Αφηρημένο

Το ακετυλοσαλικυλικό οξύ (ασπιρίνη) είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική για τη θεραπεία ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου postdiagnosis? Ωστόσο, οι μηχανισμοί δράσης της ασπιρίνης σε καρκίνο του παχέος εντέρου δεν είναι σαφώς καθορισμένες. Η ασπιρίνη και τα μεγάλα σαλικυλικό νάτριο μεταβολίτης απόπτωση που επάγεται της και μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου και του άλατος νατρίου της ασπιρίνης επίσης ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε ένα αθυμικό γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Καρκίνο του παχέος εντέρου αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης συνοδεύτηκε από ρύθμιση προς τα κάτω των πρωτεϊνών Sp1, Sp3 και Sp4 και μειωμένη έκφραση Sp-ρυθμιζόμενων προϊόντων γονιδίων συμπεριλαμβανομένων bcl-2, survivin, VEGF, VEGFR1, κυκλίνη D1, ο-ΜΕΤ και ρ65 (ΝΡκΒ). Επιπλέον, δείξαμε επίσης από την RNA παρεμβολής που της β-κατενίνης, μια σημαντική στόχος της ασπιρίνης σε ορισμένες μελέτες, είναι ένα Sp-ρυθμιζόμενο γονίδιο. Η ασπιρίνη που προκαλείται από τα πυρηνικά της κασπάσης-εξαρτώμενη διάσπαση των πρωτεϊνών Sp1, Sp3 και Sp4 και η απάντηση αυτή συνδεόταν με την παγίδευση των ιόντων ψευδαργύρου από την προσθήκη του θειικού ψευδαργύρου μπλοκάρει ασπιρίνη απόπτωση και την καταστολή των πρωτεϊνών Sp. Τα αποτελέσματα δείχνουν μια σημαντική υποκείμενη μηχανισμός δράσης της ασπιρίνης ως αντικαρκινικός παράγοντας και, με βάση την ταχεία μεταβολισμό της ασπιρίνης σε σαλικυλικό στον άνθρωπο και τα υψηλά σαλικυλικό αναλογίες /ασπιρίνη στον ορό, είναι πιθανό ότι η αντικαρκινική δράση της ασπιρίνης οφείλεται επίσης στο μεταβολίτη σαλικυλικό

Παράθεση:. ΠΑΘΗ S, Jutooru Ι, Chadalapaka G, Nair V, Λι SO, θυρίδα ασφαλείας S (2012) ασπιρίνη αναστέλλει τον καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων και την ανάπτυξη όγκων και ρυθμίζει προς τα κάτω Ειδικότητα πρωτεΐνη (Sp) Μεταγραφή Παράγοντες . PLoS ONE 7 (10): e48208. doi: 10.1371 /journal.pone.0048208

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: ένατης Αυγούστου, 2012? Αποδεκτές: 24 Σεπ 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Οκτωβρίου 2012

Copyright: © 2012 ΠΑΘΗ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το National Institutes of Health (R01 CA136571) και το Τέξας AgriLife Έρευνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ακετυλοσαλικυλικό οξύ ή ασπιρίνη είναι ένα μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες φάρμακο (NSAID) χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία του πόνου, του πυρετού και άλλων φλεγμονωδών καταστάσεων [1] και το ρόλο της ασπιρίνης και άλλων ΜΣΑΦ στον καρκίνο έχει εκτενώς ερευνήθηκε [2], [3]. χρήση ασπιρίνης συνδέεται με μειωμένο κίνδυνο για τον ορθοκολικό, του μαστού, του οισοφάγου, του πνεύμονα, του στομάχου και των ωοθηκών, και ασπιρίνη είναι τόσο χημειοπροληπτική και χημειοθεραπευτικό παράγοντα για τον καρκίνο του μαστού και του παχέος εντέρου [4] – [8]. Μια πρόσφατη έκθεση σχετικά με τις χημειοπροληπτική επιδράσεις της ασπιρίνης έδειξε ότι η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του παχέος εντέρου σε Σκωτία μειώθηκε σημαντικά στο γενικό πληθυσμό στη χαμηλότερη ημερήσια δόση ασπιρίνης (75 mg) και η μειωμένη συχνότητα εμφάνισης παρατηρήθηκε ακόμη και μετά από μόνο 5 yr χρήσης ασπιρίνης [7]. Σε μια άλλη μελέτη σχετικά με τα χημειοθεραπευτικά αποτελέσματα της ασπιρίνης σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, σε αναλογία κινδύνου 0,53 (για τη θνησιμότητα) παρατηρήθηκε σε ασθενείς που δεν χρησιμοποιούν το φάρμακο πριν από τη διάγνωση και αυτή η τιμή μειώθηκε σε 0,39 για ένα υποσύνολο των ασθενών που υπερεκφράζουν cyclooxygenase- 2 (COX-2) [5]

Αρκετές μελέτες σχετικά με τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα και μοντέλα όγκων του παχέος εντέρου έχουν επιβεβαιώσει ότι η ασπιρίνη αναστέλλει την ανάπτυξη και επάγει την απόπτωση σε αυτά τα συστήματα.? Ωστόσο, τα συγκεκριμένα αποτελέσματα της ασπιρίνης είναι κάπως μεταβλητή σε αυτές τις αναφορές. Για παράδειγμα, η ασπιρίνη ρυθμίζει προς τα κάτω bcl-2 έκφραση [9], αναστέλλει αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα, επιδεικνύει αντί-αγγειογόνο δραστηριότητα [10], [11], και αναστέλλει την WNT /β-κατενίνης μονοπάτι [12]. Dunlop και συνεργάτες απέδειξαν επίσης ότι η ασπιρίνη επαγόμενη μειορύθμιση των ΙκΒα σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα ενισχυμένη πυρηνική συσσώρευση του ΝΡκΒ συμπλόκου (ρ65 /ρ50) και αυτό έχει συνδεθεί με ένα προ-αποπτωτικό μονοπάτι σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [13] – [15]

