Αφηρημένο

υποδοχέα αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών 4 (FGFR4) είναι ζωτικής σημασίας για την έγκαιρη ανάπτυξη και επιδιόρθωση των ιστών. επίπεδα έκφρασης FGFR4 είναι πολύ περιορισμένες σε ενήλικους ιστούς, εκτός από αρκετές συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου, η οποία έδειξε υπερέκφραση FGFR4. Εδώ, η ανάλυση μετάλλαξης FGFR4 απορρίπτεται η παρουσία μεταλλάξεων ενεργοποιήσεως, εκτός από Arg

388, σε διαφορετικά ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές και καρκινικές δείγματα. Σταθερό shRNA FGFR4-σίγηση σε κυτταρικές σειρές SW480 και SW48 οδήγησε σε σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, προσκόλληση, μετανάστευση κυττάρων και εισβολή. Αυτή η μείωση στα ογκογόνα και επεμβατικές δυνατότητες του ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων συνοδεύεται από μείωση του σαλιγκαριού, Twist και τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης ΤΟΡβ και αύξηση του Ε-καδερίνης, προκαλώντας μια αναστροφή σε μια πιο επιθηλιακό φαινότυπο, σε τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, FGFR4 σηματοδότησης ενεργοποιημένης την ογκογόνο SRC, ERK1 /2 και οδοί ΑΚΤ σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου και προώθησε μια αύξηση στην κυτταρική επιβίωση. Η σημασία της FGFR4 στην αύξηση του όγκου υποστηρίχθηκε από δύο διαφορετικές στρατηγικές. Κινάσης αναστολείς κατάργησε την ανάπτυξη των κυττάρων που σχετίζονται με FGFR4 και οδών σηματοδότησης στον ίδιο βαθμό από ό, τι τα κύτταρα FGFR4-σιγήσει. Ειδικά αντισώματα FGFR4 στόχευση χρησιμοποιώντας προκάλεσε μια παρόμοια μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων. Επιπλέον, FGFR4 κύτταρα knock-down εμφάνιζαν μειωμένη ικανότητα για

in vivo

σχηματισμό όγκων και την αγγειογένεση σε γυμνούς ποντικούς. Συλλογικά, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν ένα σημαντικό ρόλο για FGFR4 στην ογκογένεση, εισβολή και την επιβίωση σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Επιπλέον, FGFR4 στόχευση αποδεικνύεται εφαρμογής του παχέος θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Peláez-García Α, Barderas R, Τόρες S, Hernández-Βάρας P, Teixido J, Bonilla F, et al. (2013) FGFR4 Ρόλος στα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση και τη θεραπευτική αξία του στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (5): e63695. doi: 10.1371 /journal.pone.0063695

Επιμέλεια: Qian Τάο, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 9 του Νοέμβρη 2012? Αποδεκτές: 6 Απρίλη 2013? Δημοσιεύθηκε: May 16, 2013

Copyright: © 2013 Peláez-García et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση BIO2009-08818 από το ισπανικό Υπουργείο Επιστημών και Καινοτομίας, χορηγεί τις καθιερωμένες ερευνητικές ομάδες (AECC) και να χορηγήσει S2011 /BMD-2344 /Colomics2 από Comunidad de Madrid. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ινοβλαστών έχουν αυξητικούς παράγοντες (FGFs) έχουν ενοχοποιηθεί σε πολλές βιολογικές διεργασίες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του εμβρύου, την επούλωση των πληγών, την αιμοποίηση και την αγγειογένεση [1]. Συνδέονται με τέσσερα υποδοχείς FGF (FGFR) που ορίζονται FGFR1-4 [2]. Η δομή FGFRs περιλαμβάνει ένα πεδίο σύνδεσης συνδετήρα που περιέχει τρεις διαφορετικές επικράτειες τύπου ανοσογλοβουλίνης (που ονομάζεται Ig I, II και Ig Ig III). Το πεδίο σύνδεσης ακολουθείται από μία μόνο διαμεμβρανική περιοχή και μια ενδοκυτταρική περιοχή κινάσης τυροσίνης κυτταροπλασματική. FGFR4 εμφανίζει το πιο περιορισμένο πρότυπο έκφρασης σε εμβρυϊκή ανάπτυξη και επιδιόρθωση των ιστών [3], [4] σε σύγκριση με τις άλλες τρεις FGFRs, και τα επίπεδα έκφρασης του μειώνονται μετά τη γέννηση. Στους ενήλικες, FGFR4 εκφράζεται σε μυϊκά μυοϊνοβλάστες κατά την αναγέννηση μετά από τραυματισμό, αλλά όχι σε ώριμο σκελετικό μυ [5]. υποδοχείς FGF απορύθμιση έχει δειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Αυτές οι μεταβολές έχουν προταθεί για να συμβεί μέσω υπερέκφρασης, ενίσχυσης γονιδίου ή μετάλλαξης [6].

Προηγουμένως, η ομάδα μας προσδιορίζονται FGFR4 ως στόχο αυτοαντίσωμα σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC) χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες πρωτεΐνη [7]. Επιπλέον, παρατηρήσαμε μια σαφή υπερέκφραση του FGFR4 σε ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές (ιδίως σε 2 από 4 πολύ μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές) με δυνατότητα σύνδεσης του FGFR4 έκφρασης για τελευταία στάδια καρκίνου του παχέος εντέρου [8]. FGFR4 έχει αναφερθεί ότι υπερ-εκφράζεται σε ανθρώπινα μαστού, του προστάτη, του παχέος εντέρου, ραβδομυοσάρκωμα, γαστρικό, παγκρεατικό, ηπατοκυτταρικό και υπόφυσης αδενοκαρκινώματα [4], [9], [10], [11], [12], [13] , [14], [15], όπου μπορεί να συμβάλει στην εξέλιξη του όγκου μέσω πολλαπλών μηχανισμών [4], [9]. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης FGFR4 συνδέθηκαν με μεταστατική νόσο και κακή επιβίωση σε γαστρικό, πνεύμονα, αδενοκαρκίνωμα του μαστού και ραβδομυοσάρκωμα [16], [17], [18]. FGFR4 σωματικές μεταλλάξεις είναι σπάνια στον καρκίνο [11], [19], [20], [21]? Arg

