PLoS One: ετεροτριμερείς G-πρωτεΐνη, Οα16, είναι ένα κρίσιμο καθοδικός τελεστής της μη Canonical σηματοδότηση Wnt και ένας ισχυρός αναστολέας της μεταμορφωμένη κυτταρικής ανάπτυξης σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Cancer

Ιούλιος 7th, 2011 elhealth του καρκίνου άρθρα

Αφηρημένο

G-πρωτεΐνες-σε συνδυασμό υποδοχέων (GPCR) είναι η μεγαλύτερη οικογένεια μορίων κυτταρικής επιφάνειας που παίζουν σημαντικό ρόλο /s σε έναν αριθμό βιολογικών και παθολογικών διαδικασιών συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων. Προγενέστερες μελέτες έχουν τονίσει τη σημασία των Wnt7a σηματοδότηση μέσω του συγγενούς υποδοχέα του Frizzled9, ενός GPCR, την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, και την αναστροφή μετασχηματισμένου φαινοτύπου σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα πρωτίστως μέσω της ενεργοποίησης του καταστολέα όγκου, ΡΡΑΚγ. Ωστόσο, οι G-πρωτεΐνη τελεστές που ζευγάρι σε αυτό το σημαντικό μονοπάτι ογκοκατασταλτικό δεν έχουν ταυτοποιηθεί και είναι πιθανών θεραπευτικό ενδιαφέρον. Σε αυτή τη μελέτη, με τη χρήση δύο ανεξάρτητων Wnt7a /Frizzled9 ειδικά ανάγνωσης-outs, εντοπίζουμε G

α16 ως νέου καθοδικός τελεστής του Wnt7a /Frizzled9 σηματοδότησης. Είναι ενδιαφέρον, G

έκφραση α16 είναι σοβαρά ρυθμίζεται προς τα κάτω, τόσο στα επίπεδα αγγελιοφόρου RNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης, σε πολλούς μη μικροκυτταρικό καρκίνο κυτταρικές σειρές πνεύμονα. Επιπλέον, μέσω του ειδικού γονιδίου νοκ-κατεβάζει και έκφραση ΘΤΡάσης ανεπάρκεια μορφές (Q212L) του G

α16, μπορούμε επίσης να καθιερώσουν G

α16 ως νέου ρυθμιστή της μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και αγκύρωση-ανεξάρτητο κυτταρική ανάπτυξη. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δεν καθορίζουν μόνο τη σημασία του G

α16 ως κρίσιμο καθοδικός τελεστής της μη κανονικής μονοπάτι σηματοδότησης Wnt, αλλά και ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο για τη θεραπεία του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα.

Παράθεση: Avasarala S, Bikkavilli RK, Van Scoyk Μ, Zhang W, Lapite Α, Hostetter L, et al. (2013) ετεροτριμερείς G-πρωτεΐνη, G

α16, είναι ένα κρίσιμο καθοδικός τελεστής της μη Canonical σηματοδότηση Wnt και ένας ισχυρός αναστολέας της μεταμορφωμένη κυτταρικής ανάπτυξης σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (10): e76895. doi: 10.1371 /journal.pone.0076895

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 29, 2013? Αποδεκτές: 28 Αυγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Οκτωβρίου του 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται από μια Merit Award από το αμερικανικό υπουργείο Υποθέσεων Βετεράνων, Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) χορηγεί R01CA1385282522717 και 5R21CA153268- 02 σε RAW. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συν-συγγραφέας, Δρ Robert Winn είναι μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Wnts εκκρίνονται γλυκοπρωτεΐνες, που τη μεταγωγή σημαντικά γεγονότα μεταγωγής σήματος που διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο, όχι μόνο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των θηλαστικών, αλλά και σε πολλές ανθρώπινες ασθένειες [1 ]. Wnts συνδέονται με τις Frizzled υποδοχείς (Fzds), και να ενεργοποιήσει είτε μια κανονική ή β-κατενίνης εξαρτάται από μονοπάτι ή μη κανονικών ή β-κατενίνης ανεξάρτητη μονοπάτια μέσω του c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK), ρ38 ενεργοποιείται από μιτογόνα πρωτεϊνικής κινάσης (ΜΑΡΚ ) οδού ή οδών υπεροξειδιοσώματος υποδοχέα γ που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή (ΡΡΑΚγ) [2] – [7]. Η ανώμαλη ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt έχει εμπλακεί σε πολλές παθήσεις, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [1], [8]. Έχουμε εντοπίσει προηγουμένως ότι Wnt7a χάνεται σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [5], [6], και την αποκατάσταση της Wnt7a σηματοδότησης σε κυτταρικές γραμμές NSCLC οδηγεί σε αντιστροφή του μετασχηματισμένου φαινοτύπου [6], αποκαλύπτοντας Wnt7a σηματοδότησης ως νέα οδός κατασταλτική του όγκου στον καρκίνο του πνεύμονα. Ωστόσο, ο μηχανισμός του Wnt7a μεταγωγής σήματος από την μεμβράνη πλάσματος προς το κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος.

