Abstract

Η σισπλατίνη ήταν η πιο αποδεκτή φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών για σχεδόν 40 χρόνια. Αν και η πλειονότητα των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών ανταποκρίνονται σε πρώτη γραμμή συνδυασμός πλατίνα χημειοθεραπεία, πολλοί ασθενείς θα αναπτύξουν τη νόσο σισπλατίνη αντίσταση, η οποία είναι εξαιρετικά ταχεία και μοιραία. Αν και έχουν διάφορους μηχανισμούς αντοχής σισπλατίνη προταθεί, τα βασικά μόρια που εμπλέκονται σε τέτοιες αντίσταση δεν έχουν ταυτοποιηθεί. MiRNAs είναι ενδογενώς εκφράζονται μικρό μη-κωδικοποίησης RNAs, τα οποία είναι εξελικτικά συντηρημένες και λειτουργούν ως μετα-μεταγραφική ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης. Δυσλειτουργία του miRNAs έχουν συσχετιστεί με τον καρκίνο έναρξη, την εξέλιξη και την αντίσταση του φαρμάκου. Οι ογκογόνο miRNA-21, ένα από τα καλύτερα μελετημένα miRNAs, υπερεκφράζεται σε όλες σχεδόν τις ανθρώπινων καρκίνων. Ωστόσο, δεν έχει εκτιμηθεί η ρύθμιση του miR-21 σε ανθεκτικά σισπλατίνη καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Σε αυτή τη μελέτη, μετρήθηκε η έκφραση miR-21 με πραγματικού χρόνου PCR και βρέθηκε προς τα πάνω ρύθμιση miR-21 σε ανθεκτικά σισπλατίνη σε σύγκριση με σισπλατίνη ευαίσθητα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Χρωματίνης μελέτες ανοσοκαταβύθισης έδειξαν την σύνδεση του παράγοντα μεταγραφής c-Jun στις περιοχές προαγωγέα DNA pri-mir-21. Ο αποκλεισμός της JNK-1, η κύρια ενεργοποιητής της φωσφορυλίωσης c-Jun, μείωσε την έκφραση των προ-mir-21 και αύξησε την έκφραση των γνωστών γονιδίου στόχου της, PDCD4. Η υπερέκφραση του miR-21 σε σισπλατίνη ευαίσθητα κύτταρα μειωμένα επίπεδα PDCD4 και αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τέλος, με στόχο miR-21 μείωσε την κυτταρική ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή των ανθεκτικών σισπλατίνη καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ΙΝΚ-1 /c-Jun /miR-21 οδού συμβάλλει στην αντίσταση σισπλατίνη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και απέδειξαν ότι miR-21 είναι ένα εύλογο στόχο να ξεπεραστεί η σισπλατίνη αντίσταση

Παράθεση:. Echevarría -Vargas IM, Valiyeva F, Vivas-Mejía ΡΕ (2014) Προς τα πάνω ρύθμιση του miR-21 σε ανθεκτικά στη σισπλατίνη καρκίνου των ωοθηκών μέσω JNK-1 /c-Jun Pathway. PLoS ONE 9 (5): e97094. doi: 10.1371 /journal.pone.0097094

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 2, Ιανουαρίου, 2014? Αποδεκτές: 14 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: May 27, 2014

Copyright: © 2014 Echevarría-Βάργκας et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το ΝΙΗ /NCI (1K22CA166226-01A1) να PEVM, θεσμικών κεφαλαίων σπόρων από το Πανεπιστήμιο του Πουέρτο Ρίκο Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου (PEVM), Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, και Μειονοτικών Βιοϊατρικής υποστήριξης Ερευνών (εκθέσεις MBR) RISE Grant Αριθμός R25- GM061838 (IEV). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικές ενδιαφέρον