388 είναι η πιο κοινή πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (SNP) σε FGFR4, η οποία προκαλεί αυξημένη σταθερότητα και παρατεταμένη ενεργοποίηση του υποδοχέα. Έχει συνδεθεί με την κακή πρόγνωση για τον καρκίνο θετικό κόμβο του μαστού, υψηλής ποιότητας σάρκωμα μαλακών ιστών, της κεφαλής και του τραχήλου και των πνευμόνων καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [9], [16], [18], [22], [23].

Μεταξύ των 18 συνδετών FGF, FGF19 δεσμεύεται κατά προτίμηση FGFR4 [24], αν και δεσμεύεται επίσης FGFR1. Η δέσμευση λαμβάνει χώρα σε ένα σύμπλοκο που περιλαμβάνει ηπαρίνη, FGFR4 και δύο μόρια FGF, η οποία πυροδοτεί FGFR διμερισμό, οδηγώντας στην αυτοφωσφορυλίωση πολλαπλών υπολειμμάτων τυροσίνης στο ενδοκυτταρικό πεδίο κινάσης τυροσίνης [3], [25]. FGF19-FGFR4 έχει προταθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην επαγωγή του πολλαπλασιασμού ηπατοκυττάρων και καρκινογένεση [26]. Αντισώματα που κατευθύνονται έναντι FGF19 έχουν δείξει θεραπευτική υπόσχεση σε διάφορες ξενομοσχεύματα όγκου [27]. Ωστόσο, το κλείδωμα της FGF19 μπορεί να ενεργεί για διαφορετικούς υποδοχείς FGF [28].

Έχουμε χρησιμοποιήσει διαφορετικά δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου και κυτταρικών σειρών (SW480, SW620, SW48, KM12C και KM12SM) [29], [30], [31] για τη διερεύνηση της παρουσίας SNPs ή ενεργοποίησης μεταλλάξεις σε FGFR4 και να χαρακτηρίσει τη βιολογική σημασία της ως ογκογονίδιο και θεραπευτικός στόχος σε καρκίνο του παχέος εντέρου. KM12C και KM12SM επιθηλιακά κύτταρα διαθέτουν παρόμοια γενετικό υπόβαθρο, που διαφέρει ως προς τη μεταστατική τους ιδιότητες [31]. SW480 και SW620 είναι δύο ισογονιδιακά ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. SW480 απομονώθηκε από Β όγκου ενός πρωτογενούς Δούκα του καρκίνου του παχέος εντέρου, ενώ κυτταρική γραμμή SW620 απομονώθηκε από ένα μεταστατικό λεμφαδένα του ίδιου ασθενούς [30]. SW48 ορθοκολικό καρκίνο κυττάρων που προέρχονται από έναν όγκο στο στάδιο C του Duke [30]. Αυτές οι πέντε κυτταρικές σειρές διαφέρουν επίσης στα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης FGFR4 [8]. Στη μελέτη μας, καμία νέα SNPs ή ενεργοποιώντας μεταλλάξεις βρέθηκαν στην FGFR4. Ωστόσο, η απώλεια του κύκλου λειτουργίας πειράματα αποκάλυψαν ένα σημαντικό ρόλο του FGFR4 σε ογκογόνα ιδιότητες του ορθοκολικού καρκίνου, κύτταρα αφού εξάντληση του κατήργησε τον πολλαπλασιασμό, προσκόλληση, μετανάστευση και εισβολή. FGFR4-σίγηση προκάλεσε αυξητική ρύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης και προς τα κάτω ρύθμιση σαλιγκάρι και άλλα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) μεσολαβητών. Τέλος, αποδείξαμε ότι FGFR4 στόχευση ήταν σε θέση να εμποδίσει την ανάπτυξη του όγκου

in vitro

και

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Η επιτροπή δεοντολογίας του Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Μαδρίτη, Ισπανία) ενέκρινε τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται για πειραματικούς εργασία με ποντίκια.

κυτταρικές σειρές, RNA Extraction, Αντισώματα και Αναστολείς

καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές KM12C και KM12SM [31], [32] ελήφθησαν από τον Δρ Ι Fidler (MD Anderson). SW480, κυτταρικές γραμμές SW48 και ΗΕΚ293 ήταν από την ATCC. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σύμφωνα με καθιερωμένα πρωτόκολλα [7]. RNA εκχυλίστηκε από κυτταρικές σειρές και 20 ζεύγη κανονικά /καρκινικό ιστό από ασθενείς με καρκίνο με την RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc.) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το εκχυλισμένο RNA ποσοτικοποιήθηκε με ένα NanoDrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (NanoDrop Technologies Inc.).

χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 15 διαφορετικών αντισωμάτων, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την FGFR4 σηματοδότησης πρωτεΐνες μονοπάτι και ελέγχου. Πηγή, κλωνικότητας, και τις συνθήκες χρήσης για κάθε περίπτωση και την τεχνική που καθορίζονται στον πίνακα S1. FGFR4-ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα (sc-124, Santa Cruz Biotechnology) και έλεγχος GST-ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα από την GE Healthcare χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα FGFR4-στόχευσης. αναστολείς FGFR ήταν PD173074 (Sigma) και ΤΚΙ-258 (Novartis). PD173074 είναι ένας αναστολέας παν-FGFR που επάγει απόπτωση [33]. ΤΚΙ-258 είναι μια κλινικά σχετική, αναστολέας πολλαπλών κινασών, συμπεριλαμβανομένων των VEGFR και κινασών ΡϋΘΡΡ μεταξύ άλλων [34]. Άλλοι αναστολείς ήταν: ΡΡ2 (Sigma) για SRC, JNK Inhibitor II και UO126 (Calbiochem) για ΜΕΚ1 /2. Είχαν χρησιμοποιηθεί σε 3 μΜ και 15 μΜ, όπως έχει ήδη αναφερθεί [35].

