσο ρ21-ειδική μετενεργοποίηση και μεταγραφή σε παρουσία Smad4, καμία αύξηση σε ρ21 μετενεργοποίηση και μόνο μια μέτρια αύξηση στη μεταγραφή μετά τη θεραπεία ακτιβίνη παρουσία Smad4 βρέθηκαν (* ρ & lt? 0,05). Β)

Smad4

-wild FET τύπου και

Smad4

-null κύτταρα SW480 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ελέγχου (C), ακτιβίνη (Α), ΤΟΡβ (Τ), ή ένα συνδυασμό και των δύο προσδεμάτων (Α + Τ) για 24 ώρες πριν από την λύση για ολική πρωτεΐνη, πυρηνική και κυτταροπλασματική προετοιμασία. Ιστόνης Η3, α-τουμπουλίνης, και GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης για τα αντίστοιχα κλάσματα. Ενώ ΤΟΡβ σημαντικά αυξημένα επίπεδα ρ21 και στις τρεις κλάσματα στη θετική κυτταρική γραμμή Smad4 μόνο, ακτιβίνη προκάλεσε μία μείωση στην πρωτεΐνη πυρηνικής και συνολική p21 σε Smad4-θετικών και -αρνητικοί κυττάρων (αριστερό πάνελ). Η πυκνομετρική ανάλυση όλων των στυπωμάτων αποκάλυψε στατιστικά σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα ρ21 (δεξί πάνελ) (ns = μη σημαντική, * ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001). Γ) Η αρχική προς τα πάνω ρύθμιση της ρ21 πρωτεΐνης ακολουθείται από ρύθμιση προς τα κάτω από 24 ώρες μετά την αγωγή με ακτιβίνη.

Smad4

κύτταρα FET -wild τύπου υποβλήθηκαν σε αγωγή με ακτιβίνη ή φορέα (έλεγχος) και συλλέχθηκαν σε διάφορα χρονικά σημεία για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης πρωτεΐνης ρ21. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης και σχετική έκφραση υπολογίστηκε μέσω πυκνομετρίας. Δ) Ενώ ΤΟΡβ-επαγόμενη προς τα πάνω ρύθμιση του p21 ήταν Smad4 εξαρτώμενη, ακτιβίνη επαγόμενη μειορύθμιση της ρ21 ήταν ακόμα παρατηρείται απουσία του Smad4.

Smad4

κύτταρα FET -wild τύπου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα (CNT), ακτιβίνη ή ΤΟΡ-β σε παρουσία είτε μπάλα siRNA (SC) ή Smad4 siRNA (KD) και τα συνολικά επίπεδα ρ21 προσδιορίσθηκαν. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως φόρτωση και λύμα κυττάρων C32 ως p21 θετικός μάρτυρας.

Η

Για να επιβεβαιωθεί ότι τα αποτελέσματα συνδετήρα επί p21 εξαρτώνται άμεσα από Smad4, εμείς γκρέμισε Smad4 στο

Smad4

άγρια πληκτρολογήστε FET καρκίνων του παχέος εντέρου κύτταρα χρησιμοποιώντας siRNA. Βρήκαμε ότι η έκφραση βασικής γραμμής p21 σε FET κυττάρων μειώθηκε με Smad4 knockdown (Εικόνα 2D, λωρίδα 3), που τεκμηριώνουν τη σημασία της οδού Smad4 για τη διατήρηση υψηλών επιπέδων ρ21 σε αυτή την κυτταρική γραμμή [11]. Σταθερά, ΤΟΡβ-επαγόμενη προς τα πάνω ρύθμιση της ρ21 καταργήθηκε με την απώλεια της Smad4 (Σχήμα 2D, λωρίδα 7). Όπως αναμενόταν, η ρύθμιση προς τα κάτω της ρ21 με ακτιβίνη δεν επηρεάστηκε από την απουσία Smad4 (Εικόνα 2D, λωρίδα 5), η οποία είναι συνεπής με την ανάλυσή μας Western blot των επιπέδων ρ21 σε FET και τα κύτταρα SW480 (σχήμα 2Β) δείχνει προς τα κάτω ρύθμιση του p21 στην Smad4 θετική και αρνητική κυτταρική σειρά. Έτσι, Smad4 σηματοδότηση φαίνεται να απαιτείται για διαδικασίες που εξαρτώνται από υψηλή έκφραση p21, αλλά περιττή για διαδικασίες που συνδέονται με χαμηλά ή μειωμένα επίπεδα ρ21.

