Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία των μικρών RNAs μη κωδικοποιητική που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων. Έχουν παρεκκλίνοντα εκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνων. Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε το γονιδίωμα-ευρεία προφίλ miRNA σε καρκίνωμα ουροφόρων κύστης από βαθιά αλληλουχίας.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εντοπίσαμε 656 διαφορικά εκφρασμένων γνωστά ανθρώπινα miRNAs και miRNA αντίθετης φοράς αλληλουχίες (miRNA * ες) σε ασθενείς με καρκίνωμα της ουροδόχου κύστης urothelial εννέα από βαθιές αλληλούχιση. Πολλοί miRNAs και miRNA * s ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω ή προς τα κάτω σε καρκίνωμα ουροφόρων της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο.

HSA-miR-96

ήταν η πιο σημαντική απορυθμίζεται miRNA και

HSA-miR-490-5p

ήταν μειωτικά η πιο σημαντική μία. Απορυθμίζεται miRNAs ήταν πιο συχνή από ό, μειωτικά αυτά. Η

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200b~429

,

HSA-miR-200c~141

και

HSA-miR-17~ 92

συστάδες ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω. Η

HSA-miR-143~145

σύμπλεγμα ήταν σημαντικά μειωτικά.

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200a

,

HSA-miR-143

και

HSA-miR-195

αξιολογήθηκαν με πραγματικού χρόνου qPCR σε ένα σύνολο ασθενών με καρκίνωμα ουροθηλιακά πενήντα ένα κύστη. Είχαν εκφράζονται ανώμαλα σε καρκίνωμα ουροφόρων της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο (p & lt? 0.001 για κάθε miRNA).

Συμπεράσματα /Σημασία

Μέχρι σήμερα, αυτή είναι η πρώτη μελέτη για τον προσδιορισμό γονιδίωμα ευρύ πρότυπα έκφρασης των miRNAs σε ανθρώπινο καρκίνωμα ουροδόχου κύστης ουροφόρων από βαθιά αλληλουχίας. Βρήκαμε ότι η συλλογή των miRNAs ήταν παρεκκλίνοντα εκφράζονται σε καρκίνωμα ουροδόχου κύστης urothelial σύγκριση με συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο, γεγονός που υποδηλώνει ότι θα μπορούσαν να παίζουν ρόλους ως ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων στην ανάπτυξη ή /και την πρόοδο αυτού του καρκίνου. Τα δεδομένα μας παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τη βιολογία του καρκίνου

Παράθεση:. Χαν Υ, Chen J, Zhao Χ, Liang C, Wang Υ, Sun L, et al. (2011) Έκφραση microRNA Υπογραφές καρκίνου της ουροδόχου κύστης Revealed από Deep αλληλουχίας. PLoS ONE 6 (3): e18286. doi: 10.1371 /journal.pone.0018286

Συντάκτης: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Γερμανία

Ελήφθη: 16 του Ιούλη, 2010? Αποδεκτές: 2 Μαρτίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 28 Μαρ, 2011

Copyright: © 2011 Han et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό υψηλής Τεχνολογίας Έρευνας και Ανάπτυξης του Προγράμματος της Κίνας (863 Προγράμματος, 2006AA02A302 και 2009AA022707) και το Πρόγραμμα Προώθησης για Shenzhen Βασικά Εργαστήριο, Shenzhen, Κίνα (CXB200903090055A), Τράπεζα των κλινικών δεδομένων των σοβαρών ασθενειών και δείγματα βιολογικού υλικού Shenzhen (CXC201005260001A). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι μια από τις πιο διαδεδομένες κακοήθειες του κόσμου. Περίπου 357.000 περιπτώσεις καρκίνου της ουροδόχου κύστης είχαν πρόσφατα διαγνωστεί και 145.000 θάνατοι σχετίζονται με τον καρκίνο είχε εκτιμηθεί το 2002 [1]. καρκίνωμα ουροθηλιακά της ουροδόχου κύστης, ο πιο κοινός τύπος ιστοπαθολογική του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, έχει μια ποικιλία γενετικών και φαινοτυπικά χαρακτηριστικά. Πολλοί παράγοντες, όπως χρωμοσωμικές ανωμαλίες, γενετικών πολυμορφισμών, γενετική και επιγενετικές μεταβολές, συμβάλλουν στην ογκογένεση και την εξέλιξη του καρκινώματος ουροθηλιακά της ουροδόχου κύστης [2].