Φορείς, Τα siRNAs, siRNAs και διαμολύνσεις

pRS φορείς που περιέχουν συγκεκριμένες Τα siRNAs (TI378641, TI378642, TI378643 και TI378644) για FGFR4 (NM_022963) και ένας έλεγχος shRNA μη αποτελεσματικό έναντι οποιασδήποτε ανθρώπινη αλληλουχία (TR30003) ήταν από ΟηΟεηε. Σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα ελήφθησαν από ρετροϊική μόλυνση. Εν συντομία, τα κύτταρα HEK293FT επιμολύνθηκαν με φορείς pRS και pNGVL-gag-pol και φορείς συσκευασιών pNGVL-VSVG χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο jetPRIME Transfection (Polyplus). Μετά από επώαση των κυττάρων για 12-15 ώρες σε μέσο χωρίς ορό, το μέσο αντικαταστάθηκε με ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS και πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. Την ημέρα μετά, μέσα που περιέχουν λεντοϊού σωματίδια φυγοκεντρήθηκε, αραιωμένο 1:02-1:10 σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS και αντιβιοτικά και προστίθεται απευθείας στο SW480 και SW48 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Μετά από τρεις ημέρες επώασης, τα μολυσμένα SW480 και SW48 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα επελέγησαν με τη χρήση 1 μg /ml πουρομυκίνη (Sigma) για 2-3 εβδομάδες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με 0,5 μg /ml πουρομυκίνη.

FGFR4 siRNAs και ελέγχους αγοράστηκαν από την Sigma. Για siRNA επιμολύνσεις, 5 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας και διατηρήθηκαν σε DMEM με 10% ορό εμβρύου μόσχου στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 24 ώρες. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 55 pmol siRNA με τη χρήση 2 μΐ αντιδραστηρίου JetPrime Η επιμόλυνση σε 200 μΐ ρυθμιστικού JetPrime. Στη συνέχεια, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα αναλύθηκαν με western blot και ημι-ποσοτική PCR [35].

ανάλυση αλληλουχίας, ημι-ποσοτική και πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Εκθέτης III First Strand Synthesis (Invitrogen). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για να πάρει την αλληλουχία FGFR4 περιγράφηκαν προηγουμένως [36]. Εν συντομία, τέσσερα ζεύγη εκκινητών (Α, Β, C και D) χρησιμοποιήθηκαν για να πάρει το ολόκληρο μόριο με PCR σε θραύσματα περίπου 1000 bp με τη χρήση της πολυμεράσης Advantage 2 (Clontech). Εξωνουκλεάση Ι (USB) και αλκαλική φωσφατάση γαρίδας (USB) προστέθηκαν στα προϊόντα PCR. Είχαν αλληλουχήθηκαν απευθείας σε αλληλουχητή ABI7002 (Applied Biosystems).

cDNA συντέθηκε όπως προηγουμένως και χρησιμοποιείται άμεσα για ημι-ποσοτική PCR ανάλυση των επιπέδων του ΤΟΡ-β1 και GAPDH mRNA σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές. PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές? ανθρώπινο TGF-β1, αίσθηση 5′-ACCGGCCTTTCCTGCTTCTCA-3 ‘, αντινόημα 5′-CGCCCGGGTTATGCTGGTTGT-3′? ανθρώπινο GAPDH, την αίσθηση, 5’-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3 ‘, αντινόημα 5′-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3’. Ειδικοί εκκινητές για FGFR1-3 χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η ειδικότητα της Τα siRNAs και siRNAs που κατευθύνονται έναντι FGFR4 ήταν: FGFR1, αίσθηση 5′-CACAAGCCACGGCGGACT-3 ‘, αντινόημα 5′-TGATGCTCCAGGTGGCAT-3′? FGFR2, αίσθηση 5’-CGTTGCCATTCAAGTGACTG-3 ‘, αντινόημα 5′-GACAAAATCTTCCGCACCATC-3′? και FGFR3, αίσθηση 5’-CAGTTGGTCTTCGGCAGC-3 ‘, 5′-αντίθετης φοράς TGCTGCCAAACTTGTTCT-3’.

Για qRT-PCR, οι αντιδράσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας περιγράφηκε προηγουμένως εκκινητών EMT δείκτη [37] και SYBR-Πράσινο Μάστερ PCR αναμίξτε (Applied Biosystems), εις τριπλούν. PCR και συλλογή δεδομένων εκτελέστηκαν σε IQ5 (BioRad). Όλα τα ποσοτικοποιήσεις ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ανθρώπινο GAPDH. Για την ημι-ποσοτική PCR, το ζεύγος των εκκινητών D χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσει το ποσό της FGFR4 cDNA, χρησιμοποιώντας ενίσχυση GAPDH με ειδικούς εκκινητές καθώς ελέγχου [36].