Αιθυλ 2 -. [(2,3-δις (νιτροοξυ) προπυλ) δισουλφανυλ] βενζοϊκό (GT-094) είναι ένα συνθετικό νιτρο-μη-στεροειδές αντιφλεγμονώδες φάρμακο (NO-NSAID) και όπως η ασπιρίνη, GT-094 αναστέλλει επίσης τον καρκίνο του παχέος εντέρου αύξησης κυττάρων και όγκων [16], [17]. Μηχανιστικές μελέτες δείχνουν ότι η αντικαρκινική δράση του GT-094 οφείλεται, εν μέρει, σε ROS-εξαρτώμενη ρύθμιση προς τα κάτω της πρωτεΐνης ειδικότητας (Sp) παράγοντες μεταγραφής Sp1, SP3, Sp4 και Sp-ρυθμιζόμενα γονίδια που περιλαμβάνουν bcl-2, survivin, ανάπτυξη ηπατοκυττάρων υποδοχέα παράγοντα (c-Met), VEGF και του υποδοχέα της VEGFR1 [17]. Άλλα φάρμακα συμπεριλαμβανομένων NSAIDs όπως αναστολείς τολφεναμικό οξύ και COX-2 επίσης αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και ρυθμίζουν προς τα κάτω παράγοντες μεταγραφής Sp [18] – [26] και, στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τις επιδράσεις της ασπιρίνης επί πρωτεϊνών Sp και άλλα Sp- ρυθμιζόμενων γονιδίων συμπεριλαμβανομένων των β-κατενίνης. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ασπιρίνη και σαλικυλικό ρυθμίζουν προς τα κάτω Sp1, SP3, Sp4 και αρκετές Sp-ρυθμιζόμενο γονίδιο προϊόντα στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου και προσδιορίζει μια σημαντική οδός για την αντικαρκινική δράση της ασπιρίνης που είναι συνεπής με παρεμβολή RNA μελέτες (RNAi) στον οποίο knockdown Sp1, Sp3 και Sp4 σε καρκινικά κύτταρα αναστέλλει επίσης την ανάπτυξη και επάγει την απόπτωση [24] – [26]. Knockdown πρωτεϊνών Sp έδειξαν επίσης ότι β-κατενίνη είναι ένα Sp-ρυθμιζόμενο γονίδιο σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης, σε συνδυασμό με προηγούμενες αναφορές σχετικά με τους μηχανισμούς της ασπιρίνης μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, θα διευκολύνει επίσης την ανάπτυξη θεραπειών με ανάλογα ασπιρίνη και NSAID σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Οι αναφερόμενες αναλογίες σαλικυλικό /ασπιρίνης υψηλής ορού παρατηρήθηκαν σε ανθρώπινες μελέτες που χρησιμοποιούν ασπιρίνη [27] δείχνουν ότι το σαλικυλικό μπορεί να συμβάλλει σημαντικά στην αντικαρκινική δράση της ασπιρίνης σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου.

Πειραματικές Διαδικασίες

κυτταρικές γραμμές, τα αντιδραστήρια και τα αντισώματα

RKO, SW480, ΗΤ-29 και HCT-116 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκινώματος κόλου αποκτήθηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). RKO και SW480 κύτταρα διατηρήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο /Ham F-12 (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) με ερυθρό φαινόλης συμπληρωμένο με 0.22% όξινο ανθρακικό νάτριο, 5% εμβρυϊκό βόειο ορό, και 10 ml /L 100Χ αντιβιοτικό /αντιμυκητιακό διάλυμα (Sigma). ΗΤ-29 και HCT-116 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) με ερυθρό φαινόλης συμπληρωμένο με 0.22% όξινο ανθρακικό νάτριο, 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, και 10 ml /L 100Χ αντι-βιοτικά διάλυμα αντι-μυκητιακές (Sigma). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 150 cm

2 πλάκες καλλιέργειας σε αεροστεγή /CO

2 (95:5) ατμόσφαιρα στους 37 ° C και περάστηκαν περίπου κάθε 3-5 ημέρες. Όλα τα αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), εκτός διασπασμένου πολυ (ADP) ριβόζη πολυμεράση (PARP) και c-Met (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), Sp1, survivin και VEGF-R2 (Millipore, Temecula, CA), VEGFR1 και ρ65 (Abcam Inc. Cambridge, ΜΑ), και τα αντισώματα β-ακτίνης (Sigma-Aldrich). β-κατενίνης αγοράστηκε από Epitomics, Inc., Burlingame, CA. Το οξύ και σαλικυλικό νάτριο ακετυλοσαλικυλικό ΜΣΑΦ αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Ν, Ν, Ν ‘, Ν’-τετρακις (2-πυριδυλ μεθυλ) αιθυλενοδιαμίνη (TPEN), γλουταθειόνη (98%) (GSH), και λακτακυστίνη αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Dithiothretol (DTT) (98%) ελήφθη από την Boehringer Mannheim Corp, (Indianapolis, ΙΝ). Οι αναστολείς της κασπάσης 2, 8 και 9 και τις κασπάσες αναστολέα (Z-VAD-fmk) που αγοράστηκε από την Calbiochem (San Diego, CA). Leptomycin Β ήταν αναστολέας της πυρηνικής εξαγωγής που αγοράστηκαν από τον Enzo Επιστήμες της Ζωής International, Inc. (Plymouth Meeting, ΡΑ). Lipofectamine και Lipofectamine 2000 αγοράσθηκαν από την Invitrogen. Λουσιφεράση αντιδραστήριο ήταν από την Promega (Madison, WI). αντιδραστήριο β-γαλακτοσιδάσης ελήφθη από Tropix (Bedford, ΜΑ). κατασκεύασμα υποκινητή NFκB αγοράστηκε από Stratagene (Cedar Creek, TX). Τα μορφώματα υποκινητή του VEGF και survivin δόθηκαν από τους Drs. Gerhard Siemeister και Gunter Finkenzeller (Ινστιτούτο Μοριακής Ιατρικής, Κέντρο Βιολογίας Όγκων, Freiburg, Γερμανία) και ο Δρ Μ Zhou (Πανεπιστήμιο Emory, Ατλάντα, GA), αντίστοιχα. Sp1 και υποστηρικτής Sp3 κατασκευές ευγενικά από τους Drs. Carlos Cuidad και Veronique Noe (Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Βαρκελώνη, Ισπανία).