Τα microRNAs (miRNAs) είναι ενδογενείς, μη κωδικοποιητική μόρια RNA των περίπου 22 νουκλεοτίδια σε μήκος που ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου [3]. Ενώνουν το RNA που προκαλείται από φίμωση συγκρότημα για τη ρύθμιση στοχευμένες αγγελιαφόρο RNA τους (mRNA) από την καταστολή της μετάφρασης του mRNA και /ή να κατευθύνει mRNA διάσπασης [4]. miRNAs παίζουν σημαντικό ρόλο στην φυσιολογική ανάπτυξη, την κυτταρική ανάπτυξη, διαφοροποίηση και απόπτωση στα θηλαστικά [5].

Περισσότεροι από μισό γονίδια miRNA βρίσκονται σε περιοχές του γονιδιώματος που συνδέεται με καρκίνο ή σε εύθραυστα χώρων [6]. έχουν παρεκκλίνοντα εξέφρασαν miRNAs έχουν δειχθεί ότι συνδέονται με πολλούς τύπους καρκίνων. Και οι δύο απώλειες και τα κέρδη της λειτουργίας miRNA συμβάλλουν στην ανάπτυξη του καρκίνου. miRNAs δρουν ως ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων [7]. Το πιο σημαντικό, διαφορετικούς τύπους καρκίνου, στάδια ή καταστάσεις διαφοροποίησης έχουν μοναδικά προφίλ έκφρασης των miRNAs, γεγονός που υποδηλώνει ότι miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως νέα βιοδεικτών για τη διάγνωση του καρκίνου [8], [9].

Αρκετές προηγούμενες έρευνες που χρησιμοποιείται μικροσυστοιχίες miRNA με περιορισμένη και ποικίλη ανιχνευτές στο προφίλ της έκφρασης miRNA στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης και των αποτελεσμάτων τους, δεν δείχνουν πάντα συνεπή αποτελέσματα [10] – [13]. Για την καλύτερη κατανόηση του ρόλου των miRNAs στην ανάπτυξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και την εξέλιξη, απαιτείται ολοκληρωμένη ανάλυση της έκφρασης και της αφθονίας των miRNAs σε αυτού του καρκίνου. Με την αξία της τεχνολογίας βαθιά αλληλουχίας υψηλής απόδοσης, γονιδίωμα-ευρεία miRNAs καρκίνο μπορεί να προσδιοριστεί ποσοτικά και με ακρίβεια. Εδώ, σας παρουσιάζουμε το γονιδίωμα-ευρεία προφίλ miRNA σε εννέα ζεύγη snap-κατεψυγμένα καρκίνωμα ουροθηλιακά της ουροδόχου κύστης και συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο από βαθιά αλληλουχίας. Βρήκαμε ότι η συλλογή των miRNAs ήταν παρεκκλίνοντα εκφράζονται σε καρκίνωμα ουροδόχου κύστης urothelial σύγκριση με συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο, πολλά από τα οποία αξιολογήθηκαν με πραγματικού χρόνου qPCR σε ένα σύνολο ασθενών με καρκίνωμα ουροθηλιακά πενήντα ένα κύστη.

Αποτελέσματα

Επισκόπηση των miRNA προφίλ

Γνωστή αρχεία έκφρασης των miRNAs μεταξύ καρκίνωμα ουροθηλιακά κύστης και συνοδεύεται ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο από κάθε ασθενή συγκρίθηκαν για να μάθετε τα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs. Η έκφραση των miRNAs σε ζεύγη δειγμάτων έδειξαν με τον υπολογισμό log

2Ratio. Οι διαδικασίες όπως φαίνεται παρακάτω: (1) ομαλοποιούν την έκφραση miRNAs σε δύο δείγματα (όγκου έναντι κανονικό) για να πάρει την έκφραση του μεταγράφου ανά εκατομμύριο (TPM). Κανονικοποιημένη έκφραση = Πραγματικός αριθμός των miRNA /Συνολικός αριθμός καθαρών διαβάζει * 1000000. (2) Υπολογίστε φορές αλλαγή και τιμή p από την κανονικοποιημένη έκφραση. Στη συνέχεια Υπολογίστε ημερολόγιο

2Ratio. Διπλώστε αλλαγή = log

2Ratio (όγκου /φυσιολογικό). Έχουμε καθορίζεται 656 διαφορικά εκφρασμένων γνωστά ανθρώπινα miRNAs και αντίθετης φοράς αλληλουχίες miRNA (miRNA * s) σε miRBase14.0 σε εννέα ασθενείς με καρκίνωμα ουροφόρων της ουροδόχου κύστης (Πίνακας S1).

