Αφηρημένο

Ιστορικό

Η παγκόσμια ανισότητα στη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου εξακολουθεί να αποτελεί μείζον πρόβλημα για τη δημόσια υγεία. Έχουμε επικεντρώθηκε στην καρκίνο του προστάτη αφού μικροσκοπική νόσο στους άνδρες είναι κοινό, αλλά η συχνότητα εμφάνισης της κλινικής νόσου ποικίλλει περισσότερο από 100 φορές σε όλο τον κόσμο. Ca

2 + σηματοδότησης είναι ένας κεντρικός ρυθμιστής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αλλά έχει λάβει λίγη προσοχή στην πρόληψη του καρκίνου. Εμείς και άλλοι έχουν αναφέρει μια ισχυρή εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στη συχνότητα εμφάνισης του προστάτη και καρκίνο του πνεύμονα εντός πληθυσμούς που έχουν εκτεθεί σε βόριο (Β) στο πόσιμο νερό και τροφή? και του όγκου και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε καλλιέργεια ζωικών κυττάρων και τα μοντέλα.

Μέθοδοι /Κύρια Ευρήματα

Εμείς εξέτασε τις επιπτώσεις της Β στην Ca

2+ καταστήματα χρησιμοποιώντας τον καρκίνο και μη-καρκίνου στον άνθρωπο κυτταρικές σειρές του προστάτη, Ca

2+ δείκτες Rhod-δύο και Ινδο-μία και συνεστιακή μικροσκοπία. Σε DU-145 κύτταρα, η αναστολή της Ca

2+ απελευθέρωσης ήταν εμφανής μετά από θεραπεία με Ringers που περιέχει αγωνιστές RyR cADPR, 4CmC ή η καφεΐνη και των αντίστοιχων επιπέδων του BA (50 μΜ), (1, 10 μΜ) ή (10, 20 , 50150 μΜ). Λιγότερο επιθετική μορφή καρκίνου LNCaP κύτταρα απαιτούνται 20 μΜ ΒΑ και το κύτταρο μη καρκινικών γραμμή PWR1E απαιτούνται 150 μΜ ΒΑ ότι αναστέλλει σημαντικά την καφεΐνη διεγείρεται Ca

2+ απελευθέρωση. BA (10 μΜ) και ο ανταγωνιστής dantroline RyR (10 μΜ) ήταν ισοδύναμα ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν ER Ca

2+ απώλεια. Κυτταρομετρία ροής και η ανάλυση συνεστιακή μικροσκοπία έδειξε η έκθεση του απεμπλουτισμένου ουρανίου-145 κυττάρων σε 50 μΜ ΒΑ για 1 ώρα μειώθηκε αποθηκεύονται [Ca

2+] κατά 32%.

Συμπέρασμα /Σημασία

show Β προκαλεί μια δοσοεξαρτώμενη μείωση της τάξης του Ca

2 + αποδέσμευση από ευαίσθητα καταστήματα υποδοχέα ρυανοδίνης. Αυτό συνέβη σε συγκεντρώσεις ΒΑ που υπάρχουν στο αίμα των γεωγραφικά ανόμοιων πληθυσμούς. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν υψηλότερα επίπεδα στο αίμα της ΒΑ να μειώσει τον κίνδυνο του καρκίνου του προστάτη με τη μείωση του ενδοκυτταρικού Ca

2 + σήματα και αποθήκευση

Παράθεση:. Henderson K, Στέλλα SL Jr, Kobylewski S, Eckhert CD (2009) Receptor ενεργοποιείται Ca

2+ Τύπου αναστέλλεται από βορικό οξύ στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 4 (6): e6009. doi: 10.1371 /journal.pone.0006009

Επιμέλεια: Dong-Yan Jin, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 17 Νοεμ, 2008? Αποδεκτές: 20 Μαΐου, 2009? Δημοσιεύθηκε: 23, Ιουνίου, 2009

Copyright: © 2009 Henderson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο η χορήγηση χρηματοδοτήθηκε από την προσωπική ταμεία (CE) και εν μέρει από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια τοξικών ουσιών Έρευνας και Πρόγραμμα Κατάρτισης (TSR & amp? TP) για μερική στήριξη των KH και SK. CE είναι η διδακτορική μέντορας για ΚΗ και SK. TSR & amp? ΤΡ χρηματοδότηση ήταν για υποτροφίες των φοιτητών περιορίζεται στην υποστήριξη των φοιτητών και δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει. υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Ένας από τους τρόπους κύτταρα ανταποκρίνονται σε ερεθίσματα του περιβάλλοντος είναι ανοίγοντας διαύλους μεταξύ των χώρων του αποθηκευμένου ασβεστίου, όπως το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER), Golgi, και τα μιτοχόνδρια ( mt), οι οποίες περιέχουν υψηλά ελεύθερο Ca

2+ συγκεντρώσεις (500 μΜ), και το κυτταρόπλασμα, το οποίο περιέχει χαμηλό ελεύθερο Ca

2+ συγκεντρώσεις (100 ηΜ) [1]. Μια ταχεία αύξηση στην κυτταροπλασματική Ca

2+ μπορεί να επιτευχθεί με χωρητική είσοδο ασβεστίου (CCE) που αφορούν την απελευθέρωση των αποθηκευμένων Ca

2+ από τον υποδοχέα ρυανοδίνης (RyR) και της ΠΕ

3 υποδοχέα (IP

3R) στο κυτταρόπλασμα που ακολουθείται από την εισροή εξωκυττάριου Ca

2+. CCE ενεργοποιεί Ca

2+ πρωτεΐνες που ρυθμίζουν πολλές κυτταρικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων της μεταγραφής γονιδίων, κυτταρικό πολλαπλασιασμό, έκκριση κυστιδίων, και την απόπτωση δέσμευσης [2], [3]. Κυτταροπλασματική Ca

Οι 2+ συγκεντρώσεις επανήλθε στο φυσιολογικό, όπως Ca

2+ αφαιρείται από τους μεταφορείς, όπως το Na

2 + – Ca

2 + εναλλάκτη στη μεμβράνη του πλάσματος, το σαρκοπλασματικό ενδοπλασματικό ΑΤΡ ( SERCA) στην μεμβράνη ER, Ca

2+ uniporter στα μιτοχόνδρια, και δια συνδέσεως με υψηλή συγγένεια πρωτεΐνες δέσμευσης [4], [5]. Στην έκθεση αυτή παρουσιάζονται στοιχεία που αποδεικνύουν ότι τα φυσιολογικά επίπεδα του βορικού οξέος (BA) αναστέλλουν αποθηκεύονται Ca

2 + αποδέσμευση από ευαίσθητες περιοχές RyR αγωνιστή.