Η υπεροικογένεια του G-πρωτεΐνη υποδοχέων (GPCRs) είναι η μεγαλύτερη γνωστή οικογένεια πρωτεϊνών στο γονιδίωμα των θηλαστικών [9] και της δυσλειτουργίας τους σχετίζεται με μια σειρά από διαδεδομένες ανθρώπινων ασθενειών. Στην πραγματικότητα, οι αναδυόμενες πειραματικά και κλινικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι GPCRs έχουν ένα κρίσιμο ρόλο όχι μόνο στην ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση, αλλά και σε πολλές άλλες ανθρώπινες ασθένειες, καθιστώντας GPCRs τους μεγαλύτερους στόχους για τις τρέχουσες θεραπευτικοί παράγοντες [10]. Έχει προηγουμένως δειχθεί ότι οι GPCRs που συνδέονται με αυτοκρινή ανάπτυξη σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC, [11], [12]). Οι Frizzleds ορθά περιλαμβάνονται στην G-πρωτεΐνη υποδοχέα που συζευγνύεται (GPCR) που εμφανίζουν δομή επτά διαμεμβρανική περιοχή, η ευαισθησία σε τοξίνη κοκκύτη και διαμόρφωση του ενδοκυτταρικού ασβεστίου. Είναι ενδιαφέρον, υπάρχουν δέκα διαφορετικές Fzds κλωνοποιηθεί μέχρι σήμερα. Παρά το γεγονός ότι, όλοι οι υποδοχείς Fzd εμφανίζουν παρόμοια heptahelical δομή, παραμένει άπιαστο πώς αυτοί οι υποδοχείς σηματοδοτούν με διαφορετικό κατάντη τελεστές. Ένας άλλος καρδινάλιος ιδιοκτησία των GPCRs είναι ότι σηματοδοτούν μέσω ετεροτριμερείς G-πρωτεΐνες [13] – [19]., Πράγμα που σημαίνει ότι ετεροτριμερείς G-πρωτεΐνες μπορεί να ρυθμίζουν τις επιδράσεις της Fzds

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η αποκατάσταση της Wnt7a /Fzd9 σηματοδότηση ανέστειλε τόσο κυτταρικού πολλαπλασιασμού και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, προωθείται κυτταρική διαφοροποίηση, και ανέστρεψε το μετασχηματισμένο φαινότυπο σε κύτταρα NSCLC μέσω της ενεργοποίησης του ΡΡΑΚγ και διέγερση των πρωτεϊνών Ε-καδερίνης [5], [20]. Ωστόσο, η G-πρωτεΐνη /s μεσολάβηση της αντι-ογκογόνο ρόλο του Wnt7a /Fzd9 σηματοδότηση παραμένει άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε την ενεργοποίηση Wnt7a διεγερμένα ΡΡΑΚγ και Ε-καδερίνη σαν αναγνώσεις και τον προσδιορισμό της ετεροτριμερών G-πρωτεΐνη, G

α16, ως ένα σημαντικό καθοδικός τελεστής του Wnt7a /Fzd9 σηματοδότηση. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρούμε επίσης μειωμένη έκφραση του G

α16? τόσο σε επίπεδο μεταγραφής και στο πρωτεϊνικό επίπεδο, σε πολλές κυτταρικές σειρές NSCLC. Επιπλέον, με τη χρήση ειδικού γονιδίου νοκ κατεβάζει και έκφραση ιδιοσυστατικά ενεργά μεταλλάγματα των πρωτεϊνών G, μπορούμε επίσης να αποδείξει ότι το G

α16 είναι κρίσιμη για Wnt7a /Fzd9 μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης σε μετασχηματισμένα NSCLC. Επιπλέον, μπορούμε επίσης να καθιερώσουν G

α16 ως νέου μεσολαβητή του Wnt7a /Fzd9 μεσολάβηση ενεργοποίηση των ERK5 και κατασταλτικών πυρηνική όγκου υποδοχέα PPARγ. Στο σύνολό τους, G

α16 έχει δειχθεί εδώ για να είναι μία νέα ρυθμιστής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και NSCLC κυτταρική ανάπτυξη αγκύρωση-ανεξάρτητη.

Αποτελέσματα

Ταυτοποίηση των ετεροτριμερών G-πρωτεΐνες Ρύθμιση Wnt7a /Fzd9 σηματοδότησης

Για να αξιολογηθεί η πιθανή εμπλοκή της G-πρωτεΐνης /s σε Wnt7a /Fzd9 σηματοδότησης, κάναμε χρήση μόνιμα ενεργών G

α υπομονάδες των G-πρωτεϊνών που είναι ελλειμματική σε δράση ΟΤΡάσης, και ανιχνεύθηκαν τους συνέπειες σε δύο καθιερωμένες Wnt7a /Fzd9 εξαρτώμενη αναγνώσεις

δηλ.,

PPAR-εξαρτώμενη μεταγραφή γονιδίων και Ε-καδερίνης εξαρτώμενη μεταγραφή γονιδίων σε κυτταρικές σειρές NSCLC [5], [20]. κυτταρικές γραμμές NSCLC (Η157 και H2122) διαμολύνθηκαν παροδικά είτε με κενό φορέα ή ένα πάνελ μόνιμα ενεργών G

α υπομονάδες των πρωτεϊνών G (G

αi2Q205L, G

αoQ205L, G

αqQ209L , G

αzQ205L, G

α12Q229L, ή G

α16Q212L) μαζί με έναν PPAR-Response Element (RE) φορέα αναφοράς λουσιφεράσης. Τα αποτελέσματα της έκφρασης μόνιμα ενεργών πρωτεϊνών G επί PPAR-εξαρτώμενη γονιδιακή μεταγραφή αργότερα προσδιορίζεται με μέτρηση της φωταύγειας στα προϊόντα λύσης κυττάρων (Σχ. 1Α, Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση του G

α16Q212L, αλλά όχι G

αi2Q205L, G

αoQ205L, G

αzQ205L, ή G

α12Q229L, οδήγησε σε τετραπλασιασμό σε PPAR-RE δραστικότητα λουσιφεράσης σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, μια επίδραση παρόμοια με εκείνη του Wnt7a /Fzd9 διεγερμένα PPAR-RE λουσιφεράσης δραστηριότητα μόνο (Σχ. 1Α, Β). Για τους θετικούς μάρτυρες, δεδομένου ότι, Η157 και H2122 κύτταρα έχουν μειωμένη ή καθόλου έκφραση Wnt7a, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με πλασμίδια έκφρασης Wnt7a [5], [20]. κύτταρα Η157 είχαν επιπλέον επιμολυσμένα με Fzd9 πλασμίδιο, όπως το κάνουν όχι για την έκφραση ενδογενούς Fzd9 [5], [20]. Ήταν επίσης ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η έκφραση της G

