Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία μονόκλωνο, μη-κωδικοποίησης RNA των περίπου 22 νουκλεοτιδίων μήκος. Αυξανόμενες αποδείξεις εμπλέκουν miRNAs μπορεί να λειτουργήσει ως ογκογονίδια ή καταστολείς των όγκων. Εδώ δείξαμε ότι το miR-107 στοχεύουν άμεσα MCL1 και ενεργοποιείται ATR /Chk1 μονοπάτι για να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολής του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, βρήκαμε ότι MCL1 ήταν συχνά επάνω ρυθμισμένη σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, και knockdown του MCL1 αξιοσημείωτα ανέστειλε πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση και εισβολή, ενώ έκτοπη έκφραση της MCL1 ενισχύει σημαντικά τις ιδιότητες αυτές. Η αποκατάσταση της έκφρασης MCL1 μπορεί να εξουδετερώσει την επίδραση του miR-107 επί των καρκινικών κυττάρων. Μαζί, miR-107 είναι ένας νέος ρυθμιστής του MCL1, και οι δύο miR-107 και MCL1 παίζουν σημαντικούς ρόλους στην παθογένεση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Ως εκ τούτου, έχουμε εντοπίσει έναν μηχανισμό για την ATR /Chk1 οδός η οποία περιλαμβάνει την αύξηση των miR-107 που οδηγεί σε μείωση της MCL1. Αντίστοιχα, τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι επηρεάζονται έκφραση σηματοδότηση και την γονιδιακή ATR /Chk1 miR-107, και εμπλέκεται miR-107 ως θεραπευτικό στόχο στον ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Δείξαμε επίσης ότι η ταξόλη εξασθενημένα μετανάστευση και εισβολή σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα με την ενεργοποίηση του miR-107, στην οποία miR-107 παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης του MCL1. Διευκρίνιση αυτό ανακαλύφθηκε MCL1 άμεσα ρυθμίζεται από miR-107 θα ενισχύσει σε μεγάλο βαθμό την κατανόηση των μηχανισμών που ευθύνονται για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και θα παρέχει ένα επιπλέον χέρι για την ανάπτυξη αντικαρκινικών θεραπειών

Παράθεση:. Zhou C, Li G , Zhou J, Han Ν, Liu Ζ, Yin J (2014) miR-107 Ενεργοποιεί ATR /Chk1 Pathway και την καταστολή του τραχήλου της μήτρας Καρκίνος εισβολή από Στόχευση MCL1. PLoS ONE 9 (11): e111860. doi: 10.1371 /journal.pone.0111860

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 15 του Ιούλη του 2014? Αποδεκτές: 8 Οκτώβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 11 Νοεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Υψηλής Τεχνολογίας Έρευνας και Ανάπτυξης του Προγράμματος της Κίνας (863 πρόγραμμα) (2010AA023002) και το Εθνικό 12ο Πενταετές Επιστημονικής και Τεχνικής Υποστήριξης του Προγράμματος της Κίνα (2012BAI02B02). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η ανώμαλη microRNAs (miRNAs) έκφρασης είναι ένα καθοριστικό χαρακτηριστικό της ανθρώπινης κακοήθειας. Ειδικές miRNAs έχουν ταυτοποιηθεί ως υποκινητές ή καταστολείς του μεταστατική εξέλιξη [1], [2]. Ο καρκίνος του τραχήλου έχει επίσης πρόσφατα δειχθεί ότι σχετίζονται με μια ανώμαλη προφίλ έκφρασης miRNA, γεγονός που υποδηλώνει ότι miRNAs μπορούσαν να συμβάλουν στην ανάπτυξη του καρκίνου [3]. Καρκίνος του τραχήλου επηρεάζει σημαντικά την υγεία των γυναικών σε όλο τον κόσμο και σήμερα κατατάσσεται ως η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στις γυναίκες μετά τον καρκίνο του μαστού. Περίπου 500.000 περιπτώσεις καρκίνου του τραχήλου διαγιγνώσκονται ανά έτος, με σχεδόν το 45% των ατόμων με αποτέλεσμα το θάνατο [4], [5]. Ο καρκίνος του τραχήλου είναι μια πολύπλοκη ασθένεια που περιλαμβάνει την ανώμαλη έκφραση πολλών ογκογονιδίων και γονιδίων καταστολής όγκων. Αν και εστιάζοντας σε γνωστά γονίδια απέφερε σημαντικά νέα στοιχεία, άγνωστα RNAs μη κωδικοποιητικές, όπως miRNAs, μπορεί επίσης να παρέχει γνώσεις σχετικά με την βιολογία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