ακτιβίνη επαγόμενη Καταστολή Ανάπτυξης είναι εξαρτάται από την έκφραση ρ21, και Smad4 /ρ21 Σηματοδοσίας μπορεί να εξουδετερώσει ακτιβίνη επαγόμενη Smad4 ανεξάρτητο μετανάστευση

στη συνέχεια, επιδιώξαμε να καθορίσει το λειτουργικό ρόλο της ρ21 στην καταστολή της ανάπτυξης ακτιβίνη επαγόμενη και η κυτταρική βιωσιμότητα. Βρήκαμε ότι η απώλεια του p21 μέσω siRNA knockdown είχε σαν αποτέλεσμα κατάργηση της ακτιβίνης επαγόμενη καταστολή της ανάπτυξης σε

SMAD4-

άγριου τύπου κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η ακτιβίνη /Smad4 επαγόμενη καταστολή ανάπτυξης είναι p21-εξαρτώμενο (Σχήμα 3Α). Περαιτέρω, η απώλεια της ρ21 όχι μόνο οδήγησε σε ακύρωση της ακτιβίνης-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, αλλά επίσης σε αύξηση του αριθμού των κυττάρων που υποδηλώνει όφελος επιβίωσης με την απώλεια της ρ21 (Εικόνα 3Β). Αυτές οι παρατηρήσεις υπογραμμίζουν τη σημασία του άξονα /p21 Smad4 στην καταστολή της ανάπτυξης ακτιβίνης με τη μεσολάβηση και κυτταρικό θάνατο.

Α) κύτταρα FET υποβλήθηκαν σε θεραπεία είτε με αγωνίζομαι (SC) ή ρ21 ειδικά siRNA (KD). καταστολή της ανάπτυξης εκτιμήθηκε με ΜΤΤ-μεταβολική δοκιμασία μετά τη θεραπεία ακτιβίνης. Η ακτιβίνη επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης με την παρουσία του ρ21, αλλά το αποτέλεσμα ανατράπηκε με την απουσία του ρ21 (* ρ & lt? 0,05). Β) Η συνολική βιωσιμότητα μειώνεται σε Smad4 καρκίνων του παχέος εντέρου άγριου τύπου μετά από αγωγή ακτιβίνη παρουσία ρ21. FET κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία είτε με αγωνίζομαι ή p21 συγκεκριμένες siRNA. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με βαφή κυανούν τρυπανίου μετά τη θεραπεία ακτιβίνης. Trypan blue θετικών κυττάρων μετά από θεραπεία ακτιβίνη μειώθηκαν παρουσία p21, αλλά αυξήθηκε μετά p21 νοκ ντάουν (*** p & lt? 0.001). Γ) Η ακτιβίνη (A) επάγει την κυτταρική μετανάστευση σε Smad4-θετικών και Smad4 αρνητικών κυτταρικών γραμμών. Κυτταρική μετανάστευση επάγεται σε

SMAD

4-κύτταρα άγριου τύπου FET και

Smad4

-null SW480 κύτταρα μετά από θεραπεία ακτιβίνη, αλλά πιο έντονη επαγωγή της μετανάστευσης παρατηρείται εν απουσία Smad4. Απώλεια ρ21 οδηγεί σε αύξηση της βασικής γραμμής μετανάστευση σε κύτταρα που εκφράζουν Smad4 (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001). Δ) ρ21 νοκ ντάουν αυξάνει τη συνολική φιλο-μεταναστευτική επίδραση της ακτιβίνης στο FET κύτταρα. Απώλεια της ρ21 σε απουσία Smad4 δεν αυξάνει περαιτέρω μεταναστευτικών επαγωγή (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01)

