Αφηρημένο

Ιστορικό

Η αιτιολογία της δευτερογενούς καρκίνου σε ασθενείς με καρκίνο της παιδικής ηλικίας είναι σε μεγάλο βαθμό ασαφής. Η έκθεση των φυσιολογικών σωματικών κυττάρων σε ακτινοβολία ή /και χημειοθεραπεία μπορεί να βλάψουν το DNA και, εάν όχι όλες οι βλάβες του DNA είναι κατάλληλα στερεωμένα, η λανθασμένη επισκευή μπορεί να οδηγήσει σε παθολογικές συνέπειες. Είναι εύλογο να υποθέσουμε ότι οι γενετικές διαφορές, δηλαδή στις οδούς υπεύθυνοι για τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και την επιδιόρθωση του DNA, παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του δευτερογενούς καρκίνου.

Μεθοδολογία /Ευρήματα

Για την αναγνώριση παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την ευαισθησία για τη δεύτερη σχηματισμό του καρκίνου, θα προσληφθούν 20 άτομα που επέζησαν από μια παιδική κακοήθειας και στη συνέχεια να αναπτύξει ένα δεύτερο καρκίνο καθώς και το 20 προσεκτικά συμφωνημένα άτομα ελέγχου με την παιδική κακοήθειας, αλλά χωρίς δεύτερη καρκίνο. Με μικροσυστοιχίες αντισώματος, εμείς διαλογή των πρωτογενών ινοβλαστών συμφωνημένα ασθενών για διαφορές στην ποσότητα των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την επισκευή αντιπροσωπευτικά DNA. Βρήκαμε ιδιοσυστατικά μειωμένα επίπεδα RAD9A και αρκετές άλλες πρωτεΐνες επιδιόρθωσης DNA σε δύο ασθενείς με καρκίνο, σε σύγκριση με ασθενείς με ένα καρκίνο. Το επίπεδο της πρωτεΐνης RAD9A αυξήθηκε σε απόκριση σε βλάβη του DNA, ωστόσο σε μικρότερο βαθμό στους ασθενείς δύο καρκίνο. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης του mRNA με πραγματικού χρόνου RT PCR αποκάλυψε χαμηλότερα

RAD9A

επίπεδα mRNA τόσο μη επεξεργασμένα και 1 Gy κύτταρα γ-ακτινοβολημένα ασθενών δυο-καρκίνο.

Συμπεράσματα /Σημασία

Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την ιδέα ότι οι πρωτεΐνες διαμόρφωσης της RAD9A και άλλα σύλληψη του κυτταρικού κύκλου και στην επιδιόρθωση του DNA συμβάλλουν στον κίνδυνο ανάπτυξης μιας δεύτερης κακοήθειας σε ασθενείς με καρκίνο της παιδικής ηλικίας

Παράθεση:. Weis Ε, Schoen η, Victor Α, Spix C, Ludwig M, Schneider-Raetzke B, et al. (2011) Μειωμένη mRNA και πρωτεΐνης έκφραση της γονιδιωματικής Φύλακας RAD9A στην Πρωτοβάθμια ινοβλάστες των Ατόμων με Παιδικής και ανεξάρτητο δεύτερο Καρκίνου. PLoS ONE 6 (10): e25750. doi: 10.1371 /journal.pone.0025750

Επιμέλεια: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Γαλλία

Ελήφθη: 1 Ιούλη του 2011? Αποδεκτές: 9η Σεπτεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 3η Οκτωβρίου 2011

Copyright: © 2011 Weis et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Stiftung Rheinland-Pfalz für Καινοτομίας (σχέδιο αριθ. 698) και το FAZIT-Stiftung. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στις περισσότερες περιπτώσεις, ο καρκίνος είναι μια πολυπαραγοντική ασθένεια που προκαλείται από περιβαλλοντικούς κινδύνους, ανθυγιεινό τρόπο ζωής και /ή γενετικών παραγόντων [1]. Επειδή τα παιδιά είναι συνήθως λιγότερο εκτεθειμένες σε ένα δυσμενές περιβάλλον ή τον τρόπο ζωής από τους ενήλικες, οι γενετικοί παράγοντες είναι πιθανό να είναι ένας πιο σημαντικός [2]. Ωστόσο, μόνο ένα μικρό ποσοστό (1-10%) των καρκίνων της παιδικής ηλικίας έχει μια γνωστή γενετική αιτιολογία [3]. Είναι γνωστό ότι η ακτινοβολία και άλλους παράγοντες βλάβης του DNA που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του καρκίνου είναι σε θέση να προκαλέσει το σχηματισμό της λευχαιμίας και άλλων καρκίνων [4], [5]. Ακτινοβολία ή /και χημειοθεραπεία αποτελούν παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη μιας δεύτερης κακοήθειας, τα οποία δεν μπορούν να ταξινομηθούν ως άφεση του πρωτογενούς όγκου. Επειδή σχετικά λίγοι επιζώντες του καρκίνου της παιδικής ηλικίας να αναπτύξουν μια δεύτερη κακοήθεια [6], η γενετική προδιάθεση μπορεί να εμπλέκονται.

Τα κύτταρα εκτίθενται συνεχώς σε ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες που βλάπτουν το DNA. Υπάρχουν αρκετές οδούς που παρακολουθεί και να διατηρούν την ακεραιότητα του γονιδιώματος. Κύτταρα έχουν πολλαπλά σημεία ελέγχου που καθυστερούν παροδικά την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου για να δοθεί επιπλέον χρόνος για την επιδιόρθωση του DNA ή επάγουν απόπτωση [7], [8]. Μεταλλάξεις ή παρεκκλίνουσα ρύθμιση των γονιδίων που ελέγχουν τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και του DNA παιχνίδι επισκευή σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση [9], [10] και είναι οι πρώτοι υποψήφιοι, όταν ψάχνουν για τα γονίδια διαμόρφωση του κινδύνου για τη δευτεροβάθμια καρκίνο. Αν βλάβες στο DNA θεραπεία που προκαλείται είναι misrepaired, αυτό μπορεί να ξεκινήσει το δεύτερο την ανάπτυξη των όγκων. Η γενετική προδιάθεση μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη χρωμοσωμική αστάθεια μετά την ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία [5], [11], [12]. Μόνο σε πολύ σπάνιες περιπτώσεις της δεύτερης παιδικής κακοήθειας ένα σύνδρομο γενετικής αστάθειας, όπως η αναιμία Fanconi, αταξία τελαγγειεκτασίες ή Pigmentosum ξηροδερμίας έχει διαγνωστεί [10]. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι αιτίες που υπόκεινται στην ανάπτυξη ενός δεύτερου καρκίνου παραμένουν άγνωστες.

