Abstract

Cetuximab, ένα χιμαιρικό μονοκλωνικό αντίσωμα που αναπτύχθηκε για τη στόχευση του υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), έχει χρησιμοποιηθεί έντονα για τη θεραπεία ασθενών με καρκίνο με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου και καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. Ακέραια G ανοσοσφαιρίνη (IgG) αντισώματος όπως cetuximab, ωστόσο, έχει ορισμένους περιορισμούς όπως το υψηλό κόστος παραγωγής και χαμηλό ποσοστό διείσδυσης από αγγείωση σε στερεά μάζα του όγκου λόγω του μεγάλου μεγέθους του. Σε προσπάθεια να ξεπεραστούν αυτοί οι περιορισμοί, εμείς μηχανικής cetuximab να δημιουργήσουμε μεταβλητών θραυσμάτων μονής αλυσίδας (scFv-CH3? Μινισώματος) που εκφράστηκαν σε βακτηριακό σύστημα. Μεταξύ τριών μηχανικής minibodies, βρήκαμε ότι MI061 μινισώματος, η οποία αποτελείται από την μεταβλητή περιοχή βαριάς (V

Η) και ελαφριές (V

L) που συνδέονται με μια 18-υπολειμμάτων πεπτίδιο συνδετήρα, εμφανίζει υψηλότερη διαλυτότητα και καλύτερη εκχύλιση ιδιότητες από βακτηριακή λύμα. Επιπλέον, επικυρωμένη ότι καθαρισμένο MI061 παρεμβαίνει σημαντικά τη σύνδεση σε φωσφορυλίωση EGFR και αναστέλλει EGFR του συνδετήρα. Με τη χρήση ενός microarray πρωτεΐνη που αποτελείται από 16.368 μοναδικά ανθρώπινων πρωτεϊνών που καλύπτουν περίπου πρωτεΐνες που σχετίζονται με 2.400 πλασματικής μεμβράνης όπως υποδοχείς και κανάλια, αποδείξαμε επίσης ότι MI061 αναγνωρίζει μόνο το EGFR αλλά όχι άλλες πρωτεΐνες σε σύγκριση με το cetuximab. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Engineered MI061 διατηρεί τόσο ειδικότητα δέσμευσης και τη συγγένεια του cetuximab για EGFR. Αν και είχε σχετικά μικρό χρόνο ημισείας ζωής στον ορό, αποδείχθηκε ότι είναι εξαιρετικά σημαντικό αποτέλεσμα κατά του όγκου με αναστολή μονοπάτι ERK σε μοντέλο ξενομοσχεύματος Α431. Στο σύνολό τους, παρούσα μελέτη μας παρέχει αδιάσειστα στοιχεία που μηχανικής μινισώματος είναι πιο αποτελεσματικό και ελπιδοφόρο παράγοντα για την

in vivo

στόχευση των συμπαγών όγκων

Παράθεση:. Kim YP, Πάρκο D, Kim JJ, Choi WJ, Lee SH, Lee SY, et al. (2014) Η αποτελεσματική θεραπευτική προσέγγιση για καρκίνο κεφαλής και τραχήλου από Engineered μινισώματος Στόχευση του υποδοχέα EGFR. PLoS ONE 9 (12): e113442. doi: 10.1371 /journal.pone.0113442

Επιμέλεια: Shaida Α Andrabi, Johns Hopkins University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 του Ιουλίου, 2014? Αποδεκτές: 23, Οκτωβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 1 Δεκέμβρη, 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από τη βασική επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Επιστημών, των ΤΠΕ & amp? Μελλοντικό σχεδιασμό (Νο 2011 – 0030043 & amp? 2012-R1A1A1013558). Η εργασία αυτή υποστηρίζεται επίσης εν μέρει από μια επιχορήγηση από το Εθνικό R & amp? Προγράμματος D για τον έλεγχο του καρκίνου, του Υπουργείου Υγείας και Πρόνοιας, της Κορέας (131.280). Sinil Φαρμακευτική Εταιρεία παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς YPK, SHL, WC, και JL. YL έλαβε επίσης μισθό από τη Samsung Ινστιτούτο Τεχνολογίας (SAIT). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού. YPK, SHL, WC, και JL είναι υπάλληλοι της Sinil φαρμακευτική εταιρεία και έλαβε μισθό από αυτούς. YL είναι υπάλληλος της Samsung Ινστιτούτο Τεχνολογίας (SAIT) και επίσης έλαβε μισθό από SAIT. Δεν υπάρχουν προϊόντα στην ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι ένας από τους ErbB οικογένειας των κινασών τυροσίνης [1]. Ligand μεσολάβηση EGFR σηματοδότησης όπως ΡΙ3Κ είτε /ΑΚΤ ή οδού Ras /ERK ρυθμίζει διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων κυτταρικής επιβίωσης, θανάτου, την ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό και την κινητικότητα του [2]. Δυσλειτουργία του EGFR από υπερέκφραση ή μετάλλαξη της οδηγεί σε ανάπτυξη ενός ευρέος φάσματος των επιθηλιακών καρκίνων, π.χ. του μαστού, του παχέος εντέρου, της κεφαλής και του λαιμού, των νεφρών, των πνευμόνων, του παγκρέατος, του προστάτη και του καρκίνου [3] – [5]. Αυτή είναι μια λογική για την ανάπτυξη των παρεμποδιστών EGFR ως αντικαρκινικοί παράγοντες στην θεραπεία του καρκίνου [5]. Τελευταία δεκαετία, δύο κύριες κατηγορίες αναστολέα EGFR έχουν αναπτυχθεί με βάση το EGFR. Η πρώτη κατηγορία, αναστολείς κινάσης τυροσίνης, συμπεριλαμβανομένων gefitinib και erlotinib, δρα με σύνδεση ανταγωνιστικώς προς το θύλακα ΑΤΡ του EGFR. Η δεύτερη κατηγορία, μονοκλωνικά αντισώματα όπως cetuximab και panitumumab, μπορεί να παρεμβληθεί δέσμευση του EGFR συνδέτη [6], [7]. Και οι δύο κατηγορίες παραγόντων εμφανίζουν σημαντική δραστικότητα κατά του όγκου σε μία κλίμακα μοντέλων ξενομοσχεύματος ποντικού EGFR-εξαρτώμενη [7], [8]. Ειδικά, το cetuximab, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που στοχεύει EGFR, έχει μελετηθεί εντατικά ως αντικαρκινικού παράγοντα εγκριθεί από το FDA για τη θεραπεία καρκίνου κεφαλής και τραχήλου [9].