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων

RKO, SW480, ΗΤ-29 και HCT-116 κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου καλλιεργήθηκαν (3 × 10

4 ανά φρεάτιο) χρησιμοποιώντας ϋΜΕΜ: Ρ-12 μέσο Ham που περιείχε 2,5% απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) σε 12-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με έκδοχο ή τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της ασπιρίνης και σαλικυλικού νατρίου. Μετά από 24, 48 και 72 ώρες αγωγής, τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μετρητή σωματιδίων Coulter Ζ1. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SE για κάθε προσδιορισμό.

αννεξίνης V χρώση

Η απόπτωση, νεκρωτικά και υγιή κιτ ανίχνευσης κυτταρικού αγοράστηκε από Biotium, Inc (Hayward , CA). RKO, SW480, ΗΤ-29 και HCT-116 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου (7.5 × 10

4) σπάρθηκαν σε Lab-Tek δύο θαλάμων γυάλινες πλάκες καλύμματος και αφήνονται να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Μετά τη θεραπεία με ασπιρίνη (10 mM) για 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) δύο φορές και επωάστηκαν με FITC Annexin V, αιθίδιο ομοδιμερές III και Hoechst 33342 σε αννεξίνης V ρυθμιστικό σύνδεσης για 20 λεπτά σύμφωνα με τον κατασκευαστή του οδηγίες στο πρωτόκολλο. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης αννεξίνης V και ανιχνεύονται για flouroscence με ψηφιακό μικροσκόπιο φθορισμού.

δοκιμασίες siRNA παρεμβολή

siRNAs για Sp1, SP3, SP4, και Lamin αγοράστηκαν από Sigma- Aldrich. Τα συμπλέγματα siRNA που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη έδειξε ως εξής:

Lamin: SASI_Hs02_00367643

Sp1: SASI_Hs02_00363664

Sp3 5′-GCG GCA GGU GGA GCC UUC ACU ΤΤ

Sp4 5′-GCA GUG ACA CAU UAG UGA GCT Τ

RKO και καρκίνο του παχέος εντέρου SW480 κυτταρικές γραμμές σπάρθηκαν (6 × 10

4 ανά ml) σε πλάκες 6 φρεατίων σε DMEM: F-12 μέσο Ham συμπληρωμένο με 2,5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS χωρίς αντιβιοτικό και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 1 d. Knockdown του SP1, SP3, Sp4 μεμονωμένα ή ένας συνδυασμός όλων των 3 πρωτεϊνών διεξάγονται χρησιμοποιώντας κατάλληλα siRNA μαζί με iLamin ως έλεγχος πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντιδραστηρίου επιμόλυνσης LipofectAMINE 2000 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Δοκιμασία μορφομετατροπής και λουσιφεράσης

RKO και SW480 κύτταρα καρκίνου κόλου (1 × 10

5 ανά φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε 12 φρεατίων πλάκες σε μέσο F-12 DMEM /Ham συμπληρωμένο με 2,5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS. Μετά από 24 ώρες, διάφορες ποσότητες DNA [δηλαδή, 0,4 μg pGL3-Luc, 0,04 μg β-γαλακτοσιδάση, και 0.4 μg pNFκB-Luc (4) -Luc] επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο LipofectAMINE 2000 σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά από 5 ώρες από την επιμόλυνση, το μίγμα διαμόλυνσης αντικαταστάθηκε με πλήρες μέσο που περιέχει είτε όχημα (DMSO) ή την υποδεικνυόμενη ένωση σε DMSO.

Για μελέτες παρεμβολή RNA, RKO και SW480 του παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με siRNA για Sp1, SP3, SP4 ή Lamin μαζί με διάφορες ποσότητες DNA για pGL3-Luc ή 0,4 μg pNFκB-Luc. Μετά από 22 ώρες, τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν με 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης 1Χ ρεπόρτερ, και τα εκχυλίσματα κυττάρων (30 mL) χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασίες λουσιφεράσης και β-γαλακτοσιδάσης. Ένα φωτόμετρο Lumicount χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό λουσιφεράσης και β-γαλακτοσιδάσης δραστηριότητες και τις δραστηριότητες λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκαν σε β-γαλακτοσιδάση δραστικότητα.