Για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι οι διακυμάνσεις στην έκφραση των γονιδίων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και επιδιόρθωσης DNA που συνδέεται με δευτερογενή καρκίνο, αναλύσαμε πρωτογενείς ινοβλάστες της παιδικής ηλικίας ασθενείς με καρκίνο με ένα δεύτερο καρκίνο (2C ασθενείς) και προσεκτικά μάρτυρες χωρίς δεύτερη καρκίνο (1C ασθενείς). ινοβλάστες δέρματος αντιπροσωπεύουν ένα φυσιολογικό σωματικό κυτταρικό τύπο. Σε αντίθεση με το αίμα και EBV-μετασχηματισμένα λεμφοβλάστες, τα οποία μπορούν να ληφθούν πιο εύκολα, πρωτογενείς ινοβλάστες συνιστούν μια ομοιογενή πληθυσμό κυττάρων με ανέπαφο κυτταρικό κύκλο και την επιδιόρθωση του DNA των σημείων ελέγχου. Μέχρι στιγμής έχουν υπάρξει μόνο λίγες μελέτες σε πρωτογενείς ινοβλάστες των ασθενών με καρκίνο. Οι ινοβλάστες από ασθενείς με καρκίνο του μαστού και του θυρεοειδούς βρέθηκαν να έχουν ελαττωματικό επισκευή ή /και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου [13]. Ανώμαλη έκφραση του γονιδίου σε σωματικά κύτταρα των ανεπηρέαστη γονείς των ασθενών ρετινοβλάστωμα είναι επίσης σύμφωνη με κληρονομική προδιάθεση για την ανάπτυξη καρκίνου [14].

Για να προσδιοριστούν οι παράγοντες ευαισθησίας για τη δεύτερη σχηματισμό του καρκίνου, θα προβληθεί διάφορες επιδιόρθωσης DNA που συνδέεται γονίδια για συστατική διαφορές έκφραση πρωτεΐνης σε 2C έναντι των ασθενών 1Γ. Η βλάβη του DNA RAD9A πρωτεΐνη σημείο ελέγχου προς τα κάτω σε τόσο θεραπεία και ακτινοβολημένα σωματικά κύτταρα των ασθενών με δύο καρκίνο, συγκριτικά με τους ασθενείς με ένα καρκίνο. Αυξημένη συστατική και βλάβες στο DNA που προκαλείται από τα επίπεδα της πρωτεΐνης RAD9A και άλλα γονιδιωματική επιστάτες μπορεί να βοηθήσει να διατηρήσει τη σταθερότητα του γονιδιώματος και την πρόληψη δεύτερη εξέλιξη του όγκου μετά από ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία. RAD9A, η οποία σε ορισμένες χαρτιά ονομάζεται hRAD9 ή απλά Rad9, είναι ένα ενδιαφέρον υποψήφιο, επειδή λειτουργεί σε πολλαπλές οδούς, συμπεριλαμβανομένων επιδιόρθωσης του DNA, του ελέγχου σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης και ανώμαλη έκφραση του έχει συνδεθεί με την ογκογένεση [15], [16 ].

Αποτελέσματα

Πρόσληψη των ασθενών

Είκοσι άτομα που επέζησαν από καρκίνο της παιδικής ηλικίας και στη συνέχεια αναπτύχθηκε ένα δεύτερο καρκίνο είχαν προσληφθεί από την γερμανική Childhood Cancer registery. Τουλάχιστον ενός έτους πρέπει να έχουν περάσει από τη διάγνωση του δεύτερου καρκίνου. Είκοσι συμφωνημένα περιπτώσεις που επέζησαν από καρκίνο της παιδικής ηλικίας και δεν ανέπτυξαν μια δεύτερη καρκίνο επιλέχτηκαν τυχαία από το registery. Τα κριτήρια ταύτισης ήταν ίδιου φύλου, ίση πρώιμη διάγνωση του καρκίνου, ίση ηλικία κατά την πρώτη διάγνωση, και την ίδια ώρα υπό παρακολούθηση. Επειδή οι πρωτογενείς όγκους συμφωνημένα ασθενείς ενός και δύο-καρκίνου διαγνώστηκαν κατά το ίδιο έτος, οι μέθοδοι θεραπείας ήταν σε μεγάλο βαθμό όμοια. Όλοι οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν από την πρωτογενή διάγνωση του καρκίνου στο χρόνο, όταν είχαν προσληφθεί.

Οι ασθενείς έπρεπε να είναι ζωντανός και τουλάχιστον 18 ετών (νόμιμη ηλικία στη Γερμανία) για να δώσει εν επιγνώσει συναίνεση τους για βιοψία δέρματος . Λιγότερο από το 50% των ασθενών σε επαφή δύο-καρκίνο αποφάσισαν να συμμετάσχουν στη μελέτη. Λόγω αυτών των κριτηρίων ένταξης, θα μπορούσαμε να προσλάβει μόνο έναν περιορισμένο αριθμό ασθενών με δύο καρκίνο όλη τη Γερμανία. Υπάρχει μια ορισμένη προκατάληψη στην κατανομή των πρωτογενών και δευτερογενών καρκίνων. Για παράδειγμα, η πιο συχνή συνδυασμός της οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας μετά από οξεία λεμφοειδής λευχαιμία έχει πολύ δυσμενή πρόγνωση και, ως εκ τούτου, δεν αντιπροσωπεύεται. Από την άλλη πλευρά, οι δευτερογενείς καρκινώματα του θυρεοειδούς υπεραντιπροσωπεύονται, επειδή οι ασθενείς έχουν καλή πρόγνωση και να φτάσει στην ενηλικίωση.