Η στοχευμένη θεραπεία χρησιμοποιώντας ανέπαφα IgGs σαν cetuximab έχει κυρίως βελτιωμένη κακή πρόγνωση και τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο [10]. Ωστόσο, παρά την υψηλή αντικαρκινική αποτελεσματικότητα τους, η χρήση ανέπαφων ολόκληρο IgGs για θεραπεία του καρκίνου είναι περιορισμένη λόγω του υψηλού κόστους παραγωγής, λόγω της απαίτησης για ένα σύστημα έκφρασης θηλαστικών, και χαμηλό ποσοστό διείσδυσης σε ιστούς όγκων [11]. Ως εκ τούτου, η αγέρωχη ανάγκη μηχανικής αντίσωμα που παράγεται από το βακτηριακό σύστημα έχει αυξηθεί και ένα σωρό μελέτες που έχουν εισαγάγει διάφορες δομές της μηχανικής μινισώματος βάση για την πολυμορφία της ανέπαφη IgG [11], [12].

Για να ξεπεραστούν τρέχοντα ζητήματα, δημιουργήσαμε μεταβλητών θραυσμάτων μονής αλυσίδας (scFvs) που εκφράζεται σε

E.coli

με βάση γονικού αντισώματος, το cetuximab. Τα τροποποιημένα scFvs δεν έχει μόνο τη σειρά τομέα του V

H και V

περιοχή L αλλά επίσης εύκαμπτο συνδετήρα πολυπεπτίδιο που αποτελείται από υπολείμματα 18 αμινοξέων μεταξύ V

H και V

domains L για την αποτελεσματική παραγωγή και σταθερότητα. Η (εφεξής μινισώματος) περιοχή scFv συνδέθηκε με C

H3

μέσω

περιοχή της άρθρωσης. Στην παρούσα μελέτη, η μηχανική μινισώματος (V

H-18Linker-V

L-άρθρωσης-C

Η3) χαρακτηρίστηκε

in vitro

και σε σύγκριση με το cetuximab για του

in vivo

εφαρμογή στο μοντέλο ξενομοσχεύματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Κατασκευή MI045, φορείς έκφρασης MI053 και MI061

Για την κατασκευή του MI045 (VL-συνδέτης-VH ), τα θραύσματα DNA που κωδικοποιούν τον τομέα VL και VH συντέθηκαν με βάση τις αλληλουχίες αμινοξέων (1ος-107η αα) της αλυσίδας Α του cetuximab Fab θραύσματος (GenBank αριθμός πρόσβασης Νο. 1YY8_A) και τις αλληλουχίες αμινοξέων (1ος-119η αα) της Β αλυσίδας του cetuximab Fab θραύσματος (GenBank με αρ. 1YY8_B), αντίστοιχα. Τα κλασικά (G4S) 3 σειρές (GGGGSGGGGSGGGGS) χρησιμοποιήθηκαν ως ένα συνδετήρα [13]. Η MI053 δημιουργήθηκε με μια παρόμοια μέθοδο με τη διαφορά ότι το μήκος και οι αλληλουχίες του συνδέτη, αποτελείτο από 18 α (GSTSGSGKPGSGEGSTKG) που προέρχεται από m218 Whitlow συνδετήρα [14]. Η MI061 έχει ίδια δομή σε σύγκριση με MI053 εκτός τάξης τομέα των VH και VL. Το θραύσμα DNA που κωδικοποιεί πεδίο αρθρωτό CH3 συντέθηκε επίσης με βάση τις αλληλουχίες αμινοξέων της ανθρώπινης IgG-1. Η αλληλουχία άρθρωσης τροποποιήθηκε με 15 αα (EPKSPKSADKTHTAP). Τα κωδικόνια ήταν βελτιστοποιημένα για

Ε. coli

έκφρασης. Κάθε scFv κομμάτια DNA υποβλήθηκαν σε πέψη με

BamHI

και

HindIII

και των αρθρωτών-C

H3 θραύσμα DNA χωνεύεται με

HindIII

και

XhoI

εισήχθησαν σε pET26b. Αυτά τα κατασκευάσματα περιείχαν αλληλουχία οδηγό pelB στο Ν-τερματικό άκρο για περιπλασμική έκφραση σε BL21 (DE3), και περιείχε 6-Ιστιδίνης υπολείμματα στο Ο-τερματικό άκρο για τον καθαρισμό συγγένειας.

Έκφραση και καθαρισμός μινισώματος

Κάθε κατασκευή που κωδικοποιεί MI045, MI053 και MI061 μετατράπηκε σε

Ε. coli

BL21 (DE3). Καλλιεργείται αποικίες καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C επί μία νύκτα με έντονη ανάδευση, και στη συνέχεια, 1 ml αυτής της προ-καλλιέργειας εμβολιάστηκε σε φρέσκο ​​ζωμό 1 L LB. Η πρωτεϊνική έκφραση προκλήθηκε με την προσθήκη IPTG σε μια τελική συγκέντρωση 0.4 mM, όταν η οπτική πυκνότητα στα 600 nm έφθασε 0.5-0.6. Οι καλλιέργειες συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν με 100 ml ρυθμιστικού PBS που περιέχει 1 mM PMSF, 0.2 mg /ml DNase Ι, και 0.2 mg /ml ΚΝάση Α, και στη συνέχεια διασπάστηκαν με υπερήχους. Τα διαλυτά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα ελήφθησαν με φυγοκέντρηση στα 20.000 rpm για 20 λεπτά στους 4 ° C και επωάστηκαν με Ni