Το βόριο (Β) είναι το 9

ου πιο άφθονο στοιχείο στο θαλασσινό νερό (425 μΜ Β) και μέχρι πρόσφατα απέρριψε ως βιολογικά άσχετο [6]. Β δεσμεύεται στο οξυγόνο στη φύση και σε φυσιολογικά υγρά 98,4% είναι παρόν με τη μορφή Β (ΟΗ)

3 βορικό οξύ και 1,6% ως Β (ΟΗ)

4

– βορικό. Βιολογία έχει χρησιμοποιήσει αυτό το στοιχείο στη δομή πολλών μορίων, συμπεριλαμβανομένων: των αντιβιοτικών σε μύκητες [7]? αίσθησης απαρτίας auto επαγωγέα 2 σε βακτήρια [8]? και ο ραμνογαλακτουρονάνη-ΙΙ διμερές σε φυτά [9]. Στα φυτά, Β απαιτείται για την επιμήκυνση των κυττάρων, την ανθοφορία και τον σχηματισμό των σπόρων και αποτελεί αναπόσπαστο συστατικό των καλλιεργειών τροφίμων. Μη φορτισμένα ΒΑ διασχίζει τη μεμβράνη των επιδερμικών κυττάρων ρίζας πλάσματος στο κυτοσόλιο με παθητική διάχυση και αυτό διευκολύνεται από NIP5? 1 μεταφορείς [10]. BA μερικώς μετατρέπεται σε βορικό κυτοσόλιο (pKa 9.6) και μεταφέρεται στο ξύλημα χρησιμοποιώντας το μεταφορέα εξαγωγής BOR1 [11], [12]. Ένα ανθρώπινο ομόλογο της BOR1 ονομάζεται NaBC1has έχουν αναφερθεί ότι υπάρχουν σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών και για να ενισχύσει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε χαμηλές συγκεντρώσεις ΒΑ [13], αλλά αυτό δεν έχει ακόμη επιβεβαιωθεί από άλλο εργαστήριο. Η επίδραση της ΒΑ στην ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε πέστροφα, zebrafish και το ΗΕΚ θηλαστικών και κύτταρα HeLa ακολουθεί μια ανεστραμμένου U-σχήμα με υψηλότερες συγκεντρώσεις που προκαλούν αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης [13] – [15]. Συγκεντρώσεις 60 έως 100 μΜ ΒΑ αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, ενώ οι υψηλές συγκεντρώσεις των 500 έως 1000 BA μΜ απαιτούνται για να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη μη καρκινικών κατά το ίδιο χρονικό διάστημα [16].

Ανθρώπινο επίπεδα στο αίμα της ΒΑ αντικατοπτρίζουν την τοπική γεωλογία, την ποιότητα του νερού, και τα φυτά στη διατροφή με παγκόσμια εμβέλεια 2 με 120 μΜ (21-1232 ng B /g υγρού αίματος) σε ελεύθερη διαβίωση υγιών ανδρών και γυναικών [17 ], [18]. Αρκετές μελέτες σε ανθρώπους έχουν παρατηρήσει μια μείωση του κινδύνου του προστάτη και του καρκίνου του πνεύμονα, του τραχήλου της μήτρας και ανώμαλη κυτταροπαθολογία σε αναλογία με την ποσότητα του Β προσλαμβάνεται από την τροφή και το νερό [19] – [22]. Μία μελέτη δεν τήρησε μια προστατευτική επίδραση, αλλά διέφερε από άλλες μελέτες χρησιμοποιώντας μια διαφορετική βάση δεδομένων Β τροφίμων και εκτιμώμενη περιεκτικότητα σε Β ορισμένων τροφίμων [23], [24].

Η βιολογική αληθοφάνεια για την χημειοπροφυλακτική επίδραση της BA υποστηρίζεται από αρκετές γραμμές της έρευνας. Σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς, η συμπλήρωση BA μείωσε την ανάπτυξη των μεταμοσχευμένων όγκων ανθρώπινου προστάτη, μείωση των συγκεντρώσεων IGF-1 ιστό, και μείωσε συγκεκριμένα επίπεδα αντιγόνου ορού του προστάτη [25]. Σε κυτταρική καλλιέργεια, η ΒΑ μειωμένη τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών καρκίνου του προστάτη σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο και ανέστειλαν μετανάστευση κυττάρου και εισβολή [16], [26], [27]. Ανακαλύψαμε τη σχέση μεταξύ της ικανότητας της ΒΑ να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη και σηματοδότηση ασβεστίου μετά μελέτες φασματομετρία μάζας έδειξε την συγγένεια της ΒΑ για NAD

+ μειώθηκε με φωσφορυλίωση και επομένως δυνητικά υπόκεινται σε βιολογική ρύθμιση [28], [29]. ΒΑ αποδείχθηκε επίσης να είναι ένας μη-ανταγωνιστικός αναστολέας της ADP-ριβοζυλ κυκλάσης [30]. Αυτό μας οδήγησε να μελετήσει τις επιπτώσεις της στην NAD

+ /cADPR Ca

2 + οδού απελευθέρωση. Δείξαμε ότι φαρμακολογικά επίπεδα της ΒΑ (250 και 1000 μΜ), αλλά όχι μεθυλοβορικό οξύ, μειωμένη NAD