Μειωμένα επίπεδα πρωτεϊνών επιδιόρθωσης που σχετίζεται με DNA σε κύτταρα από δύο ασθενείς με καρκίνο-

Προσαρμοσμένη μικροσυστοιχίες αντίσωμα (για παράδειγμα, βλέπε Εικόνα 1) χρησιμοποιήθηκαν για να συγκριθεί η συστατική επίπεδα έκφρασης (χωρίς επαγωγή της βλάβης του DNA) των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την επισκευή διαφορετικό DNA σε εκθετικά αυξανόμενη πρωτογενείς ινοβλάστες ασθενών με καρκίνο της παιδικής ηλικίας με και χωρίς δεύτερη όγκου, αντίστοιχα. Τα 19 μελέτησαν τα γονίδια επιλέχθηκαν (Πίνακας 1), επειδή αποτελούν βασικούς παράγοντες σε διαφορετικά μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA (δηλαδή DNA διπλό σκέλος επισκευή διάλειμμα, νουκλεοτίδιο επιδιόρθωση εκτομής, επισκευή βάσης εκτομή, και την επισκευή ασυμφωνία), τα οποία συμμετέχουν είτε στη σηματοδότηση της βλάβης του DNA , σημείο ελέγχου ελέγχου ή /και επιδιόρθωση του DNA. Μεταλλάξεις σε πολλά από αυτά τα γονίδια είναι γνωστό ότι προδιαθέτουν στην ανάπτυξη του καρκίνου.

Διαφορετικές ποσότητες (περίπου 1,5, 1,0 και 0,5 μg) του αντι-RAD9A αντίσωμα (2 ng /μl) κηλιδώνονται εις τριπλούν επί νιτροκυτταρίνης -επικαλυμμένα διαφάνειες και επωάστηκαν με φθορίζουσα σήμανση εκχύλισμα πυρηνική πρωτεΐνη των ανεπεξέργαστων ινοβλαστών από δύο καρκίνο 2C-7 ασθενούς και του ασθενούς συμφωνημένα ένα καρκίνο 1C-7, αντίστοιχα. Anti-ACTB χρησιμεύει ως θετική και κηλίδες ρυθμιστικού ως αρνητικός μάρτυρας. Η μετρούμενη αναλογία πρωτεΐνης 2C /1C RAD9A είναι 0,5.

Η

Για κάθε συμφωνημένα (2C έναντι 1C) ζεύγος ασθενή προσδιορίσαμε την αναλογία z τριπλών μετρήσεων των επιπέδων της πρωτεΐνης (ομαλοποιήθηκε με log10 μετασχηματισμού και βαθμολογίες z). Έξι από τα 19 ελέγχθηκαν πρωτείνες, που αντιπροσωπεύουν διαφορετικές οδούς επιδιόρθωσης του DNA, εμφανίζεται χαμηλότερα επίπεδα σε δύο ασθενείς με καρκίνο (Πίνακας 1). Τα οικόπεδα κουτί στο σχήμα 2 του παρόντος η κατανομή του z αναλογίες για BRCA1 (-1.36x? P = 0,017), DDIT3 (-1.27x? P = 0,011), MSH6 (-1.16x? P = 0,021), TP53 (-1,18 χ? p = 0,003), RAD9A (-1.38x? p = 0,040), και RAD51 (-1.37x? p = 0,009). Οι τιμές ρ δεν διορθώθηκαν για πολλαπλές δοκιμές και θα πρέπει να θεωρούνται ως εξερευνητικό. Προκειμένου να αποδειχθεί η αξιοπιστία των μικροσυστοιχιών αντισώματος μας, ανάλυση στυπώματος Western των RAD9A διεξήχθη σε ένα αντιπροσωπευτικό ζεύγος. Το αντίσωμα αντι-RAD9A βάφονται το αναμενόμενο 45 μπάντα kDa στα εκχυλίσματα πυρηνική πρωτεΐνη, ενώ καμία ή μόνο μία αμυδρή ζώνη παρατηρήθηκε σε κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα (σχ. 3). Σε συμφωνία με την microarray αντίσωμα (Σχ. 1), η κηλίδα Western έδειξε μία μικρότερη ποσότητα (60%) του RAD9A πρωτεΐνης στον ασθενή 2C, σε σύγκριση με την συμφωνημένα ασθενή 1Γ.

Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης σε ινοβλάστες του 2C έναντι 1C ασθενείς είναι -1.36x (p = 0.017) για BRCA1, -1.27x (p = 0,011) για DDIT3, -1.16x (p = 0.021) για MSH6, -1.18x (p = 0.003) για ΤΡ53, – 1.38x (p = 0,040) για RAD9A, και -1.37 (p = 0.009) για RAD51. Η έκφραση της πρωτεΐνης μετρήθηκε με μικροσυστοιχίες αντίσωμα (κανονικοποιούνται log10 μετασχηματισμό και βαθμολογίες z). οικόπεδα κουτί δείχνουν την κατανομή των δεικτών z σε συμφωνημένα 2C εναντίον 1C ασθενείς. Η διάμεση αντιπροσωπεύεται από οριζόντιες γραμμές. Το κάτω μέρος του κουτιού υποδεικνύει το 25

ο εκατοστημόριο, στην κορυφή του 75

ου εκατοστημόριο. Οι ράβδοι Τ εκτείνονται από τα κουτιά το πολύ σε 1,5 φορές το ύψος του κουτιού. Οι ακραίες τιμές παρουσιάζονται ως ανοικτοί κύκλοι.

Η

Η γέλη στην αριστερή πλευρά δείχνει Coomassie blue χρώση εκχυλισμάτων πυρηνικής και κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης (30 μg έκαστο) από μη επεξεργασμένο ινοβλάστες δύο-καρκινικών ασθενών 2C-7 και η συμφωνημένα ασθενής ένα καρκίνο 1C-7. Το αντίστοιχο γέλη στη δεξιά πλευρά χρωματίζεται με αντίσωμα αντι-RAD9A, η οποία αναγνωρίζει μια πυρηνική πρωτεΐνη 45 kDa. Η υπολογισμένη αναλογία πρωτεΐνης 2C /1C RAD9A είναι 0,6.