Εντοπίσαμε ένα μεγάλο αριθμό των miRNAs και miRNA * s ότι ήταν signicantly ρυθμισμένη προς τα πάνω ή προς τα κάτω σε αυτούς τους ασθενείς και θα μπορούσαν να κάνουν διακρίσεις καρκίνωμα ουροφόρων κύστης από συμφωνημένα φυσιολογικό ουροθήλιο.

HSA-miR-96

(log

2Ratio = 4,664328) ήταν η πιο σημαντική απορυθμίζεται miRNA και

HSA-miR-490-5p

(log

2Ratio = -5.79794) ήταν η πιο σημαντικά μειωτικά ένα (Πίνακας 1). Επιλεγμένα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs επικυρώθηκαν από την Real-Time qPCR. Οι Real-Time qPCR ευρήματα συσχετίζονται καλά με την ανάλυση της αλληλουχίας. Η σύγκριση μεταξύ των ευρημάτων Real-Time qPCR και τα αποτελέσματα βαθιά αλληλούχισης φαίνεται στο Σχήμα 1. Οι μετρήσεις του ρυθμίζεται αυξητικά και μειωτικά miRNAs διέφερε σε διαφορετικούς ασθενείς. Προς τα πάνω ρυθμισμένη miRNAs ήταν πιο κοινή από αυτές ρυθμίζεται προς τα κάτω (Σχήμα 2). Επιπλέον, εντοπίσαμε μια αξιοσημείωτη απόκλιση των επιπέδων έκφρασης μεταξύ των miRNAs και σε συνδυασμό miRNA *. Τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs ήταν συνήθως υψηλότερο από εκείνο των ζεύγη miRNA * s (Σχήμα 3).

Για τη σύγκριση μεταξύ των στοιχείων βαθιά αλληλουχίας και σε πραγματικό χρόνο αποτελέσματα qPCR,

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200a

,

HSA-miR-143

και

HSA-miR-195

καθορίζεται να εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο ουροφόρων της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο σε εννέα ασθενείς με βαθιά αλληλουχίας επικυρώθηκαν με χρήση Real-Time qPCR. Τα ύψη των στηλών στον πίνακα αντιπροσωπεύουν τις log-μετασχηματιστεί μέση αλλαγές φορές (όγκος /κανονική) στην έκφραση από τους εννέα ασθενείς για κάθε μία από τις πέντε miRNAs επικυρωθεί? οι ράβδοι παριστάνουν τυπικά σφάλματα. Τα αποτελέσματα της επικύρωσης των πέντε miRNAs έδειξε ότι τα δεδομένα βαθιά αλληλουχίας συσχετίζονται καλά με τα αποτελέσματα σε πραγματικό χρόνο qPCR.

Η

Πολλοί miRNAs ήταν αποφασισμένοι να απορυθμίζεται σημαντικά ή προς τα κάτω σε καρκίνωμα ουροφόρων της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο σε εννέα ασθενείς με βαθιά αλληλουχίας. Οι μετρήσεις του ρυθμίζεται προς τα πάνω και προς τα κάτω ρυθμισμένη miRNAs ποίκιλαν ανάλογα με τα εννέα ασθενείς. Σε οκτώ από τους εννέα ασθενείς με καρκίνωμα ουροφόρων κύστης ρυθμίζεται προς τα πάνω miRNAs ήταν πιο συχνή από ό, μειωτικά αυτά. Σε ένα μόνο ασθενή (Patient Νο Β13), ρυθμίζεται προς τα πάνω miRNAs ήταν λιγότερο συχνές από ό, μειωτικά αυτά.