Ανάλυση Western Blot

Protein εκχυλίσματα από καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα παρασκευάστηκαν και προσδιορίστηκαν ποσοτικά με το κιτ 2D-Quant (GE Healthcare) σύμφωνα με προηγουμένως δημοσιευμένα πρωτόκολλα [7]. Στη συνέχεια, 25 μg του κάθε πρωτεϊνικού εκχυλίσματος έτρεξαν παράλληλα χρησιμοποιώντας 10% SDS-PAGE. Για ανοσοστύπωση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Ηγοοηά-C έξτρα) χρησιμοποιώντας ημίξηρο εξοπλισμού (Bio-Rad). Μετά τον αποκλεισμό, οι μεμβράνες επωάστηκαν με ειδικές μονο- ή πολύκλωνα αντισώματα εναντίον των επιλεγμένων πρωτεϊνών. Οι μεμβράνες επωάστηκαν σε αραιώσεις βελτιστοποιηθεί με πρωτεύοντα αντισώματα ακολουθούμενη από επώαση με είτε HRP-αντι-ποντικού IgG (Pierce) σε 1:5000 αραίωση ή HRP-αντι-κουνελιού IgG (Sigma) σε αραίωση 1:5000. Ειδικές αντιδραστικές πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν με SuperSignal West Pico μέγιστη ευαισθησία Υπόστρωμα (Pierce). Η αφθονία των πρωτεϊνών σε δοκιμασίες κηλίδος Western προσδιορίστηκε με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας v4.6 Ποσότητα Ένας 1D Λογισμικό Ανάλυσης (Bio-Rad Laboratories).

κυτταρικής προσκόλλησης, εισβολή, ανίχνευσης απόπτωσης, πολλαπλασιασμό, και Επούλωση Δοκιμασίες

Για δοκιμασίες κυτταρικής προσκόλλησης, πλάκες 96-φρεατίων επικαλύφθηκαν με Matrigel (0,4 μg /mm

2) (BD Biosciences) σε ρυθμιστικό επικάλυψης (0.1 Μ NaHCO

3 pH: 8,8) επί μία νύκτα στους 4 ° C και, στη συνέχεια, επωάστηκαν με μέσο πρόσφυσης (0.5% αλβουμίνη βόειου ορού σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό) για 2 ώρες στους 37 ° C για να εμποδίσει μη ειδική σύνδεση. Τα κύτταρα στερήθηκαν χωρίς ορό για 5 ώρες και επισημαίνονται με BCECF-ΑΜ (Molecular Probes) κατά τη διάρκεια 30 λεπτών στους 37 ° C, ανεξάρτητο με 2 mM EDTA σε PBS και επαναιωρήθηκαν σε μέσο προσκόλλησης. Στη συνέχεια, 10

5 κύτταρα προστέθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες και επωάστηκαν για 30 λεπτά. Για να απομακρυνθούν τα μη προσκολλημένα κύτταρα, τα τρυβλία πλύθηκαν δύο φορές με DMEM. Δεσμώτης κύτταρα λύθηκαν με τη χρήση 1% SDS σε PBS και ο φθορισμός ποσοτικά κατά Varioskan Flash Πολύτροπες Reader (Thermo Scientific). Για τις δοκιμασίες εισβολή Matrigel, 8 × 10

5 SW480 ή SW48 κύτταρα επανα-εναιωρήθηκαν σε μέσο εισβολή φίλτρα μεγέθους πόρων (ελεύθερο ορού ϋΜΕΜ που περιέχει 0.5% BSA) και φορτώθηκε σε 8 μm επικαλυμμένα με 35-50 μΐ 1 :3 αραίωση Matrigel (BD Biosciences) σε Transwells (Costar). Τα κατώτερα διαμερίσματα των θαλάμων εισβολή πληρώθηκαν με μέσο που περιέχει 10% FBS (Gibco). Μετά από 22 ώρες επώασης στους 37 ° C, μη-εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια του φίλτρου, και τα κύτταρα που μετανάστευσαν διαμέσου του φίλτρου μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (Sigma), χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και τα εισβάλλοντα κύτταρα μετρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο. Για την επούλωση τραυμάτων, SW480 και SW48 κύτταρα σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πυκνότητα 10

6 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων. Μετά την προσκόλληση, ± 1 mm κλίμακα πληγή παρήχθη στην κυτταρική μονοστιβάδα, το μέσο ανάπτυξης αντικαταστάθηκε και μια φωτογραφία τραβήχτηκε (ημέρα 0) σε ένα μικροσκόπιο Olympus CK40 εξοπλισμένο με μια μηχανή Olympus DP12 στο × 40 μεγέθυνση. Εικόνες από το ίδιο πεδίο λήφθηκαν κάθε 24 ώρες.

Για δοκιμασίες ανίχνευσης απόπτωσης, τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 mM H

2O

2 για 16 ώρες χωρίς ορό. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν και επωάστηκαν με FITC σημασμένα-αννεξίνης V (Miltenyi Biotec Inc.) και ιωδιούχο προπίδιο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και αναλύθηκαν με κυτταροφθορισμομετρία (Coulter Epics XL). Για προσδιορισμούς κυτταρικού πολλαπλασιασμού, τα πειράματα διεξήχθησαν ακολουθώντας καθιερωμένες διαδικασίες [38], [39]. Εν συντομία, το μέσο ανάπτυξης αλλάχθηκε 24 ώρες μετά την σπορά (ημέρα 0) και τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω κατά τη διάρκεια των τριών ημερών. Στη συνέχεια, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα βάφτηκαν με 100 μΙ του χρωμογόνου βαφής 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (Sigma) σε τελική συγκέντρωση 1 mg /ml σε DMEM . Τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω για 1 ώρα στους 37 ° C και 5% CO

2. Στη συνέχεια, το μέσο αναρροφήθηκε προσεκτικά και 100 μΐ DMSO (Sigma) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να διαταράξει κύτταρα. Η απορρόφηση διαβάστηκε στα 570 nm. Όλα τα πειράματα έγιναν τρεις φορές εις διπλούν. Για τη μείωση του πολλαπλασιασμού, η βιωσιμότητα των κυττάρων που αντιπροσωπεύεται συγκρίνοντας την επίδραση των αντι-FGFR4 ή αντι-GST (ως μάρτυρας) αντισώματα ή ειδικούς αναστολείς σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (100% του πολλαπλασιασμού) επωάζονται υπό τις ίδιες συνθήκες [39].