Η

Κατά συνέπεια, εξετάσαμε το ρόλο του p21 σε ακτιβίνη επαγόμενη μετανάστευση. εκτίμηση της κυτταρικής κινητικότητας υπό την παρουσία και απουσία του Smad4. Βρήκαμε ότι η Ακτιβίνη αυξημένη μετανάστευση στην Smad4 θετικά και Smad4 αρνητικά κύτταρα (Σχήμα 3C), η οποία τάσσεται υπέρ μιας Smad4 ανεξάρτητη πορεία που ρυθμίζει τη μετανάστευση. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζονται από παρόμοια ευρήματα σε TGFβ σηματοδότησης για την οποία παρουσιάζεται μια ισχυρή προ-μεταναστευτικά και Smad4-ανεξάρτητη επίδραση [20], [22]. Επειδή η θεραπεία με ακτιβίνη συνδέθηκε με μια μείωση στα επίπεδα ρ21 όσο και την αύξηση της μετανάστευσης, περιμέναμε ότι η απώλεια του ρ21 με knockdown θα ενισχύσει την αρχική τιμή μετανάστευση καθώς και η μετανάστευση μετά ακτιβίνης θεραπεία σε Smad4 ακέραια κύτταρα, εάν τα υπόλοιπα ρ21 ήταν τουλάχιστον εν μέρει εμπλέκονται στην καταπολέμηση ακτιβίνη επαγόμενη μετανάστευση. Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, δείχνουν έναν αυξημένο ρυθμό βασική μετανάστευσης στην Smad4 κύτταρα που εκφράζουν ακόλουθα νοκ ντάουν p21 (Σχήμα 3C), καθώς και τη συνολική πιο έντονη μετανάστευση κατά την αγωγή ακτιβίνη (Σχήμα 3D).

Επίσης, διαπιστώθηκε ότι βασικοκυτταρικό καρκίνωμα μετανάστευση ενισχύθηκε από ακτιβίνης κατεργασία απουσία είτε p21 ή Smad4 σε Smad4-θετικά κύτταρα FET, αλλά ότι knockdown του p21 δεν είχε καμία επιπλέον επίδραση στην μετανάστευση όταν Smad4 ήταν απούσα, όπως σε SW480 κύτταρα (Σχήμα 3D). Για ΤΟΡβ, διαπιστώσαμε ότι η μετανάστευση των κυττάρων ενισχύθηκε ανεξάρτητα από την παρουσία του ρ21 (Σχήμα 2Β, εικόνα S1D). Αυτό υποστηρίζει και πάλι ότι τα p21-προκαλούμενα αποτελέσματα μετά από θεραπεία ακτιβίνη εξαρτώνται από Smad4 και ότι p21 δρα κατάντη του Smad4 για αντι-πολλαπλασιαστική και αντι-μεταναστευτικά επιδράσεις του (Σχήμα 4). Περαιτέρω, το γεγονός αυτό δείχνει ότι, στην περίπτωση του ΤΟΓβ, κάποια σήματα promigratory μπορεί να παρακάμψει Smad4 ως υποτεθεί προηγουμένως [22] παρακάμπτοντας ρ21 και ανασταλτικές επιδράσεις της. Εν ολίγοις, συμπεραίνουμε ότι η p21 μπορεί να εξουδετερώσει τη μετανάστευση κατάντη της Smad4 και ότι προς τα κάτω ρύθμιση του p21 μπορεί να είναι υπεύθυνη για μερικά από τα προ-μεταναστευτικά δυναμικό της σηματοδότησης ακτιβίνης. Έτσι, η διαφορική ρύθμιση της p21 μπορεί να είναι στο κέντρο των διακριτών λειτουργικών αποτελεσμάτων της ακτιβίνης και TGFβ.