Ο αριθμός των miRNAs έχουν εντοπιστεί να ρυθμίζουν τη μετάσταση των όγκων. Μεταξύ αυτών, miR-107, που ανήκει στην οικογένεια miR-103/107, λόγω ταυτόσημες αλληλουχίες σπόρους τους, είναι ικανό να επάγει επιθηλιακή-προς-μεσεγχυματικά μετάβαση των μαστικών επιθηλιακών κυττάρων, ευνοώντας έτσι επεμβατικές και μεταστατική συμπεριφορά των καρκίνων [6] – [8]. Μυελοειδών κυττάρων λευχαιμίας-1 (MCL1) είναι ένα αντι-αποπτωτικό μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών Bcl-2, και η έκφρασή του έχει βρεθεί ότι επάγεται σε κύτταρα σε διάφορα στάδια της ανάπτυξης και διαφοροποίησης [9]. Λόγω της αντι-αποπτωτικό ιδιότητες, MCL1 είναι ένας πιθανός πρωτο-ογκογονιδίου. Επιπλέον, αυξημένη έκφραση MCL1 παρατηρείται σε ένα ευρύ φάσμα όγκων, συμπεριλαμβανομένων ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, τον καρκίνο του μαστού, κλπ [10] – [13]. Όλο και περισσότερες ενδείξεις δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης MCL1 σχετίζεται με χειρότερα κλινικά αποτελέσματα σε διάφορους τύπους καρκίνου. Αν και το miR-107 θεωρείται ότι διαδραματίζει βασικό ρόλο στον καθορισμό ιδιοτήτων όγκου, η ρύθμιση της έκφρασης MCL1 στους καρκίνους του τραχήλου παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Αυτό μας ώθησε να αναλύσει περαιτέρω το ενδιαφέρον των MCL1 για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο ρόλος που διαδραματίζουν οι miR-107, ένα miRNA που σχετίζονται με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και την αλληλεπίδρασή του με τον καταστολέα MCL1. Ως εκ τούτου, έχουμε καθορίζεται από qRT-PCR που MCL1 ήταν υπερεκφράζεται σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας σε σχέση με το παρακείμενο φυσιολογικούς ιστούς, και MCL1 αναγνωρίστηκε ως άμεσο στόχο miR-107. Εξόντωση MCL1 κατέστειλε την ανάπτυξη και την διεισδυτικότητα του ανθρώπινου καρκίνου του τραχήλου της μήτρας HeLa και SiHa κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι MCL1 μπορεί να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο και είναι ένας μεσολαβητής του miR-107 στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Παρά τη διαθεσιμότητα των διαφόρων μεθόδων επεξεργασίας, όπως η χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία, η 5-ετή επιβίωση παραμένει φτωχή. Ως εκ τούτου, είναι απολύτως απαραίτητο να διερευνηθούν φάρμακα ικανά πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Η ταξόλη έχει βρεθεί να διαθέτουν επιδράσεις κατά των όγκων στην ανθρώπινη πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος, τα ανθρώπινα κυτταρικής σειράς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος Bel-7402, την ανθρώπινη κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος μαστού MCF-7 και ποντικού Lewis κυτταρική γραμμή καρκινώματος πνεύμονα

κλπ

[14] – [16]. Έτσι, σε αυτή τη μελέτη, η ταξόλη είχε αναλάβει να μάθετε αν η ταξόλη είχε οποιεσδήποτε επιπτώσεις στον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας, και να ερευνήσει την πιθανή μηχανισμού στο επίπεδο της μεταγραφής.

Πειραματικές Μέθοδοι

Ηθικοί και θέματα

Γράφει πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλα τα μαθήματα. Το πειραματικό πρωτόκολλο εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Harbin Ιατρικό Πανεπιστήμιο (HMU-ΕΚ-10168) και διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Κατασκευή πλασμιδίου

Pri-miR-107 ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε εντός των θέσεων περιορισμού του pcDNA3. Η προκύπτουσα κατασκευή pcDNA3 /PRI-miR-107 επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση DNA. Μια συντίθεται ASO-miR-107 ήταν ως αναστολέας του miR-107. Το θραύσμα 3′-UTR του γονιδίου MCL1 περιέχει την προβλεπόμενη θέση σύνδεσης miR-107 ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές. Τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο pcDNA3 /EGFP. Ο προκύπτον φορέας ονομάστηκε pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR. Επιπλέον, τα μεταλλαγμένα θραύσμα του MCL1 3′-UTR που περιέχει μία μεταλλαγμένη θέση πρόσδεσης miR-107 ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας PCR κατευθυνόμενης σε θέση μεταλλαξογένεσης και κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pcDNA3 /EGFP μεταξύ τους ίδιους χώρους. Όλες οι ενθέσεις επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση. Για την κατασκευή του φορέα SIR-MCL1, ένα 70-bp διπλής έλικος θραύσμα ελήφθη μέσω μιας αντίδρασης ανόπτησης χρησιμοποιώντας δύο μονών κλώνων. Ο φορέας pcDNA3 χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθεί ένα πλασμίδιο υπερέκφραση MCL1. Η ανθρώπινη αλληλουχία MCL1 πλήρους μήκους cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας PCR από ένα φορέα κλώνο cDNA και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε εντός των θέσεων περιορισμού με τη χρήση εκκινητών.

Cell Culture

κυτταρικές σειρές HeLa και SiHa ελήφθησαν από καρκίνο Ερευνητικό Κέντρο του Χαρμπίν Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Χαρμπίν, Κίνα). κύτταρα Hela διατηρήθηκαν σε RPMI1640 (GIBCO) και τα κύτταρα SiHa διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM, τα κύτταρα αυτά συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? HyClone, Logan, UT), 100 IU /ml πενικιλίνη και 100 μg /ml του στρεπτομυκίνη σε μία υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2 στους 37 ° C.