Ομοεστιακή Μικροσκοπία

τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 1% παραφορμαλδεΰδη και περατά με PBS-0.5% Triton Χ-100 πριν από την επώαση με το ειδικό αντίσωμα FGFR4 ή ΤΚΙΤΟφαλλοειδίνη για 1 ώρα στους 37 ° C . FGFR4 ή αντισώματα Ε-καδερίνης ανιχνεύθηκαν με AlexaFluor 488-σημασμένο αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (TCS-SP5-AOBS-UV, Leica Microsystems-) μετά πυρήνα αντικηλίδωση με DAPI. Οι εικόνες ελήφθησαν με ένα καταδυτικό αντικειμενικό φακό 63 × χρησιμοποιώντας το Ομοεστιακή λογισμικού Leica. Εμφανίζονται εικόνες συνελήφθησαν στα ίδια τμήματα στα διαφορετικά δείγματα.

In vivo

Ξενομοσχεύματα όγκου

ελβετικά γυμνά ποντίκια (Charles River) χρησιμοποιήθηκαν για μελέτες ξενομοσχεύματος μετάσταση και όγκου . Η Επιτροπή Ηθικής του Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Μαδρίτη, Ισπανία) ενέκρινε τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται για πειραματικούς εργασία με ποντίκια.

Για ξενομοσχευμάτων όγκου, τα ποντίκια έλαβαν υποδόρια ένεση στην δεξιά πλευρά με τη χρήση 1 × 10

7 SW48 σταθερώς διαμολυσμένα κύτταρα ορθοκολικού καρκίνου σε 0,2 mL PBS σε Matrigel αραιωμένο 1:03. Τα μεγέθη των όγκων παρακολουθούνται τουλάχιστον δύο φορές την εβδομάδα και κάθε ζώο υποβλήθηκε σε ευθανασία με χρήση CO

2 θαλάμου σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τα Ανθρώπινα τελικά σημεία για ζωικά χρήση στη βιοϊατρική έρευνα.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις, εκτός όπου υποδεικνύεται, έγιναν με το Microsoft Excel. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως διάμεση ± τυπική απόκλιση. Για την αξιολόγηση της στατιστικής σημαντικότητας σε σύγκριση μεταξύ των ομάδων όλων των

σ

τιμές προήλθαν από μία δίπλευρη στατιστική δοκιμή με διάστημα εμπιστοσύνης 95%.

σ

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

FGFR4 κατάστασης μεταλλάξεων στον καρκίνο του παχέος Γραμμές κυττάρων και ιστών Δείγματα

Ερευνήσαμε μεταλλάξεις FGFR4. σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές και δείγματα καρκίνου που θα μπορούσαν να συμβάλουν προς αντίσωμα αναγνώριση από υπερέκφραση ή ενεργοποίηση. Ολικό RNA απομονώθηκε και cDNA συντίθεται με την ανάδρομη μεταγραφή. cDNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για τον προσδιορισμό της παρουσίας μεταλλάξεων.

Συνολικά, βρήκαμε 3 SNPs στο cDNA FGFR4 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος 4 και 20 δείγματα καρκίνου (Πίνακας 1 και Σχήμα S1). Παρατηρήσαμε τρεις μεταλλάξεις στην εξωκυτταρική και διαμεμβρανική περιοχή της FGFR4 σε δείγματα ασθενών. Εκτός από την καλά χαρακτηρισμένη Arg

388 SNP [9], [15], βρήκαμε V10L εντοπίζεται στο σηματοδοτικό πεπτίδιο και P136L μεταξύ περιοχών ανοσοσφαιρίνης 1 και 2 (Σχήμα S1). Αυτές οι δύο SNPs έχουν προηγουμένως αναφερθεί χωρίς συσχέτιση με παθολογικές εκδηλώσεις [40], [41]. Σε KM12C και KM12SM ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα, παρατηρήσαμε την παρουσία της Arg

388 SNP, ενώ SW480 και SW48 δεν περιέχουν αυτό το SNP. Σε 20 παχέος δείγματα καρκίνου, το 60% των ασθενών παρουσίασε τον πολυμορφισμό Arg

388, ενώ ο επιπολασμός των άλλων δύο μεταλλάξεις ήταν 55% για P136L και 15% για V10L. Τα στοιχεία αυτά είναι σε συμφωνία με παλαιότερα δημοσιευμένα δεδομένα, όπου το 50% των όγκων παρουσιάσει το Arg

388 SNP, 53% ο πολυμορφισμός P136L και το 30% των όγκων περιέχουν V10L [9].

Η

δεν βρήκαμε καμία ενεργοποίηση μετάλλαξης στο FGFR4 ή οποιαδήποτε αλλαγή νουκλεοτιδίων από προηγουμένως αναφερθεί για FGFR4. Στη συνέχεια, τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι η αυξημένη έκφραση του FGFR4 μπορούσε να είναι υπεύθυνη για την επαγωγή αυτοαντισωμάτων σε ασθενείς CRC και υψηλότερες εισβολή και μετάσταση στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

FGFR4 Knockdown μειωμένης πρόσφυσης, τη μετανάστευση και την εισβολή του ορθοκολικού καρκίνου Cells

Για να μελετηθεί ο ρόλος των FGFR4 υπερέκφραση στην ογκογένεση και τη μετάσταση, μελετήθηκε η επίδραση της έκφρασης FGFR4 σε SW48, SW480 και του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές SW620, το οποίο δεν περιείχε το Arg