+ διεγείρεται απελευθέρωση Ca

2+ χωρίς να επηρεάζει την απελευθέρωση ασβεστίου όταν εφαρμόζεται μόνο του [27]. Δεν ήταν σαφές από τις μελέτες αυτές, αν η ΒΑ ήταν αναστέλλοντας Ca

2+ απελευθέρωση παρεμβαίνοντας με NAD

+ μετατροπή σε cADPR, εμποδίζοντας την απελευθέρωση του Ca

2+ καταστήματα, ή παρεμβαίνοντας με CCE. Διατύπωσε επίσης την πιθανότητα ότι οι συγκεντρώσεις ΒΑ στα φυσιολογικά όρια στο αίμα μπορεί να είναι σε θέση να αναστείλουν Ca

2 + αποδέσμευση από τον υποδοχέα ρυανοδίνης (RyR) ευαίσθητο καταστήματα. Εδώ έχουμε αποδείξει ότι φυσιολογικά επίπεδα της ΒΑ αναστέλλουν Ca

2 + αποδέσμευση από RyR ανταποκρίνεται καταστήματα σε ανθρώπινα κύτταρα επιθηλιακά προστάτη και κάτω αυλού Ca

2+ επίπεδα.

Μέθοδοι

τηλέφωνα καλλιέργειες

Πειράματα χρησιμοποιήθηκαν προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές DU-145 και LNCaP και η μη-καρκινική PWR1E κυτταρική γραμμή. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν και διατηρήθηκαν σε τρυβλία κυτταρικής καλλιέργειας στους 37 ° C σε 95% αέρα και 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα. Για συνεστιακή πειράματα, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες για 24 ώρες πριν από την εκτέλεση δοκιμασιών και μελετήθηκαν σε συρροή μικρότερη από 80%. DU-145 και PWR1E κύτταρα αποκτήθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και LNCaP ήταν ένα δώρο από τον Δρ Allen Πάντακ του Τμήματος Ουρολογίας, Geffen της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια, στο Λος Άντζελες. RPMI μέσα κυτταρικής καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), πενικιλλίνη (100 U /ml), στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) και L-γλουταμίνη (200 mM). PWR1E μη καρκινικά κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσα κερατινοκυττάρων που περιείχε στρεπτομυκίνη (100 μg /ml), L-γλουταμίνη (200 mM), 2,5 μg ανθρώπινου ανασυνδυασμένου EGF, και 25 mg εκχυλίσματος υποφύσεως βοοειδών (Gibco, Carlsbad, CA). Βόριο απεμπλουτισμένο media παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας βόριο ειδική ρητίνη ιοντικής ανταλλαγής, Amberlite IRE-743 (Sigma) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16] και να τροποποιηθούν ως ακολούθως. Εννέα γραμμάρια αυτόκλειστο IRA-743 ρητίνη ανταλλαγής ιόντων προστέθηκαν σε 500 ml μέσου και αναμιγνύεται σε ένα περιστροφέα τροχιά σε 75 έως 100 rpm για 15 έως 20 ώρες στους 9 ° C.

Μέτρηση Ca

2 + Μεταβατικά

Αποθήκευση Ca

2+ αλλαγές παρακολουθήθηκαν χρησιμοποιώντας την ευαίσθητη ασβέστιο χρωστική Rhod-2, ΑΜ εστέρα (Biotium, Hayward, CA), το οποίο συσσωρεύεται στα οργανίδια. Rhod-2, ΑΜ εστέρας έχει Kd 1 mM και έχει αποδειχθεί ότι δημιουργούν στεγανά, ιδιαίτερα στα μιτοχόνδρια, αλλά όπως έχουμε δείξει, με άλλα οργανίδια, καθώς και (Εικ. 1). Χρησιμοποιήσαμε επίσης ER Tracker πράσινο και Mito πράσινο Tracker (Molecular Probes, Carlsbad, CA), σε συνδυασμό με Rhod-2, Am εστέρα. Είναι ιδιαίτερα ειδικές φθορίζουσες ετικέτες για το ενδοπλασματικό δίκτυο και τα μιτοχόνδρια, αντίστοιχα. Αναλύσαμε Ca

2+ αλλαγές ως απάντηση στην ΒΑ και διάφορους αγωνιστές επιλέγοντας περιοχές ενδιαφέροντος σε κύτταρα που επικαλύπτονται το κόκκινο Rhod-2 Ca

2+ ετικέτα με το πράσινο tracker ER (Εικ. 1Α) [31] – [33]. Rhod-2, ΑΜ εστέρα παρασκευάστηκε ως ένα διάλυμα αποθέματος 1 mM σε DMSO και αραιώνεται σε είτε πλήρες μέσο RPMI ή πλήρες μέσο κερατινοκυττάρου έως 3 μm. Τα κύτταρα επωάστηκαν με Rhod-2 ΑΜ εστέρα (5 μΜ) και ER ή Mt Tracker (0,5 μΜ, 250 ηΜ αντίστοιχα) σε RPMI ή κερατινοκυττάρων πολυμέσων για 30 λεπτά στους 37 ° C. Ca

απελευθέρωση 2+ τονώθηκε με τη χρήση αγωνιστών σε συνδυασμό με διαφορετικές συγκεντρώσεις της ΒΑ σε διάλυμα Ringer. Εικόνες συλλέχθηκαν με ένα Zeiss 510 LSM 5 Pascal τοποθετηθεί σε όρθια μικροσκόπιο (Zeiss Αχίορίαπ 2) εφοδιασμένο με ένα αντικειμενικό εμβάπτιση σε νερό Axoplan Χ63 (NA 0.95). Ένα λέιζερ HeNe χρησιμοποιήθηκε για να διεγείρει Rhod-2 σε 543 nm. 488 nm από μια δίοδο λέιζερ χρησιμοποιείται για να διεγείρει ER ή Mt Tracker. Η εκπομπή συλλέχθηκε σε ένα σωλήνα φωτοπολλαπλασιαστή μέσω ενός φίλτρου LP 560 nm για Rhod-2 και ένα φίλτρο 505 LP για ER και ιχνηλάτες Mito. Πρόσθετες μεγέθυνσης, χρονοσειρές, και αφαίρεση φόντο ελέγχθηκαν με τη χρήση του λογισμικού απόκτηση Zeiss LSM. Όλες οι εικόνες αποκτήθηκαν ως 12 bit.