αqQ209L επίσης προκαλείται από PPAR-RE-λουσιφεράσης δραστηριότητα,

αν

λιγότερο αποτελεσματικά από ό, τι G

α16Q212L (Εικ. 1Α, Β). Οι επιδράσεις της είτε G

α16Q212L ή G

αqQ209L έκφρασης ήταν ειδική για δραστικότητα ΡΡΑΚγ αλλά όχι να ΡΡΑΡδ δραστικότητας, δεδομένου ότι, η έκφραση του G

α16Q212L, G

αqQ209L, ή Wnt7a /Fzd9 σε Η157 και H2122 απέτυχε να διεγείρει δραστικότητα λουσιφεράσης ΡΡΑΡδ-RE, ένας ειδικός ανταποκριτής για ΡΡΑΡδ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δεδομένου ότι, Wnt7a /Fzd9 σηματοδότησης απέτυχε να τονώσει δραστηριότητα ΡΡΑΚα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), εμείς, ως εκ τούτου δεν επιχείρησε να δοκιμάσει τις συνέπειες της G

α16Q212L, G

αqQ209L στην ενεργοποίηση ΡΡΑΚα.

Επιπτώσεις της ουσιαστικά δραστική G

α υπομονάδες για Wnt7a /Fzd9-εξαρτώμενη διαβάστε-άουτ. κυτταρικές γραμμές NSCLC, Η157 (Α) ή H2122 (Β) διαμολύνθηκαν είτε με κενό φορέα, ή ουσιαστικά δραστική G

α υπομονάδες των πρωτεϊνών G σε συνδυασμό με PPAR-RE-λουσιφεράσης και CMV-β-γαλακτοσιδάσης διανύσματα αναφοράς. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα λύθηκαν και οι δραστηριότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. κυτταρικές γραμμές NSCLC, Η157 (C) ή H2122 (D) διαμολύνθηκαν είτε με κενό φορέα, ή ουσιαστικά δραστική G

α υπομονάδες των πρωτεϊνών G σε συνδυασμό με Ε-καδερίνης προαγωγού-λουσιφεράσης-ρεπόρτερ και CMV-β-γαλακτοσιδάση ανταποκριτού φορείς. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα λύθηκαν και οι δραστηριότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Λουσιφεράσης τιμές ομαλοποιήθηκαν σε τιμές CMV-β-γαλακτοσιδάση και αντιπροσωπεύθηκαν στο γράφημα. Ουσιαστικά δραστική

δραστηριότητα υποστηρικτής α υπομονάδα G-επαγόμενη PPRE-εξαρτώμενη μεταγραφή του γονιδίου ή E-cadherin εκπροσωπήθηκαν ως φορές μεταβολής πάνω από το κενό φορέα ελέγχου. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM τριών ξεχωριστών πειραμάτων. **

& lt? 0,01? έναντι κενός φορέας μάρτυρας.

Ε-καδερίνης είναι ένα πολύ γνωστό δείκτη διαφοροποίησης επιθηλιακών [21], [22] και έχει προηγουμένως δειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός στόχος για κατάντη τόσο Wnt7a /Fzd9 σηματοδότηση και έκφραση ΡΡΑΚγ σε NSCLC [6], [23]. Ως εκ τούτου, αξιολόγησε επίσης τις επιπτώσεις της ουσιαστικώς δραστικής G-πρωτεΐνες στη δραστικότητα προαγωγού Ε-καδερίνης σε κύτταρα NSCLC (Η157 και H2122). Παρόμοια με τις επιδράσεις στην δραστικότητα ΡΡΑΚγ, η έκφραση του G

α16Q212L προκάλεσε μια ισχυρή αύξηση της δραστηριότητας προαγωγού Ε-καδερίνης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν σε σύγκριση με τα κενά στοιχεία ελέγχου φορέα (Σχ. 1C, D). Τα αποτελέσματα του G

αqQ209L έκφραση για τη δραστηριότητα υποκινητή Ε-καδερίνης, αν και σημαντική, ήταν λιγότερο ισχυρή από εκείνη του G

α16Q212L έκφραση (Σχ. 1C, D). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν μια ισχυρή σύνδεση των πρωτεϊνών G, G

α16 και G

αq, με την ενεργοποίηση του ΡΡΑΚγ και αυξημένη κυτταρική διαφοροποίηση, όπως φαίνεται από την αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης.

έκφραση α16 χάνεται στα NSCLC

Έχουμε εντοπίσει G

α16 και G

αq ως σημαντικοί μεσολαβητές των PPARγ και της έκφρασης Ε-καδερίνης σε κυτταρικές σειρές NSCLC (Εικ. 1). Ήταν ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι τόσο G

α16 και G

αq ανήκουν στην οικογένεια Gq των G-πρωτεϊνών. Ωστόσο, δεδομένου ότι G

αqQ209L έκφραση όχι μόνο έδειξε λιγότερο ισχυρά επηρεάζει τη δραστηριότητα ΡΡΑΚγ και την έκφραση Ε-καδερίνης, αλλά είχε επίσης κακή και ασυνεπή αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού NSCLC και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων (τα δεδομένα δεν φαίνονται), εστιάσαμε στην αξιολόγηση της ρόλος του G

α16, αλλά όχι G

αq. Προκειμένου να καθοριστεί έναν πιθανό ρόλο για το G

α16 στον NSCLC, εμείς ανιχνεύθηκαν πρώτα τα επίπεδα έκφρασης του G

α16 σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών NSCLC χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR (qPCR, Σχ. 2Α). Για αυτά τα πειράματα, ολικό RNA εξήχθη από μη μετασχηματισμένα πνεύμονος βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (Beas2B), αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (Α549, H2122), πλακώδες καρκίνωμα (Η157) και μεγάλες κυτταρικές γραμμές καρκινώματος (H661 και Η1299), αντίστροφη μεταγραφεί και ο cDNAs χρησιμοποιήθηκαν αργότερα για τη μέτρηση των επιπέδων του G