388 πολυμορφισμό. SW480 και SW48 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με τέσσερα Τα siRNAs που στοχεύουν FGFR4 συν ένα στοιχείο ελέγχου κωδικοποιημένο shRNA. SW620 κυττάρων παροδικά φιμώνονται με siRNA. shRNA # 41 έδειξε την υψηλότερη μείωση στην έκφραση FGFR4 πρωτεΐνης (Εικόνα 1Α) και τα επίπεδα του mRNA (Σχήμα 1Β) στους δύο τύπους κυττάρων. shRNA # 44 ήταν επίσης αποτελεσματική στην μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης, ιδιαίτερα σε κύτταρα SW48. Παρόμοια επίπεδα μείωσης ελήφθησαν με παροδικές αποσιώπηση siRNA στα κύτταρα SW620. Για να μελετηθεί η επίδραση της αποσιώπησης FGFR4 σε άλλα μέλη της οικογένειας, διενεργήσαμε RT-PCR. επίπεδα mRNA για FGFR1, FGFR2 και FGFR3 παρέμεινε αναλλοίωτη μετά FGFR4- αποσιώπηση, επιβεβαιώνοντας την ειδικότητα για FGFR4 (Εικ. 1Β). Ανάλυση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι η έκφραση FGFR4 ήταν σημαντικά μειωμένη σε SW480 και SW48 μετά την επιμόλυνση με shRNA 41 φορείς, αν και παρατηρήθηκε κάποια υπολειμματική χρώση στον πυρήνα των κυττάρων SW48 (Εικόνα S2).

Τέσσερις Τα siRNAs που κατευθύνονται έναντι διαφορετικών εξώνια του FGFR4 και ένα κωδικοποιημένο shRNA χρησιμοποιήθηκαν για να ληφθούν σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου μετά από επιλογή με πουρομυκίνη. Επιπλέον, παροδική siRNA FGFR4-σίγηση διεξήχθη σε SW620 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. A. ανάλυση Western blot της έκφρασης FGFR4 σε σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές SW480 και SW48, και παροδικά επιμολυσμένων SW620 κυττάρων. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β Ημι-ποσοτική ανάλυση PCR του FGFR1, FGFR2, FGFR3 και FGFR4 έκφραση χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές σε τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. C. Ο πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε με προσδιορισμούς ΜΤΤ μετά από 24 ώρες καλλιέργειας. Οπτική πυκνότητα μειώθηκε σημαντικά από FGFR4 νοκ ντάουν (*, p & lt? 0,01? **, P & lt? 0.001). Δ Κωδικοποιημένα και σιγήσει κύτταρα αναπτύχθηκαν μέχρι συρροής και μεταναστευτικά δυνατότητές τους αναλύθηκαν σε μία δοκιμασία για επούλωση της πληγής κάθε 24 ώρες μέχρις ότου συρροή. Αντιπροσωπευτικές εικόνες του προσδιορισμού επούλωση της πληγής φαίνεται. ταχύτητα μετανάστευσης (μm /h) των κωδικοποιημένα και FGFR4-σιγήσει κυττάρων υπολογίστηκε ως η απόσταση που καλύπτεται σε 96 ώρες. Ε κυττάρων πρόσφυση σε Matrigel των FGFR4-σιγήσει ή ομελέτα κύτταρα, μετά την λιμοκτονούν κύτταρα για 5 ώρες σε μέσο μόνο. F. SW480 και SW48 κωδικοποιημένα κύτταρα έδειξαν περίπου 2 φορές υψηλότερη από ό, τι εισβολή shRNA # 41 FGFR4 σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα. Τα δεδομένα για όλα τα πειράματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων.

Οι σ

τιμές όλων των πειραμάτων φαίνονται.

Η

Για την αξιολόγηση των ογκογόνων ιδιοτήτων, προσδιορίσαμε την ανάπτυξη των κυττάρων, την προσκόλληση, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων FGFR4-σιγήσει. Χρησιμοποιώντας αναλύσεις ΜΤΤ, FGFR4-σιγήσει SW480 ή κύτταρα SW48 παρουσίασαν μειωμένο συντελεστή πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με ομελέτα κύτταρα (Σχήμα 1Γ). Για να διερευνηθεί η επίδραση της FGFR4 για τη μετανάστευση, FGFR4-σιγήσει κυτταρικές σειρές SW480 και SW48 σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και αναλύθηκε με δοκιμασίες επούλωσης πληγών. FGFR4-φιμώνονται τα κύτταρα δεν ήταν σε θέση να κλείσει την πληγή ακόμα και μετά από 96 ώρες (Εικόνα 1D). Ο καθυστερημένος μετανάστευση ήταν πιο σημαντικό για SW48 (3 φορές) από SW480 κύτταρα (2 φορές). Αυτά τα αποτελέσματα είναι παρόμοια με αυτά που αναφέρθηκαν παραπάνω με τη χρήση δύο διαφορετικών κυτταρικών γραμμών CRC, HCT116 και ΗΤ29, και διαφορετικές δοκιμασίες [15].

Επιπλέον, χρησιμοποιώντας δοκιμασίες Matrigel, υπήρξε μια σημαντική μείωση της ικανότητας προσκόλλησης και εισβολής του FGFR4-σιγήσει κύτταρα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. κύτταρα SW480 μειωμένη ικανότητα προσκόλλησης τους σε 2,5 φορές, ενώ τα κύτταρα SW48 έδειξε σχεδόν 4 φορές σε σχέση μείωσης στα ανακατωμένα κύτταρα (Σχήμα 1Ε). Εισβολή ήταν περίπου 2-φορές μειώνονται κατά FGFR4 knockdown στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1 F). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ένα σημαντικό ρόλο των FGFR4 στην ογκογένεση και την εισβολή του καρκίνου του παχέος εντέρου, που είναι πιο σχετικές για μεταστατικά κύτταρα SW48.