2 + -ΝΤΑ στήλη ρητίνης (GE Healthcare Life Science, USA) σύμφωνα με το εγχειρίδιο του προμηθευτή. Η στήλη πλύθηκε με 30 όγκους στήλης PBS που περιέχει 50 mM ιμιδαζόλης, και στη συνέχεια, οι δεσμευμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν με 10 όγκους στήλης PBS που περιέχει 400 mM ιμιδαζολίου. Οι καθαρισμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με 12% SDS-PAGE. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με την μέθοδο δικιγχονινικού οξέος (Pierce, Rockford, IL, USA)

Ανθρώπινο πρωτεΐνη microarray

Ο HuProt Human Proteome Microarray αγοράστηκε από CDI εργαστήρια (http:. //www.cdi-lab.com). Το τσιπ περιλαμβάνει 16.368 μοναδικά πλήρους μήκους ανθρώπινο ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες εις διπλούν, μαζί με αρκετές πρωτεΐνες ελέγχου, όπως IgG, GST, BSA-βιοτίνη, και ιστόνες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Αντιγόνου ειδικότητα τόσο μινισώματος και cetuximab δέσμευσης (Erbitux, Merck, Darmstadt, Γερμανία) μετρήθηκαν με τη χρήση Alexa-Fluor 546 ή 647 συζευγμένο αντι-ανθρώπινο αντίσωμα IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mouse μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-GST (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Εν συντομία, το chip πρωτεΐνης επωάστηκε πρώτα με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (5% BSA σε PBS με 0,05% (ν /ν) Tween 20) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια μινισώματος (32 ηΜ), cetuximab (32 ηΜ) ή αντι- ποντικού μονοκλωνικό αντίσωμα GST επωάστηκαν περαιτέρω στο πλαίσιο της lifterslip (Thermo επιστημονική, USA) για 1 ώρα σε RT. Μετά από πλύση τρεις φορές με 1χ PBS που περιείχε 0,05% Tween 20 με ήπια ανακίνηση για 10 λεπτά η κάθε μία, η μικροσυστοιχία επωάστηκε με συζευγμένο αντίσωμα Alexa-Fluor. Στη συνέχεια, η μικροσυστοιχία πλένεται τρεις φορές και στη συνέχεια ελήφθησαν οι τιμές του σήματος ανιχνευτή χρησιμοποιώντας μία GenePix Pro 6.0 λογισμικό (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Κυτταρική καλλιέργεια και αντιδραστήρια

Το Α431 κύτταρα (KCLB, Σεούλ, Κορέα) καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Gibco, Καρλσρούη, Γερμανία) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, UT, USA), 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη ( Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής ως προς τη δέσμευση

δοκιμασία αντισώματος

Για να επιβεβαιωθεί cetuximab, MI053 και MI061 σύνδεση με EGFR , κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της κυτταρικής γραμμής Α431, που εκφράζει υψηλά επίπεδα του EGFR. Ένα σύνολο 1 × 10

5 κύτταρα επωάστηκαν με cetuximab, MI053 ή MI061 στα 2 μg /ml για 30 λεπτά επί πάγου και πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης (1% BSA /PBS), που ακολουθείται από 30 λεπτών επώαση με 4 μg /ml ενός επισημασμένου με FITC κατσίκας αντι ανθρώπινη Fc mAb (Sigma). Τα κύτταρα αναλύθηκαν με μια ροή Accuri C6 κυτταρομετρίας (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Η ανταγωνιστικής σύνδεσης

δοκιμασία

Τα κύτταρα Α431 ρυθμίζεται σε 1 × 10

5 κύτταρα /σωλήνα και επωάζεται περιέχει 6 ηΜ FITC-επισημασμένο συνδετήρα EGF (Molecular Probes, Leiden, Ολλανδία) συν τις σχετικές κρύο ανταγωνιστές, τα οποία είναι cetuximab και MI061 (2 μg /ml) για 30 λεπτά στους 4 ° C. Μετά πλένονται τρεις φορές για να απομακρυνθεί το μη συνδεδεμένο υλικό, τα κύτταρα αναλύθηκαν με μια ροή Accuri C6 κυτταρομετρίας (BD Biosciences) για να προσδιοριστεί η σχετική ποσότητα δεσμευμένου FITC-επισημασμένο EGF.

Immunoassay

Οι 96 φρεατίων ανοσοπλάκα (SPL, Σεούλ, Κορέα) επικαλύφθηκαν με sEGFR (Fitzgerlad Industries International, ΜΑ, USA) επανασυστάθηκε σε 200 mM Na

2CO

3 (ρΗ 9.6). Η πλάκα μπλοκαρίστηκε με 200 μΐ /φρεάτιο 1Χ διάλυμα μπλοκαρίσματος (Sigma), σφραγίζεται και αποθηκεύεται στους 4 ° C μέχρι τη χρήση. Αραιώσεις του cetuximab (από 2 mg /ml) παρασκευάσθηκαν σε ένα εύρος 1:10-1:4096000 με σειριακή αραίωση με PBS για πρότυπη καμπύλη. Για ανοσοδοκιμασία του μινισώματος δραστηριότητας, το αραιωμένο πλάσμα (1:50) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και η επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Στη συνέχεια, κάθε φρεάτιο πλύθηκε τρεις φορές με PBS-T (Αλατόνερο Ρυθμισμένο με Φωσφορικό με 0,05% Tween 20) και 100 μl /φρεάτιο IgG (C

τομέα Η3) αντίσωμα 1:100 ποντικού αντι-ανθρώπου (Thermo Scientific, Rockford , IL, USA) προστέθηκε. Το κάθε φρεάτιο επωάστηκε για 1 ώρα και στη συνέχεια προστέθηκε αντι-ποντικού IgG HRP (Sigma) δευτερογενές αντίσωμα. Για την αξιολόγηση της μινισώματος συγκέντρωση στο πλάσμα, το κάθε φρεάτιο πλύθηκε τρεις φορές με PBS-T και αντι-ανθρώπινο αντίσωμα IgG ειδικού Fab κουνελιού (Sigma) επωάστηκε για 1 ώρα μαζί με HRP IgG αντι-κουνελιού (Sigma) δευτεροβάθμια. Μετά την πλύση με PBS-T, 100 μΙ /φρεάτιο υποστρώματος ΤΜΒ (Sigma) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 10 λεπτά σε RT. Η αντίδραση σταμάτησε με 1 MH

2SO

4 και την πλάκα στη συνέχεια αναγνώστηκε σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας στα 450 nm.