έκφραση α16 (Εικ. 2Α). Είναι ενδιαφέρον, G

έκφραση α16 σοβαρά εξασθενημένη σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν NSCLC σε σύγκριση με μη-μετασχηματισμένα βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων (Beas2B, Σχ. 2Α). Προσδιορίσαμε επίσης τα επίπεδα πρωτεΐνης G

α16 στα μη μετασχηματισμένα πνεύμονος βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (Beas2B) και κυτταρικές γραμμές NSCLC χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ειδικό για G

α16 (Εικ. 2Β)

. Κηλίδωση Western κυτταρολυμάτων NSCLC αποκάλυψε πλήρη απώλεια της έκφρασης του G

α16 (Εικ. 2Β). Αν και δεν υπάρχει έκφραση ανιχνεύσιμο mRNA, Η157 κύτταρα εμφάνισαν κάποια G

έκφραση της πρωτεΐνης α16. Μόνο η κερδοσκοπία, η ανιχνεύσιμη έκφραση του G

α16 σε Η157 μπορεί να οφείλεται σε χαμηλό κύκλο εργασιών πρωτεΐνη. Αντιθέτως, κυτταρικές γραμμές NSCLC και Beas2B εξέφρασαν παρόμοια επίπεδα G

αo (Εικ. 2Β), το G-πρωτεΐνη που είναι ειδικά για το β-κατενίνης εξαρτώμενη οδό σηματοδότησης [2], [24]. Δεδομένου ότι, η απώλεια της ετεροζυγωτίας (ΑΕ) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (ΕΠΠΕ), μπορούμε επίσης να αναζητηθούν ΑΕ (κατά διαστήματα έντασης γονότυπος) στο GNA15 /16 τόπου (G

α16) στο καρκινικό κύτταρο πνεύμονα μας γραμμές χρησιμοποιώντας το εργαλείο CONAN (Copy Number Analysis) (https://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP/conan/) από το Sanger Cancer Genome έργου. Θα μπορούσαμε να ανιχνεύσει ΑΕ σε Η157, Α549, H2122 και H661. Επιπλέον, μπορούμε επίσης να αναζητηθεί σωματικά παραλλαγές αριθμού αντιγράφων (CNV) σε GNA15 /16 locus σε ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα. Για το σκοπό αυτό, τα δεδομένα CNV σε 493 αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα και σε ασθενείς ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα 416 του πνεύμονα είχαν κατεβάσει από τον καρκίνο Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov/) του έργου. οι εκτιμήσεις του αριθμού αντιγράφων του γονιδίου επιπέδου αργότερα επεξεργασία χρησιμοποιώντας GISTIC2 [25] και του αγωγού firehose TCGA. Εντυπωσιακά, η κατάσταση μετάλλαξης του GNA15 /16 locus ήταν 1,22% για ομόζυγα διαγραφές και 53,14% για την απλή διαγραφές αντίγραφο σε ανθρώπους ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα και 0,96% για την ομόζυγη διαγραφές και 41,34% για την απλή διαγραφές αντίγραφο σε ασθενείς πλακώδες καρκίνωμα ανθρώπινου πνεύμονα. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν περαιτέρω ενδείξεις για την απώλεια του G

α16 σε καρκίνους του πνεύμονα.

Α, πραγματικού χρόνου PCR αναλύσεις της έκφρασης του G

α16 σε μη μετασχηματισμένα και NSCLC κυτταρικές σειρές. Ολικό RNA εξήχθη από μη μετασχηματισμένη κυτταρική γραμμή (Beas2B) ή κυτταρικές σειρές NSCLC (Η157, H2122, Α549, H661 και Η1299) και G

έκφραση α16 ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το νόημα: caccacgctagcctggtcatg και αντι-νόημα: εκκινητές gcgcccttcttgctgccctcggg . β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για ομαλοποίηση. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM τριών ξεχωριστών πειραμάτων που έγιναν εις διπλούν.

##,

& lt? 0,01? έναντι του ελέγχου (Beas2B). Β, Ανάλυση κηλίδας Western των G

έκφραση α16 σε μη-μετασχηματισμένα και NSCLC κυτταρικές σειρές. Ίσες ποσότητες συνολικά κυτταρολύματα ενός μη μετασχηματισμένη κυτταρική γραμμή (Beas2B) ή κυτταρικές σειρές NSCLC (Η157, H2122, Α549, H661 και Η1299) διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν επί κηλίδων νιτροκυτταρίνης και τα «κηλίδες» ήταν αργότερα, ανιχνεύθηκαν με είτε αντι-G

α16, αντι-G

αo ή αντι-β-ακτίνης αντισώματα.

Ο ρόλος των G

α16 στον NSCLC κυτταρικού πολλαπλασιασμού και Anchorage- ανεξάρτητη ανάπτυξη κυττάρων

Προηγούμενες μελέτες απέδειξαν έναν σημαντικό ρόλο για ΡΡΑΚγ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC, μετασχηματισμένα ανάπτυξη, μετάσταση, και επιθηλιακή διαφοροποίηση [23], [26]. Ομοίως, ιδρύσαμε επίσης τη σημασία της Wnt7a /Fzd9 σηματοδότησης σε μειωμένη μετατραπεί ανάπτυξη και την αύξηση της κυτταρικής διαφοροποίησης στον NSCLC, μέσω της επαγωγής του PPARγ [5], [20]. Αν G

α16 είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής του Wnt7a /Fzd9 σηματοδότηση, έχουμε λόγο ότι G

α16 μπορούσε δυνητικά να μεσολαβούν την κυτταρική ανάπτυξη μετασχηματισμένο σε NSCLC. Για να ανακρίνουν την ειδική συμμετοχή του G