κηλίδες Western

RKO, SW480, ΗΤ-29 και HCT- 116 κόλον καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε DMEM: F-12 του Ham που περιείχε 2,5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS και, μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με φορέα (DMSO) ή τα υποδεικνυόμενα ενώσεις. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με χρήση ρυθμιστικού υψηλού άλατος (50 mM HEPES, 0,5 mol /L NaCl, 1.5 mM MgCl

2, 1 mM EGTA, 10% γλυκερόλη, και 1% Triton-X-100) και 10 ml /L Protease κοκτέιλ αναστολέα (Sigma-Aldrich). Μετά από φυγοκέντρηση των κυτταρολυμάτων σε 15.000

g

για 15 λεπτά στους 4 ° C, τα υπερκείμενα ανακτήθηκαν και πρωτεΐνη ποσοτικοποιήθηκε με την δοκιμασία πρωτεΐνης Bradford. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης (15-60 μg) επωάστηκαν για 5-10 λεπτά στους 100 ° C, μαζί με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης 5Χ και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 7,5 έως 12% δωδεκυλ νάτριο πηκτώματα θειικού-πολυακρυλαμιδίου στα 120 V για 3 έως 4 ώρες. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου με υγρή ηλεκτροστύπωσης σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 25 mM Tris, 192 mM γλυκίνη και 20% μεθανόλη για 1.5 ώρα σε 180 mA. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 45 λεπτά με 5% TBST-Blotto (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, ρΗ 8,0, 0,05% Triton Χ-100, και 5% άπαχο ξηρό γάλα) και επωάζονται σε φρέσκο ​​5% TBST-Blotto με 1:500 πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα με ήπια ανακίνηση στους 4 ° C. Μετά από πλύση δύο φορές με TBST για 10 λεπτά, η μεμβράνη επωάστηκε με δευτερογενές αντίσωμα (1:5000) σε 5% Blotto TBST-επί 3-4 ώρες με ήπια ανακίνηση. Η μεμβράνη πλύθηκε δύο φορές με TBST για 10 λεπτά, επωάστηκαν με 2 ml υποστρώματος χημειοφωταύγειας (Millipore, Temecula, CA) για 1 λεπτό, και εκτέθηκαν σε σταθμό εικόνας Kodak 4000 mm Pro (Carestream Health, Rochester, ΝΥ).

ξενομοσχεύματος μελέτες σε αθυμικούς ποντικούς

Θηλυκά αθυμικά γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από την Harlan Laboratories (Indianapolis, ΙΝ). Τα ποντίκια στεγάστηκαν και διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνου σε εγκαταστάσεις εγκεκριμένες από την Αμερικανική Ένωση για τη Διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων και σύμφωνα με τους ισχύοντες κανονισμούς και τα πρότυπα του Υπουργείου Γεωργίας των Ηνωμένων Πολιτειών, του Υπουργείου Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών των Ηνωμένων Πολιτειών. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από το Texas A & amp? M University Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (IACUC) (AUP # 2012 έως 131). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Για την παραγωγή όγκων, RKO κύτταρα συλλέχθηκαν από καλλιέργειες ταπήτιο από μια σύντομη έκθεση σε 0,25% θρυψίνη και 0,02% αιθυλενοδιαμινοτετραοξεικό οξύ. Η επεξεργασία με θρυψίνη διακόπτεται με μέσο που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, και τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά σε μέσο άνευ ορού και επαναιωρήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό. Μόνο εναιωρήματα που αποτελούνται από μονά κύτταρα με 90% βιωσιμότητα χρησιμοποιήθηκαν για τις ενέσεις. Ένα ξενομοσχεύματος ιδρύθηκε με υποδόρια ένεση των κυττάρων (3 χ 10

6) στα πλευρά των μεμονωμένων ποντικών. Οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν επί 6 d έως ότου ήταν προφανής. Τα ποντίκια στη συνέχεια τυχαιοποιήθηκαν σε δύο ομάδες των 6 ποντικών ανά ομάδα και δοσολογείται από του στόματος καθετηριασμό σε αραβοσιτέλαιο 200 mg /kg /ημέρα (εξουδετερώθηκε με ισομοριακή συγκέντρωση του ΝαΟΗ) της ασπιρίνης σε κάθε ημέρα για 14 d. Οι ποντικοί ζυγίστηκαν, και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε δεύτερη ημέρα με δαγκάνες να επιτραπεί ο υπολογισμός του όγκου των όγκων: V = LW

2/2, όπου τα L και W ήταν μήκος και το πλάτος, αντίστοιχα. Μετά από 14 d, τα ζώα θυσιάστηκαν? τελικό σώμα και όγκου βάρη προσδιορίστηκαν και απεικονίζονται. Στο τέλος του πειράματος, τα κύρια σπλαχνικά όργανα και οι όγκοι συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για έκφραση της πρωτεΐνης Sp και επαγωγή της απόπτωσης χρησιμοποιώντας κηλίδες Western και χρώση TUNEL αντίστοιχα.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημασία των διαφορών προσδιορίστηκε με ανάλυση διακύμανσης και Student t-test, και τα επίπεδα των πιθανοτήτων παρατηρήθηκαν. Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων. IC

50 τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης και εκφράζεται σε μΜ, κατά διαστήματα εμπιστοσύνης 95%.

Αποτελέσματα

Η ασπιρίνη αναστέλλει την ανάπτυξη και επάγει την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα κόλου

σε αυτή τη μελέτη, διαφορετικές συγκεντρώσεις (2.5-10 mM) της ασπιρίνης ανέστειλε την ανάπτυξη των SW480, RKO, ΗΤ29 και κύτταρα HCT116 σε μια περίοδο 3 ημερών (Σχ. 1Α και 1Β), και IC

50 τιμές για ασπιρίνη επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης ήταν της τάξεως των 2,5-5 mM σε όλες τις κυτταρικές σειρές 4. Η υψηλή δόση (10 mM) της ασπιρίνης χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των προ-απόπτωσης αυτής της ένωσης μετά από θεραπεία μόνο για 24 ώρες και τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ασπιρίνη αυξημένη χρώση αννεξίνης V σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου 4 (Εικ. 1 C). Οι προ-απόπτωσης της ασπιρίνης (5 και 10 mM) ερευνήθηκαν περαιτέρω σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου με προσδιορισμό αλλαγές στην έκφραση των πρωτεϊνών επιβίωση bcl-2 και survivin και επαγωγή της διάσπασης της ΡΑΚΡ κασπάσης-εξαρτώμενη. Η ασπιρίνη προκάλεσε συγκέντρωσης- και χρονο-εξαρτώμενη ρύθμιση προς τα κάτω της survivin και bcl-2 και επαγόμενη από διάσπαση PARP, ενός δείκτη της απόπτωσης (Σχ. 1D και 1Ε).