Η

Ακτιβίνης θεραπεία οδηγεί σε Ουβικιτινίωση ρ21 και αναστολή της Proteasome Καταργεί Ακτιβίνης που προκαλείται από ρ21 Ελάττωση

για την περαιτέρω τεμαχίσει το μηχανισμό της ακτιβίνης μεσολάβηση μείωση πρωτεΐνη p21, p21 αξιολογήσαμε ουβικιτινίωση μετά τη θεραπεία ακτιβίνη και την εξάρτησή της από το πρωτεόσωμα (Σχήμα 5Α, Β). Για το σκοπό αυτό, συγκρίναμε ρ21 ουβικιτινίωση εξής ακτιβίνη και θεραπεία ΤΟΡβ. Σε αντίθεση με ΤΟΡβ, ακτιβίνη επάγεται θεραπεία p21 polyubiquitination (Σχήμα 5Α). Η θεραπεία με MG-132 αναστολέας του πρωτεασώματος ακύρωσε ακτιβίνη προκληθείσα μείωση πρωτεΐνη p21, (Σχήμα 5Β), επικαλούμενη ουβικιτίνη μεσολαβεί αποικοδόμηση του πρωτεασώματος σε ακτιβίνη επαγόμενη ρ21 μειορύθμιση. Αυτό είναι παρόμοιο με την υποβάθμιση της πρωτεΐνης p21 προκαλεί η ακτινοβολία UV [24], αλλά διαφέρουν από τα βασικά υποβάθμιση του p21 του πρωτεασώματος [25], η οποία δεν χρησιμοποιεί ουβικιτίνωσης.

Α)

ACVR2 /TGFBR2 /Smad4

-wild τύπου FET κύτταρα προκατεργάστηκαν για 30 λεπτά με αναστολέα πρωτεασώματος MG-132 και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με φορέα (έλεγχος), ακτιβίνη, TGFβ για 24 ώρες και ουβικιτινίωση των συνολικών ρ21 εκτιμήθηκε μέσω ανοσοκαταβύθιση του ρ21 και κηλίδωση με ένα ουμπικουϊτίνης-ειδική αντίσωμα (άνω τμήμα) και reblotting του p21. Πολλαπλές ζώνες ενδεικτική polyubiquitination παρατηρήθηκαν μόνο μετά ακτιβίνης θεραπεία. Β) ακτιβίνη προκαλούμενη ρ21 προς τα κάτω ρύθμιση εξαρτάται από το πρωτεάσωμα.

Smad4

κύτταρα FET -wild τύπου προκατεργάστηκαν για 30 λεπτά με αναστολέα πρωτεασώματος MG-132 που ακολουθείται από επεξεργασία με όχημα (έλεγχος) ή ακτιβίνη για 24 ώρες και συγκρίθηκαν με κύτταρα που κατεργάζονται αναλόγως χωρίς αναστολή του πρωτεασώματος. έκφραση ρ21 εκτιμήθηκε και έδειξε αναστολή της p21 αρνητική ρύθμιση μετά τη θεραπεία ακτιβίνη σε συνδυασμό με την αναστολή του πρωτεασώματος.

Η

Πυρηνική p21 έχει χαθεί σε μια υποομάδα των πρωτοπαθών καρκίνων του παχέος εντέρου με άθικτη

ACVR2

στη συνέχεια, αξιολόγησε κατά πόσο διαταραγμένη ακτιβίνης /TGFβ σηματοδότηση επηρεάζονται p21 εντοπισμό των πρωτογενών καρκίνων του παχέος εντέρου. Προσδιορίσαμε παρουσία έναντι απώλεια της έκφρασης πυρηνικών p21 σε 56 πρωτογενή καρκίνο παχέος εντέρου δείγματα των διαφόρων γονιδιωματικών υποτύπων, και συσχετίστηκε αυτά τα δεδομένα με την ακτιβίνη και την κατάσταση του υποδοχέα ΤΟΡβ (Πίνακας 1). Βρήκαμε ότι ένα μεγάλο υποσύνολο των καρκίνων του παχέος εντέρου έδειξε απώλεια πυρηνικών ρ21, και ότι αυτή η απώλεια συνδέθηκε με διατήρηση του ACVR2 (Πίνακας 1 και Σχήμα 6), υποδηλώνοντας μειωμένη σηματοδότηση μέσω του άξονα /ρ21 Smad4, αλλά άθικτη ακτιβίνη Smad4 ανεξάρτητη σηματοδότηση . Το αντίθετο συνέβη στην περίπτωση TGFBR2: Διατήρηση της TGFBR2 σχετίστηκε με επίμονη πυρηνικών p21 (Πίνακας 1). Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με μας

in vitro

ευρήματα του TGFβ /Smad4-εξαρτώμενη ρύθμιση προς τα άνω των p21 και ακτιβίνης /μη-Smad4-εξαρτώμενη ρύθμιση προς τα κάτω της p21.