Η

Μια συλλογή από miRNAs και σε συνδυασμό αντίθετης φοράς αλληλουχίες miRNA (miRNA * s) ήταν αποφασισμένοι να εκφράζονται σε εννέα ασθενείς της ουροδόχου κύστης καρκίνωμα ουροφόρων από βαθιά αλληλουχίας. Εντοπίσαμε μια αξιοσημείωτη απόκλιση της έκφρασης μεταξύ των miRNAs και σε συνδυασμό miRNA *. Η έκφραση των miRNA /miRNA * ζεύγη φαίνεται στο διάγραμμα διασποράς με λογάριθμο σύστημα συντεταγμένων? Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει την έκφραση ενός ζεύγους miRNA /miRNA *. Στις περισσότερες miRNA /miRNA * ζεύγη, το επίπεδο έκφρασης των miRNAs ήταν υψηλότερο από εκείνο των ζεύγη miRNA *. Σε ένα μικρό αριθμό των miRNA /miRNA * ζεύγη, miRNA ήταν λιγότερο πλούσια από ό, τι σε συνδυασμό miRNA *.

Η

Εκτός από τα γνωστά miRNAs και miRNA * s, 92 νέα miRNA υποψήφιοι ακολουθία ανιχνεύθηκαν σε μας μελέτης (Πίνακας S2). Τα περισσότερα από αυτά εκφράζεται σε πολύ χαμηλά επίπεδα και μόνο σε ορισμένα δείγματα. πρότυπα έκφρασης τους και πιθανοί ρόλοι χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση.

Η έκφραση του συμπλέγματος miRNAs

Βρήκαμε ότι μια συλλογή από απελευθερωμένης clusters miRNA εκφράστηκαν. Η

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200b~429

,

HSA-miR-200c~141

και

HSA-miR-17~ 92

συστάδες ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω. Η

HSA-miR-143~145

σύμπλεγμα ήταν σημαντικά ρυθμίζεται προς τα κάτω.

Real-Time qPCR επικύρωση

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200a

,

HSA-miR-143

και

HSA-miR-195

αξιολογήθηκαν από Σε πραγματικό Χρόνος qPCR σε ένα σύνολο ασθενών με καρκίνωμα ουροθηλιακά πενήντα ένα κύστη.

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

και

HSA-miR-200a

ήταν υπερεκφράζεται

HSA-miR-143

και

HSA-miR-195

ήταν υποεκφράζονται σε καρκίνωμα ουροφόρων της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο (p & lt? 0.001 για κάθε miRNA). (Πίνακας S3)

Συζήτηση

Η ανάπτυξη του υψηλής απόδοσης τεχνολογίας βαθύ αλληλούχιση παρέχει τη δυνατότητα μιας σχεδόν πλήρη θέα του προφίλ miRNA. τεχνολογία Deep αλληλούχιση έχει τη δυνατότητα για την ταυτοποίηση νέων ειδικών ιστών miRNAs [14]. Καθορίζει την απόλυτη αφθονία των miRNAs και να ανακαλύψουν νέες miRNAs που έχουν χαθεί από κοινές μεθόδους κλωνοποίησης και προσδιορισμού αλληλουχίας [15]. τεχνολογία Deep αλληλουχίας είναι ανώτερη από μικροσυστοιχίες που καθορίζουν περιορισμένη γνωστό miRNAs και συνήθως δεν περιέχουν την πλήρη λίστα των γνωστών αντίθετης φοράς αλληλουχίες miRNA. Μέχρι τώρα η τεχνολογία βαθιά αλληλουχίας ήταν το χρυσό πρότυπο για την ολοκληρωμένη ανάλυση των miRNAs.

Έρευνες έχουν δείξει ότι miRNAs μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για διαφορετικούς τύπους καρκίνων [8], [9]. Μερικά miRNAs ως βιοδείκτες είναι σε θέση να εντοπίζουν τον ιστό προέλευσης των καρκίνων του αγνώστου πρωτοπαθούς προέλευσης [16]. Συγκεκριμένες υπογραφές miRNA είναι ανώτερες από τις υπογραφές mRNA στην πρόβλεψη της πρόγνωσης του καρκίνου του πνεύμονα [17].