Αναστολή SW480 και RKO (Α) και ΗΤ29 και HCT116 (Β) του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 2,5-10 mM ασπιρίνη για 3 ημέρες, και οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. Η επαγωγή της χρώσης αννεξίνης V (C) και αποπτωτικών αποκρίσεις σε RKO και SW480 (D) και ΗΤ29 και κύτταρα HCT116 (Ε). χρώση αννεξίνης V προσδιορίσθηκε όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. Η έκφραση των αποπτωτικών πρωτεϊνών διάσπασης της ΡΑΚΡ προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου, όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. Αποτελέσματα στο (Α) και (Β) είναι μέσα ± SE για 3 Προσδιορισμός επαναληπτικές για κάθε ομάδα θεραπείας, και σημαντική (ρ & lt? 0,05) αναστολή υποδεικνύεται (*)

Η

Η ασπιρίνη και το σαλικυλικό ρυθμίζει προς τα κάτω Sp1. , SP3, Sp4 και Sp-ρυθμιζόμενα γονίδια

Προηγούμενες μελέτες με παρεμβολή RNA (RNAi) δείχνουν ότι και οι δύο survivin και bcl-2 ρυθμίζονται από Sp1, Sp3 και Sp4 σε καρκινικά κύτταρα [17], [22], [24] – [26]. Ως εκ τούτου, RKO, SW480, ΗΤ29 και HCT116 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 και 10 mM ασπιρίνη για 24 ή 48 ώρες και η ανάλυση στυπώματος western έδειξε ότι υπήρχε μια συγκέντρωσης- και χρονο-εξαρτώμενη μείωση στην πρωτεΐνες Sp1, Sp3 και Sp4 σε όλες τις 4 κυτταρικές γραμμές (Σχ. 2Α και 2Β). Επιπλέον, η θεραπεία του RKO, SW480, ΗΤ-29 και HCT116 του κόλου με 5 ή 10 mM ασπιρίνη για 24 ή 48 ώρες μειώθηκε επίσης έκφραση αρκετών γονιδιακών προϊόντων ρυθμίζεται από Sp1, Sp3 και Sp4 [24] – [29] και αυτά περιλαμβάνουν VEGF, VEGFR1, κυκλίνη D1 και ο-ΜΕΤ πρωτεϊνών (Σχ. 2C και 2D), και οι επιδράσεις της ασπιρίνης επί της έκφρασης τους ήταν τόσο συγκέντρωσης- και χρονο-εξαρτώμενη.

η μειωτική ρύθμιση των πρωτεϊνών Sp σε RKO και SW480 (Α) και ΗΤ29 και HCT116 (Β) και Sp-ρυθμίζονται γονιδιακών προϊόντων σε RKO και SW480 (C) και ΗΤ29 και κύτταρα HCT116 (D). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 ή 10 mM ασπιρίνη για 24 ή 48 ώρες, και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου αναλύθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western, όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. Τα αποτελέσματα είναι τυπικά των διπλών πειραμάτων. (Ε) Η ασπιρίνη μειώνει δραστικότητα γονιδίου αναφοράς. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pSp1For4, pSp3For5, pVEGF και pSurvivin και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή ασπιρίνη (5 ή 10 mM). Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι ± SE (3 επαναλήψεις) και σημαντική (ρ & lt? 0,05). αναστολή υποδεικνύεται (*)

Η

Ερευνήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της 5 και 10 mM ασπιρίνη για ενεργότητα λουσιφεράσης σε RKO και τα κύτταρα SW480 επιμολυσμένα με κατασκευάσματα που περιέχουν ένθετα υποκινητή πλούσια σε GC από το Sp1 (pSp1For4, -751 έως -20), Sp3 (pSp3For5, -417 έως -38), VEGF (pVEGF, -2018 έως +50) και survivin ( pSurvivin, -269 να +49) γονίδια (Σχ. 2Ε). Με την εξαίρεση του μορφώματος VEGF, 5 και 10 mM ασπιρίνη μειώθηκαν σημαντικά λουσιφεράσης δραστηριότητα και τα αποτελέσματα αυτά συσχετίζονται με την μειωμένη έκφραση του αντίστοιχου Sp1, SP3, VEGF και πρωτεΐνες survivin σε RKO κύτταρα και SW480. Η αύξηση στη δραστηριότητα λουσιφεράσης σε κύτταρα RKO σε επεξεργασία με 5 mM ασπιρίνη και επιμολύνθηκαν με pVEGF μπορεί να οφείλεται στη σχετικά αργή ρύθμιση προς τα κάτω αυτής της πρωτεΐνης η οποία παρατηρήθηκε μόνο μετά από 48 ώρες σε συγκέντρωση 10 mM, υποδηλώνοντας ότι άλλες οδοί ασπιρίνη επαγόμενη μπορεί επίσης να ενεργοποιεί VEGF.