ανθρώπινα δείγματα ιστών

Είκοσι έξι ζεύγη κλινικά δείγματα, συμπεριλαμβανομένων 26 ανθρώπινα καρκίνου του τραχήλου τομές ιστών από ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και των αντίστοιχων παρακείμενων φυσιολογικών ιστών, ελήφθησαν από την Πρώτη συνδεδεμένες νοσοκομείο, Harbin Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Η ιστολογική όλες οι βιοψίες ήταν πλακώδες καρκίνωμα και τα στάδια του καρκίνου ήταν από III. Οι διαγνώσεις αυτών των δειγμάτων επαληθεύθηκαν από παθολόγους.

Real-time RT-PCR ανάλυση

Ποσοτική RT-PCR για την ανίχνευση των σχετικών επιπέδων μεταγραφής του miR-107. Εν συντομία, 3 μα των μικρών RNA που εκχυλίζεται και απομονώνεται από κύτταρα ή δείγματα ιστού μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA με το στέλεχος-βρόχο αντίστροφης μεταγραφάσης εκκινητή με τη χρήση της ανάστροφης μεταγραφάσης Μ-ΜΕν (Promega, Madison, WI). cDNA χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για την ενίσχυση του miR-107 και ενός ενδογενούς ελέγχου, U6 snRNA, μέσω PCR. Οι εκκινητές αστάρι και qPCR MCL1 αντίστροφης μεταγραφής (RT) συντέθηκαν από Sangon Biotech., Inc. (Σαγκάη, Κίνα). κύκλοι PCR ήταν ως ακολούθως: 94 ° C για 3 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους των 90 ° C για 30 s, 55 ° C για 30 s, και 74 ° C για 30 s. Για να ποσοτικοποιηθεί η έκφραση MCL1, 4 μg του RNA που εξάγεται από κύτταρα ή δείγματα ιστού μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας την ανάστροφη μεταγραφάση Μ-ΜΕν. κύκλοι PCR ήταν ως ακολούθως: 94 ° C για 3 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους των 96 ° C για 30 s, 56 ° C για 30 s, και 70 ° C για 30 s. SYBR πράσινο RCR έγινε εις τριπλούν χρησιμοποιώντας Bio-Rad Χρωμο 4 πραγματικό χρόνο σύστημα RCR ανιχνευτή (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Τα σχετικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης υπολογίστηκαν. Όλες οι εκκινητές αγοράστηκαν από την ΑΒΙ.

Western Blotting

στύπωση Western διεξήχθη για να προσδιοριστεί η έκφραση της πρωτεΐνης MCL1. Όλες οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-πηκτής πολυακρυλαμιδίου μετουσιωθεί και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνη PVDF. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού επί 80 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάζεται με ένα αντίσωμα κατά της αφυδρογονάσης MCL1 ή αφυδρογονάση 3-φωσφορικής (GAPDH) με όλη τη νύκτα στους 5 ° C. Οι μεμβράνες πλύθηκαν και επωάστηκαν με υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα (AuGCT, Inc. (Πεκίνο, Κίνα)). Η έκφραση της πρωτεΐνης εκτιμήθηκε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια και έκθεση σε φιλμ χημιφωταύγειας. Εργαστήριο Έργα Image Acquisition και Λογισμικό Ανάλυσης (UVP) χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση εντάσεων μπάντα.

φθορισμού Reporter Δοκιμασία

HeLa και SiHa κύτταρα συν-επιμολυσμένα με pri-miR-107 ή ASO-miR -107 σε μία πλάκα 48 φρεατίων που ακολουθείται από την /EGFP-MCL1 3′-UTR φορέα αναφοράς pcDNA3 ή pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR μεταλλαγμένο. Ένα ξεχωριστό φορέα έκφρασης RFP, pDsRed2-Ν1 (Clontech, Mountain View, CA) χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση. Τα κύτταρα λύθηκαν 72 ώρες αργότερα, και οι πρωτεΐνες συλλέχθηκαν. Οι ακόλουθοι φορείς συνδιαμολύνθηκαν σε κύτταρα: αυτοί που περιέχουν μόνο τον φορέα ρεπόρτερ EGFP, με pcDNA3 /primiR-107, ή φέρουν ASO-miR-107. PcDNA3 /EGFP, pcDNA3 ή ASO-NC χρησιμοποιήθηκαν ως φορείς ελέγχου. Οι εντάσεις της EGFP και RFP φθορισμού ανιχνεύθηκαν με το F-4500 φασματοφωτόμετρο φθορισμού (Hitachi, Tokyo, Japan).

Η επιμόλυνση Δοκιμασία

κύτταρα HeLa (1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας των 6 φρεατίων και αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-107 φορέα έκφρασης (PRI-miR-20a, 4 μg κάθε φρεάτιο) ή miR-107 αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια (ASO-miR-107). Για τα κύτταρα SiHa, 1 × 10

6 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 6 φρεατίων. 5 μg pri-miR-107 ή 500 μmol ASO-miR-107 είχε επιμολυνθεί. Το πλασμίδιο pcDNA3 και το μη-συγγενής αλληλουχία (ASO-NC) χρησιμοποιήθηκαν για αρνητικό έλεγχο. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε με Lipofectamine Αντιδραστήριο 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το μέσο αντικαταστάθηκε με νέο μέσο καλλιέργειας 5h μετά την επιμόλυνση. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την κυτταρική βιωσιμότητα, σχηματισμό αποικίας κυττάρου και σε προσδιορισμούς μετανάστευσης και εισβολή vitro.