Πενήντα-έξι καρκίνους του παχέος εντέρου βάφτηκαν για ACVR2, TGFBR2 και p21. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα για χρώση ρ21 δείχνονται: φυσιολογικό ιστό κόλου με πυρηνική χρώση (αριστερό πάνελ), του παχέος εντέρου δείγμα καρκίνου με διατηρήθηκε χρώση των πυρηνικών p21 (μεσαίο πλαίσιο), και το δείγμα καρκίνου του παχέος εντέρου με την απώλεια της χρώσης πυρηνικών p21 (δεξί πάνελ)

.

η

Συζήτηση

Στους καρκίνους του παχέος εντέρου MSI-H, τόσο TGFβ και σηματοδότηση ακτιβίνη καταργούνται λόγω πλαισίου μεταλλάξεις στον υποδοχέα τύπου ΙΙ [26]. Η απώλεια και των δύο αυτών οδών σηματοδότησης μπορεί να είναι ευεργετική και πρόσθετο για την ανάπτυξη του όγκου [20], [27], αλλά η διαφορική επίδραση επί της μετανάστευσης παραμένει ασαφής. TGFβ και ακτιβίνης χρησιμοποιούν τις ίδιες ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες Smad (SMAD2 /3 και Smad4) να μεταδίδουν το σήμα τους. Και οι δύο συνδέτη συγκεκριμένες οδούς συνήθως αδρανοποιούνται σε καρκίνους του παχέος εντέρου MSI-H, για την οποία έχουμε προηγουμένως παρατηρήθηκε μεγαλύτερη από 50% επικάλυψη μεταξύ των

ACVR2

και

TGFBR2

μεταλλάξεις [6]. Είναι ενδιαφέρον, είναι λιγότερο συχνά αδρανοποιούνται σε MSS καρκίνων του παχέος εντέρου, που τείνουν να έχουν χειρότερη πρόγνωση από MSI-H καρκίνων του παχέος εντέρου [9], και οι δύο οδοί μπορούν να στοχευθούν ανεξάρτητα. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι ενώ ακτιβίνης και ΤΟΡβ και οι δύο μπορούν να προκαλέσουν καταστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση σε διαφορετικούς βαθμούς, ενισχύουν επίσης τη μετανάστευση, την ανταλλαγή έτσι σε κατασταλτικό του όγκου καθώς και καρκίνο προώθηση ιδιότητες. Τελειοποίηση αυτών των αντίθετων επιδράσεων, καθώς και διαφορική ρύθμιση της TGFβ έναντι σηματοδότησης ακτιβίνης είναι πιθανό μια σημαντική διαδικασία στην καρκινογένεση που επηρεάζουν την τύχη των καρκινικών κυττάρων. Αυτό χειρόγραφο διερευνά τις επιδράσεις απόκλιση και τη ρύθμιση της ακτιβίνης και TGFβ σηματοδότηση σε καρκίνο του παχέος εντέρου.