Α. Δύο DU-145 κύτταρα επισημαίνονται με κόκκινη φθορίζουσα ενδοκυτταρικό ασβέστιο φθοροφόρο, Rhod-2, και πράσινη φθορίζουσα ετικέτα ενδοπλασματικό δίκτυο, ER ιχνηλάτης. Κίτρινο υποδεικνύει επικάλυψη του Ca

2 + και ER και ο κύκλος είναι η περιοχή ενδιαφέροντος (ROI) αναλύονται σε αυτά τα πειράματα. Τα βέλη υποδεικνύουν οργανίδια: nucl (πυρηνίσκο), Nuc (πυρήνας), ER (ενδοπλασματικό δίκτυο) Β Δύο DU-145 κύτταρα επισημαίνονται με κόκκινη φθορίζουσα ενδοκυτταρικού Ca

2+ φθοροφόρο, Rhod-2, και πράσινη φθορίζουσα μιτοχονδριακή ετικέτα, Mito ιχνηλάτης. Κίτρινο υποδεικνύει επικάλυψη του ασβεστίου και τα μιτοχόνδρια. Τα βέλη δείχνουν οργανίδια:. Nucl (πυρηνίσκος), Nuc (πυρήνα), mt (μιτοχόνδρια)

Η

2+ απελευθέρωση χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία

εφαρμόστηκαν Ανάλυση του Ca θεραπείες BA σε Ca

2+ λύση ελεύθερο του Ringer παρασκευάζονται με τη χρήση υπερ-καθαρό νερό για να αφαιρέσετε Β [16], [34]. Ca

απελευθέρωση 2+ από τον RyR ενεργοποιήθηκε με την προσθήκη είτε 25 μΜ cADPR έως 10 μΜ διγιτονίνης διαπερατών κυττάρων, ή 20 mM καφεΐνη ή 100 μΜ 4-χλωρο-m-κρεσόλη (4cmc) σε ακέραια κύτταρα [35] , [36]. Αναστολή της Ca

απελευθέρωσης 2+ επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας 10 μΜ δαντρολένιο ποικίλες συγκεντρώσεις ΒΑ με την παρουσία ενός αγωνιστή [37]. SERCA ανεστάλη χρησιμοποιώντας 10 μΜ κυκλοπιαζονικό οξύ (CPA) [2]. Όλες οι αιτήσεις του φαρμάκου ήταν για ένα δεύτερο διάρκεια 30 σε διάλυμα χωρίς ασβέστιο του Ringer (143 mM NaCl, 5 mM ΚΟΙ, 1 mM MgCl

2, 10 mM γλυκόζη, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA-2Η

2O, 1 mM EGTA), για να δείτε Ca

2+ απελευθέρωση από τα καταστήματα χωρίς τη συμβολή εξωτερικών Ca

2+. εφαρμογή του φαρμάκου ακολουθήθηκε από μία πλύση τριών λεπτών μόνο σε διάλυμα Ringer που περιέχει ασβέστιο (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM ΟαΟ

2, 1 mM MgCl

2, 10 mM γλυκόζη, 10 mM HEPES). Τα διαλύματα που παρέχεται στο θάλαμο διάχυσης σε ρυθμό 1 ml /min με τη χρήση ενός μόνο-pass, το σύστημα διάχυσης βαρύτητα τροφοδοσίας. Ομοεστιακή εικόνες ελήφθησαν ανά δευτερόλεπτο και ξεκίνησε δύο λεπτά πριν από την πρώτη εφαρμογή της θεραπείας προκειμένου να διαπιστωθεί μια βασική γραμμή της έντασης φθορισμού. Η αλλαγή στην ένταση φθορισμού (F) που προκαλείται από την εφαρμογή φαρμάκου σε σύγκριση με ένα μέσο όρο βασική μέτρηση η οποία αποτελείτο από τρεις μετρήσεις πριν από την εφαρμογή του φαρμάκου (FO). Όλες οι μετρήσεις κανονικοποιήθηκαν προς τη βασική γραμμή με αυτόν τον τρόπο τη χρήση του λόγου f-FO /fo. Τυπικά 6-10 κύτταρα αναλύθηκαν σε ένα οπτικό πεδίο και όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε ένα ελάχιστο τριών ανεξάρτητων παρασκευασμάτων. Η σειρά εφαρμογής του φαρμάκου βασίστηκε σε ένα αρχικό πείραμα που περιλαμβάνει διαδοχικές εφαρμογές αγωνιστή μόνο. Εάν η 2

ου εφαρμογή του αγωνιστή προκάλεσε χαμηλότερη Ca

2+ απελευθέρωση από το 1

ου, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αγωνιστή συν BA πρώτα. Αυτό αποφεύγεται το ενδεχόμενο που μετριέται αναστολή Ca

2+ απελευθέρωση οφείλεται στην ΒΑ ήταν εν μέρει οφείλεται σε πυρίμαχο κύτταρα γίνονται τόσο από προηγούμενη θεραπεία με αγωνιστή.