Για να προσδιοριστεί η ημίσεια ζωή της MI061, τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν σε 1 , 3, 6, 24 και 48 ώρες μετά την αρχική ένεση (ip, 0,3 mg /ποντικό) και τα δείγματα ηπαρινισμένο πλάσμα διαχωρίστηκαν αμέσως με φυγοκέντρηση (13.000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C). Η συγκέντρωση του μινισώματος εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μη-διαμερισματική μεθόδους με BA υπολ 2007 (KFDA, Σεούλ, Κορέα).

δοκιμασία φωσφορυλίωσης

δοκιμασίες φωσφορυλίωσης εκτελέστηκαν σε κύτταρα Α431 με την παρουσία είτε cetuximab Fab (30 μg /ml) ή μινισώματος (30 μg /ml). Μετά από καλλιέργεια για 8 ώρες, τα κύτταρα διεγείρονται με 10 ng /ml EGF επί 20 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα λύθηκαν και τα φωσφορυλιωμένα επίπεδα πρωτεΐνης EGFR μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας σάντουιτς PathScan Phospho-EGF υποδοχέα (Tyr845) ELISA Kit (κυτταρική σηματοδότηση) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

μοντέλο ξενομοσχεύματος

έξι- έως επτά εβδομάδων αρσενικών αθυμικών (ηυ /ηυ) ποντίκια αγοράστηκαν από Nara βιοτεχνολογίας (Σεούλ, Κορέα). Τα ποντίκια στεγάστηκαν κάτω από συνθήκες ελεύθερα παθογόνων σε κλουβιά μικροαπομονωτικά με εργαστηριακή τροφή και νερό διαθέσιμα

κατά βούληση

. ξενομοσχεύματα Α431 ιδρύθηκαν από υποδόρια έγχυση μεταξύ 5 × 10

6 κύτταρα /100 μΙ PBS στο αριστερό πλευρό αθυμικών ποντικών της. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε κάθε 2-3 ημέρες με ένα ψηφιακό παχύμετρο και χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: Όγκος = μήκος Χ πλάτος Χ ύψος. Οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε ένα όγκο 100 mm

3, και τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες των έξι ζώων η καθεμία. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με φυσιολογικό ορό Q3d, cetuximab σε 0.25 mg /ποντικό (Q3d), το cetuximab Fab σε 0.25 mg /ποντικό (Q3d), και MI061 σε 0.25 mg /ποντικό (q7d). Όλα τα φάρμακα χορηγήθηκαν με ε.π. ένεση. Θεραπεία των ζώων συνεχίστηκε για όλη τη διάρκεια της μελέτης. Στο τέλος κάθε χρονικό σημείο, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 ασφυξία. Στατιστική ανάλυση της ανάπτυξης του όγκου για κάθε μία από τις μελέτες προσδιορίστηκε με ένα

Student

‘

s t τεστ

χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή SigmaStat (Jandel, San Rafael, CA, USA). Τα ποντίκια διατηρήθηκαν σύμφωνα με τις πολιτικές της Θεσμικής Animal Care and Use Επιτροπής Πανεπιστήμιο Konkuk (IACUC). Η μελέτη που διεξήχθη στο παρόν εγκρίθηκε από την Konkuk Πανεπιστήμιο IACUC (Έγκριση αριθ .: KU14024).

Immunohistochemisry (IHC)

αποκομμένοι ιστοί όγκου διατηρήθηκαν σε 10% ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης για χρώση IHC. διαδικασίες χρώσης IHC για συνολική EGFR ήταν ως ακολούθως: Η παραφίνη εξαντλημένο από μια διαφάνεια και επωάστηκαν με διάλυμα πεψίνης για 15 λεπτά στους 37 ° C. Τομές ιστού καλύφθηκαν με 3% Η

2O

2 για να εμποδίσει ενδογενούς υπεροξειδάσης για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια επωάστηκαν με αντι-ΕΟΡΚ αντίσωμα σε 1:100 (Cell Signaling Technology, IL, USA) για 18 ώρες στους 4 ° C. Μετά από πλύση με TBS, τα πλακίδια επωάστηκαν με ένα δευτερογενές αντίσωμα (ϋΑΚΟ Ιαπωνία, Kyoto, Japan) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. χρώση ιστών οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας DAB (3,3’diaminobenzidine) διάλυμα χρωμογόνου υποστρώματος. IHC χρώση για φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη EGFR διεξήχθη ως εξής: Μετά το ίδιο προ-επεξεργασία του αντι-ΕΟΡΚ αντίσωμα όπως περιγράφεται ανωτέρω, τμήματα ιστού αποκλείστηκαν με μπλοκ πρωτεΐνη χωρίς ορό για την πρόληψη της μη ειδικής αντιδράσεις για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια επωάστηκαν με το πρωτογενές ρ-EGFR (Tyr845) αντίσωμα στις 1:50 (σηματοδότηση κυττάρων) για 18 ώρες στους 4 ° C. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα (ϋΑΚΟ Ιαπωνία) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. χρώση ιστών οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα DAB χρωμογόνου υποστρώματος. Οι πλάκες στη συνέχεια με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται, και τοποθετημένα.