Σε αυτή την εργασία, χρησιμοποιήσαμε την τεχνολογία βαθιά αλληλουχίας για τον προσδιορισμό των ολοκληρωμένο προφίλ έκφρασης των miRNAs σε εννέα ζεύγη snap-κατεψυγμένα ουροφόρων της ουροδόχου κύστης καρκίνωμα και συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο. Πολλοί miRNAs ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω ή προς τα κάτω σε καρκίνωμα ουροδόχου κύστης urothelial σύγκριση με συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο σε αυτούς τους ασθενείς, υποδηλώνοντας ότι αυτά τα παρεκκλίνοντα εκφράζεται miRNAs θα μπορούσαν να παίξουν ρόλο σε αυτές τις μορφές καρκίνου. Η πιο σημαντική απορυθμίζεται miRNA

HSA-miR-96

έχει αναφερθεί ότι είναι ογκογόνο [18], αλλά ο ρόλος της πιο σημαντικά μειωτικά miRNA

HSA-miR-490-5p

δεν είναι καθαρός. Πολλά miRNA * s ήταν σημαντικά απορυθμισμένη σε καρκίνωμα ουροδόχου κύστης urothelial σύγκριση με συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο σε αυτή τη μελέτη. Μερικά miRNA * s μπορεί να ενταχθεί το RNA που προκαλείται από φίμωση πολύπλοκες και έχουν ανασταλτική λειτουργία [19].

Πολλοί απορυθμισμένη συστάδες miRNA εκφράζονται σύμφωνα με την ανάλυσή μας βαθιά αλληλουχίας. Βρήκαμε ότι το

HSA-miR-183

συμπλέγματος υπερεκφράζεται στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Αυτή η ομάδα αποτελείται από

HSA-miR-96

,

HSA-miR-182

και

HSA-miR-183

και βρίσκεται στο χρωμόσωμα 7. Αυτές οι τρεις miRNAs είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω σε καρκίνωμα του προστάτη [18]. Το μοτίβο συνέκφραση των miRNAs αυτού του συμπλέγματος σε καρκίνους υποδηλώνει ότι θα μπορούσαν να διαδραματίσουν ρόλους μαζί. Η

HSA-miR-200

οικογένεια miRNAs (

HSA-miR-200a /b /c

,

HSA-miR-141

και

HSA-miR -429

) έχουν υπερεκφράζεται στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Η

HSA-miR-200b~429

συμπλέγματος βρίσκεται στο χρωμόσωμα 1 και η

HSA-miR-200c~141

συμπλέγματος βρίσκεται στο χρωμόσωμα 12. Η συν-έκφραση αυτών των clusters υποδηλώνει ότι μπορεί να ελέγχεται από κοινούς παράγοντες και να παίξουν ρόλους μαζί.

HSA-miR-200b

,

HSA-miR-200a

και

HSA-miR-429 είναι

miRNAs που κωδικοποιείται από ένα μονό πολυσιστρονικό μεταγραφή και αρνητικά ρυθμίζονται από ZEB1 και SIP1 [20]. TGFß 1 μπορούν να ρυθμίζουν προς τα κάτω την

HSA-miR-200

οικογένειας οδηγεί στην προς τα πάνω ρύθμιση ZEB1 και ZEB2 [21]. Η

HSA-miR-200

οικογένεια επίσης υπερεκφράζονται σε καρκίνους των ωοθηκών και του τραχήλου της μήτρας [22] – [24], υποδηλώνοντας αυτή την οικογένεια miRNA είναι ογκογόνοι σε seveval καρκίνους. Η

HSA-miR-17-92

συμπλέγματος βρίσκεται στο χρωμόσωμα 13 και λειτουργεί ως ογκογονίδια. E2F1 και E2F3 μπορεί να ενεργοποιήσει άμεσα τη μεταγραφή αυτών των miRNAs [25]. Η

HSA-miR-143~145

σύμπλεγμα βρίσκεται στο χρωμόσωμα 5 και ρυθμίζεται προς τα κάτω σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων της ουροδόχου κύστης και κυτταρικές σειρές τους [13], [26]. Τα ευρήματά μας παρέχονται περισσότερα στοιχεία για να υποστηρίξει ότι η

HSA-miR-143~145

cluster είναι ογκο-κατασταλτικά στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Σε αυτή τη μελέτη, Real-Time qPCR διεξήχθη για να αξιολογηθεί η πρότυπα έκφρασης των

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200a

,

HSA-miR-143

και

HSA-miR-195

σε ένα σύνολο ασθενών με καρκίνωμα ουροθηλιακά πενήντα ένα κύστη.