Η

Οι έξι πρωτεΐνες που δείχνουν συστατική διαφορές έκφρασης και ποσοτικά στα κύτταρα σε 1 ώρα και 4 ώρες μετά την 1 Gy ακτινοβολίας γ. Για κάθε ασθενή, συγκρίναμε τα επίπεδα πρωτεΐνης μετρήθηκαν με μικροσυστοιχίες αντισώματος σε αγωγή εναντίον μη επεξεργασμένα δείγματα. Δύο πρωτεΐνες, RAD9A και DDIT3, διέφεραν στην κυτταρική απόκριση τους σε βλάβη του DNA μεταξύ 2C και 1C ασθενείς. Τα οικόπεδα κουτί στο Σχήμα 4 δείχνουν τις αναλογίες z για RAD9A (μετά από κανονικοποίηση με log10 μεταμόρφωση και τα σκορ z) στο 2C και την ομάδα 1C. Και στις δύο ομάδες, τα επίπεδα πρωτεΐνης RAD9A ήταν αυξημένα μετά από βλάβη του DNA. Στην ομάδα ενός καρκίνου, RAD9A υπερεκφράστηκε υπερδιπλασίαση στην 1 ώρα και 4 ώρες μετά την ακτινοβόληση, σε σύγκριση με το επίπεδο συστατικής πρωτεΐνης. Στην ομάδα 2C, η ποσότητα της πρωτεΐνης RAD9A αυξημένη 1.76- 1.63 και φορές σε 1 ώρα και 4 ώρες, αντίστοιχα, υποδηλώνοντας μια χαμηλότερη επαγωγή (-1.44x, ρ = 0.012 σε 4 ώρες) από βλάβη του DNA σε ασθενείς με καρκίνο της παιδικής ηλικίας με ένα δεύτερο όγκο. Παρόμοια με RAD9A, την πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το DNA βλάβη επαγώγιμη μεταγραφή

DDIT3

βρέθηκε επίσης να αυξηθεί σε ακτινοβολημένα κύτταρα (Εικ. 3). Σε 1C ασθενείς, το επίπεδο της πρωτεΐνης ανυψώθηκε 1.40- 1.96 και φορές σε 1 ώρα και 4 ώρες μετά από βλάβη του DNA, σε σύγκριση με 1.26- 1.95 και-φορές στην ομάδα 2C. Σε 1 ώρα μετά την ακτινοβόληση υπήρξε μια χαμηλότερη επαγωγή (-1.13x, p = 0,019) στην ομάδα δύο-καρκίνου.

Διαφορικό επαγωγή RAD9A (αριστερή πλευρά) και DDIT (δεξιά πλευρά) σε 1 ώρα και 4 ώρες μετά από 1 Gy γ-ακτινοβολία σε ινοβλάστες από ασθενείς με καρκίνο του δύο (γκρι πλαίσια) και ασθενείς με ένα καρκίνο (διακεκομμένη κουτιά). Η έκφραση της πρωτεΐνης μετρήθηκε με μικροσυστοιχίες αντίσωμα (κανονικοποιούνται log10 μετασχηματισμό και βαθμολογίες z). οικόπεδα Box δείχνουν την κατανομή της z αναλογίες των επεξεργασμένων έναντι μη κατεργασμένων κυττάρων από τους ίδιους ασθενείς. Η διάμεση αντιπροσωπεύεται από οριζόντιες γραμμές. Το κάτω μέρος του κουτιού υποδεικνύει το 25

ο εκατοστημόριο, στην κορυφή του 75

ου εκατοστημόριο. Οι ράβδοι Τ εκτείνονται από τα κουτιά το πολύ σε 1,5 φορές το ύψος του κουτιού. Οι ακραίες τιμές παρουσιάζονται ως ανοιχτό κύκλους. Η επαγόμενη βλάβη του DNA αύξηση στην ομάδα 2C είναι χαμηλότερη από ότι στην ομάδα 1C για RAD9A στις 4 ώρες μετά την ακτινοβόληση (-1.44x, ρ = 0.012) και για DDIT3 στην 1 ώρα μετά την ακτινοβόληση (-1.13x, ρ = 0.019 ).

η

Μειωμένα επίπεδα έκφρασης RAD9A mRNA σε δύο ασθενείς με καρκίνο

Επειδή RAD9A πρωτεΐνη πιο δραματικά προς τα κάτω σε ασθενείς δύο-καρκίνο, είμαστε επικεντρώθηκε περαιτέρω μελέτη μας σε αυτό το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και της πρωτεΐνης επιδιόρθωσης του DNA. Πραγματοποιήσαμε αναλύσεις ποσοτική έκφραση του mRNA με πραγματικού χρόνου RT PCR σε αμφότερα χωρίς θεραπεία και ακτινοβολημένα κύτταρα. Τα οικόπεδα κουτί στο σχήμα 5 του παρόντος η κατανομή των αναλογιών έκφρασης σε 20 ζεύγη των ασθενών. Οι συστατικές

RAD9A

επίπεδα mRNA (χωρίς επαγωγή της βλάβης του DNA) ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ασθενείς δύο-καρκίνου (-2.40x, p = 0,004), σε σύγκριση με τους ασθενείς ενός καρκίνου. Διαφορές μεταξύ των ομάδων παρατηρήθηκαν επίσης σε 1 h (-2.54x, p = 0,003), 4 h (-2.62x, p = 0,003), και 24 ώρες (-2.54x, p = 0,003) μετά την ακτινοβόληση. Τρία ζεύγη αντιπροσωπεύουν ακραίες τιμές ή ακραία ακραίες τιμές στα διαγράμματα Θηκόγραμμα, υποδεικνύοντας ότι η σχετική

RAD9A

επίπεδα έκφρασης μπορεί να διαφέρει σημαντικά μεταξύ των ασθενών και δεν είναι πάντα μειωμένη σε ασθενείς δύο καρκίνο. Οι (ακραία) ακραίες τιμές αντιπροσωπεύουν διαφορετικούς συνδυασμούς της πρωτοβάθμιας και δευτεροβάθμιας καρκίνο.

RAD9A

επίπεδα mRNA σε θεραπεία και ακτινοβολούνται (1 ώρα, 4 ώρες και 24 ώρες μετά την 1 Gy) ινοβλάστες των δικύκλων ασθενείς με καρκίνο, σε σύγκριση με τους ασθενείς συμφωνημένα ένα καρκίνο. mRNA ποσοτικοποιήθηκε με πραγματικού χρόνου RT PCR (κανονικοποιηθεί με τη μέθοδο ΔΔCT και δύο ενδογενή γονίδια ελέγχου). οικόπεδα κουτί δείχνουν την κατανομή των λόγων έκφρασης σε συμφωνημένα 2C εναντίον ασθενείς 1C. Η διάμεση αντιπροσωπεύεται από οριζόντιες γραμμές. Το κάτω μέρος του κουτιού υποδεικνύει το 25

ο εκατοστημόριο, στην κορυφή του 75

ου εκατοστημόριο. Οι ράβδοι Τ εκτείνονται από τα κουτιά το πολύ σε 1,5 φορές το ύψος του κουτιού. Οι ακραίες τιμές παρουσιάζονται ως ανοικτοί κύκλοι, ακραία ακραίες τιμές, όπως τρίγωνα. Δύο ασθενείς με καρκίνο δείχνουν μειωμένη

RAD9A

mRNA επίπεδα χωρίς επαγωγή της βλάβης του DNA (-2.40x, p = 0,004), καθώς και στην 1 ώρα (-2.54x, p = 0,003), 4 ώρες (-2,62 x, p = 0,003), και 24 ώρες (-2.54x, p = 0,003) μετά την ακτινοβόληση.