Αξιολόγηση της Βιωσιμότητας Κυττάρων και πολλαπλασιαστική ικανότητα

Για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων και πολλαπλασιαστική ικανότητα , τα κύτταρα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας τις δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας ΜΤΤ και όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε είτε 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο (κύτταρα HeLa) ή 1,5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο (κύτταρα SiHa) και δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, ο αριθμός των αποικιών βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε μετά από 10 ημέρες (κύτταρα HeLa, κύτταρα SiHa) μετά τον εμβολιασμό 200 κύτταρα /φρεάτιο εις τριπλούν σε πλάκες 12 φρεατίων. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. σχηματισμού αποικιών προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας τον αριθμό του σχηματισμού αποικιών.

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή Αναλύσεις

Για τον προσδιορισμό της μετανάστευσης Transwell, 1 × 10

5 κύτταρα HeLa ή 1,3 × 10

5 κύτταρα SiHa σε 200 μΙ RPMI 1640 χωρίς FBS σπάρθηκαν στο άνω μέρος του κάθε θαλάμου Transwell (μέγεθος πόρων 8 μm? Corning) που περιέχει μια μη επικαλυμμένη μεμβράνη. Για τη δοκιμασία εισβολής, 1 × 10

5 κύτταρα HeLa ή 1,3 × 10

5 κύτταρα SiHa τοποθετήθηκαν στον ανώτερο θάλαμο του κάθε ένθετου επικαλύπτονται με 50 μΙ 2 mg /ml Matrigel αυξητικού παράγοντα, και 500 μΙ RPMI 1640 με 20% FBS προστέθηκε στο κατώτερο τμήμα του θαλάμου. Μετά από επώαση για αρκετές ώρες, οι θάλαμοι αποσυναρμολογήθηκαν, και οι μεμβράνες κηλιδώθηκαν με ένα διάλυμα 2% ιώδους κρυστάλλου για 15 λεπτά και τοποθετήθηκαν σε ένα γυάλινο πλακίδιο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει δια μέσου της μεμβράνης μετρήθηκαν σε πέντε τυχαία οπτικά πεδία χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν τρεις ανεξάρτητες φορές εις τριπλούν.

Ανοσοϊστοχημεία

δοκιμασία ανοσοφθορισμού διεξήχθη σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [18]. Οι τομές προκατεργάστηκαν με ακτινοβολία μικροκυμάτων, μπλοκάρει, και επωάστηκαν χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά κουνελιού αντι-ανθρώπινης MCL1 (Saier Biotechnology). Ένταση χρώσης αξιολογήθηκε μετρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

Κυτταρικού Κύκλου Δοκιμασία

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν και επιμολύνθηκαν με pcDNA3-miR-107 ή pcDNA3-NC την ημέρα 0, τότε επανακαλλιεργήθηκαν επί 1η ημέρα, και συλλέχθηκαν κατά την ημέρα 2. τα δείγματα μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής σύμφωνα με την αναφερόμενη πρωτόκολλα.

ροή Aytometry Ανάλυση

η απόπτωση εκτιμήθηκε με μέτρηση της αναδιανομής μεμβράνη της φωσφατιδυλσερίνης με ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης ιωδιούχο αννεξίνη V-προπίδιο (Sigma, USA). Επιπλέον, οι ιωδιούχο προπίδιο-χρωματισμένα κύτταρα LoVo αναλύθηκαν σε μία ροή EPICS ELITE ESP κυτταρόμετρο (Beckman Coulter, USA).

Taxol ρυθμίζει την έκφραση MCL1 από πάνω ρύθμιση miR-107

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως με τροποποιήσεις. Για τη δοκιμασία της μετανάστευσης, τα κύτταρα (2 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) υποβλήθηκαν σε αγωγή με ταξόλη (0, 25, 50, και 100 μΜ) για 48 ώρες, στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη και επαναιωρήθηκαν σε × ελεύθερο ορού μέσο και 5 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν στον ανώτερο θάλαμο του και ένθετο με φίλτρο μεγέθους πολυανθρακικό μεμβράνης 8 μm πόρων (Millipore). ΫΜΕΜ που περιέχει 20% ορό εμβρύου μόσχου τοποθετήθηκαν στον κάτω θάλαμο. Για τη δοκιμασία εισβολή, οι πειραματικές διαδικασίες είναι παρόμοιες με την δοκιμασία μετανάστευσης όπως περιγράφεται ανωτέρω, εκτός του ότι το ένθετο καλά επικαλύφθηκε με 10 μΙ Matrigel (5 mg /mL? BD Biosciences, Bedford, ΜΑ). Μετά από επώαση για 24 και 48 ώρες στους 37 ° C στην δοκιμασία μετανάστευσης ή εισβολή, αντίστοιχα. Real-Time PCR έγινε και δείτε περιγράφονται μέθοδοι για περισσότερες πληροφορίες. Αυτό το πείραμα εκτελέστηκε δύο φορές ανεξάρτητα.