Εδώ δείχνουμε ότι σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, παρά ταυτόσημες κατάντη σηματοδότησης SMAD, ακτιβίνη και ΤΟΡβ έχουν αντίθετες επιδράσεις στην ρ21 αναστολέα CDK2 προκύπτον σε διακριτές κανονισμούς της κάθε οδού. Ενώ TGFβ έχει μια ισχυρή up-ρυθμιστική επίδραση στην p21, σηματοδότηση ακτιβίνης οδηγεί σε μικρή μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης ρ21. Είναι ενδιαφέρον ότι, και τα δύο προσδέματα επάγουν Smad4 εξαρτώμενη p21 μεσολάβηση καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και του κυτταρικού θανάτου, ακόμη ΤΟΡβ φαίνεται να είναι ένας πιο ισχυρός διεγέρτης της καταστολής της ανάπτυξης, ενώ ακτιβίνης από την άλλη πλευρά είναι πιο ισχυρός επαγωγέας της απόπτωσης. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, οι δύο TGFβ και ακτιβίνης ενισχύσει την κυτταρική μετανάστευση [20], [22]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, δείχνουμε τώρα ότι η φιλο-μεταναστευτική επίδραση ακτιβίνης έχει ρυθμιστεί σε ένα Smad4 τρόπο ανεξάρτητο και περιγράφουν για πρώτη φορά μια ταυτόχρονη αύξηση του p21 ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση του πρωτεασώματος. Ως εκ τούτου, ενώ η ακτιβίνη επαγόμενη καταστολή της ανάπτυξης εξαρτάται από την ρ21, ακτιβίνη επαγόμενη μετανάστευση συνοδεύεται από μειωμένα επίπεδα ρ21 και ανεξάρτητα από Smad4. Ενώ είναι γνωστό ότι η αποικοδόμηση της πρωτεΐνης ρ21 UV-επαγόμενης είναι ubiquitinin εξαρτώμενη [24], η βασική αποδόμηση ρ21 μέσω του πρωτεασώματος δεν είναι [25]. Πρόσφατα στοιχεία εμπλέκουν ERK2 στη μεσολάβηση της πυρηνικής για να του κυτταροπλάσματος μετατόπιση και ακολούθησε ubiquitinin μεσολάβηση της υποβάθμισης της p21 [28]. Μια ποικιλία από λιγάσες ουβικιτίνης να συμπεριλάβει Ecto και Στρουμφ-1 έχουν βρεθεί να στοχεύουν τόσο SMAD-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη TGFβ σηματοδότηση [29]. Η ειδική ουβικιτίνης υπεύθυνος για ακτιβίνης με τη μεσολάβηση ρ21 ουμπικουιτίνωση λιγάση δεν έχει προσδιοριστεί μέχρι σήμερα.

Αύξηση ή μείωση των επιπέδων του p21 θα μπορούσε να οδηγήσει σε ένα κελί προς την προτιμησιακή ενεργοποίηση είτε την Smad4-εξαρτώμενη ή ανεξάρτητη οδό σηματοδότησης και αντιστρόφως αντιστρόφως, διαμορφώνοντας έτσι τη συνολική κυτταρική απόκριση. Συμπερασματικά, ρ21 φαίνεται να είναι ένας σημαντικός παίκτης για τη διαφορική ρύθμιση των Smad4-εξαρτώμενες και ανεξάρτητες οδούς ελέγχονται από ακτιβίνη και ΤΟΡβ (Σχήμα 4).

Στην πραγματικότητα, φαίνεται ότι τόσο η ακτιβίνη και TGFβ SMAD και μη σηματοδότηση SMAD συμβαίνουν ταυτόχρονα και ότι το καθαρό αποτέλεσμα είναι ένα αποτέλεσμα της σχετικής μεταβλητής κυριαρχία ενός δεδομένου συμπλοκοποιητού και /ή οδό. Διαφορική ρύθμιση του p21 μπορεί να είναι ένας σημαντικός μηχανισμός για τον έλεγχο και να τελειοποιήσουν προτιμησιακές σηματοδότησης εξαρτημένα ή ανεξάρτητα από SMAD με τους πιθανούς προγνωστικούς ενδιαφέρον. Απώλεια σηματοδότηση SMAD έχει συσχετιστεί με αυξημένη μετανάστευση και την απώλεια της καταστολής της ανάπτυξης σε καρκίνο του παχέος εντέρου [22], και δείχνουμε τώρα ένας πιθανός μηχανισμός για τον καρκίνο του παχέος εντέρου, με την οποία σηματοδότηση SMAD μπορεί να παρακαμφθεί μέσω προτιμησιακό σηματοδότηση ακτιβίνη, παρουσιάζοντας μια εξήγηση για την pro -migratory και pro-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις που συνοδεύουν χάνονται σηματοδότησης SMAD.

p21 παίζει ένα σύνθετο ρόλο στον καρκίνο. Οι όγκου κατασταλτικά ιδιότητες του p21 έχουν περιγραφεί στο πλαίσιο της επαγωγής διακοπής της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης και γήρανση και μελέτες σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου έδειξαν ότι η έκφραση ρ21 συσχετίζεται με θετική διάγνωση [10]. Σύμφωνα με την παραπάνω διαπίστωση, αρκετές μελέτες για τον καρκίνο του παχέος εντέρου αποκάλυψε μια σχέση μεταξύ p21 ρύθμιση προς τα κάτω και τη μετάσταση, καθώς και η κακή επιβίωσης [30], [31], [32] [33], ωστόσο, ορισμένες εκθέσεις δείχνουν προς ένα διττό ρόλο σε διάφορες καρκίνους με την αύξηση του p21 συσχετίζεται με κακή έκβαση [34], [35].