Η

Επειδή έχει αναφερθεί ότι

RAD9A

έκφραση εξαρτάται από DNA μεθυλίωση [17], προσδιορίσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης του υποτιθέμενη περιοχή cis-ρυθμιστικών από όξινο θειώδες Pyrosequencing. Σε σύγκριση με το κλασικό διθειώδες πλασμίδιο αλληλουχίας, όξινο θειώδες Pyrosequencing μπορεί να αναλύσει μόνο έναν περιορισμένο αριθμό CpG θέσεις που βρίσκονται στο πιο 30-50 bp 3 ‘από τον εκκινητή αλληλουχίας, ωστόσο από την άλλη πλευρά μπορεί να πολύ μεγαλύτερη ακρίβεια (± 2%) ποσοτικοποιηθεί η επίπεδο μεθυλίωσης CpG. Η ανέλυσε τμήμα DNA, το οποίο περιέχει τρεις γειτονικές θέσεις CpG, βρέθηκε να είναι μη μεθυλιωμένες στην μη επεξεργασμένα κύτταρα τόσο του 2C και 1C ασθενείς. Το εύρος των τιμών μεθυλίωσης ήταν 4-10%, όπως αναμένεται για ένα μεταγραφικά ενεργή γονίδιο. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων μεθυλίωση, η οποία θα μπορούσε να εξηγήσει την παρατηρούμενη διαφορά έκφρασης. Επειδή η πυκνότητα των μετουσιωμένο CpGs και όχι μεμονωμένες θέσεις σε ένα νησί CpG μετατρέψει ένα γονίδιο ή να απενεργοποιήσετε [18], [19], η μέση μεθυλίωση των λίγων CpGs μπορούν συνήθως να χρησιμεύσει ως εκπρόσωπος επιγενετικών δεικτών για μια δεδομένη περιοχή cis-ρυθμιστικών .

χρωμόσωμα 11q13.1 που περιέχει το

RAD9A

γονίδιο συχνά ενισχύεται σε μία ποικιλία ανθρώπινων όγκων [17]. Για να εξαιρέσετε

RAD9A

αντιγράψετε αριθμό διαφορές μεταξύ 2C και 1C ασθενείς, πραγματοποιήσαμε υψηλής ανάλυσης καρυότυπο αναλύσεις με την Affymetrix GeneChip Γονιδιώματος Ευρεία γκάμα Ανθρωπίνων SNP 6.0, καθώς και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Και οι δύο μέθοδοι αποκάλυψαν δύο αντίγραφα του

RAD9A

γονιδίου σε όλους τους ασθενείς που μελετήθηκαν.

Συζήτηση

Σε σύγκριση με τις τεράστιες προσπάθειες να χαρακτηριστούν οι transcriptomes και των πρωτεϊνών των καρκινικών κυττάρων, υπάρχουν σχετικά λίγες μελέτες που ψάχνουν για διαφορές γονιδιακή έκφραση σε φυσιολογικά σωματικά κύτταρα των ασθενών όγκου [13], [14]. Για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι οι διαφορές στις οδούς επιδιόρθωσης του DNA μπορεί να επηρεάσουν τον κίνδυνο για την ανάπτυξη ενός δεύτερου όγκου μετά τη θεραπεία του καρκίνου της παιδικής ηλικίας, συγκρίναμε τις συστατική επίπεδα πρωτεϊνών επιδιόρθωσης που σχετίζεται με DNA σε πρωτογενείς ινοβλάστες αντιστοιχισμένων ασθενείς δύο καρκίνο και το ένα του καρκίνου. Επειδή εμείς δεν αναμένουμε δραματικές διαφορές, αλλά μάλλον ανεπαίσθητες διακυμάνσεις στην ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA σε δύο ασθενείς με καρκίνο, δεν είχαμε εκτελέσει μια οθόνη γονιδίωμα-ευρεία αλλά δοκιμαστεί μόνο ένας περιορισμένος αριθμός γονιδίων επισκευής που σχετίζονται με γνωστά DNA χρησιμοποιώντας εξαιρετικά ευαίσθητο αντίσωμα μικροσυστοιχίες. Η παρατήρηση ότι 6 από 19 δοκιμάστηκαν πρωτεΐνες επιδιόρθωσης που σχετίζεται με DNA που είχαν ιδιοσυστατικά κατιούσα ρύθμιση σε φυσιολογικά κύτταρα ασθενών δύο καρκίνο προωθεί την ιδέα ότι οι οδοί επιδιόρθωσης του DNA δύο-καρκίνο ασθενείς είναι λιγότερο ικανά να χειριστούν βλάβη του DNA από εκείνα των ασθενών με ένα καρκίνο . Για δύο πρωτεΐνες δείξαμε επίσης μια μικρότερη επαγωγή μετά από βλάβη του DNA. Ένα γονίδιο,

RAD9A

αναλύθηκε με περισσότερες λεπτομέρειες. Τόσο έκφραση συστατική mRNA σε εκθετικά αυξανόμενη ινοβλάστες, καθώς και βλάβη του DNA που προκαλείται από έκφραση σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την ακτινοβόληση ήταν μικρότερη σε ασθενείς με καρκίνο δύο συγκριτικά με τους ασθενείς με ένα καρκίνο. Υπό αυτό το πρίσμα, RAD9A είναι ένας καλός υποψήφιος για έναν παράγοντα προδιάθεσης για δεύτερη καρκίνο. Η διαφορική

RAD9A

έκφραση δεν διαμεσολαβείται από μεθυλίωση του DNA ή να αντιγράψετε παραλλαγή αριθμό.