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών (OVCA) αντιπροσωπεύει σχεδόν το 3% όλων των καρκίνων στον δυτικό κόσμο [1]. Τυπική θεραπεία για τις γυναίκες με OVCA είναι cytoreduction ακολουθείται από χημειοθεραπεία [2]. Παρά το υψηλό αρχικό ποσοστό απόκρισης σε ενώσεις σισπλατίνη βάση ως την χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής, τα περισσότερα καρκινώματα ωοθήκης υποτροπή [2], [3]. Πασιφανείς μηχανισμοί αντίστασης σισπλατίνη περιλαμβάνουν μειωμένη ενδοκυτταρική συσσώρευση σισπλατίνη, αυξημένα ενδοκυτταρικά επίπεδα ορισμένων μακρομορίων που περιέχουν θείο, και αυξημένη επιδιόρθωση του DNA [4]. Τα στοιχεία δείχνουν ότι η απενεργοποίηση των εγγενών οδούς κυτταρικού θανάτου, η ενεργοποίηση των οδών κυτταρικής επιβίωσης, και απορύθμιση των ογκογονιδίων, ογκοκατασταλτικά γονίδια, και microRNAs, συμβάλλουν στην αντοχή σισπλατίνη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών [3], [5], [6]. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα καθίστανται ανθεκτικά σε θεραπεία σισπλατίνη είναι προς το παρόν άγνωστη.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι φυσικώς απαντώμενα μικρές (21-22 ζεύγη βάσης) μη-κωδικοποίησης RNAs, η οποία αναγνωρίζει κυρίως ο 3 «-UTR περιοχή του αγγελιοφόρου RNA (mRNA) και αναστέλλουν την πρωτεϊνοσύνθεση [7]. Πρόσφατες αναφορές δείχνουν ότι η απορρύθμιση των miRNAs, και τα γονίδια-στόχους τους, να προωθήσουν την έναρξη του καρκίνου, της εξέλιξης και της ανθεκτικότητας στα φάρμακα [6], [8], [9]. Για τους λόγους αυτούς, έχουν miRNAs έχουν προταθεί ως διαγνωστικά, προγνωστικά και στόχους για τη θεραπεία του καρκίνου [10]. Ένα από τα καλύτερα miRNAs μελετών είναι miR-21 η οποία υπερεκφράζεται σε περισσότερους καρκίνους και εμφανίζει ογκογόνο δραστηριότητα [11]. Σε HER2 (+) του μαστού υπερέκφραση του miR-21 ανατίθενται αντίσταση στη θεραπεία με trastuzumab [12]. . Nam et al, βρέθηκε miR-21, miR-203 και miR-205 και υπερεκφράζεται σε ορώδες καρκίνωμα των ωοθηκών σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό των ωοθηκών? miR-21 είναι παρόν σε% δείγματα 85 [13]. Xie et al. παρατήρησε ότι στις Α2780 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, miR-21 ρυθμίζει την υποξία παράγοντα-1α (HIF-1α), και την αντίσταση του paclitaxel [14]. MiR-21 ασκεί τις βιολογικές της ρόλο στοχεύοντας βασικά γονίδια που ελέγχουν την ανάπτυξη των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό. Ωστόσο, σε συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών, το ογκοκατασταλτικό γονίδιο προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο 4 (PDCD4) φαίνεται να είναι ένα από τα πιο σημαντικά λειτουργικά miR-21 στόχων [15], [16], [17]. Ο κεντρικός ρόλος της PDCD4 στον καρκίνο των ωοθηκών υποστηρίζεται περαιτέρω από παρατηρήσεις ότι χαμηλότερα επίπεδα αυτής της ογκοκατασταλτικών συσχετίζεται άμεσα με την κακή πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών [15]. Πιο πρόσφατα, Chan et al. έδειξε ότι το miR-21 υπερεκφράζεται σε σισπλατίνη ευαίσθητα σε σύγκριση με κύτταρα ανθεκτικά σισπλατίνη, και ότι miR-21 αναστολή που προκαλείται απόπτωση και αυξάνει τα επίπεδα PDCD4 [18].

Οι ανάντη μοριακά γεγονότα που ευθύνεται για την υπερέκφραση του miR-21 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών χρειάζεται περαιτέρω μελέτη. Οι εκθέσεις δείχνουν ότι οι-mir-21 pri περιοχές υποκινητή DNA περιέχουν στοιχεία αναγνώρισης για c-Jun και παράγοντες μεταγραφής STAT3 [19]. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, η κουρκουμίνη μείωσε miR-21 μέσω του AP-1 (συγκρότημα μεταγραφικός παράγοντας που αποτελείται από c-Jun και c-Fos, κυρίως) ρύθμιση, και στην ανθρώπινη προμυελοκυτταρική κυτταρική σειρά, HL-60, φορβόλη 12-μυριστικό 13- οξικό (ΡΜΑ) που επάγεται miR-21 έκφραση από την ΑΡ-1 ενεργοποίηση [17], [20]. MiR-21 προς τα πάνω ρύθμιση από ΑΡ-1 παρατηρήθηκε επίσης σε ορισμένες χημειοθεραπεία πλευρά των πληθυσμών των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [21].

Επειδή ο αναγνωρισμένος ρόλος του miR-21 στην έναρξη του καρκίνου, της εξέλιξης και της ανθεκτικότητας στα φάρμακα, ερευνήσαμε το ρύθμιση του miR-21 σε ανθεκτικά σισπλατίνη καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Χρησιμοποιήσαμε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (PCR) και βρήκαν ότι ανθεκτικά σισπλατίνη καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα miR-21 σε σύγκριση με ευαίσθητα κύτταρα σισπλατίνη. Στη συνέχεια αναλύεται ο πιθανός μηχανισμός του miR-21 προς τα πάνω ρύθμιση. Η επεξεργασία των κυττάρων με SP600125, έναν αναστολέα της φωσφορυλίωσης c-Jun, μειωμένη προ-mir-21 έκφραση σε ανθεκτικά σισπλατίνη καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) μελέτες έδειξαν υψηλότερη φωσφορυλίωση c-Jun επίπεδα (ρ-c-Jun) πρωτεΐνη συνδέεται προς την περιοχή προαγωγού PRI-mir-21 DNA σε ανθεκτικά σισπλατίνη σε σύγκριση με σισπλατίνη ευαίσθητα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Η υπερέκφραση του miR-21 σε σισπλατίνη ευαίσθητα κύτταρα, αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μειωμένη τα επίπεδα πρωτεΐνης PDCD4. Απέναντι, miR-21 αναστολέα ολιγονουκλεοτιδίων (antagomir), σημαντική αύξηση ανέστειλε κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και την ικανότητα εισβολής των A2780CP20 κυττάρων. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι προς τα πάνω ρύθμιση της JNK-1 /c-Jun μονοπάτι οδηγεί η παρεκκλίνουσα αύξηση του miR-21, και προτείνει να miR-21 ως πιθανός στόχος για να ξεπεραστεί η αντίσταση σισπλατίνη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

Cisplatin αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ) και ανασυστάθηκε σε 0.9% NaCl. SP600125 (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) ανασυστάθηκε σε 100% DMSO μέχρι τελικής συγκέντρωσης 10 mM. Όταν προστίθεται στα κύτταρα, η τελική συγκέντρωση του DMSO στο μέσο καλλιέργειας ήταν μικρότερο από 0,1%.