Western ανάλυση κηλίδος

Για την ανάλυση στυπώματος Western των καθαρισμένων MI045 (0,23 μg /λωρίδα), MI53 (0,55 μg /λωρίδα) και MI061 (1,30 μg /λωρίδα), τα δείγματα πρωτεΐνης αρχικώς διαχωρίστηκαν σε 12% γέλες SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Thermo επιστημονικούς, USA). Η μεμβράνη ανοσοστυπώθηκαν με πρωτογενές αντι-C

A567H αντίσωμα τομέα Η3 (Thermo Scientific, USA) και κάθε πρωτεΐνη οπτικοποιήθηκε με επώαση με δευτερογενή HRP-συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού IgG. Για τον έλεγχο των επιπέδων έκφρασης του EGFR, ρ-EGFR, ρ-ΑΚΤ, ERK και π-ERK σε κύτταρα όγκου με ανάλυση κηλίδος Western, μάζες όγκου απομακρύνθηκαν πλευρό των ποντικών και ομογενοποιούνται από. Τα δείγματα πρωτεΐνης που περιέχουν την ίδια ποσότητα ολικών πρωτεϊνών (40 μg /φρεάτιο) εκχυλίστηκαν και διαχωρίστηκαν σε 12% γέλες SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Τα πρωτογενή αντισώματα, EGF υποδοχέα (κυτταρική σηματοδότηση), φωσφο-EGF υποδοχέα (Tyr1068) (Cell Signaling), ΑΚΤ pS473 (Rockland), ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Erk1 /2) (κυτταρική σηματοδότηση), και φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204) αντίσωμα χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκηλίδωση σύμφωνα με τη συνιστώμενη αναλογία του κατασκευαστή (1:1000). Η μεμβράνη αναπτύχθηκε και ορατή χρησιμοποιώντας Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate (Thermo επιστημονική, USA).

Αποτελέσματα

Έκφραση και χαρακτηρισμός της μηχανικής minibodies

Αυτή η μινισώματος αποτελείται βασικά από ο V

H και V

domains L ενώνονται με ένα εύκαμπτο συνδετικό πεπτίδιο, το οποίο μπορεί να επηρεάσει τη σταθερότητα και διαλυτότητα του αντισώματος, και συνδέθηκαν με C

H3

μέσω

περιοχής άρθρωσης. Εδώ, δημιουργήσαμε τρεις minibodies περιλαμβάνει διαφορετικό μήκος του συνδετήρα ή αντίστροφα διέταξε V

H και V

domains L (Σχήμα 1Α). Η πρώτη μινισώματος που έχει σχετικά μικρή συνδέτης ονομάστηκε MI045 και ένα άλλο μινισώματος ονομάστηκε MI053 που έχουν 15 ή 18 υπολείμματα ως συνδέτη, αντίστοιχα. Τελευταία ένα αποτελείται από αντάλλαξαν V

H και V

τομέα L, και ονομάστηκε MI061. Για να διερευνήσουν τη φύση των τριών μηχανικής minibodies, η έκφραση του κάθε μινισώματος δοκιμάστηκε σε

Ε. coli

όπως περιγράφεται από τον Hu et al. [16]. Διαλυτό κλάσμα

Ε. coli

λύμα εφαρμόστηκε σε χρωματογραφία συγγενείας και είχαν ως αποτέλεσμα την ανάκτηση του υψηλής καθαρότητας minibodies χωρίς θρυμματισμός στην κηλίδα western (Σχήμα 1Β). Κάθε μινισώματος έδειξε το εκτιμώμενο μοριακό βάρος, και το ποσοστό ανάκτησης των MI053 και MI061 έδειξε 3.4 ή 4.4 διπλώνει υψηλότερη από MI045, αντίστοιχα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το 18 υπολείμματα συνδετήρα είναι πράγματι δομικά επαρκές μοντέλο από 15 υπολείμματα για να διατηρήσει τη διαλυτότητα. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι η αποδοτικότητα ανάκτησης MI061 είναι μεγαλύτερη από MI053 (Σχήμα 1Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το μήκος του συνδετήρα και της τάξης πεδίο της μεταβλητής αλυσίδες, οι οποίες με τη σειρά τους επηρεάζουν την διαλυτότητα του αντισώματος, που συνδέεται με τη φύση του μινισώματος.

(Α) Σχηματική απεικόνιση των κατασκευασμάτων κωδικοποίησης κάθε μινισώματος. (Β) Καθαρισμός-ετικέτα του μινισώματος από

Ε. coli

κύτταρα. κύτταρα BL21 (DE3) μετασχηματίσθηκαν με κάθε κατασκεύασμα και μινισώματος παραγωγή προκλήθηκε με προσθήκη IPTG. -Tagged His minibodies καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας μια κολώνα Νί-ΝΤΑ. Οι εκλουσθείσες πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 12% SDS-PAGE και κατέστησαν ορατά με είτε Coomassie Brilliant Blue (CBB) ή προσδιορισμό ανοσοστυπώματος με ένα αντίσωμα αντι-πεδίο CH3. Οι αριθμοί δείχνουν ποσοστό ανάκτησης σε σχέση με το MI045. Μ? δείκτης μοριακού μεγέθους, 1? ακατέργαστο εκχύλισμα, 2? διαλυτές πρωτεΐνες, 3? σφαιρίδιο, 4? ρέουν διαμέσου, 5? πλύσιμο με 50 mM ιμιδαζόλιο, 6? έκπλυση με 400 mM ιμιδαζόλη, WB? κηλίδα western.