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

και

HSA-miR-200a

ήταν υπερεκφράζεται

HSA-miR-143

και

HSA-miR-195

ήταν υποεκφράζονται σε καρκίνωμα ουροφόρων της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζονται ανάλυσή μας βαθιά αλληλουχίας.

Είμαστε σε σύγκριση με τα αποτελέσματά μας με τα δημοσιευμένα στοιχεία να seacrch για ανεξάρτητες εξωτερικές επικυρώσεις.

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

και

Οι HSA-miR-224

απορυθμίζεται και

HSA-miR-1

,

HSA-miR-101

,

HSA-miR-143

,

HSA-miR-145

,

HSA-miR-127

και

HSA-miR-29c

είναι μειωτικά στο καρκίνωμα ουροφόρων ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο [27]. βαθιά αποτελέσματα αλληλούχισης μας ήταν σε μεγάλο βαθμό σύμφωνη με αυτές τις διαπιστώσεις. Η ρύθμιση προς τα πάνω του

HSA-miR-182

και

HSA-miR-183

και η προς τα κάτω ρύθμιση των

HSA-miR-143

βρέθηκαν σε καρκίνωμα ουροφόρων ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο σε πραγματικό χρόνο αξιολόγησης qPCR μας. Το προφίλ των miRNAs σε 106 καρκίνους της ουροδόχου κύστης και 11 φυσιολογικά δείγματα χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες έδειξε ότι μια σειρά από miRNAs είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω ή προς τα κάτω σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης [13]. Από αυτές τις απελευθερωμένες miRNAs,

HSA-miR-21

,

HSA-miR-20a

,

HSA-miR-184

,

HSA-miR-26a

,

HSA-miR-125b

,

HSA-miR-29a

,

HSA-miR-29c

και ούτω καθεξής μοιράζονται τα παρόμοια πρότυπα έκφρασης με τα αποτελέσματά μας.

HSA-miR-133a

,

HSA-miR-133b

και

Οι HSA-miR-195

προς τα κάτω σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης [28]. Αυτά τα miRNAs έδειξε αρνητική ρύθμιση στην ανάλυση της αλληλουχίας μας και

HSA-miR-195

προς τα κάτω ρύθμιση ήταν comfirmed από την Real-Time qPCR σε αυτή τη μελέτη.

Χρησιμοποιήσαμε συμφωνημένα δίπλα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο ο έλεγχος στη μελέτη μας . Έχει αναφερθεί ότι λαμβάνονται δείγματα από ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης έχουν γενετικές αλλοιώσεις [29]. Μερικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες, τόσο για έναν όγκο και ένα ιστολογικά φυσιολογικό αναζητούν ιστό δίπλα στον όγκο μπορεί να προκαλέσει παρόμοιες αλλαγές της έκφρασης miRNA. Για να αντισταθμιστεί αυτή η αδυναμία, συγκρίναμε τα αποτελέσματά μας σε αρκετές δημοσιευμένες εκθέσεις χρησιμοποιώντας ουροδόχου κύστης από φυσιολογικούς και ελέγχου [10], [13], [28]. Μια μεγάλη συλλογή από ευρήματα ήταν συγκρίσιμα μεταξύ δικό τους και δικό μας. Τα ευρήματά μας ήταν επίσης συνεπής με αυτά τα έγγραφα χρησιμοποιώντας συμφωνημένα δίπλα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο καθώς ελέγχου όσον αφορά πολλά miRNAs [26], [27]. Οι επικαλυπτόμενες ευρήματα μεταξύ των δημοσιευμένων στοιχείων και τα αποτελέσματά μας φαίνονται στον Πίνακα 2.