FGFR4 κατασιγάσει Μειωμένη την έκφραση των επαγωγέων των μεσεγχυματικών Φαινότυπος

Από κυτταρική προσκόλληση, η μετανάστευση και επεμβατική ικανότητα των επιθηλιακών κυττάρων που συνδέεται με την επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), αποφασίσαμε να ερευνήσουμε μεταβολές στην EMT επαγωγείς. Μετά FGFR4 φίμωση, μελετήσαμε τις αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης του mRNA της Snail1 (SNA1), TWIST1, ZEB1, και Ε-καδχερίνη (Cdh1) με πραγματικού χρόνου PCR ή ημι-ποσοτική PCR (TGFβ1). Σε SW480 και SW620, FGFR4 νοκ ντάουν προκάλεσε σημαντική μείωση στην EMT επαγωγείς TGFβ1, SNA1 και TWIST συνοδεύεται από μεγάλη αύξηση του επιθηλιακού δείκτη Cdh1 (Σχήμα 2Α, Β). κύτταρα SW48 παρουσίασαν μεγαλύτερη μείωση στην SNA1, TGFβ1 και TWIST1and μια μικρότερη αύξηση Cdh1. ZEB1 μείωση ήταν πιο σημαντική στην SW480 από ό, τι στις μεταστατικές κυτταρικές σειρές SW620 και SW48. Τα επιθηλιακά και μεσεγχυματικά δείκτες αναλύθηκαν σε επίπεδο πρωτεΐνης με στύπωμα western. Σαλιγκάρι και E-cadherin επιβεβαιωμένα αποτελέσματα mRNA. Βιμεντίνης, ένα μεσεγχυματικό δείκτη, μειώθηκε μετά FGFR4 αποσιώπηση στις τρεις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2C). Μόνο μικρές αλλαγές στην έκφραση ΜΤ1-ΜΜΡ ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα SW480 και SW48 μετά FGFR4-αποσιώπησης. Ωστόσο, παρατηρήσαμε μια μεγάλη αύξηση της έκφρασης ΜΤ1-ΜΜΡ σε κύτταρα SW620, η οποία παραλληλίζει τα επίπεδα έκφρασης Ε-καδερίνης ενδεικτική μιας μείωσης του φαινοτύπου μεσεγχυματικών.

A. cDNA συντίθεται από συνολικό RNA από σταθερά και παροδικά, αθόρυβη και τον έλεγχο των κυττάρων υποβλήθηκε σε qRT-PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για τους επαγωγείς EMT SNAI1, TWIST1, ZEB1 και Cdh1, χρησιμοποιώντας GAPDH για εξομάλυνση. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD από δύο πειράματα. B. Ίδια cDNA υποβλήθηκε σε ημι-ποσοτική ανάλυση RT-PCR για την ενίσχυση TGFβ1, χρησιμοποιώντας ΟΑΡϋΗ ως έλεγχο. C. SW480 και SW48 κωδικοποιημένα και FGFR4-σιγήσει κύτταρα λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση WB χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα εναντίον των πρωτεϊνών που αναφέρονται και δείκτες EMT. Η αφθονία του κάθε πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε με πυκνομετρία. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Δ ανοσοφθορισμού ανάλυση της Ε-καδερίνης σε ομελέτα και φιμώνονται κύτταρα SW480 και SW48. DAPI χρησιμοποιήθηκε για αντιχρωματισμός του πυρήνα σε μπλε. χρώση Ε-καδερίνης σε πράσινο.

Η

Η αύξηση στην έκφραση Ε-καδερίνης, μετά FGFR4 νοκ ντάουν, σε ενώσεις προσφύσεως και τις επαφές κυττάρου-κυττάρου επιβεβαιώθηκε με ανοσοφθορισμό (Σχήμα 2D). Οι διαφορές στην έκφραση Ε-καδερίνης ήταν περισσότερο εμφανής στην κυτταρική μεμβράνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι FGFR4 σίγηση διευκόλυνε την έκφραση των λειτουργικών Ε-καδερίνης στην επιφάνεια του κυττάρου και αναστροφή σε έναν επιθηλιακό φαινότυπο. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές επιβεβαιώνουν ότι FGFR4 αποτελεί σημαντικό τελεστή σε EMT. FGFR4 knock-down προκαλεί μια μείωση σαλιγκάρι και την αύξηση της E-cadherin με την επακόλουθη επίδραση στην πρόσφυση, μετανάστευση και την εισβολή.

Σηματοδοσίας Ανάλυση σε FGFR4-σιγήσει κύτταρα. Ο ρόλος της FGFR4 στο θάλαμο διάσωσης

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της δραστικότητας FGFR4 επί κατάντη σηματοδότησης, αναλύσαμε την επίδραση της αποσιώπησης FGFR4-σχετικά με τις οδούς σηματοδότησης μετά από ενεργοποίηση με FGF19 ± ηπαρίνη σε σύγκριση με μέσο χωρίς ορό. Μετά FGFR4 knockdown, ενεργοποίηση phosphoSRC, phosphoERK1 /2 και phosphoAkt ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε SW480 και SW48 (Σχήμα 3Α). ERK1 ειδικότερα έδειξαν σχεδόν πλήρη αναγωγή. Όσον αφορά ΑΚΤ, το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει μια επίδραση που προκαλείται από FGFR4 μέσω ΑΚΤ στην EMT και την επιβίωση των κυττάρων. Για να δοκιμαστεί η επίδραση του FGFR4 στην επιβίωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε απόπτωση που επάγεται από το υπεροξείδιο του υδρογόνου. FGFR4-σιγήσει κύτταρα έδειξαν σημαντική μείωση της τάξεως του 20-30% στην επιβίωση σε σύγκριση με κωδικοποιημένα κυττάρων μετά κατεργασία υπεροξειδίου του υδρογόνου (Σχήμα 3Β). Χωρίς θεραπεία, ομελέτα και FGFR4-φιμώνονται SW480 και SW48 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα έδειξαν παρόμοια επίπεδα απόπτωσης. Αυτή η επίδραση FGFR4 στην κυτταρική απόπτωση σε απόκριση στο οξειδωτικό στρες μπορεί να παίζει ρόλο σε προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου, διευκολύνοντας την επιβίωση του μεταστατικού κολοορθικού καρκίνου κύτταρα.