Η

Δραστηριότητα και την εξειδίκευση των

Με βάση την απόδοση ανάκτησης κάθε μινισώματος από βακτηριακές λύμα, επιλέχθηκαν για τη συμπληρωματική μελέτη μηχανικής minibodies

τόσο MI053 και MI061. Για τη μέτρηση της δραστηριότητας τους, ανάλογα με τον προσανατολισμό του τομέα των μεταβλητών περιοχών, που είχε εκτιμηθεί αρχικά δεσμευτική δραστηριότητά τους με το EGFR. Α431 κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα EGFR επωάστηκαν με αντισώματα, και η επακόλουθη αλλαγή στο σήμα φθορισμού μετρήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής λέιζερ που βασίζεται. Κατά συνέπεια, όλα τα κατεργασμένα αντισώματα προκάλεσε μια μετατόπιση στο σήμα φθορισμού μεγαλύτερο από εκείνο του μη επεξεργασμένου ελέγχου (Σχήμα 2Α). Μεταξύ αυτών, το cetuximab έδειξε την υψηλότερη δραστικότητα συνδέσεως με EGFR. Ιδιαίτερα, επιβεβαιώσαμε ότι MI061 και MI053 διατήρησε επίσης υψηλή συγγένεια και ήταν ικανά ισχυρή σύνδεση με EGFR. Η συγγένεια μεταξύ MI061and EGFR ήταν ισχυρότερη από την συγγένεια μεταξύ MI053 και EGFR. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η παραγγελία τομέα των μεταβλητών αλυσίδων συνδέεται με συγγένεια μινισώματος. Μια εναλλακτική προσέγγιση για να ληφθεί η ειδικότητα, η δοκιμασία ανταγωνισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα ΡΙΤΟ-επισημασμένο συνδετήρα EGF με έννοια που παρεμβολή της αλληλεπίδρασης μεταξύ EGF και EGFR θα μπορούσε να αναστείλει την ενεργοποίηση του EGFR και κατάντη μονοπάτι σηματοδότησης της. Ως αποτέλεσμα, το cetuximab εντελώς ανταγωνίστηκε με EGF, ενώ η αγωγή των MI061 ανέστειλε μερικώς δέσμευσης με EGFR (Εικόνα 2Β). Για να επιβεβαιώσετε ανασταλτική ικανότητα της MI061, αναλύσαμε σχετικό ρυθμό φωσφορυλίωσης του EGFR (Εικόνα 2C). ποσοστό φωσφορυλίωση του EGFR που προκαλείται από το ΕΤΠ αναλύθηκε σε κύτταρα Α431 σε παρουσία είτε cetuximab Fab θραύσματος (CT Fab), EGFR περιοχές του cetuximab ή MI061 δεσμευτική. Η θεραπεία του EGF με CT Fab καταστέλλεται σε σχέση φωσφορυλίωση έως περίπου 50%. Ομοίως, η θεραπεία του EGF με MI061 έδειξε επίσης ίδια επίδραση σε σύγκριση με CT Fab. Αν και συγγένεια δέσμευσης τους και την ειδικότητα ήταν σχετικά χαμηλότερες σε σύγκριση με cetuximab, MI061 ήταν σε θέση να αναγνωρίσει έντονα EGFR και καταστέλλουν τη φωσφορυλίωση του EGFR στο κυτταρικό σύστημα. Για την επικύρωση ειδικότητα σύνδεσης αντιγόνου του MI061, χρησιμοποιήσαμε το chip ανθρώπινη πρωτεΐνη μικροσυστοιχίας, η οποία περιέχει 16.368 μοναδικά GST-tagged ανθρώπινες πρωτεΐνες πλήρους μήκους (Σχήμα 3Α). Το τσιπ πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε επεξεργασία παράλληλα με είτε MI061 ή cetuximab σε ίσες μοριακή αναλογία για 1 ώρα σε RT. Οι πρωτεΐνες σύνδεσης με αντίσωμα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας Alexa Fluor-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα. Το τσιπ στη συνέχεια σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή GenePix 4100A. Για την κανονικοποίηση του σήματος Alexa-Fluor, το τσιπ πρωτεΐνη στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με ένα αντίσωμα αντι-GST, ακολουθούμενη από τη σάρωση. Στο τσιπ μικροσυστοιχιών κάθε πρωτεΐνη, τόσο MI061 και cetuximab έδειξαν παρόμοιο μοτίβο πρόσδεσης εις διπλούν, με ίδια ένταση, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β). Επίσης, σε μια υψηλής απόδοσης άποψη, αυτοί δεσμεύονται μόνο πρωτεΐνη EGFR, εκτός από τις πρωτεΐνες ελέγχου, όπως GST (Σχήμα 3Β, κάτω πλαίσιο).

(Α) δοκιμασία σύνδεσης EGFR. Κάθε αντίσωμα επωάστηκε με EGFR-υπερεκφράζεται A431cells και έπειτα συγγένεια δέσμευσης για EGFR αναλύθηκε με ένταση FL1-Η χρήση κυτταρομετρίας ροής (FACS) δοκιμασία ανταγωνισμού (Β) EGFR. FITC-επισημασμένο EGF επωάσθηκε με κύτταρα Α431 και η δραστικότητα δέσμευσης του με EGFR παρακολουθήθηκε με FACS. Για τη δοκιμασία συναγωνισμού, EGF επωάσθηκε κύτταρα μαζί με είτε cetuximab (αριστερό πάνελ) ή MI061 (δεξί πάνελ). δοκιμασία φωσφορυλίωσης (C) EGFR. Ο σχετικός ρυθμός φωσφορυλίωσης του EGFR που προκαλείται από κάθε αντίσωμα αξιολογήθηκε με ELISA χρησιμοποιώντας ένα αντι-EGFR φωσφο-αντισώματος. Ο EGF χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για τη φωσφορυλίωση του EGFR όπως υποδεικνύεται. Τα ποσοτικά δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± s. μι. μ.

* P & lt? 0,05. N.s, δεν είναι σημαντική.