miRNA στόχος Πρόβλεψη και Στατιστική Ανάλυση

θέσεις-στόχους των miRNAs είχαν προβλέψει τη χρήση του RNA22 λογισμικό σε απευθείας σύνδεση (https://cm.jefferson.edu/rna22v1.0/), TargetScan ενσωματωθεί με αλγόριθμους Gnet. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον εις τριπλούν. Η στατιστική σημαντικότητα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμή Student t. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

miR-107 στοχεύει άμεσα MCL1

Εμείς που χρησιμοποιούνται κατ ‘αρχάς των ολοκληρωμένων υπολογιστικών αλγορίθμων της μεθόδου Gnet με TargetScan (βλέπε σχήμα S1.. στο S1 File) για τον εντοπισμό του γονιδίου-miRNA ζεύγη σημαντικά ρυθμίζονται σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Χρησιμοποιήσαμε αυτόν τον αλγόριθμο προγράμματα για την πρόβλεψη miR-107 δεσμευτική άμεσα με 3’-UTR της MCL1. Στη συνέχεια, η επίδραση του miR-107 επί της έκφρασης MCL1 ελέγχθηκε με κέρδος miR-107 και η απώλεια των λειτουργιών. Σε αμφότερες κύτταρα HeLa και SiHa, qRT-PCR πραγματοποιήθηκε για την επικύρωση της miR-107 υπερέκφραση κατασκεύασμα ή miR-107 ASO, με pcDNA3 ή ASO-NC να είναι οι αντίστοιχες ελέγχους (Σχ. 1

A

). Τα κύτταρα HeLa συν-επιμολύνθηκαν με το φορέα pcDNA3 έκθεση /EGFP-MCL1 3′-UTR και PRI-miR-107 ή ASO-miR-107. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1

B

, η ένταση του φθορισμού EGFP στην ομάδα pri-miR-107 ήταν σημαντικά μειωμένη, ενώ εκείνη στην ομάδα ASO-miR-107 αυξήθηκε σημαντικά στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Για να προσδιοριστεί η λειτουργία της θέσης δέσμευσης miR-107, κατασκευάσαμε ένα πρόσθετο φορέα αναφοράς EGFP που περιέχει τον MCL1 3′-UTR με ένα μεταλλαγμένο miR-107 θέση πρόσδεσης. Ως αποτέλεσμα, ούτε η υπερέκφραση ούτε μπλοκάρισμα του miR-107 είχε καμία επίδραση στην ένταση του φθορισμού EGFP σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον μεταλλαγμένο φορέα 3′-UTR (Εικ. 1

C

). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι miR-107 συνδέεται άμεσα με το 3′-UTR του MCL1 να καταστέλλει την έκφραση του γονιδίου. Επιπλέον, προσδιορίσαμε αν miR-107 καταστέλλει επίσης την ενδογενή έκφραση MCL1 στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο, αναλύσαμε την επίδραση του miR-107 στην ενδογενή επίπεδα MCL1 mRNA και της πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας ανάλυση qRT-PCR και κηλίδωση Western, αντιστοίχως. Σε κύτταρα HeLa, η υπερέκφραση του miR-107 είχε ως αποτέλεσμα περίπου 70% μείωση στα επίπεδα MCL1 mRNA (σχ. 1

D

) και περίπου 50% μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης (Εικ. 1

E

). Επιπλέον, MCL1 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης αυξήθηκε περίπου 3 και 2 φορές, αντίστοιχα, σε κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με ASO-miR-107. Παρατηρήσαμε παρόμοια αποτελέσματα στην κυτταρική γραμμή SiHa (Εικ. 1,

D

και

E

). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι miR-107 ρυθμίζει αρνητικά την ενδογενή έκφραση πρωτεΐνης MCL1 μέσω αποικοδόμησης του mRNA και της μεταφράσεως καταστολή.

Α, το επίπεδο έκφρασης της miR-107 σε κύτταρα HeLa και SiHa μεταβλήθηκε σημαντικά μετά την επιμόλυνση με είτε pri-miR -107 ή έκφραση ASO-miR-107 κατασκευάζει όπως καθορίζεται από qRT-PCR χρησιμοποιώντας U6 snRNA για εξομάλυνση. Β, η ένταση του φθορισμού EGFP σε κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με pri-miR-107 μειώθηκε μετά από 48 ώρες και αυξήθηκαν μετά την επιμόλυνση με ASO-miR-107. C, PRI-miR-107 και ASO-miR-107 δεν είχε καμία επίδραση στην ένταση του φθορισμού EGFP σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον μεταλλαγμένο φορέα 3′-UTR. Το mRNA (D) ή πρωτεΐνη (Ε) επίπεδα MCL1 σε κύτταρα HeLa και SiHa μειωμένη ή αυξημένη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου όταν pri-miR-107 βρέθηκε να υπερεκφράζεται ή μπλοκαριστεί, αντίστοιχα (*,

ρ

& lt ? 0,05, **,

σ

& lt?. 0.005)

Η

miR-107 Αναστέλλει τη μετανάστευση και την εισβολή

Πραγματοποιήσαμε ΜΤΤ, σχηματισμό αποικιών, τη μετανάστευση των κυττάρων, και προσδιορισμούς διηθητικότητα χρησιμοποιώντας κύτταρα HeLa και SiHa επιμολυσμένα με είτε pri-miR-107 ή ASO-miR-107 πλασμίδια να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα της έκφρασης miR-107

in vitro

. δοκιμασίες ΜΤΤ και σχηματισμού αποικίας έδειξαν μια στατιστικά σημαντική μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας και πολλαπλασιασμού των pri-miR-107-μορφομετατραπέντα κύτταρα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, ενώ ASO-miR-107 προφανώς αυξημένη αυτές τις ιδιότητες σε κύτταρα HeLa (Σχ. 2