α16 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC και να μετατραπεί κυτταρική ανάπτυξη, χρησιμοποιήσαμε δύο προσεγγίσεις: (1) τις επιπτώσεις των μικρών RNAs παρεμβολών (siRNAs) ειδικά για το G

α16 και (2) έκφραση μιας συστατικώς δραστικής G

α16Q212L. RNAs μικρές παρεμβολές (siRNAs) που στοχεύουν ειδικά είτε G

α16 ή G

αo σχεδιάστηκαν, ελέγχθηκαν για την ειδικότητα τους, και στη συνέχεια να χρησιμοποιηθούν για να καταστείλουν επιλεκτικά G

α16 ή G

αo στα κύτταρα Beas2B. Τα αντιδραστήρια siRNA καταστέλλεται ειδικά είτε G

α16 ή G

αo, επιτυγχάνοντας 70% ή περισσότερο μείωση στην έκφραση της κάθε πρωτεΐνης (Εικ. 3Α). Κωδικοποιημένα siRNAs που σχεδιάστηκε από τον εμπορικό προμηθευτή εξετάστηκαν ως μάρτυρες σε ορισμένα υποσύνολα? που δεν έδειξε την ικανότητα να καταστείλουν είτε G

α16 ή G

αo έκφρασης (Εικ. 3Α). Θεραπεία της μη μετασχηματισμένων βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (Beas2B, με G

έκφραση α16) με G

α16-ειδική siRNAs αύξησε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όπως προσδιορίζεται με κλωνογόνο (Σχ. 3Β) και δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρου MTS (Σχ. 3C). Ενώ, η θεραπεία των κυττάρων Beas2B με G

αo ειδικά siRNAs, ένα G-πρωτεΐνη που είναι ειδικό για β-κατενίνης εξαρτώμενη οδό σηματοδότησης [2], [24], δεν είχε καμία ή μέτρια επίδραση στα ποσοστά πολλαπλασιασμού των κυττάρων, σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου αντιμετωπίζονται siRNA, όπως καθορίστηκε με κλωνογόνο (Σχ. 3Β) και MTS δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχ. 3C), υποδεικνύοντας μία ειδική σύνδεση της G

α16 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC. Αν η υπόθεση μας ότι η G

α16 μεσολαβεί τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό NSCLC ήταν αληθής, τότε η έκφραση μιας συστατικώς δραστικής, ΟΤΡάσης ανεπάρκεια (Q212L) μετάλλαξη του G

α16 σε κύτταρα NSCLC θα πρέπει να οδηγήσει σε μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ακόμη και εν απουσία του Wnt7a. Πράγματι, η παροδική έκφραση του G

α16Q212L, αλλά όχι G

αoQ205L, σε H2122 κυττάρων οδήγησε σε μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό όπως προσδιορίζεται με κλωνογόνο (Σχ. 3D), MTS δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχ. 3Ε), και /ή 5-ημερών ανάλυση καμπύλης ανάπτυξης των κυττάρων (Σχ. 3F). Επιπλέον, σταθερή έκφραση του G

α16Q212L σε H2122 κύτταρα ανέστειλε επίσης την ικανότητα των H2122 κύτταρα να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ, ένα

in vitro

μέτρο του κυτταρικού μετασχηματισμού (Σχ. 3G). Έτσι, χρησιμοποιώντας πολλές ξεχωριστές και ισχυρές δοκιμασίες, δείχνουμε ότι η G

α16 αλλά όχι G

αo ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και NSCLC μετασχηματισμένο κύτταρο ανάπτυξης.

A. κύτταρα Beas2B επιμολύνθηκαν είτε με έλεγχο siRNA ή siRNAs ειδικά G

α16 ή G

αo. Ολικό RNA απομονώθηκε και αναλύθηκε για την έκφραση του G

α16 ή G

αo χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR. Ομαλοποιημένη G

α16 ή G

αo επίπεδα mRNA με εκείνη του mRNA β-ακτίνης εκπροσωπήθηκαν στις γραφικές παραστάσεις.

##,

& lt? 0,01? έναντι του ελέγχου siRNA. κύτταρα Beas2B επιμολύνθηκαν είτε με siRNA έλεγχο ή siRNAs-ειδικό για G

α16 ή G

αo και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων τα ποσοστά αργότερα προσδιορίζεται είτε με τη χρήση ενός κλωνογονική δοκιμασία (Β) ή μία δοκιμασία MTS (C) όπως περιγράφεται στο οι μέθοδοι. Άνω του πίνακα αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM από δύο ανεξάρτητους πολύ επαναλήψιμα πειράματα, ενώ εκπρόσωπος εικόνες που εμφανίζονται στο κάτω πάνελ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM από τρεις ανεξάρτητες ιδιαίτερα αναπαραγώγιμη πειράματα. *,

& lt? 0,05? **

& lt? 0,01? έναντι του ελέγχου siRNA. κύτταρα H2122 επιμολύνθηκαν είτε με κενό φορέα ή ουσιαστικά δραστική G

α16Q212L ή G

αoQ205L φορείς έκφρασης και οι ρυθμοί πολλαπλασιασμού των κυττάρων αργότερα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας είτε κλωνογονική δοκιμασία (D), μία δοκιμασία MTS (Ε) ή πέντε- ημέρα ανάλυση καμπύλης ανάπτυξης των κυττάρων (F) όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Άνω του πίνακα αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM από δύο ανεξάρτητους πολύ επαναλήψιμα πειράματα, ενώ εκπρόσωπος εικόνες που εμφανίζονται στο κάτω πάνελ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM από τρεις ανεξάρτητες ιδιαίτερα αναπαραγώγιμη πειράματα.

& lt? 0,05? G, H2122 κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με κενό φορέα ή ουσιαστικά δραστική G

α16 Q212L και τις ικανότητες των επιμολυσμένων κυττάρων να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ αργότερα ανιχνεύθηκαν. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM από τρεις ανεξάρτητες ιδιαίτερα αναπαραγώγιμη πειράματα.