η ασπιρίνη μεταβολίζεται ταχέως σε σαλικυλικό [27] και ερευνήθηκε επίσης τα αποτελέσματα της σαλικυλικού επί της ανάπτυξης των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, πρωτεΐνες Sp και Sp-ρυθμιζόμενα γονίδια (Εικ. 3). Σαλικυλικό (άλας νατρίου) (2.5-10 mM) επίσης ανέστειλε την ανάπτυξη όλων των 4 κυτταρικών σειρών (Σχ. 3Α και 3Β), και τα ανασταλτικά αποτελέσματα ανάπτυξης ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε για ασπιρίνη (Σχ. 2Α και 2Β). Η αναστολή της ανάπτυξης συνοδεύτηκε από την εξαρτώμενη από το χρόνο μειορύθμιση του SP1, SP3, Sp4 και Sp-ρυθμιζόμενη γονιδιακών προϊόντων (bcl-2, κυκλίνη D1, survivin και VEGF) σε RKO και SW480 (Εικ. 3C) και HCT116 και ΗΤ29 (εικ. 3D) κύτταρα. Αυτό το πρότυπο των αποκρίσεων για το σαλικυλικό νάτριο ήταν συγκρίσιμη με εκείνη που παρατηρείται για ασπιρίνη (Σχ. 1 και 2) και παρόμοιες επιδράσεις παρατηρήθηκαν επίσης για το σαλικυλικό μεθύλιο (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), το οποίο είναι επίσης μεταβολίζεται ταχέως προς σαλικυλικό.

Αναστολή του RKO και SW480 (Α) και HCT116 και ΗΤ29 (Β) την ανάπτυξη των κυττάρων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2,5-10 mM σαλικυλικό νάτριο για 3 ημέρες, και οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. Πρωτεΐνη μειορρύθμιση σε RKO και SW480 (C) και HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα (D). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 ή 10 mM σαλικυλικό για 24 ή 48 ώρες, και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου αναλύθηκαν με στυπώματα Western, όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες.

Η

Ασπιρίνη επαγόμενη καταστολή της ΝΡκΒ και β-κατενίνης οφείλεται, εν μέρει, στην Sp-μειορρύθμιση

Εχει προηγουμένως αναφερθεί ότι η ασπιρίνη ενισχυμένη συσσώρευση πυρηνικών ΝΡκΒ [13] – [15] και αυτό ερευνήθηκε περαιτέρω σε RKO κύτταρα και SW480 επεξεργασία με 5 και 10 mM ασπιρίνη για 48 ώρες. Επίπεδα κυτοσολικής επίπεδα ρ65 και ρ50 μειώθηκαν, ενώ τα επίπεδα της πυρηνικής ρ65 και ρ50 ήταν σχετικά αμετάβλητη μετά από θεραπεία με ασπιρίνη (Σχήματα 4Α και 4Β.) Και τα αποτελέσματα αυτά διέφεραν με προηγούμενες μελέτες [13] – [15]. Επιπλέον, τα συνολικά επίπεδα των πυρηνικών πρωτεϊνών ήταν & lt? 10% των κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών και αυτό επιβεβαιώθηκε με ανάλυση western blot των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου από κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 5 ή 10 mM ασπιρίνη η οποία έδειξε ότι αμφότερες οι πρωτεΐνες ρ65 και ρ50 μειώθηκαν στις δύο κυτταρικές σειρές εντός 48 ωρών μετά την αγωγή με ασπιρίνη (Σχ. 4Α και 4Β). Η ασπιρίνη μείωσε επίσης την ενεργότητα λουσιφεράσης σε κύτταρα SW480 και RKO επιμολύνονται με ένα pNFκB-Luc κατασκεύασμα (Εικ. 4C) και αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με την παρατηρηθείσα αρνητική ρύθμιση και των δύο πρωτεϊνών ρ65 και ρ50 (Σχ. 4Α και 4Β). Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν ότι η ασπιρίνη μειωμένη έκφραση β-κατενίνης σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [12] και τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν ότι 5-10 mM ασπιρίνη μειώνει επίσης την έκφραση β-κατενίνης σε RKO και SW480 καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα (Σχ. 4D).

Μειωμένη p65 /ρ50 σε RKO (Α) και τα κύτταρα SW480 (Β). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες με 5 ή 10 mM, και ολικού κυττάρου, πυρηνικά και κυτοσολικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western, όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. Επίπεδα των πρωτεϊνών ρ65 και ρ50 (σε σχέση με την β-ακτίνη) σε προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου προσδιορίσθηκαν ποσοτικά από 3 πειράματα επαναληπτικές και ήταν σημαντικά μειωμένη από την ασπιρίνη. (Γ) Η ασπιρίνη μειώνει ΝΡκΒ-Ιυο. Το κατασκεύασμα διαμολύνθηκε σε RKO κύτταρα και SW480 σε επεξεργασία με DMSO ή ασπιρίνη, και η δραστικότητα της λουσιφεράσης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. Τα αποτελέσματα είναι μέσοι όροι ± SE (3 επαναλήψεις) και σημαντική (ρ & lt? 0,05) αναστολή υποδεικνύεται (*). (Δ) Η ελαττωμένη β-κατενίνης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 ή 10 mM ασπιρίνη για 48 ώρες, και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου αναλύθηκαν με στυπώματα Western, όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες.