Κύτταρα και συνθήκες καλλιέργειας

Τα ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα ωοθηκών SKOV3ip1, HEYA8, και A2780CP20 κύτταρα έχουν περιγραφεί αλλού [22], [23], [24], [25], [26]. Α2780 και A2780CIS κύτταρα αγοράστηκαν από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών Κυττάρων (ECACC). Τα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν

in vitro

σε RPMI-1640 (Thermo Scientific, Logan, UT, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Thermo Scientific) και 0.1% /αντιμυκητιακό διάλυμα αντιβιοτικού (Thermo Scientific) και διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2/95% αέρα. Όλες οι κυτταρικές γραμμές όγκου υποβλήθηκαν σε διαλογή χρησιμοποιώντας μυκόπλασμα παράγοντα απομάκρυνσης όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (Abd Sertotec, NC, USA).

In vitro

δοκιμασίες διεξήχθησαν σε 70-85% πυκνότητα κυττάρων. A2780CP20 κύτταρα (5 × 10

5 κύτταρα /τρυβλίο) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μmol /L SP600125 για οκτώ ώρες. Οι συγκεντρώσεις Cisplatin που αναστέλλει 50% της κυτταρικής ανάπτυξης (IC

50) υπολογίστηκαν μετά από επώαση του φαρμάκου 72-hr (δόσεις cisplatin: 100, 10, 1, 0,1 και 0,01 μΜ, τελικές συγκεντρώσεις). Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με την μπλε χρωστική Alamar όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27].

ανάλυση μικροσυστοιχιών της έκφρασης του γονιδίου

Ολικό RNA απομονώθηκε από Α2780 και A2780CP20 ωοθηκών καρκινικές κυτταρικές σειρές με τη GenElute Mammalian Σύνολο RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich). Η συγκέντρωση του RNA αναγνώσθηκε σε ένα nanodrop. ποιότητα RNA επαληθεύτηκε σε Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Εκατό νανογραμμάρια ολικού RNA χρησιμοποιήθηκαν για την σύνθεση cDNA. Συμπληρωματικές cDNA συντέθηκε, επισημαίνονται, κατακερματισμένη και σε υβριδισμό με την Affymetrix GeneChip Gene 1.0 ST Ανθρωπίνων Array. Μετά από 16 ώρες επώασης στους 45 ° C, οι συστοιχίες πλύθηκαν, χρωματίστηκαν και σαρώνεται (Affymetrix Μοντέλο 3000 scanner), και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Partek Γονιδιωματική Κατάλληλη (Partek, St. Louis, ΜΟ). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Αμφίδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορισθούν οι διαφορές στην έκφραση των γονιδίων (ρ & lt? 0,05 φορές αλλαγή 2). 1359 ανιχνευτές (4%) σετ έδειξε ± 2 φορές αλλαγή μεταξύ A2780CP20 και Α2780 κύτταρα. Πρόσθετο φιλτράρισμα (± 3 φορές την αλλαγή, και η P & lt? 0.003) έδειξε 321 ανιχνευτές (0,96%) άλλαξαν μεταξύ A2780CP20 και Α2780 κύτταρα

απομόνωση RNA και σύνθεση cDNA

Το συνολικό RNA (συμπεριλαμβανομένων των miRNAs. ) απομονώθηκε με τη χρήση του

mir

Βάνα miRNA κιτ απομόνωσης από την Ambion (Technology Life, Grand Island, Νέα Υόρκη). RNA μετατράπηκε σε cDNA με την ενισχυμένη Γρίπη RT κιτ σύνθεσης πρώτου κλώνου από Sigma-Aldrich. Εν συντομία, ολικό RNA (1 μg), 500 μΜ dNTP και 3,5 μΜ ολίγο (dT)

23 αναμείχθηκαν και προστέθηκε νερό μέχρι 10 μL συνολικός όγκος. Τα δείγματα αναμίχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν και θερμαίνεται στους 70 ° C για 10 λεπτά. Το μίγμα αυτό συνδυάζεται με 1 μL ενισχυμένη γρίπης RT, 2 μΙ 10Χ ρυθμιστικό διάλυμα, 1 μL αναστολέα RNase, και νερό έως και 20 μL τελικό όγκο. Τα δείγματα επωάστηκαν στους 25 ° C για 15 λεπτά μετά από 45 ° C για 50 λεπτά. Η σύνθεση του cDNA για τον εντοπισμό ώριμων miRNAs εκτελέστηκε με το κιτ ανίχνευσης All-in-One miRNA qRT-PCR (GeneCopoeia, Rockville, MD). Εν συντομία, μείγμα σύνθεσης cDNA περιείχε 1 μg συνολικού RNA, 1 μΙ πολυ (Α) πολυμεράσης, 1 μL ΚΤ-άση Mix, 5 μL 5Χ PAP /RT ρυθμιστικό διάλυμα και ύδωρ μέχρι 25 μL τελικό όγκο. Η αντίδραση μεταγραφής Revere επωάστηκε στους 37 ° C για 60 λεπτά, και 85 ° C για 5 λεπτά σε ένα θερμικό ανακυκλωτή Veriti (Applied Biosystems, Carlsbad, CA).

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και SYBR- I-based πραγματικού χρόνου PCR

η PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα Verity 96 πηγάδια θερμικό ανακυκλωτή (Applied Biosystems). Εν συντομία, 12,5 μί JumpStart REDTaq Readymix 1X (Sigma), 0,5 μί προς τα εμπρός, και 0.5 μΐ αντίστροφης εκκινητές (0.4 μΜ τελική συγκέντρωση του καθενός), 2 μL του προϊόντος cDNA, και νερό έως τελικό όγκο 50 μΐ. Οι συνθήκες κυκλοποίησης ήταν ένας κύκλος στους 94 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα (μετουσίωση), 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα (αναδιάταξη) και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα (επέκταση). Ένα τελικό στάδιο επέκτασης διεξήχθη στους 72 ° C για 10 λεπτά. PCR προϊόντα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1%. Εικόνες ελήφθησαν (μετά από χρώση γέλης με βρωμιούχο αιθίδιο) σε ένα FluorChem 8900 (Άλφα Innotech). SYBR-Ι-PCR σε πραγματικό χρόνο για την αξιολόγηση των επιπέδων ώριμη miR-21 πραγματοποιήθηκαν με το κιτ All-in-One miRNA qRT-PCR ανίχνευσης (GeneCopoeia) σε StepOne συν πραγματικό χρόνο σύστημα θερμικού κύκλου PCR (Applied Biosystems). Οι αντιδράσεις μείγμα PCR περιείχε 10 μl 2Χ All-in-One qPCR Mix, 2 μl All-in-One miRNA qPCR αστάρι, 2 μί καθολική προσαρμογέα εκκινητή PCR, 2 μί πρώτο κλώνο cDNA, και 4 μλ νερό. Ειδικοί εκκινητές για miR-21 και U6 (εσωτερικό πρότυπο) που χρησιμοποιείται (GeneCopoeia). συνθήκες Ποδηλασία: ένας κύκλος από 15 λεπτά στους 95 ° C, και 40 κύκλους των 15 sec στους 94 ° C, 30 sec στους 60 ° C και 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C [28]. Melt ανάλυση καμπύλης ήταν πάντα εκτελείται στο τέλος της αντίδρασης PCR. Σχετική έκφραση miR-21 υπολογίστηκε με τη μέθοδο ΔΔCt-[29], [30], [31].

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα Saline ( PBS), συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι να μεταποιηθούν. Για κυτοσολικό και πυρηνικά εκχύλιση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε κυτταροπλασματικό ρυθμιστικό διάλυμα (0,5% Nonidet Ρ-40, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, ρΗ 7,9, και αναστολέα πρωτεάσης 1Χ) για 15 λεπτά επί πάγου και φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 rpm στους 4 ° C [32]. Τα υπερκείμενα (που περιέχει το κυτταροπλασματικό κλάσμα) συλλέχθηκαν. Τα υπόλοιπα σφαιρίδια πλύθηκαν δύο φορές με το κυτταροπλασματικό ρυθμιστικό διάλυμα ακολουθούμενη από την προσθήκη των πυρηνικών ρυθμιστικού (400 mM NaCl, 20 mM Hepes, ρΗ 7,9 και αναστολέων πρωτεάσης 1χ). Τα δείγματα επωάστηκαν για 15 λεπτά σε πάγο, υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο (που περιέχει τα κλάσματα πυρηνική πρωτεΐνη) συλλέχθηκαν. Για ολική εκχύλιση των πρωτεϊνών, τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM NaCl, 1% Triton-X, 0.4 mM NaF, 0.4 mM NaVO

4, 25 mM Tris-HCl, ρΗ 7,6 και αναστολέων πρωτεάσης 1χ) για 45 λεπτά επί πάγου, φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στους 4 ° C και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη χρήση Bio-Rad Protein Αντιδραστήρια (Bio-Rad, Hercules, CA). προϊόντα λύσης πρωτεΐνης (50 μg) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, κηλιδώθηκαν πάνω σε μεμβράνες, και ανιχνεύθηκαν με την κατάλληλη αραίωση του πρωτογενούς αντισώματος κάθε. Οι μεμβράνες ξεπλύθηκαν και επωάστηκαν με το κατάλληλο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας, ξεπλένονται πάλι, και τα δεσμευμένα αντισώματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (GE Healthcare, Piscataway, NJ) ακολουθούμενη από αυτοραδιογραφία σε FluorChem 8900 (Άλφα Innotech Corporation, San Leandro, CA). Πρωτογενής αντι-σώματα: αντι-φωσφο-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), αντι-SAPK /JNK, αντι-φωσφο-c-Jun (Ser73), αντι-c-Jun, αντι-φωσφο-ΕΚΚ (Thr202 /Tyr204 ), αντι-ERK κινάση, αντι-STAT3, αντι-ιστόνης Η3 (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ), αντι-PDCD4 (Rockland, Gilbertsville, ΡΑ) και αντι-β-ακτίνης (Sigma-Aldrich). Δευτερογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού χρένο IgG υπεροξειδάσης (HRP), αντι-κουνελιού (Cell Signaling).

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα

A2780CP20 και τα κύτταρα Α2780 συλλέχθηκαν και διασταυρωμένες με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα λύθηκαν εντός ρυθμιστικού διαλύματος δωδεκυλθειικού νατρίου (SDS) λύσεως (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, ρΗ 8,1 και αναστολέων πρωτεάσης και φωσφατάσης). Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε υπερήχους (4 ° C) χρησιμοποιώντας ένα Branson 250 συσκευή υπερήχων με 10 παλμούς συνέχιση των 10 δευτερολέπτων (sec) η κάθε μία. Οι σε επεξεργασία με υπερήχους κυτταρολύματα προ-καθαριστεί με πρωτεΐνη Α ή σφαιρίδια μαγνήτης G επί μία νύκτα στους 4 ° C. Τα υλικά λύσεως ανοσοκατακρημνίσθηκαν με 5 ή 10 μα αντισώματος /σφαιριδίων μαγνήτη έναντι pc-Jun, Pol-ΙΙ (Santa Cruz), c-Jun (BD Transduction εργαστήριο, Franklin Lakes, New Jersey, USA) ή IgG (Abcam, Cambridge, ΜΑ , USA) για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Τα δείγματα πλύθηκαν πέντε φορές για 5 λεπτά κάθε στους 4 ° C με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (RIPA) (50 mM Hepes-ΚΟΗ ρΗ 7,6, 500 mM LiCl, 1% ΝΡ-40, 0.7% δεοξυχολικό οξύ, 1 mM EDTA, και πρωτεάση 1Χ και αναστολείς 1Χ φωσφατάση). Τα δείγματα πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα 1Χ ΤΕ και εκλούεται με ρυθμιστικό διάλυμα SDS έκλουσης (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris ρΗ 8.1, και πρωτεάση και αναστολείς 1Χ 1Χ φωσφατάση). Μετά την έκλουση, τα δείγματα ήταν αντίστροφη σταυροειδείς δεσμούς στους 65 ° C για 4 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNase Α (0,2 μg /ml) στους 37 ° C για 2 ώρες, αναμίχθηκε με ΟαΟ