Ανάλυση των αποθηκευμένων επίπεδα ασβεστίου

DU-145 καρκινικών κυττάρων του προστάτη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΒΑ για 1 έως 72 ώρες σε μέσα απογυμνώνεται από βόριο χρησιμοποιώντας Amberlite IRA-743 ρητίνη ανταλλαγής ιόντων (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Ακριβώς πριν από κύτταρα ανάλυσης απομακρύνθηκαν από την πλάκα χρησιμοποιώντας 1% πέψη με θρυψίνη, φυγοκεντρήθηκαν, και σημάνθηκαν για 45 λεπτά σε στάνταρ μέσο με 3 μΜ Rhod-2 ΑΜ εστέρα για αποθήκευση Ca

2+ ανάλυση. Για την παρακολούθηση κυτοπλασμική Ca

2+ επίπεδα, τα κύτταρα σημάνθηκαν με 5 μΜ Indo-1 ΑΜ (Invitrogen, Carlsbad, CA) για 45 λεπτά. Τα επισημασμένα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 1 mL φυσιολογικά μέσα. Ο φθορισμός αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα αναλυτικό ροής Beckton Dickinson BD-LSR Ι κυτταρόμετρο. Rhod-2 διέγερση επιτεύχθηκε με ένα λέιζερ αργόν 514 nm και αναλύονται στο (581 nm) FL-2 καναλιών. Ινδο-1 διεγέρθηκε με ένα λέιζερ υπεριώδους (351 nm) και αναλύθηκαν σε 400 nm (FL5) και 510 nm (FL4) φίλτρα διέλευσης ζώνης. Τα αποτελέσματα για Indo-1 κύτταρα σημασμένα δίνονται ως αναλογίες φθορισμού (FL5 /FL4). Προς τα εμπρός και την πλευρά διασποράς χρησιμοποιήθηκαν για να περιφράσσει το κυτταρικό θραύσματα [38]. Πρώτες κυτταρομετρία ροής δεδομένων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo (Treestar Software, San Carlos, CA, USA). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως Ca

επίπεδα% 2+ σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Αποθήκευση Ca

2+ επίπεδα αναλύθηκαν επίσης σε BA κατεργασμένα και μη-κατεργασμένα κύτταρα με σύγκριση Ca

2+ αποθήκευση κένωση σε απόκριση προς 100 μΜ θαψιγαργίνη χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία [39].

Στατιστική ανάλυση του

δεδομένων

τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας του Student ζεύγη ή μη ζευγαρωμένο t-test ή μονόδρομη ANOVA για πολλαπλές συγκρίσεις με πολλαπλή σύγκριση post-hoc τεστ Dunnett χρησιμοποιώντας Graphpad Prism 4.0. Μία τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. Η εξίσωση για μη γραμμικές μία θέση σύνδεσης (υπερβολής) Υ = Bmax * Χ /(Κ

d + Χ) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό Κ

d και αξίες Bmax χρησιμοποιώντας λογισμικό Graphpad.

Χημικά και προμήθειες

Β αφαιρέθηκε από το νερό και τα μέσα ενημέρωσης, χρησιμοποιώντας μεθόδους που περιγράφονται προηγουμένως [13]. Η καφεΐνη, 4-ΟΜΟ, ΑΤΡ, CPA, δαντρολένη, θαψιγαργίνη, cADPR, διγιτονίνη και βορικό οξύ ελήφθησαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ) αραιωμένη σε ασβέστιο ελεύθερο διάλυμα Ringer για να εξασφαλιστεί ότι αν DMSO ήταν παρούσα επίπεδα δεν ήταν μεγαλύτερη από 0,1 %. Όλα τα διαλύματα παρασκευάστηκαν φρέσκα πριν από την αιμάτωση. Superfusion με 0,1% DMSO σε διάλυμα Ringer ελεύθερο ασβέστιο δεν επηρέασε ER Ca

2+ επίπεδα ή απαντήσεις απεικόνισης.

Αποτελέσματα

Ο στόχος της μελέτης ήταν να καθοριστεί εάν φυσιολογικές συγκεντρώσεις BA αναστέλλουν την απελευθέρωση του Ca

2+ από ευαίσθητα RyR καταστήματα σε ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη και μη καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων. DU-145 κύτταρα φορτώθηκαν με Rhod-2 και ER ιχνηλάτης ή Mito ιχνηλάτης για να προσδιοριστεί εάν Rhod-2 σε διαμερίσματα σε ένα ή δύο διαμερίσματα. Δεν ήταν δυνατόν να οριοθετηθούν Ca

2+ σηματοδότησης από το ER έναντι μιτοχόνδρια ζώντων κυττάρων χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. Rhod-2 επισημασμένου Ca

2+ στα μιτοχόνδρια, ER, πυρηνίσκο, και σε άλλες περιοχές του κυττάρου (Εικ. 1Α-Β). Στα πειράματά μας, ένας συνδυασμός ER Tracker και Rhod-2 χρησιμοποιήθηκαν για να καθορίσουν τις περιοχές ενδιαφέροντός μας στις ιστοσελίδες των αποθηκευμένων Ca

2 + (Εικ. 1Α). Αυτή η περιοχή περιλαμβάνεται Ca

2+ καταστήματα που βρίσκονται στο ER και τα μιτοχόνδρια (Σχ. 1 Α-Β). Εφαρμογή της ΒΑ 0,1 έως 1.000 μΜ μόνο του δεν αποδεικνύει άμεση μετρήσιμη επίδραση στην αποθήκευση Ca

2 + χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

βορικό οξύ αναστέλλει Ca

απελευθέρωση 2+ στο απάντηση ρυανοδίνης αγωνιστές των υποδοχέων

για να προσδιοριστεί αν η ΒΑ αναστέλλεται Ca

2 + αποδέσμευση από την RyR, θα αντιμετωπίζονται DU145 κύτταρα με τρεις διαφορετικούς αγωνιστές RyR σε συνδυασμό με την ΒΑ. ανάλυση ανταγωνιστικής δέσμευσης συνδέτη έδειξε BA ήταν μια ενιαία θέση αναστρέψιμος ανταγωνιστικός αναστολέας της cADPR, ενός ενδογενούς αγωνιστή του RyR (Σχ. 2Α-C). Η σταθερά διαχωρισμού ισορροπίας, (Κ

D) για cADPR ήταν 15.10, αλλά με την παρουσία της ΒΑ αυξήθηκε σε 49.39. Η αναστολή από την BA αντιστράφηκε με την αύξηση της συγκέντρωσης των cADPR και την παρουσία της ΒΑ δεν αλλάξετε το μέγιστο αριθμό των θέσεων δέσμευσης (Bmax) (Πίνακας 1).