Η

Από ΝΡκΒ (ρ65) και οι προαγωγοί β-κατενίνης περιέχουν πλούσιες σε GC θέσεις δέσμευσης Sp [28], [29], χρησιμοποιήσαμε RNAi για τον προσδιορισμό του ρόλου του SP1, Sp3 και Sp4 στη ρύθμιση του p65, ρ50 και β-κατενίνης σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. RKO και SW480 κύτταρα επιμολύνθηκαν με μικρά ανασταλτική RNAs στόχευσης Sp1 (iSp1), Sp3 (ISP3), και Sp4 (iSp4) μόνα τους και σε συνδυασμό (iSp1 /3/4). Το σχήμα 5Α δείχνει ότι κάθε άτομο ολιγονουκλεοτίδιο μειωμένη έκφραση του ατομικού του στόχου της (SP1, Sp3 και SP4) και iSp1 /3.4 γκρέμισε τις τρεις πρωτεΐνες. iSp1 μειώθηκε επίσης έκφραση της Sp4 (αλλά όχι SP3) και αυτό είναι συμβατό με προηγούμενες μελέτες που δείχνουν διασταυρούμενη ρυθμιστικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των παραγόντων Sp μεταγραφής λόγω πλούσια σε GC υποστηρικτές τους [22], [25]. Το σχήμα 5Β απεικονίζει κύτταρο μεταβλητής διαφορές στα αποτελέσματα της iSp1, ISP3 και iSp4 στην έκφραση ρ65 σε RKO και κυττάρων SW480 όπου Sp1, Sp3 και Sp4 knockdown οδήγησε σε μικρές αλλαγές στην ρ65 σε κύτταρα RKO και Sp1 και σε μικρότερο βαθμό Sp4 knockdown μειώθηκε p65 σε SW480 κύτταρα. iSp1 /3/4 για (συνδυασμένη ολιγονουκλεοτίδια) μειωμένη έκφραση p65 στις δύο κυτταρικές σειρές, ενώ παρατηρήθηκαν ελάχιστες ανεπιθύμητες για ρ50. Έτσι, ασπιρίνη επαγόμενη μειορύθμιση της ρ50 (Σχ. 4Α και 4Β) ήταν Sp-ανεξάρτητη. Το Σχήμα 5C δείχνει ότι iSp1 /3/4 για μειώθηκε επίσης δραστικότητα λουσιφεράσης σε RKO (90%) και SW480 (40%) κύτταρα επιμολυσμένα με το ΝΡκΒ-Ιυο κατασκεύασμα, και τις διαφορετικές επιπτώσεις των Sp knockdown σε αυτά τα κύτταρα δείχνουν ένα πιο κυρίαρχο ρόλο για Sp-εξαρτώμενη ρύθμιση του ΝΡκΒ στον RKO από τα κύτταρα SW480. Sp knockdown (συνδυασμένη) μειώθηκαν επίσης πρωτεΐνη β-κατενίνης σε RKO και τα κύτταρα SW480 και τα αποτελέσματα της knockdown μεμονωμένων Sp πρωτεϊνών υποδεικνύουν ότι Sp1 και Sp4 είναι οι κυρίαρχοι παράγοντες μεταγραφής που απαιτείται για την συστατική έκφραση της β-κατενίνης σε κύτταρα RKO, ενώ knockdown του Sp1 , Sp3 και Sp4 να μειώσουν τα επίπεδα της β-κατενίνης πρωτεΐνη στα κύτταρα SW480 (Εικ. 5D). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι μελέτες RNAi δείχνει ότι η διάσπαση PARP (απόπτωση) προκαλείται κυρίως μετά από νοκ ντάουν της Sp3 τόσο RKO και τα κύτταρα SW480 (Εικ. 5Ε).

Νοκ ντάουν του SP1, SP3, Sp4 και Sp1 /4.3 (Α) και ρ65 /ρ50 (Β) σε καρκινικά κύτταρα κόλου. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με διάφορα ολιγονουκλεοτίδια, και προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου αναλύθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. (C) Νοκ ντάουν του Sp1 /3.4 (συνδυασμένη) αναστέλλει NFκB-Luc. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με iLamin (έλεγχος) και iSp1 /3/4 για (συνδυασμένη ολιγονουκλεοτίδια) και ΝΡκΒ-Ιυο και δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι ± SE (3 επαναλήψεις), και σημαντικά (ρ & lt? 0,05) μειωμένη δραστικότητα υποδεικνύεται (*). Sp knockdown μειώνει β-κατενίνης (D) και προκαλεί διάσπαση PARP (Ε). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με διάφορα ολιγονουκλεοτίδια, και προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου αναλύθηκαν με στυπώματα Western, όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες.

Η

Μηχανισμός ασπιρίνη επαγόμενη μειορύθμιση του SP1, Sp3 και Sp4

Αρκετές οδοί έχουν περιγραφεί για αυξημένη αποικοδόμηση Sp σε κυτταρικές σειρές καρκίνου και σε αυτά περιλαμβάνονται η ενεργοποίηση του πρωτεασωμάτων, κασπασών και ROS [17] – [20], [22] – [26] και επίσης ένα μονοπάτι που περιλαμβάνει την πυρηνική εξαγωγή του Sp1 που ακολουθείται από πρωτεολυτική αποικοδόμηση στο κυτοσόλιο [30]. Η ανάλυση στυπώματος Western των πυρηνικών και κυτοσόλιο κλάσματα από RKO και τα κύτταρα SW480 δείχνει ότι Sp1, Sp3 και Sp4 είναι εντοπισμένη στον πυρήνα και θεραπεία με ασπιρίνη μειωμένη Sp1, Sp3 και τα επίπεδα πρωτεΐνης Sp4 στον πυρήνα χωρίς καμία προφανή μετάθεση στο κυτοσόλιο (Σχ. 6Α). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν μετά ταυτόχρονης θεραπείας με ασπιρίνη και τον αναστολέα της πυρηνικής εξαγωγής leptomycin Β (συνδυασμένο), υποδεικνύοντας ότι η πυρηνική εξαγωγή του SP1, το SP3 ή Sp4 δεν ήταν απαραίτητη για την ασπιρίνη που προκαλείται ρύθμιση προς τα κάτω του SP1, Sp3 και SP4. Άλλοι παράγοντες, όπως το νιτρο-NSAID GT-094 και betulinic οξύ μειώθηκε πρωτεΐνες Sp σε RKO και τα κύτταρα SW480 μέσω ROS-εξαρτώμενη επαγωγή Sp μεταγραφικός καταστολέας ZBTB10 και αυτή η απόκριση ήταν εξασθενημένος από αντιοξειδωτικά όπως η GSH ή DTT [17], [31 ]? Ωστόσο, τα αποτελέσματα στην Εικόνα 6Β δείχνουν ότι αυτά τα αντιοξειδωτικά δεν αποκλείουν ασπιρίνη επαγόμενη μειορύθμιση των πρωτεϊνών Sp. Τα αποτελέσματα των προκαταρκτικών μελετών δείχνουν ότι η ασπιρίνη επαγόμενη μειορύθμιση των πρωτεϊνών Sp επίσης δεν εμποδίζεται από αναστολείς πρωτεασώματος (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), αλλά επηρεάστηκε από της ταυτόχρονης θεραπείας με τον αναστολέα για τις κασπάσες Z-VAD-fmk. Τα Σχήματα 6C και 6D δείχνουν ότι η ασπιρίνη επαγόμενη Sp κατιούσα ρύθμιση σε RKO και SW480 κύτταρα ανεστάλη μετά της ταυτόχρονης θεραπείας με τον αναστολέα κασπάσες (Ζ-VAD-fmk), κασπάση-2 (Ζ-VDVAD-fmk) και κασπάσης-8 (Ζ- IETD-fmk) αναστολείς, αλλά μόνο μερικώς μπλοκαριστεί με τον κασπάσης 9 (Ζ-LEHD-fmk) αναστολέα.