2 (300 mM CaCl

2 σε 10 mM Tris ρΗ 8,0) και πρωτεϊνάση Κ (0,2 mg /ml) στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Το ανοσοκαταβυθισμένο DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας κιτ καθαρισμού QIAquick PCR (Qiagen). DNA ποσοτικοποιήθηκε με SYBR-1 που βασίζεται σε πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας StepOne Plus Thermocycler (Applied Biosystems). Εν συντομία, μείγμα αντίδρασης PCR περιείχε 10 μL SYBR-πράσινο, 0,5 μί πρόσθιο εκκινητή, 0,5 μΐ αντίστροφο έναυσμα (0,25 ηΜ τελική συγκέντρωση), 2 μί δείγματος DNA και 7 μλ νερό χωρίς νουκλεάση. συνθήκες Ποδηλασία: ένας κύκλος από 10 λεπτά στους 95 ° C, και 40 κύκλους των 30 sec στους 95 ° C, 30 sec στους 60 ° C και 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C

Παροδικές και σταθερές επιμολύνσεις

η έκτοπη miR-21 έκφραση πραγματοποιήθηκε σε Α2780 κύτταρα. Εν συντομία, Α2780 (2 × 10

4 κύτταρα /ml) κύτταρα σπάρθηκαν σε έξι φρεατίων. Για κάθε φρεάτιο, 1 μα pCMV-MIR21 ή 1 μg κενού φορέα (pCMV-EV) (και τα δύο από ΟηΟεηε Technologies, Inc. Rockville, MD) και 1 μι MegaTran 1,0 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Origen) αραιώθηκαν σε 98 μL του Opti-ΜΕΜ Ι (Life Technologies). φορέας pCMV περιέχει ένα πράσινο φλουορεσκεΐνη πρωτεΐνη (GFP) κασέτα. Το μίγμα επωάστηκε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και προστέθηκαν στα κύτταρα. Είκοσι-τέσσερις ώρες αργότερα, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​RPMI-1640 (10% FBS, /αντιμυκητιακό διάλυμα 0,1% αντιβιοτικό και διάλυμα διθειικού άλατος 500 μg /mL G418). Μετά από 2-3 εβδομάδες, ανεξάρτητες αποικίες παρελήφθησαν και καλλιεργήθηκαν χωριστά ως ανεξάρτητους κλώνους. Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης παρακολουθήθηκε με ανοσοφθορισμό ως ακολούθως: κλώνοι Α2780 σπάρθηκαν σε πλάκες μικροσκοπίου όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, δεσμεύτηκαν με 0,3% Η

2O

2 σε μεθανόλη για 10 λεπτά και 10% FBS για 20 λεπτά. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-ΟΡΡ αντίσωμα (αραίωση 1:250) ή DAPI (αραίωση 1:5000 από την Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, Texas, USA) για όλη τη νύχτα. Την επόμενη ημέρα, τα πλακίδια πλύθηκαν, και προστέθηκε το αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα (αραίωση 1:5000). Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν επί των πλάκες μικροσκοπίου και σταθεροποιήθηκαν με μέσο υδατικής στερέωσης (Abcam). Τα κύτταρα οπτικοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν σε Όλυμπο 1X71 ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Κέντρο Valley, PA). Για να ανασταλεί miR-21, έχουμε παροδικά διαμόλυνση A2780CP20 κυττάρων με ένα ολιγονουκλεοτίδιο miR-21 (Technology Life, Grand Island, ΝΥ, USA) και ένα αρνητικό αναστολέα ολιγονουκλεοτίδιο ως έλεγχος (Technology Life). αναστολείς miRNA ήταν πάντα αναμειγνύονται με HiPerfect αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Qiagen, Valencia, CA, USA), και Opti-ΜΕΜ Ι μέσο ανάπτυξης (Life Technologies).

Μικρές παρεμβολές RNA (siRNA) επιμόλυνση

να φιμώσουν την ανθρώπινη c-Jun (NM_002228) δύο siRNAs που στοχεύουν τις ακολουθίες: 5′-CCTTCTATGACGATGCCCT-3 ‘και 5′-GATGGAAACGACCTTCTAT-3’ χρησιμοποιήθηκαν (Sigma-Aldrich). Ένα μη φίμωση siRNA (NC-siRNA) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (Sigma-Aldrich). Εν συντομία, A2780CP20 (2,25 × 10

5 κύτταρα) σπάρθηκαν σε τρυβλία Petri. Είκοσι-τέσσερις ώρες αργότερα, 200 ηΜ siRNA (τελική συγκέντρωση) αναμίχθηκαν με το αντιδραστήριο διαμόλυνσης HiPerfect (Qiagen) σε 1:02 αναλογία (siRNA: αντιδραστήριο επιμόλυνσης) σε Opti-ΜΕΜ Ι μέσο ανάπτυξης. Το μίγμα επωάστηκε για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και προστέθηκαν στα κύτταρα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες και αποθήκευση στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