Η

Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτό είναι το πρώτο γονιδίωμα-ευρεία προφίλ των miRNAs σε ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης από βαθιά αλληλουχίας. Βρήκαμε ότι η συλλογή απελευθερωμένης miRNAs ήταν παρεκκλίνοντα εκφράζονται σε καρκίνωμα ουροδόχου κύστης urothelial σύγκριση με συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο, γεγονός που υποδηλώνει ότι θα μπορούσαν να παίζουν ρόλους ως ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων στην ανάπτυξη ή /και την πρόοδο αυτού του καρκίνου. Τα δεδομένα μας παρέχει νέες γνώσεις για τη βιολογία του καρκίνου. θα χρειαστεί περισσότερη δουλειά για τον προσδιορισμό των πιθανών ρόλων των miRNAs ως διαγνωστικοί βιοδείκτες και των υποψήφιων θεραπευτικών στόχων για καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα δείγματα ασθενών

γραπτή συγκατάθεση ήταν που λαμβάνονται από όλους τους ασθενείς και η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review του Πεκίνου Πανεπιστήμιο Shenzhen Νοσοκομείο. Πενήντα ένας ασθενείς με καρκίνωμα της ουροδόχου κύστης urothelial που έλαβαν μερική ή ριζική κυστεκτομή συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Από αυτούς τους ασθενείς, εννέα χρησιμοποιήθηκαν για την αρχική ανάλυση βαθύ αλληλουχίας των miRNAs και σαράντα δύο χρησιμοποιήθηκαν για επιπλέον αξιολόγηση. καρκίνωμα της ουροδόχου κύστης ουροφόρων διαγνώστηκε ιστοπαθολογικά. Της ουροδόχου κύστης καρκίνωμα ουροθηλιακά και συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο από κάθε αντικείμενο καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο immmediately μετά την εκτομή. Λεπτομερείς πληροφορίες των ασθενών καρκίνωμα ουροθηλιακά εννέα ουροδόχου κύστης σε βαθουλωτά αλληλούχιση συνοψίζεται στον πίνακα S4.

RNA Extraction

Όταν η αναλογία καρκινικών κυττάρων σε ένα τμήμα ιστού ήταν μεγαλύτερη από 80%, το κατεψυγμένο μπλοκ υπεβλήθη σε εκχύλιση RNA. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από πενήντα-ενός ζεύγη snap-κατεψυγμένων καρκίνωμα της ουροδόχου κύστεως και ουροφόρων συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε από Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA).

miRNA αλληλουχίας και ανάλυση

Δεκαοκτώ μικρές βιβλιοθήκες RNA που παρασκευάζεται από εννέα ζεύγη snap-κατεψυγμένα ουροδόχου κύστης ουροθηλιακό καρκίνωμα και συμφωνημένα ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο κατασκευάστηκαν, ενισχύεται και η αλληλουχία τους. Ολικό RNA που χρησιμοποιείται για αλληλούχιση miRNA. Μετά 5’adapter και 3’adapter συνδέθηκαν σε μικρές RNAs, Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε. Τότε PCR διεξήχθη και τα προϊόντα της PCR καθαρίστηκαν. Τέλος, miRNA βιβλιοθήκες κατασκευάστηκαν και η αλληλουχία από το σταθμό Illumina Cluster και Γονιδιώματος Ανάλυση (Illumina Inc, CA, USA) στο Πεκίνο Genomics Institute στο Shenzhen, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Χαμηλή ποιότητα διαβάζει αφαιρέθηκαν και οι αλληλουχίες προσαρμογέα ήταν ακριβή κούρεμα με τη βοήθεια ενός δυναμικού αλγορίθμου προγραμματισμού πριν από την περαιτέρω ανάλυση. Μετά την κατάργηση των διπλών διαβάζει, το υπόλοιπο διαβάζει τουλάχιστον 18 nt χαρτογραφήθηκαν σε ένα ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς (hg19) χρησιμοποιώντας SOAP V2.0 [30]. Για τον προσδιορισμό των ετικετών αλληλουχίας που προέρχεται από την κωδικοποίηση εξώνια, επαναλήψεις, rRNA, tRNA, snRNA και snoRNA, UCSC RefGene, RepeatMasker, δεδομένων NCBI REFSEQ και οι σχολιασμοί ncRNA καταρτίζονται από τα δεδομένα NCBI Genbank (https://www.ncbi.nih.gov ) είχαν χρησιμοποιήθει. Για τον προσδιορισμό των νέων γονιδίων miRNA, όλες οι δομές φουρκέτας RNA μοιάζει περιλαμβάνει μικρές ετικέτες RNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας MIREAP (https://sourceforge.net/projects/mireap).