Το

RAD9A

γονίδιο εξελικτικά εξαιρετικά διατηρημένη από ζύμη στον άνθρωπο, η οποία θεωρείται γενικά καλός δείκτης για τη λειτουργική σημασία. Δρα σε πολλαπλές οδούς, συμπεριλαμβανομένων βάση εκτομή, ομόλογο ανασυνδυασμό και επισκευή αναντιστοιχία καθώς και τον έλεγχο του σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Πολλές από τις λειτουργίες του φαίνεται να διαμεσολαβείται από το σύμπλοκο πυρηνική πρωτείνη RAD9A-HUS1-Rad1 που μοιάζει με PCNA [15], [16]. Ποντίκι

Rad9

–

/

– και, σε μικρότερο βαθμό,

Rad9

+ /

– κύτταρα νοκ-άουτ [20] και τα ανθρώπινα νοκ ντάουν RNAi κύτταρα με μειωμένη

RAD9A

επίπεδα [21] είναι ευαίσθητα σε διαφορετικούς τύπους βλάβης του DNA, εμφανίζοντας γονιδίωμα αστάθεια, έλλειψη επιδιόρθωση του DNA και αλλαγμένη σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Εμβρυϊκά θνησιμότητα του ποντικιού

Rad9

–

/

– μετάλλαξης δείχνει ότι οι πολλαπλές λειτουργίες του Rad9A είναι απαραίτητα για την εμβρυογένεση και τη φυσιολογική ανάπτυξη. Τα ποντίκια με στοχευμένες

Rad9

–

/

– διαγραφή στα κερατινοκύτταρα είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι σε genotoxin που προκαλείται από το σχηματισμό όγκων του δέρματος [22], [23].

Rad9

–

/

– κερατινοκύτταρα εμφανίζουν μεγαλύτερο αριθμό αυθόρμητη και genotoxin που προκαλείται από τα διαλείμματα του DNA, ανώμαλης κατανομής του κυτταρικού κύκλου και την αύξηση του ποσοστού της απόπτωσης. Αυτό είναι σύμφωνο με την άποψη ότι RAD9A λειτουργεί ως καταστολέας όγκων στο δέρμα και άλλους ιστούς μέσω της προώθησης επιδιόρθωση του DNA στα κατεστραμμένα κύτταρα και τη σταθεροποίηση του γονιδιώματος πριν συμβεί ογκογένεση. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι τόσο η ρύθμιση προς τα κάτω και προς τα πάνω ρύθμιση του

RAD9A

έχουν συσχετιστεί με ογκογένεση.

RAD9A

υπερέκφραση έχει παρατηρηθεί σε μία ποικιλία όγκων, συμπεριλαμβανομένου του μαστού [17], του πνεύμονα [24], του θυρεοειδούς [25], και καρκίνο του προστάτη [26]. Αυτό υποδηλώνει ότι

RAD9A

μπορεί επίσης να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο, πιθανότατα από ανώμαλη μετενεργοποίηση των κατάντη γονιδίων στόχων. Σε γενικές γραμμές, η

RAD9A

επίπεδο σχετίζεται με το μέγεθος ή /και το στάδιο του όγκου.

RAD9A

ανήκει σε μια αυξανόμενη ομάδα των γονιδίων με διπλούς ρόλους στον καρκίνο. Ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου και του περιβάλλοντος ιστού, μπορεί να αποδείξει είτε προαγωγής όγκων ή καταστολής όγκου δραστηριότητα [15]. Οι μηχανισμοί με την οποία οι πολυλειτουργική πρωτεΐνη RAD9A δρα ως ένα ογκογονίδιο και ογκοκατασταλτικά, αντίστοιχα, είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

Επειδή ο αριθμός των ασθενών με καρκίνο των δύο να είναι 18 ετών ή μεγαλύτερα είναι σχετικά μικρό, δεν θα μπορούσαμε να περιορίσουν μας μελέτησαν τους ασθενείς σε μια συγκεκριμένη οντότητα όγκου ή θεραπεία πρωτόκολλο. Το μεγαλύτερο υποομάδα των πρωτογενών όγκων ήταν λεμφοειδείς λευχαιμίες (10 περιπτώσεις). Λόγω της καλής τους πρόγνωση, καρκινώματα του θυρεοειδούς (6 περιπτώσεις) ήταν υπερεκπροσωπούνται ως δεύτερη καρκίνους. Η θεραπεία ακτινοβολίας είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για το καρκίνωμα του θυρεοειδούς [27]. Υπό το πρίσμα αυτό, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η αφθονία των RAD9A πρωτεΐνης μπορεί να διαμορφώνει τον κίνδυνο για όγκους που προκαλείται από ακτινοβολία. Μελλοντικές πιο αναλυτικές μελέτες θα πρέπει να εξετάσει τις συνέπειες των διαφόρων τρόπων θεραπείας του καρκίνου της παιδικής ηλικίας. Ωστόσο, όπως περιγράφεται παραπάνω, την πρόσληψη ομοιογενείς ομάδες ασθενών είναι εξαιρετικά δύσκολο. Πήραμε βιοψίες δέρματος και τα δείγματα αίματος από όλους τους ασθενείς μας που μελετήθηκαν. Επειδή πολλοί ασθενείς ήταν μυελού των οστών μεταμοσχευθεί, τα κύτταρα του αίματος δεν αναλύθηκαν. Ινοβλαστών καλλιέργειες ιδρύθηκαν ένα ή περισσότερα χρόνια μετά τη δεύτερη καρκίνο διάγνωσης /θεραπείας, γεγονός που καθιστά απίθανο ότι οι διαφορές έκφρασης μεταξύ των δύο καρκίνου σε σχέση με τους ασθενείς ενός καρκίνου επηρεάζονται άμεσα ή έμμεσα από την ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία. Αν και είναι εύλογο να υποθέσουμε ότι οι καλλιεργημένοι ινοβλάστες αντιπροσωπεύουν την κατάσταση σε φυσιολογικά κύτταρα του σώματος, θα ήταν επιθυμητό να μελετηθεί επίσης μη καλλιεργημένα κύτταρα ή /και άλλους ιστούς.