Η κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό

A2780CP20 (2 × 10

4 κύτταρα /ml) σπάρθηκαν σε έξι καλά πλακών. Είκοσι τέσσερις ώρες αργότερα, ένα μείγμα αντίδρασης που περιέχει την επιμόλυνση αναστολέα miR-21 (Technology Life) (50 ηΜ τελική συγκέντρωση) και αντιδραστήριο επιμόλυνσης HiPerfect (Qiagen) σε αναλογία 1:04, προστέθηκε στα κύτταρα. Έξι ώρες αργότερα, το καλλιεργημένο μέσο απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε από μέσο RPMI-1640 (10% FBS). Για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων εβδομήντα δύο ώρες μετά την επιμόλυνση, τα ζωντανά κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν με την παρουσία 0,5% Trypan blue χρησιμοποιώντας Countess αυτοματοποιημένο μετρητή κυττάρων (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Εν συντομία, οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, 1000 κύτταρα σπάρθηκαν σε δίσκους των 10 cm-Petri. Δέκα ημέρες αργότερα, οι αποικίες βάφτηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες σε μεθανόλη, και μετρήθηκαν με τη χρήση του μικροσκοπίου Nikon έκλειψη TS100.

In vitro εισβολή δοκιμασία

Τα κύτταρα (2.5 × 10

4 κύτταρα /ml) τοποθετήθηκαν σε ένα τρυβλίο Petri. Είκοσι τέσσερις ώρες αργότερα, ένα μείγμα αντίδρασης που περιέχει την επιμόλυνση αναστολέα miR-21 (Technology Life) (50 ηΜ τελική συγκέντρωση) και αντιδραστήριο επιμόλυνσης HiPerfect (Qiagen) σε αναλογία 1:02, προστέθηκε στα κύτταρα. Την επόμενη μέρα, 600 μL του αραιωμένου matrigel (μέσο RPMI ελεύθερο ορού) ήταν putted στην άνω βουλή του 6-φρεατίων φρεατίων (Corning Incorporated, Lowell, MA). Ο θάλαμος επωάσθηκε στους 37 ° C τουλάχιστον 4 έως 5 ώρες για πηκτωματοποίησης. MiR-21 αναστολέα-επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 χωρίς ορό σε πυκνότητα 1,5 × 10

5 κύτταρα /ml. Το matrigel απαλά πλένεται με ελεύθερο RPMI-1640 θερμαίνονται ορού και 1.0 mL του κυτταρικού αιωρήματος putted επί του matrigel. Το κατώτερο τμήμα του transwell πληρώθηκε με 1,0 ml RPMI-1640 (10% FBS), και η πλάκα επωάστηκε στους 37 ° C για 48- ώρες. Οι transwells απομακρύνθηκαν από τις πλάκες 6-φρεατίων και χρωματίστηκαν με το πρωτόκολλο ΗΕΜΑ 3 σετ Stain (Fisher Scientific Company, Kalamazoo, ΜΙ). Τα μη εισέβαλαν κύτταρα αποξέστηκαν από την κορυφή του transwell με ένα βαμβάκι. Ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν μετρήθηκε σε τέσσερα πεδία μικροσκοπίου (10Χ) ανά συνθήκη. Ποσοστό εισβολή υπολογίστηκε σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων που εισέβαλαν στον έλεγχο miRNA αναστολέα καλά, η οποία ελήφθη ως 100%.

Στατιστική ανάλυση

έλεγχος τ διεξήχθη χρησιμοποιώντας GraphPad Prism version 5.04 για Windows, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και p-value & lt? 0,05 για μια δοκιμή δύο όψεων θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η έκφραση του miR-21 και miR-21-σχετικά μόρια in. ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

σε μια προκαταρκτική ανάλυση μικροσυστοιχιών που πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριό μας, εντοπίσαμε 320 γονίδια που εκφράζονται διαφορικά (πάσο αλλαγή & gt? 3 και τιμή-p & lt? 3 × 10

-4) σε A2780CP20 (σισπλατίνη ανθεκτικά)

vs.

Α2780 () κύτταρα σισπλατίνη ευαίσθητα (Πίνακας S1). Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών κατατέθηκε στο Gene Expression Omnibus (GEO): προσχώρηση: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE51683. Ενώ ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω miR-21 και C-Jun, PDCD4 ήταν προς τα κάτω σε A2780CP20 σε σύγκριση με τα κύτταρα Α2780 (Πίνακας S1). πειράματα RT-PCR επιβεβαιώθηκαν τα δεδομένα μικροσυστοιχίας (Σχήμα 1Α). γονίδιο MiR-21 βρίσκεται στο ιντρόνιο 10 της TMEM-49 γονίδιο [17]. Τα επίπεδα αγγελιοφόρου RNA (mRNA) του TMEM-49 και β-ακτίνη δεν ήταν διαφορετικές σε A2780CP20 και Α2780 κύτταρα (Σχήμα 1Α), η οποία επιβεβαιώνουν προηγούμενο εύρημα ότι οι προ-mir-21 και TMEM-49 ανεξάρτητα ρυθμιζόμενες [33]. Η Εικόνα 1Β δείχνει ότι τα επίπεδα miR-21 συσχετίζεται με την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε θεραπεία σισπλατίνη (IC

50, Σχήμα 1Β). ανάλυση κηλίδας Western (Σχήμα 1 C) έδειξε ότι το σύνολο των c-Jun και ρ-c-Jun επίπεδα πρωτεΐνης ήταν υψηλότερα σε σύγκριση A2780CP20 με κύτταρα Α2780. Ωστόσο, τα επίπεδα πρωτεΐνης PDCD4 έδειξαν αντίθετα αποτελέσματα (Σχήμα 1 C). Σε άλλες κυτταρικές σειρές, το σήμα αισθητηρίου και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) ρυθμίζουν την έκφραση του miR-21 [17]. Ωστόσο, τα επίπεδα πρωτεΐνης STAT3 ήταν παρόμοιες σε A2780CP20 και Α2780 κύτταρα (Σχήμα S1), το οποίο αποκλείει την πιθανότητα ότι ο λογαριασμός STAT3 για τα υψηλότερα επίπεδα miR-21 σε A2780CP20 σύγκριση με τα κύτταρα Α2780. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι c-Jun είναι υπεύθυνος για τα επίπεδα έκφρασης του miR-21 σε ανθεκτικά σισπλατίνη καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