Η

(Α) Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας πρωτεΐνης μικροσυστοιχιών. (Β) Τα κομματάκια πρωτεΐνη επωάστηκαν είτε με MI061 ή cetuximab, και οι αλληλεπιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας Alexa Fluor-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα. Μετά το πλύσιμο, κάθε τσιπ σαρώθηκε από GenePix Scanner στα 532 nm (Cy3) και 635 nm (Cy5). Κάθε τιμή των σημάτων ιχνηλάτης ελήφθη με τη χρήση GenePix Pro 6.0 λογισμικό. Κόκκινο σήμα υποδεικνύει την ένταση δέσμευσης αντιγόνου και των δύο MI061 και cetuximab. Όλες οι πρωτεΐνες σύντηξης GST ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα αντι-GST και οπτικοποιήθηκαν με πράσινο φθορισμό όπως υποδεικνύεται. Λευκά τετράγωνα υποδεικνύουν περιοχή μεγέθυνσης για κάτω πίνακα.

Η

Η αντικαρκινική επίδραση της μηχανικής μινισώματος

Για να αξιολογεί και να χαρακτηρίζουν τη φαρμακοκινητική πλάσματος (PK) του MI061, φαρμακοκινητικές παράμετροι εξετάστηκαν σε ξενομόσχευμα ζώων. Μετά intraperitoneral ένεση (ΙΡ) της MI061 με 0,3 mg /ένεση, η C (max), Τ (max), περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) και t

1/2 μετρήθηκαν ως 14,4 mg /L, 1 ώρα , 24,8 mg • h /L και 4,3 ώρες, αντίστοιχα (Εικόνα 4Α). Σύμφωνα με τα στοιχεία ΡΚ του MI061, η αντικαρκινική δράση της MI061 παρακολουθήθηκε στο μοντέλο ξενομοσχεύματα Α431. Κάθε ένα από τα ποντίκια υποβλήθηκε σε θεραπεία για 22 ημέρες από 13

ου μετά την μεταμόσχευση ημέρα μέσω ί.ρ. έγχυσης με cetuximab, CT Fab από κάθε 3 ημέρες ή MI061 από καθημερινή βάση σχετικά με τη δραστηριότητα ΡΚ. Ένεση των αντισωμάτων δεν επηρέασε την αύξηση του σωματικού βάρους των Α431 όγκων ξενομοσχευθέντος ποντικούς (Εικ S1c). Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο κατά προσέγγιση επιφάνεια. Το μέγεθος του όγκου στην ομάδα οχήματος εμφάνισε μια γραμμική αύξηση καθ ‘όλη τη διάρκεια της περιόδου 22 ημερών και έφθασαν μέγεθος περίπου 1200 mm

3 (Εικόνα 4Β). Η έγχυση του cetuximab ή MI061 κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου στα 300 mm

3. Παρόλο MI061 εγχύθηκε περισσότερες φορές από ό, τι άλλα αντισώματα, έδειξε σημαντική αντικαρκινική δράση ως cetuximab. Κάθε μάζα του όγκου αυξάνεται από ξενομόσχευμα εξήχθη από τους ποντικούς για να μετρηθεί η σχετική όγκος του όγκου (Σχήμα 4C). Είναι ενδιαφέρον ότι, η έγχυση MI061 σε ξενομοσχευθέντος ποντίκια κατέστειλε σημαντικά τον όγκο του νεοπλάσματος στο 25% σε σύγκριση με την ομάδα υπό αγωγή με όχημα (Εικόνα 4D). Έτσι, MI061 έδειξε παρόμοια επίδραση κατά του όγκου σε σύγκριση με την ομάδα cetuximab Θεραπείας

in vivo

. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποστήριξαν ότι καθαρισμένα MI061 από βακτηριακό σύστημα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για κλινική εφαρμογή ως παράγοντας κατά των όγκων.

(Α) Φαρμακοκινητική του MI061 μινισώματος. Τα δείγματα αίματος για φαρμακοκινητική του MI061 συλλέχθηκαν σε 1, 3, 6, 24 και 48 ώρες μετά την αρχική ενδοπεριτοναϊκή ένεση (ί.ρ., 0,3 mg /ποντικό) και η συγκέντρωση τους υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας μη-διαμέρισμα μεθόδους. (Β) χρονική πορεία της αλλαγής στο μέγεθος του όγκου. Αθυμικά γυμνά ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή με cetuximab ή με cetuximab Fab κάθε 3 ημέρες, ή με μινισώματος ημερησίως για 10 ημέρες με ένεση ί.ρ (0,25 mg /ποντικό). Η θεραπεία ξεκίνησε όταν το μέγεθος του όγκου φθάσει τα 100 mm

3 μετά το ξενομόσχευμα. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο κατά τη διάρκεια της ημέρας του πειράματος. (C) Εκπρόσωπος ευρήματα των μαζών Α431 όγκου. (ΡΕ). Σχετικός όγκος του όγκου. Το μέγεθος των μαζών Α431 όγκου αφαιρέθηκε από ποντίκια χωρίς θύμο αδένα αντιμετωπίζεται κάθε αντίσωμα μετρήθηκε με παχύμετρο και υποδεικνύεται ως σχετική όγκο σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε θεραπεία με cetuximab. Τα ποσοτικά δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± s. μι. μ.

* P & lt? 0,05

Η

Η επίδραση της μηχανικής μινισώματος για EGFR κατάντη της οδού σήμα

Τα επίπεδα έκφρασης του EGFR και φωσφορυλιωμένη-EGFR (ρ-EGFR) αναλύθηκαν από Α431 τομές όγκων όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α. Σε σύγκριση με την ομάδα οχήματος, οι εντάσεις χρώσης των δύο EGFR και ρ-EGFR ήταν σημαντικά μειωμένη στο αντίσωμα αντιμετωπίζονται όλες οι ομάδες. Για να ληφθεί το αποτέλεσμα MI061 επί EGFR μονοπάτι κατάντη σήμα, το καθένα μάζες όγκων λύθηκαν. Αυτοί αναλύθηκαν για την κατάσταση ενεργοποίησης των κατάντη μορίων σηματοδότησης ακολουθούμενη από ενεργοποίηση EGFR. Παρόμοια με ανοσοϊστοχημεία δεδομένων έναντι EGFR και ρ-EGFR, βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης του EGFR ήταν σημαντικά μειωμένη στην ομάδα αγωγής είτε CT ή Fab MI061 (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, τα επίπεδα τόσο της ρ-EGFR και ρ-ERK ήταν μόνο εντελώς κατασταλεί στην ομάδα MI061 επεξεργασμένο αλλά όχι στην άλλη ομάδα (Σχήμα 5Β). Σε αντίθεση, CT Fab μόνο ανέστειλε φωσφορυλίωση των ΑΚΤ (Σχήμα 5Β). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι CT Fab και MI061 μπορεί να εμπλέκεται σε διάφορες κατάντη οδό σήματος, παρά ένα παρόμοιο ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της φωσφορυλίωσης του EGFR