Ο αριθμός των ασθενών που αναλύθηκαν είναι σχετικά μικρή. Παρ ‘όλα αυτά, τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης συστατική RAD9A καθώς και η έκταση της επαγωγής μετά από βλάβη του DNA διαφέρουν μεταξύ των δύο καρκίνου και ένας-παιδική ηλικία ασθενών με καρκίνο. Προτείνουμε ότι λειτουργεί RAD9A ως καταστολέας όγκων σε ινοβλάστες του δέρματος και άλλα φυσιολογικά κύτταρα του σώματος και, ως εκ τούτου, βοηθά στην πρόληψη του καρκίνου του δευτερολέπτου. Ανάλυση των διαφόρων κανονική τύπων κυττάρων σε μεγαλύτερους πληθυσμούς ασθενών, για τους επιζώντες του καρκίνου παράδειγμα των ενηλίκων είναι αναγκαία για να υποστηρίξει ένα ρόλο για RAD9A στο DNA βλάβη που προκαλείται από την καρκινογένεση.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα δείγματα ασθενών

Το Μητρώο γερμανική Παιδικού Καρκίνου έχει συγκεντρώσει σχεδόν όλους τους καρκίνους της παιδικής ηλικίας στη Γερμανία από το 1980, τη διεξαγωγή μιας αόριστης διάρκειας παρακολούθησης, με έμφαση στην δεύτερη νεοπλάσματα. Με τη βοήθεια του registery, έχουμε προσληφθεί 20 άτομα που επέζησε μια παιδική ηλικία κακοήθεια και στη συνέχεια, άσχετα με το πρώτο συμβάν, ανέπτυξε ένα δεύτερο καρκίνο (2C ασθενείς), καθώς και 20 προσεκτικά συμφωνημένα προσώπων [ιδίου φύλου, ίδια πρωτογενή καρκίνο (ταξινόμηση Ιοοο ), ίσο ηλικία (± 1 έτος) κατά την πρώτη διάγνωση] που δεν ανέπτυξαν μια δεύτερη κακοήθεια (1C ασθενείς). Η γενετική συμβουλευτική προσφέρθηκε και ενημέρωσε γραπτό περιεχόμενο λήφθηκε από όλους τους ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη, η οποία εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής του Ιατρικού Συλλόγου της Ρηνανίας-Παλατινάτου (Αρ 837.440.03 [4102]).

Η μέση ηλικία κατά τη διάγνωση του πρώτου όγκου ήταν 6,8 έτη (εύρος 0-14) και στις δύο ομάδες. Οι πρωτογενείς όγκοι ήταν οξεία μυελογενή λευχαιμία ή λεμφοειδή (11 περιπτώσεις), Hodgkin ή λέμφωμα Burkitt (5 περιπτώσεις) και άλλων στερεών όγκων (4 περιπτώσεις). Η μέση ηλικία κατά τη δεύτερη διάγνωση στην ομάδα 2C ήταν 16,7 έτη (εύρος 9-30). Το δεύτερο όγκοι ήταν μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο ή λέμφωμα (7 περιπτώσεις), καρκίνωμα του θυρεοειδούς (6 περιπτώσεις) και άλλων στερεών όγκων (7 περιπτώσεις). Δεύτερον νεοπλάσματα επιβεβαιώθηκαν από έμπειρους κλινικές ογκολόγους να υπάρχουν υποτροπές ή εναλλακτικές εκδηλώσεις του πρωτογενούς νεοπλάσματος.

ελήφθησαν βιοψίες δέρματος το νωρίτερο ένα χρόνο, συνήθως αρκετά χρόνια μετά τη δεύτερη θεραπεία του καρκίνου. καλλιέργειες πρωτογενών κυττάρων ινοβλαστών καθορίστηκαν από βιοψίες δέρματος και καλλιεργήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο με άλατα Earle (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, βιταμίνες και αντιβιοτικά. Τα κύτταρα (χωρίς βλάβη του DNA) συλλέχθηκαν από εκθετικά αναπτυσσόμενες καλλιέργειες υποσυρρέουσες. Για να επάγουν επιδιόρθωση του DNA, υποσυρρέουσες καλλιέργειες εκτέθηκαν σε 1 Gy ιονίζουσα ακτινοβολία χρησιμοποιώντας μία 2000 (Cs137) ακτινοβολίας Gammacell. Τα δείγματα ελήφθησαν από 1 ώρα, 4 ώρες και 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι περαιτέρω χρήσης.

κηλίδος Western και το αντίσωμα microarray

Για κύτταρα εκχύλιση των πυρηνικών πρωτεϊνών επαναιωρήθηκαν δύο φορές σε 500 μΐ 10 mM HEPES , 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, ρΗ 7,9 και επωάστηκαν σε πάγο για 10 λεπτά. Μετά από 10 s φυγοκέντρηση σε μέγιστη ταχύτητα το υπερκείμενο απορρίφθηκε. Στη συνέχεια, το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 100 μΐ 20 mM HEPES, 0,42 Μ NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 25% γλυκερόλη, ρΗ 7.9 και ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια σύριγγα με βελόνα διαμετρήματος. Μετά την επώαση σε πάγο για 30 λεπτά και φυγοκέντρηση για 30 λεπτά σε μέγιστη ταχύτητα σε 4 ° C, το υπερκείμενο που περιέχει το πυρηνικό εκχύλισμα διαχωρίστηκε από το σφαιρίδιο κυτταροπλασματική και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε σύμφωνα με το Bradford, χρησιμοποιώντας Roti Quant (Roth, Karlsruhe, Germany).

Για την ανάλυση στυπώματος Western, 30 μg εκχύλισμα πυρηνικής πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν επί 8% γέλη SDS-PAGE και κατόπιν μεταφέρονται σε μια μεμβράνη Hybond-P (Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Η μεμβράνη πρώτα αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα (NFDM) διαλυμένο σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (50 mM Tris-Cl, ρΗ 7,5, 150 mM NaCl), 0.1% Tween 20 (TBST). Τα στυπώματα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-RAD9A αντίσωμα, αραιωμένο 1:250 (2 μg /ml) σε TBS με 5% NFDM. Μετά το πλύσιμο η κηλίδα τρεις φορές για 5 λεπτά με TBST, πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα αντι-ποντικού δευτερογενούς κουνελιού σημασμένο με υπεροξειδάση χρησιμοποιώντας το ΒΜ χημικής φωταύγειας Western Blotting Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). εντάσεις μπάντα ήταν ποσοτικά με ΣΕΝ-3000 (Fujifilm, Düsseldorf, Γερμανία) φωταύγειας αναλυτή εικόνας. μπλε χρώση Comassie χρησιμοποιήθηκε για να ρυθμίσει τις εντάσεις σήματος προς την ποσότητα της πρωτεΐνης.