Α. 50 μΜ ΒΑ ανέστειλε 25 μΜ cADPR που προκαλείται από Ca

2+ αποδέσμευσης (n = 6? *** P & lt? 0.001). Β Ανταγωνιστικές συνδέτη μελέτης δέσμευσης έδειξε BA ήταν υπερνικηθούν ανταγωνιστής της cADPR σε ένα ενιαίο μοντέλο τοποθεσία. Συγκεντρώσεις ΒΑ διεξήχθησαν σε 50 μΜ. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις cADPR BA μετατόπισε την απόκριση Ca

2+ απελευθέρωσης προς τα δεξιά, αλλά αυτή αντιστράφηκε σε υψηλότερες συγκεντρώσεις cADPR και η μέγιστη απόκριση (Bmax) δεν άλλαξε. Κάθε σημείο δεδομένων είναι ο μέσος όρος των n = 6. R

2 είναι 0,9155 και 0,8606 για cADPR χωρίς και με BA, αντίστοιχα.

Η

Στη συνέχεια αναλύεται η επίδραση της ΒΑ σε άλλα αγωνιστές RyR σε ακέραια κύτταρα. Χρησιμοποιήσαμε πρώτα καφεΐνη [20 mM] ένας αγωνιστής που ενισχύει την ευαισθησία RyR προς το φυσικό συνδετήρα του, Ca

2+. Σε απάντηση σε δύο διαδοχικές εφαρμογές της καφεΐνης, ο δεύτερος απελευθέρωση ήταν ελαφρώς μεγαλύτερη από την πρώτη (Εικ. 3Α). Αυτή η αλληλουχία επαναλήφθηκε στη συνέχεια με ΒΑ προστίθενται σε συνδυασμό με καφεΐνη στο δεύτερο αίτηση. Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων δείχνουν ότι η ΒΑ μειωμένη Ca

απελευθέρωσης 2+ σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο από 10 έως 150 μΜ ΒΑ (Σχ. 3Β-F). Στη συνέχεια εξέτασε την επίδραση της ΒΑ στις 4CmC, άμεσο αγωνιστή του RyR. Διαδοχική εφαρμογές των 50 μΜ 4CmC οδήγησε σε ισοδύναμο Ca

2+ απελευθέρωσης (Σχ. 4Α). Όπως παρατηρήθηκε με την καφεΐνη, ΒΑ μειώθηκε 4CmC διεγείρονται Ca

απελευθέρωση 2+ με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 4Β-Ε). Ωστόσο, η αναστολή ξεκίνησε στις 1 μΜ ΒΑ και έφθασε ένα μέγιστο στα 10 μΜ ΒΑ.

Α. Ca

2+ αποδέσμευσης σε DU-145 κύτταρα σε απόκριση προς διαδοχικές εφαρμογές των 20 mM καφείνης (n = 6, * ρ = 0,0168). Β 10 μΜ ΒΑ ανέστειλε σημαντικά Ca

2+ αποδέσμευσης (n = 6, ** p & lt? 0,01). Γ 20 μΜ Μ BA ανέστειλε σημαντικά Ca

2+ αποδέσμευσης (n = 6, * p = 0,0163). D. 50 μΜ ΒΑ ανέστειλε σημαντικά Ca

2+ αποδέσμευσης (n = 6, ** ρ = 0.0042). Ε 150 μΜ ΒΑ ανέστειλε σημαντικά Ca

2+ απελευθέρωσης, η = 6, *** p = 0,0001. ΣΤ συνδυασμένη ανάλυση των δεδομένων που δείχνουν ανασταλτική επίδραση δόσης-απόκρισης της BA σχετικά με την καφεΐνη διεγερμένη Ca

2+ απελευθέρωση, (n = 6 ανά συγκέντρωση, ** p & lt? 0,01). Τα Σχήματα 2-9, κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση απόκριση από 6 πειράματα (η = 6) επαναλήφθηκε 3 φορές. Οι σαρώσεις γραμμή σχετικά με το δικαίωμα του κάθε ραβδόγραμμα είναι αντιπροσωπευτικές απαντήσεις από ένα μόνο πείραμα.

Η

Α. Διαδοχική εφαρμογές του 4-CMC δεν μετέβαλε την απόκριση απελευθέρωση ασβεστίου (n = 6, NS). Β 0.1 μΜ ΒΑ δεν αναστέλλει την Ca

2+ απελευθέρωση. Γ 1.0 μΜ ΒΑ αναστέλλεται Ca

2+ αποδέσμευσης (n = 6, * ρ & lt? 0,05). Δ 10 μΜ ΒΑ αναστέλλεται Ca

2+ αποδέσμευσης (n = 6, *** p = 0,0005). E. ανάλυση συνδυασμένα δεδομένα δείχνουν μια δοσοεξαρτώμενη Ca

2+ απάντηση αποδέσμευσης (n = 6 ανά συγκέντρωση (** p & lt?. 0.01)

Η

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ανασταλτική επίδραση της ΒΑ στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στο IC

50 για DU-145 κύτταρα ήταν περίπου 10% λιγότερο αποτελεσματική για την λιγότερο επιθετική LNCaP καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή. Επιπλέον, η ΒΑ δεν ήταν σε θέση να επιτύχει μια μείωση 50% του πολλαπλασιασμού σε μη-όγκου PWR1E προστάτη επιθηλιακών κυττάρων σε πειράματα που χρησιμοποιούν έως και 4 φορές το IC

50 για DU145 [16]. Εξετάσαμε αυτές τις κυτταρικές σειρές για να προσδιοριστεί αν η ΒΑ ήταν επίσης λιγότερο αποτελεσματική στην αναστολή καφεΐνη ευαίσθητο Ca

2+ απελευθέρωση. η αναστολή της Ca

απελευθέρωσης 2+ σε απόκριση σε καφεΐνη σε καρκινικά κύτταρα LNCaP του προστάτη συνέβη πάνω από 20 μΜ-150 μΜ ΒΑ (Σχ. 5Α-Δ). Έτσι, τα κύτταρα LNCaP ήταν λιγότερο ευαίσθητα σε σύγκριση με BA DU-145. κύτταρα LNCaP ήταν δεν ανταποκρίνεται σε θεραπεία 4CmC (δεν φαίνεται). Το PWR1E μη-όγκου, υπερπλαστικού κυτταρική σειρά προστάτη απαιτούνται 150 μΜ ΒΑ να αναστέλλουν την καφεΐνη διεγείρεται Ca

2+ απελευθέρωσης (Σχ. 6Α-D). κύτταρα PWR1E ήσαν μη αποκρινόμενα σε αγωγή 4CmC (δεν φαίνεται).