Α, Β

και Σχ. S2A στο S1 αρχείου). Transwell δοκιμασία χωρίς Matrigel (σχ. 2

C

και

Εικ. S2B σε S1 File) απέδειξαν ότι miR-107 υπερέκφραση μειωμένη μετανάστευση σε κύτταρα HeLa κατά 60%, και η διαμόλυνση του ASO-miR -107 αυξημένη μετανάστευση κατά περίπου δύο φορές σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-107 είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση του επεμβατική δυναμικό των κυττάρων HeLa, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε Transwell δοκιμασία με Matrigel, και κύτταρα επιμολυσμένα με ASO-miR-107 είχε αυξηθεί σημαντικά σε διηθητικό τους δυναμικό (Σχ. 2

D

και Σχ. S2C στο αρχείο S1). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με την κυτταρική γραμμή SiHa (σχήμα 2,

Μια

–

D

). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι miR-107 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, μετανάστευση και διεισδυτικότητα σε κύτταρα HeLa και SiHa

in vitro

.

Ο καρκίνος του τραχήλου κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με pri-miR-107 ή ASO- miR-107. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε σε 24, 48, και 72 ώρες μετά την σπορά σε πλάκες 96 φρεατίων με χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ.

Μια

, το ιστόγραμμα εμφανίζει τα δεδομένα στο χρονικό σημείο των 48 ωρών. Όλα τα τρία σημεία δεδομένων έδειξε σημαντική διαφορά.

B

τραχήλου καρκινικά κύτταρα επιμολύνθηκαν με pri-miR-107 ή ASO-miR-107 και στη συνέχεια σπείρονται σε πλάκες 12 φρεατίων. Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, τα κύτταρα βάφτηκαν με διάλυμα 2% κρυσταλλικού ιώδους και μια αντιπροσωπευτική εικόνα εμφανίζεται.

C

και

D

, δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολής διεξήχθησαν με κύτταρα HeLa και SiHa επιμολυσμένα με είτε pri-miR-107 ή ASO-miR-107. Αντιπροσωπευτικές εικόνες και τυχαία επιλεγμένα πεδία εμφανίζονται. Εξόντωση MCL1 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διεισδυτικότητα του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων.

E

, το επίπεδο της πρωτεΐνης MCL1 μετρήθηκε με κηλίδωση Western 48 ώρες μετά την επιμόλυνση των SIR-MCL1 σε κύτταρα HeLa και SiHa. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης /μεταφοράς (

Ctrl

) και για την εξομάλυνση των τιμών.

F

και

G

, τα αποτελέσματα της MCL1 knockdown στη βιωσιμότητα των κυττάρων (

F

) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό σχηματισμού αποικίας (

G

).

Η

και

I

, αλλαγές στη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολής που προκαλείται από τον Sir-MCL1 προσδιορίστηκαν με αναλύσεις μετανάστευση και την εισβολή. (*, P & lt? 0,05? **, P & lt? 0.005).

Η

Νοκ ντάουν της MCL1 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή

Η λειτουργία της MCL1 σε κύτταρα HeLa και SiHa ήταν εξετάστηκαν με τη χρήση παρεμβολής RNA. HeLa και SiHa κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA που στοχεύει MCL1. Κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η επίδραση της siRNA στην αναστολή της πρωτεΐνης MCL1. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2

E

, Sir-MCL1 προκάλεσε μια στατιστικά σημαντική μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης MCL1, μέχρι περίπου 60% σε κύτταρα HeLa και 50% σε κύτταρα SiHa. Η αναστολή της έκφρασης MCL1 μειωμένη βιωσιμότητα (Σχ. 2

F

) και σχηματισμό αποικίας (Εικ. 2

G

) του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Επιπλέον, knockdown έκφρασης MCL1 οδήγησε σε σημαντική μείωση του ρυθμού της κυτταρικής μετανάστευσης (Εικ. 2

H

) και εισβολή (Εικ. 2

I

). Αυτά τα ευρήματα κατέδειξαν την επίδραση της MCL1 knockdown στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή, τα οποία είναι συνεπή με την επίδραση του miR-107 υπερέκφραση στις δύο κύτταρα HeLa και SiHa.

Αποκατάσταση MCL1 εξουδετερώνει Επιδράσεις της miR-107 έκφραση

για να επιβεβαιωθεί ότι τα αποτελέσματα του miR-107 στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, και εισβολής των κυττάρων HeLa και SiHa μεσολάβηση MCL1, κατασκευάσαμε ένα φορέα pcDNA3 /MCL1 περιέχει το MCL1 ORF χωρίς την 3′ UTR για να αποφευχθεί η επίδραση των miRNAs. Η επιμόλυνση των κυττάρων HeLa και SiHa με αυτό το κατασκεύασμα έκφρασης MCL1 ORF αντιστραφεί τα αρνητικά αποτελέσματα του miR-107 επί των επιπέδων MCL1 πρωτεΐνη (Εικ. 3

A

). Η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχ. 3

B

), σχηματισμό αποικίας (Σχ. 3

C

και το Σχ. S3A σε S1 File), μετανάστευση (Εικ.3

D

και το Σχ. S3b σε S1 File), και διεισδυτικότητα (Σχ. 3

E

και το Σχ. S3C σε File S1) που προκαλείται από PRI-miR-107 καταργήθηκε σε κύτταρα συν-επιμολύνονται με το pcDNA3 /διάνυσμα MCL1. Υπερ-έκφραση του MCL1 αντιμετωπιστεί το αποτέλεσμα της miR-107 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, μετανάστευση και διηθητικότητα των κυττάρων HeLa και SiHa.