##,

& lt? 0,01? σε σχέση με άδειο φορέα ελέγχου.

Wnt7a διεγείρεται ERK5 ενεργοποίηση είναι G

α16 Εξαρτημένων

Εμείς προηγουμένως παρατηρηθεί ότι η έκφραση Wnt7a /Fzd9 σε NSCLC κύτταρα οδηγεί σε ισχυρή ενεργοποίηση των ERK5 [5]. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν ανασυνδυασμένη hWnt7a διέγερση των κυττάρων Beas2B είναι επίσης ικανή να ενεργοποιεί ERK5? με ανοσοκηλίδωση στυπώματα γέλης SDS-PAGE με αντισώματα ειδικά για φωσφο-ERK5 (Σχ. 4Α). Η διέγερση των καλλιεργειών με Beas2B rWnt7a αποτέλεσμα την ταχεία ενεργοποίηση των ERK5 κορύφωση εντός 15 λεπτών από τη θεραπεία (Εικ. 4Α). Για να διαπιστωθεί αν σηματοδότησης Wnt7a /ERK5 λειτουργούσε μέσω G

α16, κάναμε χρήση του G

α16-ειδικά siRNAs (Εικ. 4Β). Σε αυτές τις μελέτες, τα κύτταρα Beas2B συν-επιμολύνθηκαν με G

α16-ειδική siRNAs είτε με ή χωρίς φορείς έκφρασης Wnt7a (Εικ. 4Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία με G

α16-ειδική siRNAs κατάργησε την ικανότητα του να διεγείρει Wnt7a ενεργοποίηση ERK5 (Εικ. 4Β). Εάν εξάντληση του G

α16 θα μπορούσαν να μπλοκάρουν Wnt7a διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ERK5, τότε η έκφραση του ιδιοσυστατικά ενεργή μορφή της G

α16 (Q212L) θα πρέπει να επάγει την ενεργοποίηση ERK5. Προκειμένου να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, κάναμε χρήση ενός MEF2-C-εξαρτώμενη κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης [27]. Αυτό ρεπόρτερ μετρά τη δραστηριότητα κινάσης ERK5, καθώς είναι υποχρεωτικά για την ενεργοποίηση MEF2-C-εξαρτώμενη γονιδιακή μεταγραφή [27]. Πρόσκαιρη έκφραση ιδιοσυστατικά ενεργή μορφή της G

α16Q212L μαζί με MEF2-C-λουσιφεράσης πλασμίδια ανταποκριτές οδήγησε σε ισχυρή αύξηση της λουσιφεράσης δραστηριότητες όπως προσδιορίζεται στις δύο κυτταρικές σειρές NSCLC Η157 (Εικ. 4C) και H2122 (Εικ. 4D). Επιπλέον, ο G

α16Q212L επαγόμενη MEF2 C-εξαρτώμενη-δραστηριότητες λουσιφεράσης ήταν ευαίσθητα στη θεραπεία της PD98059, η οποία αναστέλλει ΜΕΚ 1, 2, και 5 (Σχ. 4C, D), αλλά όχι από τον αναστολέα ΜΕΚ1 /2 U0126 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), υποδεικνύοντας την ειδικότητα της δοκιμασίας μας. Στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν σαφώς ότι G

λειτουργία α16 είναι κρίσιμη για Wnt7a μεσολάβηση ενεργοποίησης ERK5.

Α, κύτταρα Beas2B στερήθηκαν ορού για τζελ 2-PAGE και αργότερα ανιχνεύτηκαν για την ενεργοποίηση ERK5 ανιχνεύοντας το στυπώματα νιτροκυτταρίνης με αντι-pERK5 αντισώματα και κανονικοποιημένο για ίση φόρτωση με ανίχνευση με αντι-ERK5 αντισώματα. Β, κύτταρα Beas2B επιμολύνθηκαν είτε με siRNA ελέγχου ή G

α16 ειδικά siRNAs μαζί με ή χωρίς φορέα έκφρασης Wnt7a. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα λύθηκαν και αναλύθηκαν για την ενεργοποίηση ERK5 ανιχνεύοντας τα στυπώματα με αντίσωμα αντι-pERK5 και αντισώματα ERK5. κυτταρικές γραμμές NSCLC, Η157 (C) ή H2122 κύτταρα (D) διαμολύνθηκαν είτε με κενό φορέα ή G

α16Q212L μαζί με MEF2-C-εξαρτώμενη ανταποκριτή λουσιφεράσης, που ακολουθείται από μια κατεργασία είτε χωρίς είτε με αναστολέα ΜΕΚ PD98059 (20 μΜ ). Μετά από 24 ώρες, τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν για λουσιφεράση δραστηριότητες όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM τριών ξεχωριστών πειραμάτων. **

& lt? 0,01? σε σχέση με άδειο φορέα ελέγχου.

##,

& lt? 0,01? έναντι G

α16 Q212L.

α16 Ρυθμίζει Wnt7a διεγείρεται PPARγ Ενεργοποίηση

επόμενο ανακρίθηκε αν η εξάντληση του G

α16 αποκλείει επίσης η απόσταση κατάντη τελεστή Wnt7a /Fzd9 σηματοδότηση σηματοδότηση

δηλ.,

PPARγ [5]. Η157 και H2122 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με G

α16-ειδική siRNAs είτε με ή χωρίς φορείς έκφρασης Wnt7a και PPAR-RE λουσιφεράσης φορέα αναφοράς (Σχ. 5Α, Β). Η εξάντληση του G

α16, αλλά όχι G

αo, μπλοκάρει επιλεκτικά Wnt7a διεγείρεται ενεργοποίηση ΡΡΑΚγ σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχ. 5Α, Β). Συνεπής με τα αποτελέσματα της G

εξάντληση α16 επί Wnt7a διεγείρεται ενεργοποίηση ΡΡΑΚγ, έκφραση μόνιμα ενεργών G

α16Q212L, αλλά όχι G

αoQ205L, σε Η157 ή H2122 κυτταρικές γραμμές προκάλεσαν μια ισχυρή αύξηση στη δραστικότητα ΡΡΑΚγ ( Σχ. 5C, D). Επιπλέον, G

α16Q212L επαγόμενη αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα επί της ανάπτυξης κυττάρου H2122 καταργήθηκαν από δηλητηρίαση από τα επιμολυσμένα κύτταρα με αναστολέα PPARγ (T007090) τόσο Η157 (Σχ. 5Ε) και κυτταρικές γραμμές H2122 (Εικ. 5F). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν σθεναρά ότι οι αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις του G

α16 στον NSCLC διαμεσολαβούνται μέσω ERK5 (Εικ. 4) και PPARγ (Εικ. 5).