A. Κωδικοποιημένα και FGFR4-σιγήσει SW480 και SW48 κύτταρα στερήθηκαν τροφής, και επωάστηκαν με FGF19, ηπαρίνη, ή FGF19 συν ηπαρίνη για 30 λεπτά σε DMEM. Στη συνέχεια, τα κύτταρα λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση WB χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα εναντίον φωσφορυλιωμένων και ολική Akt, ERK1 /2 και SRC. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β κύτταρα επωάστηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS και αντιβιοτικά παρουσία ή απουσία H

2O

2 για 16 ώρες, και υποβλήθηκε σε προσδιορισμούς ανίχνευσης απόπτωσης. UNT., Μη επεξεργασμένα κύτταρα. Τα δεδομένα έδειξαν ότι τα αποτελέσματα για ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία. Γ Εισβολή σε όλη Matrigel των κωδικοποιημένων και σιγήσει κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς να MEK1 /2 (UO126), JNK, και SRC (ΡΡ2) όπως υποδεικνύεται. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Για να μελετήσει μια συνεργιστική δράση για την ενίσχυση της αναστολής FGFR4 σχετικά με τις οδούς σηματοδότησης στο κελί εισβολή, χρησιμοποιήσαμε ειδικούς αναστολείς σε στοχευμένες και κωδικοποιημένα κύτταρα. UO126 (α /2 αναστολέα ΜΕΚ1 ανάντη της ERK1 /2) και ΡΡ2 (αναστολέας SRC) μείωσε την ικανότητα εισβολής των κυττάρων SW480 και SW48. Η μείωση αυτή ήταν πολύ πιο έντονη σε κωδικοποιημένα σε σχέση με σιγήσει κύτταρα (Σχήμα 3C). Ο αναστολέας JNK προκάλεσε μικρή μόνο επίδραση στην ικανότητα εισβολής των κωδικοποιημένων και σιγήσει κύτταρα SW480 και SW48. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι FGFR4-knockdown προκάλεσε μια σημαντική μείωση του SRC και ΜΕΚ1 /2-ERK1 /2 με τη μεσολάβηση εισβολή σε κύτταρα SW480 και SW48, παρόμοια με αυτή που προκαλείται από ειδικούς αναστολείς σε κωδικοποιημένα κύτταρα.

FGFR4 ως θεραπευτικός στόχος στο ορθοκολικό καρκίνο

Ακολουθήσαμε δύο διαφορετικές στρατηγικές για να αποδείξουν τη θεραπευτική αξία της FGFR4 σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Πρώτα, ελέγξαμε δύο αναστολείς κινάσης PD173074 και ΤΚΙ-258. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα FGFR4-σιγήσει για τη μελέτη της εξάρτησης από τις FGFR4 για την ανάπτυξη του όγκου σε ξενομοσχεύματα ποντίκι. Μεταστατικός κυτταρικές γραμμές (SW48 και KM12SM), τα οποία εκφράζουν περισσότερο FGFR4, ήταν πιο ευαίσθητα σε χημικές αναστολείς από ανεπαρκώς ή μη μεταστατικού κυτταρικές γραμμές (KM12C, SW480) (Σχήμα 4Α). αναστολέας ΤΚΙ Multi-κινάσης ήταν πιο αποτελεσματικό από παν-FGFR αναστολέα PD για τη μείωση του παχέος πολλαπλασιασμό καρκίνου σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο (

σ

αξία & lt? 0.001), ιδιαίτερα στις μεταστατικές κυτταρικές γραμμές. Στα 80 ηΜ συγκέντρωση, η αναστολή ήταν υψηλότερη σε μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές (20% σε SW48 και 60% σε KM12SM) από ό, τι σε μη μεταστατικά κύτταρα ή κύτταρα ελέγχου. Σε κύτταρα KM12, αναστολή ΤΚΙ ήταν αποτελεσματική μέχρι 1 ηΜ συγκέντρωση. κυτταρική γραμμή αναφοράς ΗΕΚ293, η οποία εκφράζει χαμηλά επίπεδα FGFR4, αναστάλθηκε σε χαμηλότερο βαθμό. Η αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης συσχετίστηκε με την αναστολή της ίδιας κατάντη ρυθμιστών που επηρεάζονται από οδούς σηματοδότησης FGFR4 (Σχήμα 4Β). Οι πιο σημαντικές επιδράσεις λήφθηκαν με ΤΚΙ-258. Παρατηρήσαμε μια τεράστια μείωση (& gt? 90%) στην ενεργοποίηση SRC, μια σημαντική μείωση (50-80%) σε phosphoERK1 /2 και μια ασθενή μείωση phosphoAkt στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4Β). Η μείωση στην ενεργοποίηση μονοπατιών FGFR4 σηματοδότησης ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε μετά FGFR4-σίγησης, επιβεβαιώνοντας την επίπτωση της FGFR4. Για να επιβεβαιωθεί η εξειδίκευση FGFR4, χρησιμοποιήσαμε εμπορικά αντισώματα αντι-FGFR4 για SW480 και SW48 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Παρατηρήσαμε μια σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού, δοσοεξαρτώμενη, σε σύγκριση με κύτταρα μάρτυρες (

σ

αξία & lt? 0,01) (Σχήμα S3). κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου SW480 και SW48 έδειξαν αναστολή της ανάπτυξης μετά τη θεραπεία αντισώματος, έως και 75% και 60% στα 400 nm και 40% και 55% στα 100 ηΜ, αντίστοιχα.