(Α)

, τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με το pcDNA3 /φορέα MCL1, το οποίο δεν περιείχε το 3′-UTR του MCL1, με ή χωρίς PRI-miR-107 φορέα. (

B

–

D)

, στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, το επίπεδο της πρωτεΐνης MCL1 μετρήθηκε με κηλίδωση Western. δοκιμασία ΜΤΤ (

Β

), δοκιμασία σχηματισμού αποικίας (

C

), φρεατίων δοκιμασίες χωρίς Matrigel (

D

), ή Transwell δοκιμασίες με Matrigel (

E

) χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων, ικανότητα ανάπτυξης, και το δυναμικό για τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή, αντίστοιχα. (

F

) ATR και τα επίπεδα ATM mRNA παρακολουθούνταν από qRT-PC R στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά miR-107transfection. GADPH χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± τυπικό σφάλμα (SE) από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (

G

) δοκιμασία κηλίδος Western αποκάλυψε ότι μετά το miR-107 υπερέκφραση, ATR ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω, τότε η φωσφορυλίωση της Chk1 αυξήθηκε, αλλά φωσφορυλίωση της Chk2 ήταν καμία διαφορά. (Η, Ι και J) Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο, miR-107 ή MCL1 με χρώση ιωδιούχου προπιδίου και κυτταρομετρία ροής 24 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Ν

και

O

, η σχετική έκφραση του miR-107 (

K

) και MCL1 (

L

) στις 15 ζεύγη, συμπεριλαμβανομένων του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς και συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς, προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR.

Μ

, έκφραση MCL1 σε τραχηλικού ιστού καρκίνου και των φυσιολογικών ιστών από ανοσοϊστοχημεία (

n

= 12).

Ν

, σχηματική αντιπροσωπεύουν miR-107-μεσολάβηση ρύθμιση της έκφρασης MCL1 κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου. Μοντέλο τροποποιημένων ATR /Chk1 οδού, στην οποία συμμετέχουν miR-107 και MCL1. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SE από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Σημασία προσδιορίστηκε με t-test του Student:. * Ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0.005

Η

miR-107 Ενεργοποιεί ATR /Chk1 Διαδρομή

Για να βεβαιωθείτε ότι αν miR-107 θα μπορούσε να ενεργοποιήσει μονοπάτια βλάβες στο DNA, που παρακολουθείται το επίπεδο του mRNA της ATR και ΑΤΜ (Εικ. 3

F

). Κέρδος των pri-miR-107 μαζικά προκαλείται από την έκφραση της ATR, αλλά δεν ATM σε επίπεδο mRNA. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε επίπεδο πρωτεΐνης (Σχήμα 3

G

). Σε σύγκριση με τον έλεγχο, ATR πρωτεΐνη ήταν αυξημένη κατά primiR-107 υπερεκφράζεται. Παρακολουθήσαμε επίσης την ενεργοποίηση των Chk1 και Chk2, ένα κατάντη γονίδιο της ATR και ΑΤΜ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3

G

, Chk1 δραματικά φωσφορυλιωμένη μετά pri-miR-107 υπερέκφραση, ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική μεταβολή στην φωσφορυλίωση της Chk2. Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση του Chk1 συνήθως οδηγεί σε G1 σύλληψη, ελέγξαμε το προφίλ του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής (Εικ. 3

Η

,

I

και

J

). Αντίστοιχα, τα κύτταρα σε φάση S ελαττώθηκαν μαζί με miR-107 υπερέκφραση ενώ δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στην G2 /M φάση. Όλα αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η αυξημένη miR-107 προκαλεί G1 σύλληψη με την ενεργοποίηση ATR /Chk1 οδού.

Η έκφραση του miR-107 και MCL1 στον Καρκίνο του Τραχήλου της Μήτρας και των φυσιολογικών ιστών

Για την ανίχνευση της έκφρασης του miR -107 σε ανθρώπινους καρκινικούς ιστούς του τραχήλου της μήτρας, η δοκιμασία qRT-PCR διεξήχθη επί δεκαπέντε ζεύγη δειγμάτων του καρκίνου του τραχήλου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. miR-107 εκφράστηκε σε χαμηλότερο επίπεδο (Σχ. 3

K

), ενώ MCL1 εκφράστηκε σε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο στους ιστούς του όγκου σε σύγκριση με τα αντίστοιχα φυσιολογικούς ιστούς (Σχ. 3

L

). Σε αυτό το σκηνικό, χρησιμοποιήσαμε μία δοκιμασία ανοσοϊστοχημείας για περαιτέρω ανίχνευση του επιπέδου έκφρασης MCL1 σε ανθρώπινους καρκινικούς ιστούς του τραχήλου της μήτρας και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3

Μ

, τα επίπεδα έκφρασης των MCL1 ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες στο γειτονικό φυσιολογικούς ιστούς, υποστηρίζοντας περαιτέρω ότι το miR-107 ρυθμίζει αρνητικά MCL1. Το μοντέλο εργασίας της αλληλεπίδρασης miR-107 MCL1 κατά την διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου φαίνεται στο Σχ. 3

Ν

. Η ανακάλυψη αυτή προσφέρει μια εικόνα για το πώς ρυθμίζεται η έκφραση MCL1, και προτείνει θεραπευτικοί στόχοι για τη διάσωση της λειτουργίας της πρωτεΐνης MCL1 πιο συχνά συνδέεται με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ανθρώπινο.