Real-Time qPCR επιβεβαίωση και στατιστικών μεθόδων

Τρεις υπερεκφράζεται (

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

και

HSA-miR-200a

) και δύο υποεκφράζονται miRNAs (

HSA-miR-143

και

HSA-miR-195

) αξιολογήθηκαν σε όλους τους ασθενείς που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη. Η επιλογή των miRNAs ήταν επειδή ήταν σημαντικά απελευθερωθεί στην αρχική ανάλυση βαθύ sequecing. snRNA U6 χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος. Real-Time qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας το All-in-One ™ miRNA qRT-PCR κιτ Ανίχνευσης (GeneCopoiea Inc, Rockville, MD, USA). 10 μg ολικού RNA μετατράπηκε σε cDNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα συνολικό όγκο αντίδρασης 20 μΙ, συμπεριλαμβανομένων 10 μΙ 2xAll-in-One ™ qPCR Mix, 2 μΐ της Universal Adaptor PCR Primer (2 μΜ), 2 μΙ All-in-One ™ qPCR Primer (2 μΜ), 2 μλ First-Strand cDNA (αραιωμένο σε 1:05), 50xROX Dye αναφοράς 0,4 μΙ και 3,6 μΙ διπλά αποσταγμένο νερό. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το ΑΒΙ PRISM 7000 Fluorescent Ποσοτική PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Διεξήχθησαν αντιδράσεις PCR για τον καρκίνο και την κανονική cDNA εις τριπλούν για κάθε σετ. Οι παράμετροι του ποδηλάτου για PCR είχαν ως εξής: (1) ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης των 15 λεπτών στους 95 ° C? (2) 40 κύκλους, με 1 κύκλο να αποτελείται από 15 s στους 95 ° C, 20 s στους 55 ° C, και 30 s στους 70 ° C. Οι αριθμοί καταλόγου του All-in-One ™ miRNA qPCR Αστάρια παρατίθενται στον Πίνακα S5. Η διάμεση τιμή σε κάθε τριπλούν χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των σχετικών συγκεντρώσεων των miRNAs (ΔΟΙ = Ct

medianmiRNA-Ct

mediansnRNAU6). αλλαγές έκφρασης φορές υπολογίστηκαν με τη χρήση 2

-ΔΔCt μεθόδους [31]. Οι διαφορές έκφρασης των miRNAs μεταξύ του καρκίνου και του ελέγχου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

test του Student στο SPSS (έκδοση 16.0 του SPSS Inc.). Μια τιμή του ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1..

miRNAs εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ καρκίνωμα ουροθηλιακά κύστης και συνοδεύεται ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο.

doi: 10.1371 /journal.pone.0018286.s001

(XLS)

Πίνακας S2.

Οι ακολουθίες των νέων υποψηφίων miRNA ανιχνεύθηκαν σε καρκίνωμα ουροθηλιακά κύστης και συνοδεύεται ιστολογικά φυσιολογικό ουροθήλιο.

doi: 10.1371 /journal.pone.0018286.s002

(XLS)

Πίνακα S3. τιμές

Delt-Ct του Real-Time qPCR σε ασθενείς με καρκίνωμα ουροφόρων πενήντα μία κύστη.

doi: 10.1371 /journal.pone.0018286.s003

(DOC)

Πίνακας S4.

πληροφοριών για τον ασθενή σε βαθιά σύνολο αλληλουχίας.

doi: 10.1371 /journal.pone.0018286.s004

(DOC)

Πίνακας S5. Κατάλογος

Primer.

doi: 10.1371 /journal.pone.0018286.s005

(DOC)

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε όλους τους χορηγούς που συμμετείχαν σε αυτό το πρόγραμμα, όλοι οι συνεργάτες μας, οι οποίοι συνέβαλαν στην η κατασκευή του ιστού Ουρολογικής Τράπεζας στο Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Shenzhen Νοσοκομείο και όλους εκείνους που αφιερώθηκε στην υπηρεσία βαθιά αλληλουχίας στο Πεκίνο Genomics Institute στο Shenzhen.