κυτταρικές σειρές NSCLC, Η157 (Α) ή κύτταρα H2122 (Β) επιμολύνθηκαν είτε με siRNA ελέγχου ή G

α16-ειδική siRNAs μαζί με PPAR-RE-λουσιφεράσης και είτε χωρίς είτε με φορέα έκφρασης Wnt7a. Μετά από 48 ώρες, τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν για λουσιφεράση δραστηριότητες όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM τριών ξεχωριστών πειραμάτων. **

& lt? 0,01? σε σχέση με άδειο φορέα ελέγχου.

##,

& lt? 0,01? έναντι Wnt7a. κύτταρα κυτταρικές σειρές NSCLC, Η157 (C) ή H2122 (D) διαμολύνθηκαν είτε με κενό φορέα ή ουσιαστικά δραστική G

α16 Q212L ή G

φορείς αo Q205L έκφρασης μαζί με ανταποκριτή PPAR-RE-λουσιφεράσης. Μετά από 48 ώρες, τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν για λουσιφεράση δραστηριότητες όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM τριών ξεχωριστών πειραμάτων. **

& lt? 0,01? σε σχέση με άδειο φορέα ελέγχου. κυτταρικές γραμμές NSCLC, Η157 (Ε) ή H2122 (F) διαμολύνθηκαν είτε με κενό φορέα ή ουσιαστικά δραστική G

α16Q212L. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με είτε χωρίς αναστολέα PPARγ (T0070907, 10 μΜ) όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. ρυθμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων αργότερα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία MTS όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM από τρεις ανεξάρτητες ιδιαίτερα αναπαραγώγιμη πειράματα.

##,

& lt? 0,01? σε σχέση με άδειο φορέα ελέγχου. **

& lt? 0,01? έναντι G

α16 Q212L + T007090.

Μυθιστόρημα ρόλος για ROR1 /2 στο Wnt7a /Fzd9 Σηματοδοσίας

Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η ενεργοποίηση της Wnt /β-κατενίνης-εξαρτώμενη σηματοδότηση απαιτεί συν-υποδοχείς λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας (LRP5 /6) και το G-πρωτεΐνη, G

αo [24], [28] – [30]. Δεδομένου ότι, έχουμε καθιερώσει G

α16 ως κρίσιμο μεσολαβητή των Wnt7a /Fzd9 σηματοδότησης (Εικ. 1, 2, 3,4), μπορούμε δίπλα αξιολογούνται για το ρόλο του συν-υποδοχείς, αν όχι καθόλου, στη μεσολάβηση Wnt7a /Fzd9 σηματοδότησης. Για τις μελέτες αυτές, Η157 και Η1299 κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με κενό φορέα ή πλασμίδια έκφρασης Wnt7a και Fzd9. Είναι ενδιαφέρον ότι, ανιχνεύοντας τα κυτταρικά λύματα που εκφράζουν Wnt7a /Fzd9 απεκάλυψε μία ισχυρή αύξηση στην έκφραση των ορφανών κινάσης τυροσίνης-πρωτεΐνης υποδοχείς, ROR1 /2 (Σχ. 6Α). Ενώ, ο συν-υποδοχείς καρδινάλιος στο /β-κατενίνης εξαρτώμενη μονοπάτι σηματοδότησης Wnt, LRP6 ή ενεργοποιημένη μορφή του (φωσφο-LRP6-S1490) δεν επηρεάζεται (Σχ. 6Α). Σε ισχυρή υποστήριξη των ευρημάτων μας, Wnt7a /Fzd9 σηματοδότηση παρέλειψε, επίσης, για την τόνωση της δραστηριότητας TOPFLASH, ένα Wnt /β-κατενίνης ειδικά ανάγνωσης-out (Εικ. 6Β). Ενώ, υπό παρόμοιες συνθήκες, Wnt7a /Fzd9 διεγείρεται μια ισχυρή αύξηση της μεταγραφής του γονιδίου PPAR-RE-εξαρτώμενη, όπως αναμενόταν (Εικ. 6C). Συνολικά, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η Wnt7a /Fzd9 μονοπατιού σηματοδότησης, σε αντίθεση με εκείνη του μηχανισμού β-κατενίνης που εξαρτώνται από τη σηματοδότηση, θα μπορούσε να σηματοδοτήσει μέσω της G-πρωτεΐνης, G

α16 και οι συν-υποδοχείς, ROR1 /2.

Α, Η157 και Η1299 κύτταρα είτε επιμολυσμένα με άδειο φορέα ή με φορείς έκφρασης Wnt7a και Fzd9. Μετά από αντισώματα 48-β-ακτίνης. κύτταρα Η157 διαμολύνθηκαν είτε με κενό φορέα ή φορείς έκφρασης Wnt7a και Fzd9 μαζί με είτε ρεπόρτερ M50-TOPFLASH λουσιφεράσης (Β) ή PPAR-RE-λουσιφεράσης (C). Οι θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα αναφοράς M50-TOPFLASH είναι ο φορέας έκφρασης β-κατενίνης και στην περίπτωση του φορέα PPAR-RE-λουσιφεράσης είναι ο φορέας έκφρασης ΡΡΑΚγ. Μετά από 48 ώρες, τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν για λουσιφεράση δραστηριότητες όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM τριών ξεχωριστών πειραμάτων. **

& lt? 0,01? έναντι κενός φορέας μάρτυρας.