A. 20 μΜ ΒΑ αναστολή της απελευθέρωσης ασβεστίου (n = 6, * ρ = 0,0226). Β 50 μΜ ΒΑ αναστολή Ca

2+ αποδέσμευσης (n = 6, ** ρ = 0.0019). C. 150 μΜ ΒΑ αναστολή της καφεΐνης που προκαλείται από Ca

2+ αποδέσμευσης (n = 6, *** ρ & lt? 0,0001). δεδομένων D. Συνδυασμένη δείχνει εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή της καφεΐνης διεγείρεται απελευθέρωση (n = 6, ** p & lt? 0,01)

Η

Α.. Διαδοχική εφαρμογές καφεΐνη στο κελί PWR1E προστάτη. (N = 6, NS). Β ΒΑ 50 μΜ και η καφεΐνη που προκαλείται από Ca

2+ απελευθέρωση δεν δείχνει αναστολή (n = 6, NS). C. 150 μΜ ΒΑ ανέστειλε την καφεΐνη που επάγεται Ca

2+ αποδέσμευσης (n = 6, ** ρ = 0.0029). Δ συνδυασμένα δεδομένα δείχνουν καμία απάντηση δόση και η αναστολή μόνο στα 150 μΜ (n = 6, * ρ & lt? 0,05).

Η

βορικό οξύ αναστέλλει κυκλοπιαζονικό οξέος που προκαλείται από Ca

απελευθέρωση 2+ από το ER

Η απελευθέρωση του ER Ca

2+ καταστήματα σε ορισμένες μη διεγέρσιμα κύτταρα μπορούν να διεγερθούν με τη χρήση κυκλοπιαζονικό οξύ (CPA), η οποία αναστέλλει την SERCA με τρόπο παρόμοιο με θαψιγαργίνη, αλλά μπορεί να πλυθεί [40] . BA (0.1-1000 μΜ) από μόνη της δεν μετέβαλε τα επίπεδα ασβεστίου αποθήκευσης κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας του πειράματος (δεν φαίνεται). Απαντήσεις σε διαδοχικές εφαρμογές της CPA [10 μΜ] δεν διασπώνται (Εικ. 7Α). Ταυτόχρονη εφαρμογή της CPA και 1 μΜ ΒΑ προκάλεσε σημαντική μείωση στην απελευθέρωση και 10 ΒΑ μΜ προκάλεσε σχεδόν πλήρη αναστολή (Σχ. 7Β-D). Στη συνέχεια δοκιμάστηκε η επίδραση της δαντρολένη, ένα γνωστό αναστολέα της RyR για Ca

2+ απελευθέρωση από CPA. Βρήκαμε ότι το 10 μΜ δαντρολένη αναστέλλεται CPA διεγείρονται Ca

απελευθέρωση 2+ σε επίπεδο ισοδύναμο με 10 μΜ ΒΑ (Εικ. 8Α-Β).

Τα κύτταρα ελέγχθηκαν με CPA + BA ακολούθησε CPA. Α Διαδοχική εφαρμογές της CPA δεν μετέβαλε Ca

2+ αποδέσμευσης (n = 6, NS). B. 0,1 μΜ Μ ΒΑ δεν αναστέλλει CPA διεγείρεται Ca

2+ αποδέσμευσης (n = 6, NS). Γ 1.0 μΜ ΒΑ αναστέλλεται CPA διεγείρονται Ca

2+ αποδέσμευσης (n = 6, ** p = 0,0037). Δ 10 μΜ ΒΑ αναστέλλεται CPA διεγείρονται Ca

2+ αποδέσμευσης (n = 6, *** p & lt? 0.0001)

Η

Α.. Τα κύτταρα εξετάστηκαν με CPA (10 μΜ) + δαντρολένη (10 μΜ) ακολουθούμενη από CPA (n = 6, *** ρ & lt? 0,0001 B. BA ανέστειλε CPA διεγείρονται Ca

2+ απελευθέρωσης σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο Η.. ανασταλτική δράση της dantroline και ΒΑ ήταν ισοδύναμη με 10 μΜ, CPA (n = 6, ** p & lt? 0,01).

Η

επεξεργασία βορικό οξύ μειώνει την αποθήκευση [Ca

2 +] χωρίς επιπτώσεις στις κυτταροπλασματικές [Ca

2 +]

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν BA αναστέλλεται Ca

2+ απελευθέρωση μας οδηγήσει να αναλύσουμε σε σχέση [Ca

2 +]

επίπεδα st χρησιμοποιώντας Rhod-2 χρωματισμένα κύτταρα και τη σχετική [Ca

2 +]

επίπεδα cyt χρησιμοποιώντας Ινδο 1-χρώση των κυττάρων και κυτταρομετρία ροής. Η έκθεση των DU-145 κύτταρα στην BA [10-50 μΜ] για 24 ώρες δεν επηρεάζει [Ca

2+]

cyt (Εικ. 9Α). Ωστόσο, οι μειώσεις [Ca

2 +]

st (22%) παρατηρήθηκε με 10 μΜ ΒΑ οδήγησε σε μείωση 32% σε [Ca

2 +]

st από 50 μΜ ΒΑ στη 1 ώρα (Σχ. 9Β). ούτε υψηλότερες συγκεντρώσεις ΒΑ ούτε η θεραπεία με 10 μΜ ΒΑ έως 72 ώρες είχε ως αποτέλεσμα περαιτέρω μείωση της [Ca

2+]

st (Εικ. 9BC). στη συνέχεια διεξήχθη συνεστιακή μετρήσεις θαψιγαργίνη διεγείρονται Ca

2+ απελευθέρωση μετά DU-145 κύτταρα προ-θεραπεία με BA (50 μΜ) για 24 ώρες και παρατηρείται μια μείωση 35% σε Ca

2+ απελευθέρωσης (εικ. 9D).