in vivo

. Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα κατά των όγκων των MI061 σε σύγκριση με το cetuximab σε Α431 ξενομοσχεύτηκε μοντέλο, που υποστηρίζουν τη σημασία της περαιτέρω μελέτες για τη χρήση των MI061 να παραδώσει αντικαρκινικό παράγοντα

in vivo

.

(Α) φωσφορυλίωση του EGFR. Το φωσφορυλιωμένο EGFR κατεψυγμένου τμήματος του ιστού Α431 όγκου αναλύθηκε με χρώση ανοσοϊστοχημείας με χρήση ρ-EGFR (Tyr 845) αντίσωμα. Κλίμακα ράβδου = 200 μm (Β) EFGR μονοπάτι καθοδικά σηματοδότησης σε λύμα του όγκου αναλύθηκε με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας κάθε αντίσωμα όπως υποδεικνύεται. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Συζήτηση

Tumor-στοχευμένες θεραπείες χρησιμοποιώντας ανέπαφα ολόκληρη IgG έχουν εντατικά μελετηθεί για ασθενείς με καρκίνο σε πολυάριθμες έρευνες και οδήγησε σε ένα κύμα εγκεκριμένα από τον FDA αντισωμάτων [6] – [10]. Ως εκ τούτου, έχουν αξιόλογα αποτελέσματα επιτεύχθηκαν στη θεραπεία του καρκίνου, αλλά εξακολουθούν να υπάρχουν ορισμένοι περιορισμοί στη χρήση ολόκληρο IgG στη θεραπεία σε ασθενείς με καρκίνο. Αυτές περιλαμβάνουν εξαιρετικά υψηλό κόστος παραγωγής και φαρμακοκινητική έναντι διείσδυσης ιστού [17], [18]. Για να ξεπεραστούν αυτά τα μειονεκτήματα, οι ερευνητές έχουν προσπαθήσει να μειώσει το μέγεθος του αντισώματος για την αποτελεσματική παραγωγή σε βακτηριακά σύστημα και να ενισχυθεί η ποσοστό διείσδυσης του αντισώματος για την αποτελεσματική θεραπεία [16], [19]. Στην παρούσα μελέτη, που παράγεται επίσης τρεις minibodies προέρχεται από cetuximab και εξετάζονται τα χαρακτηριστικά και αντικαρκινική δράση τους

in vitro

και

in vivo

.

Πολλές προσπάθειες έχουν αναληφθούν για να δημιουργήσουν αντισώματα για ανθρώπινη θεραπευτική χρήση σε κύτταρα θηλαστικών. Ωστόσο, τα επιμολυσμένα κύτταρα των θηλαστικών δεν προτιμούνται ως ένα σύστημα έκφρασης λόγω των χαμηλών επιπέδων έκφρασης, αργή ανάπτυξη και ακριβά θρεπτικά μέσα [20]. Αυτά τα προβλήματα μπορούν να αντιμετωπιστούν με τη χρήση ενός

Ε. coli

σύστημα έκφρασης για την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Αν και υπάρχουν κάποιοι περιορισμοί όπως ενδοκυτταρική συσσώρευση, το δυναμικό για την υποβάθμιση του προϊόντος και την παραγωγή ενδοτοξίνης, έχει ευρέως χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών λόγω της ικανότητάς του να αναπτύσσεται ταχέως, σε υψηλή πυκνότητα σε φθηνά υποστρώματα και σχετικά απλό χειρισμό [20] . Επίσης, οι διάφορες τεχνικές ανασυνδυασμένου DNA επέτρεψαν την παραγωγή θραυσμάτων αντισωμάτων με διάφορα μεγέθη [11], [16], [19], [21]. Μινισώματος (scFv-C

Η3), ένας από αυτούς, μπορεί να εκφραστεί σε βακτηριακό σύστημα και το μικρό τους μέγεθος και χαμηλού μοριακού βάρους επιτρέπει γρήγορη και εύκολη διείσδυση ιστού [22]. Παρά βελτιωμένη τεχνολογία και βαρέων έρευνα, ωστόσο, εξακολουθούν να υπάρχουν περιορισμοί όσον αφορά την παραγωγικότητα και θερμική σταθερότητα του μινισώματος [22]. Σε γενικές γραμμές, scFvs παρουσιάζουν χαμηλή θερμική σταθερότητα και τείνουν να μετουσιωθούν ή να συσσωματωθούν υπό τις συνθήκες της κλινικής χρήσης, λόγω του σχετικά ασθενής V

H-V

L αλληλεπίδραση [22]. Για την κατάκτηση χαμηλή σταθερότητα, μερικοί ερευνητές επικεντρώθηκαν σε μήκος συνδετήρα, επιμήκυνση του υπολείμματος στο συνδετήρα ελαφρώς ενισχυμένη σταθερότητα των scFvs [23]. Δοκιμάσαμε επίσης θερμική σταθερότητα και των δύο MI045 και MI053 και διαπίστωσε ότι MI053, η οποία έχει 18 κατάλοιπα ως συνδέτης, είναι πιο σταθερό και όχι κατά τη διάρκεια της MI045 48 ώρες (Εικ. S1D και Υλικά και Μέθοδοι S1).