(Α) Επικύρωση των μικροσυστοιχιών με RT-PCR. (Β) Τα επίπεδα MiR-21 σε ένα πάνελ καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. MiR-21 επίπεδα εκφράστηκαν σε σχέση με τα κύτταρα Α2780 επίπεδα miR-21. IC50s υπολογίστηκαν μετά από αγωγή 72-hr κυττάρων με διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης, όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι». (Γ) Αξιολόγηση των c-Jun και ρ-c-Jun έκφραση πρωτεΐνης σε Α2780 και A2780CP20 κύτταρα. ανάλυση της έκφρασης (D) Πρωτεΐνη των MAPKs συνολικά και πυρηνικά κλάσματα Α2780 και A2780CP20 κύτταρα. επίπεδο έκφρασης στα Σχήματα Α, C και D είναι χωρίς θεραπεία cisplatin. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο. Στήλες αντιπροσωπεύουν τον μέσο τριπλών ± S.E.M.

Η

Είναι γνωστό ότι η μείζων ενεργοποιητής του c-Jun είναι JNK-1 [34]. Έτσι, αξιολόγησε τα επίπεδα πρωτεΐνης του JNK σε Α2780 και A27870CP20 κύτταρα. Η συνολική επιπέδων πυρηνικής ρ-ΙΝΚ-1protein JNK-1 και ήταν υψηλότερα σε σύγκριση A2780CP20 με κύτταρα Α2780. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του ρ-JNK-2/3 και η συνολική JNK-2/3, οι δύο άλλες JNK-1 ισομορφές, ήταν παρόμοιες και στις δύο γραμμές κυττάρων (Σχήμα 1D), που δείχνουν ότι η ΙΝΚ-1 /c-Jun καταρράκτη ρυθμίζουν miR-21 στο A2780CP20 κύτταρα. Τα στοιχεία δείχνουν ότι το εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης, ΕΚΚ μπορεί να ενεργοποιήσει c-Jun [35], [36]. Αν και τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης ERK ήταν παρόμοια και στις δύο γραμμές κυττάρων, τα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ-ΕΚΚ ήταν χαμηλότερες σε A2780CP20 σύγκριση με κύτταρα Α2780 απέκλεισε την πιθανότητα ότι ενεργοποιημένα λογαριασμός ΕΚΚ για τα υψηλότερα επίπεδα miR-21 σε A2780CP20 σύγκριση με τα κύτταρα Α2780.

Επίδραση της JNK-1 /αναστολή c-Jun έκφραση του miR-21 και PDCD4

Για να καθοριστεί περαιτέρω εάν JNK-1 ρυθμίζει c-Jun και miR-21 έκφρασης σε κύτταρα ανθεκτικά σισπλατίνη, εμείς κατεργάζεται A2780CP20 κυττάρων με SP600125, ένα πολύ γνωστό χημικό αναστολέα της φωσφορυλίωσης c-Jun με JNK-1 [34]. Η επώαση των κυττάρων με A2780CP20 SP600125 μείωσε τα επίπεδα ρ-c-Jun, όπως αναμενόταν (Εικόνα 2Α). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα της πρωτεΐνης του c-Jun, συνολική και ρ-ΙΝΚ-1 ή ολική και ρ-JNK-2/3 παρατηρήθηκαν μετά την αγωγή των κυττάρων με A2780CP20 αναστολέα SP600125 (Σχήμα 2Α). Real-time PCR έδειξε μία σημαντική μείωση (60% και * ρ & lt? 0,05) στα επίπεδα προ-mir-21 μετά την επεξεργασία των κυττάρων με A2780CP20 SP600125 (Σχήμα 2Β). Το ίδιο αναστολέας προκάλεσε αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης PDCD4 όπως παρατηρείται στο δυτικό κηλίδος Σχήμα 2C. Επιπλέον, η αναστολή της miR-21 με ένα ειδικό αναστολέα ολιγονουκλεοτίδιο miR-21 (antagomiR) αύξησε τα επίπεδα της πρωτεΐνης PDCD4 (Εικόνα 2D), η οποία επιβεβαίωσε τα προηγούμενα αποτελέσματα ότι miR-21 ρυθμίζει PDCD4 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [37], [18]. Επιπλέον, παροδική επιμόλυνση των A2780CP20 κυττάρων με ένα siRNA εναντίον c-Jun σημαντικά (** ρ & lt? 0,01) ανέστειλε προ-miR-21 έκφρασης (Σχήμα 2Ε). Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι η θεραπεία των ευαίσθητων cisplatin Α2780 κυττάρων με SP600125 δεν επηρέασε τα επίπεδα του p-ΙΝΚ-1, JNK-1, π-JNK-2/3, JNK2 /3, c-Jun, προ-ΜΙΚ 21 ή PDCD4 (Εικόνα S2). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ΙΝΚ-1 /c-Jun μονοπατιού οδηγούν σε miR-21 υπερέκφραση σε ανθεκτικά σισπλατίνη καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