Συζήτηση

Wnt7a έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητη για την κανονική διαμόρφωση επιθήλιο και για τη διατήρηση ενός φυσιολογικά επιθηλιακά φαινότυπο στον πνεύμονα [31]. Επιπλέον, η έκφραση Wnt7a συχνά χάνεται σε NSCLC [32]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η εκ νέου έκφραση του Wnt7a αντιστραφεί κυτταρικού μετασχηματισμού, μειωμένη ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, και επαγόμενη από τα επιθηλιακά διαφοροποίησης σε κύτταρα NSCLC μέσω συγγενή υποδοχέα του Fzd9 [5], [20]. Αυτό το αποτέλεσμα προκαλείται, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω ERK5-εξαρτώμενη ενεργοποίηση του ΡΡΑΚγ [5]. Είναι σημαντικό, Wnt7a /Fzd9 δεν ενεργοποιεί την κανονική /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt. Frizzleds, τα μέλη της GPCR υπεροικογένειας [33], παρουσιάζουν πολλά από τα ορόσημα που παρατηρούνται σε όλες σχεδόν τις GPCRs, συμπεριλαμβανομένης της παρουσίας επτά υδρόφοβων διαμεμβρανικών τμημάτων προβλέπεται να σχηματίζει α-έλικες, και τρεις ενδοκυτταρικές θηλιές καθώς και μια κυτταροπλασματική ουρά [33] , [34]. Αξίζει να σημειωθεί, Fzds αναφέρονται επίσης ως στενά συνδεδεμένη με τα μόρια του προσαρμογέα, όπως αυτό της β-αρρεστίνης, μια γνωστή πρωτεΐνη προσαρμογέα που εμπλέκονται στην GPCR de-ευαισθητοποίηση [35] και ρυθμιστές της σηματοδότησης G-πρωτεϊνών (RGS, [ ,,,0],36]).

G-πρωτεΐνες είναι καρδινάλιος να GPCR σηματοδότησης και έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται στην κανονική σηματοδότηση /β-κατενίνης Wnt, μη κανονική Wnt /Ca

2 + /cGMP και επίπεδες οδούς κυτταρικού πολικότητα [34]. Μέχρι στιγμής, G

αo και G

αq δείχθηκαν να είναι κρίσιμη κατά την ανάπτυξη των θηλαστικών, και τερατοκαρκινώματος βλαστικών κυτταρική διαφοροποίηση σε απόκριση προς ογκογόνο Fzd1 διέγερση [24]. Ωστόσο, ο όγκος προστατευτικό ρόλο για G-πρωτεΐνες, αν υπάρχουν, δεν έχουν ταυτοποιηθεί. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε εντοπίσει G

αq οικογένεια των G-πρωτεϊνών όπως μυθιστόρημα κατάντη μεσολαβητών της Wnt7a /Fzd9 μεσολάβηση ενεργοποίηση ERK5 και το ογκοκατασταλτικό γονίδιο PPARγ. Για πρώτη φορά, έχουμε δείξει ότι η G

αq μέλη της οικογένειας, ειδικότερα, G

α16, μπορεί να ενεργοποιήσει μια νέα, μη κανονική σηματοδότηση Wnt. Η καταρράκτη σηματοδότησης κατάντη του G

α πρωτεΐνες περιλαμβάνει ποικίλες και πολύπλοκες κινάσες που τελικά οδηγούν σε ρυθμιζόμενη μεταγραφή γονιδίων και αλλαγές στην κυτταρική φυσιολογία. Κάθε G

αq μέλος της οικογένειας έχει ενοχοποιηθεί στη ρύθμιση ενός ή περισσοτέρων από τα ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) οδούς σε καλλιέργειες κυττάρων, αν και ο ακριβής μηχανισμός /s σηματοδότησης παραμένει ασαφής. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουν επίσης ότι η G

α16 είναι ο καθοδικός τελεστής του Wnt7a /Fzd9 σηματοδότησης που οδηγεί στην ενεργοποίηση της ERK5. Είναι ενδιαφέρον, άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι οι GPCRs επίσης μπορεί να διεγείρει ERK5 μέσω μηχανισμών που εμπλέκουν G

αq και G

α12 /13, ανεξάρτητα από Rho, Rac1 και Cdc42 [37]. Ωστόσο, δεν είδαμε καμία ενεργοποίηση των PPARγ με G

α12 έκφρασης (Εικ. 1). Μέχρι στιγμής, G

αq μεσολάβηση σηματοδότηση ΜΑΡΚ περιορίζεται στην ενεργοποίηση του JNK1 /2 ή ERK1 /2, αλλά όχι ERK5. Στην παρούσα μελέτη, επίσης, δείχνουν ότι ένα μέλος του G

αq οικογένεια, G

α16, ως νέου ρυθμιστή της ERK5. Είναι γνωστό ότι ο G

αq οικογένεια (G

αq, G

α11, G

α14, G

α15 /16), κατά την ενεργοποίηση, δεσμεύει και ενεργοποιεί PLC-β- μεσολάβηση φωσφορικής ινοσιτόλης καταρράκτη σηματοδότησης που οδηγεί σε κινητοποίηση του ασβεστίου και την ενεργοποίηση ΡΚΟα μέσω φωσφολιπιδίου φωσφατιδυλινοσιτόλη διφωσφονικό (ΡΙΡ2), τριφωσφορική ινοσιτόλη (ΙΡ3) και διακυλ γλυκερίνης (DAG, [38]). Στις ίδιες γραμμές, Wnt7a /Fzd9 σηματοδότηση διεγείρεται επίσης PLCβ και PKC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Χρόνιες ασθένειες