(Α) Επίδραση της leptomycin Β κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 mM ασπιρίνη σε παρουσία ή απουσία leptomycin Β για 48 ώρες, και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου αναλύθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western, όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. Επιδράσεις της αντιοξειδωτικά (Β) και αναστολείς κασπάσης (C, D) σχετικά με ασπιρίνη επαγόμενη Sp πρωτεΐνη μειορρύθμιση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, ασπιρίνη μόνη της ή σε συνδυασμό με αντιοξειδωτικά ή αναστολείς κασπάσης, και μετά από 48 ώρες, λύματα ολόκληρων κυττάρων αναλύθηκαν με στυπώματα Western, όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες.

Η

Favier και συνεργάτες [ ,,,0],32], [33] έχουν αναφερθεί στο παρελθόν σε κύτταρα HeLa ότι ο ψευδάργυρος αποσιδήρωσης από το διαπερατό χηλικοποιητή μεταλλικών ιόντων TPEN ενεργοποιηθεί πολλαπλές κασπάσες (3, 8 και 9) και μειωμένη έκφραση των πρωτεϊνών Sp1, Sp3 και Sp4 που περιέχουν ιόντα ψευδαργύρου σε τους καταλυτικές θέσεις. Θεραπεία των RKO και κυττάρων SW480 με 25 ή 50 μΜ TPEN για 18 ώρες επαγόμενη διάσπαση PARP και ενεργοποίησης (διάσπαση) των κασπασών 8, 9, 3 και 7 (εικ. 7Α). Ο κρίσιμος ρόλος της εξάντλησης ψευδαργύρου στην διαμεσολάβηση αυτήν την απόκριση και προς τα κάτω ρύθμιση των πρωτεϊνών Sp επιβεβαιώθηκε με κατεργασία των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου με TPEN μόνη ή σε συνδυασμό με 50 μΜ ZnSO

4 (Σχ. 7Β). TPEN μειωμένη έκφραση του SP1, Sp3 και Sp4 και την προσθήκη ZnSO

4 αντιστραφεί πλήρως το TPEN-εξαρτώμενη ρύθμιση προς τα κάτω των πρωτεϊνών Sp1, Sp3 και SP4. Όπως TPEN, ασπιρίνη επάγεται επίσης διάσπαση PARP και ενεργοποίησης (διάσπαση) των κασπασών 8, 9, 3 και 7 (Σχ. 7C). Ασπιρίνη-επαγόμενη διάσπαση PARP ανεστάλη επίσης με θειικό ψευδάργυρο (Σχήμα 7D).? Επιπλέον, η θεραπεία των RKO και SW480 κυττάρων με ασπιρίνη μόνη ή σε συνδυασμό με 50 μΜ ZnSO

4 δείχνουν ότι ZnSO

4 μειώθηκε επίσης ασπιρίνη μεσολάβηση μειορύθμιση του SP1, Sp3 και Sp4 (Εικ. 7Ε), επιβεβαιώνοντας έτσι ότι ασπιρίνη, όπως TPEN, επάγει κασπάσης-εξαρτώμενη διάσπαση των πρωτεϊνών Sp που οφείλεται σε ψευδάργυρο εξάντληση ιόντων.

(Α) TPEN επάγει την ενεργοποίηση (διάσπαση) των κασπασών. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 25 ή 50 μΜ TPEN για 18 ώρες, και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου αναλύθηκαν με στυπώματα Western, όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. (Β) TPEN μειώνει Sp έκφραση πρωτεΐνης και θειικό ψευδάργυρο μπλοκ των επιπτώσεων των TPEN επί Sp μειορρύθμιση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΜ ZnSO

4 για 18 ώρες, και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου αναλύθηκαν με western blots. (Γ) Η ασπιρίνη ενεργοποιεί κασπάσες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ασπιρίνη για 48 ώρες, και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου αναλύθηκαν με στυπώματα Western όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. (D) Η ασπιρίνη-επαγόμενη διάσπαση PARP μπλοκάρεται από ZnSO

4. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες με μόνη ή σε συνδυασμό με ασπιρίνη ZnSO

4 και PARP διάσπαση αναλύθηκε με κηλίδες Western των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου. (Ε) οι συνέπειες της ZnSO

4 στην ασπιρίνη που προκαλείται αρνητική ρύθμιση των πρωτεϊνών Sp.