A2780CP20 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 μΜ SP600125. (Α) κηλίδας Western φαίνεται η αναστολή της ρ-c-Jun μετά από θεραπεία με SP600125 σε A2780CP20 κύτταρα σε σύγκριση με τον έλεγχο (DMSO). (Β) SYBR-Ι-based πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη για να υπολογίσει τη σχετική έκφραση προ-mir-21 σε A2780CP20 κύτταρα μετά από θεραπεία με αναστολέα SP600125. (C) κηλίδα Western και πυκνομετρική ανάλυση των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης PDCD4 μετά την επεξεργασία των κυττάρων με A2780CP20 SP600125. τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης (Δ) PDCD4 μετά την διαμόλυνση των A2780CP20 με αναστολέα ολιγονουκλεοτίδιο miR-21. (Ε) Α2780 CP20 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με δύο c-Jun-στοχευμένες siRNAs, όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι» ενότητα. ανάλυση Western blot δείχνει ότι τόσο c-Jun-siRNA που μειώθηκαν τα επίπεδα γ-Ιούνιος SYBR-Ι-based πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε PCR (βλέπε κεφάλαιο «Υλικά και Μέθοδοι») για τον υπολογισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης προ-mir-21 σε κύτταρα μετά από A2780CP20 siRNA μεσολάβηση c-Jun σίγηση. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο. Στήλες αντιπροσωπεύουν τα μέσα του τριπλούν ± SEM

Η

Ανάλυση της δέσμευσης του c-Jun με miR-21 περιοχές υποκινητή DNA

Για να σίγουρα να αποδείξει ότι η c-Jun είναι υπεύθυνος της τριτοβάθμιας miR -21 επίπεδα σε A2780CP20 σε σύγκριση με τα κύτταρα Α2780, αξιολογήσαμε τις pri-mir-21 περιοχές του DNA που σχετίζονται με υποκινητή pc-Jun με ανάλυση chip. Η ποσότητα του DNA που ανοσοκατακρημνίστηκε με ρ-c-Jun αντίσωμα σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές ενισχύθηκε με ένα ζεύγος εκκινητών συμπεριλαμβάνονται τα στοιχεία αναγνώρισης c-Jun στην περιοχή προαγωγού PRI-mir-21 (Σχήμα S3 και Πίνακας S2). Άλλες ζεύγος εκκινητών ενισχύει μία περιοχή DNA μακριά από τις θέσεις αναγνώρισης c-Jun χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος (Πίνακας S2). Περισσότεροι από πέντε φορές των επιπέδων του ΟΝΑ τραβώντας προς τα έξω σε A2780CP20 παρά σε κύτταρα Α2780 μετά ανοσοκαταβύθιση με το αντίσωμα ρ-c-Jun (Σχήμα 3Α). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές σε ποσότητες DNA παρατηρήθηκαν μετά ανοσοκαταβύθιση με c-Jun, ροΐ II ή IgG αντισώματα (Σχήμα 3Α), η οποία κατέδειξε ότι το pc-Jun δεσμεύεται ειδικά με 21 PRI-mir-περιοχές προαγωγού, και ότι περισσότερο τα επίπεδα της πρωτεΐνης PC-Jun είναι υψηλότερα σε σχέση με το A2780CP20 Α2780 κύτταρα. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα του DNA παρατηρήθηκαν όταν η PCR διεξήχθη με τα αρχικά τεμάχια του DNA μη-υποκινητή μετά ανοσοκαταβύθιση με το αντίσωμα pc-Jun (Σχήμα 3Β).

δοκιμασία ChIP διεξήχθη όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά τμήμα και Μέθοδοι «. (Α) SYBR-Ι-based πραγματικού χρόνου PCR ενίσχυση της περιοχής που περιέχει την αλληλουχία αναγνώρισης c-Jun στο pri-miR-21 DNA. Τα επίπεδα φωσφο-c-Jun συνδέεται με το pri-miR-21 προαγωγός ήταν υψηλότερη σε A2780CP20 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα Α2780. (Β) SYBR-Ι-based πραγματικού χρόνου PCR ενίσχυση μιας περιοχής DNA μακριά του υποκινητή προ-mir-21 εκτελέστηκε ως μάρτυρας. * Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με το μάρτυρα. Στήλες αντιπροσωπεύουν τον μέσο τριπλών ± SEM

Η

Επίδραση του miR-21 υπερέκφραση στην ευαισθησία των ωοθηκών καρκινικών κυττάρων στη σισπλατίνη θεραπεία

Για να δοκιμαστεί εάν miR-21 συμβάλλει στην αντίσταση σισπλατίνη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, θα εκτοπικά εκφραζόμενη προ-mir-21 σε Α2780 κύτταρα (Σχήμα S4 και S5). Το σχήμα 4Α, δείχνει ότι σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα Α2780 ή με τον κενό φορέα (κλώνος 1, Σχήμα S4), σταθερή επιμόλυνση των προ-mir-21 (κλώνος 1, Σχήμα S4) αύξησε τα επίπεδα ώριμη miR-21. Τα επίπεδα πρωτεΐνης PDCD4 μειώθηκαν επίσης σημαντικά (69%, *** ρ & lt? 0.001) στο προ-mir-21 Α2780 κλώνος (Α2780-miR-21) σε σύγκριση με τον κενό φορέα κλώνος (Α2780-EV) (Σχήμα 4Β) . Η έκτοπη έκφραση της προ-mir-21 σε Α2780 κύτταρα οδήγησε σε σημαντική αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (15,4%, *** ρ & lt? 0.001) σε σύγκριση με κύτταρα Α2780-EV (Σχήμα 4C). Επιπλέον, η θεραπεία σισπλατίνη (1 μΜ) του Α2780-miR-21 κύτταρα οδήγησε σε σημαντική (περίπου 15%, ** ρ & lt? 0,01) μείωση της αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων σε σύγκριση τη θεραπεία cisplatin κυττάρων Α2780-EV (Εικόνα 4D)

(Α) κύτταρα Α2780 ήταν σταθερά επιμολυσμένα με pCMV-miR21 ή κενούς φορείς pCMV-EV. Η έκφραση miR-21 ποσοτικοποιήθηκε με qRT-PCR.