ταξόλη Καταστέλλει τη Μετανάστευση και την εισβολή του τραχήλου της μήτρας Καρκίνος

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την κυτταροτοξικότητα της ταξόλης με κατεργασία του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα με διάφορες συγκεντρώσεις ταξόλης για 24 ή 48 ώρες. Τα αποτελέσματα από την δοκιμασία ΜΤΤ έδειξαν ότι η ταξόλη δεν ήταν σημαντικά τοξική για HeLa και SiHa (Εικ. 4

Α

) κύτταρα στις συγκεντρώσεις μέχρι 100 μΜ για 24 έως 48 ώρες. Αυτή η περιοχή συγκεντρώσεων, κατά συνέπεια, εφαρμόζεται σε όλα τα επόμενα πειράματα. Τα καρκινικά κύτταρα αποκολληθούν από γειτονικά κύτταρα, απελευθερώνοντας τις διακυτταρικές τους συνδέσεις κατά την διάρκεια της μετάστασης, και η εξωκυτταρική μήτρα είναι πρωτεολυτικώς υποβαθμισμένη να επιτραπεί η μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Για να διερευνηθεί η επίδραση της ταξόλης στην κακοήθεια του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, τα μετανάστευση και εισβολή ικανότητες των κυττάρων HeLa και SiHa προσδιορίστηκαν. Στη δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων, κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με 50 και 100 μΜ ταξόλης έδειξαν μια σημαντική μείωση στην κινητικότητα, αντίστοιχα, και παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα SiHa με αναστολή (εικ. 4

B

). Στην δοκιμασία κύτταρο εισβολή, η ταξόλη έχει δειχθεί ότι μειώνουν την κυτταρική διείσδυση σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Στα 50 μΜ, εισβολή μειώθηκε κατά 46,12% και 61,24%, και σε 100 μΜ, εισβολή μειώθηκε κατά 50,04% και 80,11% σε HeLa και SiHa κύτταρα, αντίστοιχα (Σχ. 4

C

). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ταξόλη ανέστειλε σημαντικά την μετανάστευση και την εισβολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων υπό μη τοξικές συγκεντρώσεις.

(

A

) Η χημική δομή της ταξόλης. (

Β

) κύτταρα HeLa και κύτταρα SiHa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ταξόλης για 24 και 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Το οικόπεδο παρουσιάζει σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (0 μΜ). HeLa και SiHa κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ταξόλης για 48 ώρες. Στη συνέχεια, ο μεταναστευτικός (

C

) και επεμβατικές (

D

) ικανότητα των κυττάρων μετά από κάθε θεραπεία προσδιορίσθηκαν, όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Οι κάτω οικόπεδα ήταν οι σχετικοί αριθμοί των κυττάρων σε σύγκριση με ότι σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (0 μΜ). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ταξόλης για 48 ώρες. (

E

) το ρυθμισμένο μέσο από κάθε κατεργασία συλλέχθηκε και δραστικότητα MCL1 προσδιορίστηκε με καζεΐνης ζυμογραφία. (

F

) κυτταρόλυμα εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων της πρωτεΐνης των MCL1 με κηλίδωση Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (

G

) δοκιμασία απόπτωσης έδειξαν ότι η ταξόλη κατέστειλε την κυτταρική απόπτωση και G1 σύλληψη. (

Η

) η σχετική έκφραση του miR-107, (

I

) το μοντέλο λειτουργίας της ταξόλης ρυθμίζει την έκφραση των MCL1 από τα κάτω ρύθμιση miR-107. Μπάρες δείχνουν την αξία ως μέση τιμή ± S.E. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *, P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.005, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα

Η

Η ταξόλη αναστέλλει την έκφραση των MCL1

Για να διερευνηθεί η πιθανή υποκείμενη αντι-μεταστατική επίδραση της ταξόλη, την έκφραση της MCL1 σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις ταξόλης εξετάστηκαν. Όπως φαίνεται στη δοκιμασία καζεϊνολυτική δραστικότητα, δραστικότητα MCL1 μειώθηκαν με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μετά τη θεραπεία με ταξόλη. ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι η δραστηριότητα MCL1 μειώθηκε κατά 20,2%, 60,1%, και 85,4% στα κύτταρα HeLa, και κατά 40,5%, 70,8%, και 84,2% στα κύτταρα SiHa όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25, 50, και 100 μΜ της ταξόλης, αντίστοιχα (Εικ. 4

D

). Η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη για να εξεταστεί η έκφραση πρωτεΐνης των MCL1 σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου και στις δύο δύο τραχήλου γραμμών καρκίνου δοκιμάστηκαν, ταξόλη ανέστειλε την πρωτεΐνη έκφραση MCL1 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 4

E

). Όπως φαίνεται στο Σχ. Σύκο. Σύκο. Σύκο.