Προσαρμοσμένες μικροσυστοιχίες αντίσωμα για την ποσοτικοποίηση των 19 διαφορετικών πρωτεϊνών επιδιόρθωση του DNA που σχετίζονται με (Πίνακας 1) παρασκευάστηκαν με κηλίδωση μία σταγόνα, δύο σταγόνες και /ή τρεις σταγόνες, κάθε σταγόνα περιέχει περίπου 0,5 αντίσωμα pg εις τριπλούν σε πλακίδια νιτροκυτταρίνης με επίστρωση (Oncyte, νιτροκυτταρίνη 16 διαφάνειες multi-pad, Γκρέις Bio-Labs, Bend, OR, USA), χρησιμοποιώντας ένα spotter σειρά μη-επαφής (sciFLEXARRAYER 3 , Scienion, Βερολίνο, Γερμανία). Αντισώματα έναντι βήτα-ακτίνης (ACTB) χρησίμευσε ως θετικός, κηλίδες αίματος ρυθμιστικό ως αρνητικός έλεγχος. Τα πλακίδια αποθηκεύθηκαν στους 4 ° C σε ξηρή κατάσταση. Πυρηνικές πρωτεΐνες σημάνθηκαν με μια αμίνη αντιδραστική βαφή φθόριο, το οποίο σχηματίζει έναν ομοιοπολικό δεσμό αμιδίου μεταξύ των πρωτοταγών αμινών των πρωτεϊνών. Δύο μικρογραμμάρια πρωτεΐνης και 0.12 μλ φθορίζουσα χρωστική (Dylight 649 NHS Εστέρα, Pierce, Rockford, USA) επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, η περίσσεια φθορίζουσα χρωστική αδρανοποιήθηκε με την προσθήκη 100 mM γλυκίνη στην αντίδραση. Πριν από τη χρήση, μικροσυστοιχίες αντισωμάτων καλύφθηκαν με 16-pad θαλάμους υβριδισμού FAST πλαίσιο (Whatman, Maidstone, UK). Μη ειδικές θέσεις σύνδεσης αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε 4 ° C με 120 μΙ PBS που περιέχει 4% NFDM ανά υπο-συστοιχίας, ακολουθούμενο από τρεις πλύσεις με 120 μΐ PBS κάθε επί 10 λεπτά. Τα επισημασμένα δείγματα πρωτεΐνης επωάστηκαν σε υπο-συστοιχίες όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, τα πλακίδια εκπλύθηκαν δύο φορές για 15 λεπτά με PBS, 5% Tween 20 και δύο φορές για 15 λεπτά με HPLC βαθμού νερό. Τέλος, τα πλακίδια ξηραίνονται σε SpeedVac και σαρώνεται με ένα σαρωτή συνεστιακή υψηλής ανάλυσης (Affymetrix συστοιχία σαρωτή 428 ΤΜ, High Wycombe, UK). εικόνες Slide αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Spotfinder 3.1.1 (ΤΜ4, Dana Faber Cancer Institute, Boston, USA). Ιστορικό αφαίρεση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τον τύπο: ένταση κηλίδα = μέση ένταση SP – (άθροισμα BKG – άθροισμα top25 BKG) /(αριθμός pixelSP – αριθμός pixel top25 BKG), όπου SP αντιπροσωπεύει οποιοδήποτε σημείο, BKG το αντίστοιχο υπόβαθρο και top25 BKG το κορυφαίο 25% των φόντο pixel.

Για την στατιστική ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών πραγματοποιήσαμε log10 μετασχηματισμού, βαθμολογία z και z υπολογισμούς λόγο [28]. Για συγκρίσεις μεταξύ ομάδων χρησιμοποιήθηκε το τεστ σημείου και, αν είναι δυνατόν, η δοκιμασία Wilcoxon (ασυμμετρία [-1, + 1]) και οικόπεδα κουτί ως γραφικά (στατιστικές PASW 18,0). Δεν απαιτείται προσαρμογή για πολλαπλές δοκιμές πραγματοποιήθηκαν. Οι αναλύσεις θεωρήθηκαν ως διερευνητικό, και οι τιμές ρ των αντίστοιχων δοκιμών παρουσιάζονται για περιγραφικούς λόγους. Τα αποτελέσματα αυτών των δοκιμών δεν μπορεί επομένως να θεωρηθεί σημαντική σε οποιοδήποτε επίπεδο.

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT PCR

Ολικά RNAs παρασκευάσθηκαν από επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα καλλιέργειες ινοβλαστών με τη χρήση της μεθόδου ΤΚΙζοΙ (Invitrogen ). Ένα μικρογραμμάριο από τα δείγματα του RNA αντίστροφα μεταγραφή σε cDNA χρησιμοποιώντας το SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT PCR του

RAD9A

πραγματοποιήθηκε με Δοκιμασία QuantiTect Primer (Qiagen, Hilden, Γερμανία) και της Applied Biosystems 7500 Fast σύστημα Real-Time PCR (Life Technologies, Karlsruhe, Germany). Εξόνιο που εκτείνονται προς τα εμπρός (5′-GAGAAGACGGTGGAAAAATG-3 ‘) και πίσω (5′-GGAAGGACAGGTTGTGAGTC-3’) εκκινητές σχεδιάστηκαν με τη Primer3, έκδοση 0.4.0 (https://frodo.wi.mit.edu/primer3/) του προγράμματος. Γραμμικότητα ενίσχυσης επαληθεύτηκε με qPCR πρότυπη καμπύλη και ανάλυση αλληλουχίας.

RRN18S

(Qiagen, # QT00199367) και

TBP (# QT00000721) χρησιμοποιήθηκαν ως ενδογενή γονίδια ελέγχου. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Κάθε όγκος αντίδρασης 25 μΙ περιείχε 25 ng εκμαγείου cDNA σε 10 μΐ RNase-free PCR βαθμολογούνται νερό, 2.5 μΙ 10χ QuantiTect Δοκιμασία Primer και 12,5 μΙ 2χ QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen). PCR πραγματοποιήθηκε σε δύο στάδια με ένα κύκλο 95 ° C για 15 λεπτά (πρώτο στάδιο) και 40 κύκλους των 94 ° C για 15 s, 55 ° C για 30 s, και 72 ° C για 40 s (δεύτερο στάδιο).