Εδώ, αναφέρουμε έναν σημαντικό αριθμό πρωτογενών καρκίνων του παχέος εντέρου με την απώλεια των πυρηνικών p21, η οποία συσχετίζεται με την παρουσία της ACVR2 και απουσία TGFBR2 . Αυτό είναι σύμφωνο με μας

in vitro

δεδομένων, όπου δείχνουμε προς τα κάτω ρύθμιση του p21 στο πλαίσιο της ενισχυμένης Smad4 ανεξάρτητη σηματοδότηση που προκαλείται από ακτιβίνης. Είναι επίσης συνεπές με την έννοια του απόντος αυξορρύθμιση της ρ21 μετά κατάργηση του άξονα ΤΟΡβ /Smad4, η οποία μπορεί να εξηγηθεί από knockdown του Smad4, όπως στα πειράματα μας, αλλά και από την απουσία TGFBR2, όπως φαίνεται στα δείγματα καρκίνου. Οι λειτουργικές συνέπειες που θα περιμένατε από μειωμένα επίπεδα p21, σε συνδυασμό με τη διατήρηση των ACVR2 και την απώλεια της TGFBR2 με βάση τα δεδομένα μας είναι αυξημένη μετανάστευση μέσω Smad4-ανεξάρτητη σηματοδότηση και την απώλεια της καταστολής της ανάπτυξης μέσω του /Smad4 άξονα TGFβ /p21. Ανεξάρτητα από την επίδραση στην καταστολή της ανάπτυξης, η οποία μόνη έχει βρεθεί ότι είναι ένας αδύναμος προγνωστικός δείκτης σε πολλούς καρκίνους [36], η κατάσταση του υποδοχέα ACVR2 + /TGFBR2- συνδέονται με την απώλεια των σημείων πυρηνικών p21 σε ένα προ-μεταστατικό και συνεπώς πιο επιθετικό καρκίνο φαινότυπο. Αυτό είναι συνεπές με προηγούμενα ευρήματα που δείχνουν ότι η απώλεια του ρ21 συνδυάζεται με χειρότερη έκβαση σε διάφορους τύπους καρκίνου [10]. Ενώ άλλα μονοπάτια σηματοδότησης μπορεί να κατευθύνει p21 εντοπισμού, τα δεδομένα μας δημιουργήσει τη βάση για την περαιτέρω αξιολόγηση της ακτιβίνης και την κατάσταση των υποδοχέων TGFβ σε συνεργασία με την p21 εντοπισμού για την πρόβλεψη του αποτελέσματος και την ανταπόκριση στη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Εν ολίγοις, μας δεδομένα δείχνουν ότι TGFβ είναι ένας πιο ισχυρός διεγέρτης της καταστολής ανάπτυξης, ενώ η ακτιβίνη είναι ένας πιο ισχυρός επαγωγέας της απόπτωσης. Περαιτέρω, η καταστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση από τους δύο συνδέτες εξαρτώνται από Smad4 και ρ21. Ωστόσο, η ακτιβίνη ρυθμίζει προς τα κάτω πρωτεΐνη πυρηνικής ενέργειας και των συνολικών p21 σε Smad4-ανεξάρτητο τρόπο, σε συνδυασμό με την αυξημένη ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση του πρωτεασώματος που συνδέονται με την αυξημένη μετανάστευση. ΤΟΡβ αφετέρου ρυθμίζει προς τα πάνω την πυρηνική ρ21 σε ένα Smad4 τρόπο εξαρτώμενο να επηρεάσει την ανάπτυξη σύλληψης και μπορεί παράκαμψης p21 να επηρεάζει τη μετανάστευση. Περαιτέρω, οι πρωτογενείς καρκίνους του παχέος εντέρου δείχνουν την έκφραση του p21 απόκλιση συνεπής με

ACVR2 /TGFBR2

κατάσταση των υποδοχέων τους. Συμπερασματικά, αναφέρουμε ρ21 ως επηρεάζονται διαφορετικά ακτιβίνης /στόχων του TGFβ και μεσολαβητής του συνδέτη συγκεκριμένες λειτουργίες στον καρκίνο του παχέος εντέρου, η οποία θα μπορούσε να αξιοποιηθεί για τη μελλοντική διαστρωμάτωση του κινδύνου και θεραπευτική παρέμβαση.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Πανεπιστημίου της Βόρειας Καρολίνας νοσοκομεία. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση για τη συλλογή των δειγμάτων, ως μέρος της IRB έγκριση σύμφωνα με διεξαχθεί Βόρεια Καρολίνα παχέος Μελέτης του Καρκίνου (NCCCS), όπως αναφέρονται παρακάτω. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Northwestern University Institutional Review (IRB # STU00020989). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες.

Δείγματα Ασθενών

όγκων του παχέος εντέρου προοπτικά που συλλέγονται στο πλαίσιο IRB έγκριση ως μέρος του παχέος Μελέτης του Καρκίνου Βόρεια Καρολίνα (NCCCS), μια βασισμένη στον πληθυσμό, υπόθεση -Έλεγχος μελέτη που περιλαμβάνει 503 ασθενείς [14], [15]. Για τη μελέτη αυτή, 15 δείγματα ασθενών με άφθονη όγκου και φυσιολογικό ιστό επιλέχθηκαν τυχαία. Για επαλήθευση, συλλέξαμε ένα επιπλέον 41 συνεχόμενες παχέος δείγματα καρκίνου από το Πανεπιστήμιο Northwestern στο πλαίσιο των θεσμικών IRB έγκριση (IRB # STU00020989) (Πίνακας S1). Όλες οι όγκοι ήταν σταθεροποιημένα με φορμαλίνη, ενσωματωμένα σε παραφίνη και κόπηκαν σε τομές 5 μm.

Καρκίνος του παχέος εντέρου Κυτταρικές Γραμμές

SW480 κύτταρα (ATCC, Manassas, VA) διατηρήθηκαν σε Iscove τροποποιημένο κατά Dulbecco και FET κύτταρα (γενναιόδωρο δώρο από τον Michael Brattain, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα, ΝΕ [16]) σε F12 /τροποποιημένου μέσου Eagles του Dulbecco (αμφότερα Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό ορό και πενικιλλίνη G βοοειδών [100 U /ml] /στρεπτομυκίνη [100 μg /ml] (Invitrogen). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2. Όλα τα κύτταρα στερήθηκαν τον ορό για 24 ώρες πριν από τον πειραματισμό για κατά προσέγγιση το συγχρονισμό του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα ελέγχθηκαν για μόλυνση μυκοπλάσματος χρησιμοποιώντας το PCR Mycoplasma Detection Set (Takara, Otsu, Japan) και επικυρώνονται από STR προφίλ χρησιμοποιώντας το Σύστημα PowerPlex 1.2 (Promega, Madison, WI).

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

ακτιβίνη Α ανασυστάθηκε σε PBS, TGFβ1 σε 4 mM HCl σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (και τα δύο R &? D, Minneapolis, ΜΝ) και χρησιμοποιήθηκαν σε τελικές συγκεντρώσεις των 25 ng /ml και 10 ng /ml όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], [18], [19], [20]. MG-132 (Calchemie, Darmstadt, Germany) χρησιμοποιήθηκε για την αναστολή του πρωτεασώματος. Για ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις, χρησιμοποιήσαμε μια κατσίκα πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι ACVR2 (1:50) (ab10595, Abcam, Cambridge, ΜΑ), όπως επίσης και μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού έναντι TGFBR2 (1:50) (ab78419, Abcam) και p21 (1: 150) (sc-817, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Για στύπωμα Western, p21 (# sc-469) (1:250) (Santa Cruz, Biotechnology), α-τουμπουλίνης (# 3873), Η3 ιστόνης (# 9715) (αμφότερα Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), και GAPDH