Α. Σχετική [Ca

2 +]

cyt μετά από έκθεση σε 0, 10 και 50 μΜ ΒΑ για 24 ώρες (η = 5, NS). Β [Ca

2 +]

st ως ποσοστό από 0 θεραπείας σε DU-145 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 0-250 μΜ ΒΑ για 24 ώρες. Βορικό οξύ [10-50 μΜ] μείωσε τα επίπεδα ER ασβεστίου κατά περισσότερο από 22% -32% σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (η = 5, * ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001). Γ Μείωση της [Ca

2 +]

st στα κύτταρα DU145 αγωγή με 50 μΜ ΒΑ 1 έως 72 ώρες (n = 5, ** p & lt? 0,01). Δ Ομοεστιακή μέτρηση έδειξε προεπεξεργασία των κυττάρων με ΒΑ για 24 ώρες μείωσε θαψιγαργίνη διεγείρεται Ca απελευθέρωση

2+ σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (n = 6, *** p & lt? 0.0001)

Η

Συζήτηση.

Αυτή η μελέτη αναφέρει το απροσδόκητο εύρημα που αποθηκεύονται Ca

2+ απελευθέρωσης και του αυλού επίπεδα μπορεί να διαμορφώνεται από φυσιολογικά σχετικά επίπεδα της ΒΑ στην DU-145 επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. Αυτό είναι σχετικό με την κατανόηση των κινδύνων καρκίνου του δεδομένου ότι τα επίπεδα στο αίμα της ΒΑ καθορίζεται από την κατανάλωση του Β στο πόσιμο νερό και τα παράγωγα φυτικών τροφών [17]. Είναι πιθανό να είναι η πρώτη κυτταρική απόκριση σε έκθεση Β και συνεπώς ένα σημείο εκκίνησης για την κατανόηση του τρόπου ο κίνδυνος του προστάτη και καρκίνο του πνεύμονα μειώνεται κατά Β με δοσοεξαρτώμενο τρόπο [16], [21], [22]. BA παρουσίασαν τα χαρακτηριστικά ενός κλασικού ανταγωνιστή υπό την έννοια ότι δεν έχει άμεση επίδραση στην Ca

2+ απελευθέρωση όταν εφαρμόζεται από μόνη της και τα αποτελέσματά της ήταν αγωνιστής εξαρτάται. BA δόση εξαρτώμενο ανέστειλε Ca

2+ απελευθέρωσης σε απόκριση cADPR, ένας ενδογενής αγωνιστής του RyR και αγωνιστές καφεΐνη και 4-CMC (Εικ. 2-5). Σε ανταγωνιστική ανάλυση δέσμευσης συνδέτη μας, η BA εμφανίζεται το χαρακτηριστικό ενός ενιαίου ανταγωνιστή τόπου σε ότι ήταν αναστρέψιμη σε υψηλότερες συγκεντρώσεις του cADPR (εικ. 2Β). BA αυξημένη K

d από 15,1 να 49,4, αλλά δεν επηρέασε Bmax (Πίνακας 1). ΒΑ έχει αποδειχθεί ότι δεσμεύονται σε cADPR σε υψηλές συγκεντρώσεις, ωστόσο, την ικανότητα της ΒΑ να αναστέλλει cADPR, η καφεΐνη και η απελευθέρωση 4CmC επάγεται Ca

2+ δεικνύει ότι σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις ΒΑ μπορεί να συνδέεται με την θέση δέσμευσης cADPR στο RyR σταθεροποίηση του Ca

2 + κανάλι στην ανενεργή κατάσταση [30].

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων LNCaP έχουν αναφερθεί να είναι περίπου 10% λιγότερο ευαίσθητη και PWR1E μη νεοπλασματικά κύτταρα είναι περισσότερο από 4 φορές λιγότερο ευαίσθητα στην ΒΑ από DU-145 κύτταρα [16]. Παρατηρήσαμε επίσης αυτό το μοτίβο της ευαισθησίας στην ικανότητά της ΒΑ να αναστέλλει την καφεΐνη διεγείρεται Ca

2+ απελευθέρωση. Η ελάχιστη αποτελεσματική συγκέντρωση για DU-145 ήταν 10 μΜ ΒΑ, LNCaP ήταν 20 μΜ ΒΑ, και PWR1E ήταν 150 μΜ ΒΑ (Σχήμα 3F, 5D & amp?. 6D). Εκτός από τη μειωμένη ανταπόκριση προς ΒΑ, τόσο LNCaP και PWR1E ήταν μη ανταποκρινόμενοι στη θεραπεία 4CmC. RyR ισομορφές 1 και 2, αλλά όχι 3 είναι γνωστό ότι ενεργοποιείται από 4CmC σε μερικές κυτταρικές γραμμές [41]. Είναι πιθανό ότι οι διαφορές κυτταρική γραμμή ήταν λόγω των διαφορών στην ισομορφές RyR ή έκφρασή τους. Οι LNCaP κυτταρικές γραμμές έχουν δειχθεί ότι εκφράζουν RyR 1 και 2, αλλά όχι 3 [42]. Ήμασταν σε θέση να εντοπίσει τις μελέτες στη βιβλιογραφία που προσδιορίζονται ισομορφές RyR στο απεμπλουτισμένο ουράνιο-145 ή κύτταρα PWR1E σε κάθε κυτταρική σειρά προστάτη.

Νεφρική δοκιμές λειτουργίας έχουν δείξει ΒΑ απορροφάται από τον νεφρό σε μη έγκυες και οι έγκυες γυναίκες [43]. Η ανακάλυψη ενός ηλεκτρογενή, η τάση ρυθμίζεται όξινο ανθρακικό νάτριο-βορικό συζευγμένο συν-μεταφορέα (NaBC1) σε σωληνάρια νεφρού αρουραίου μπορεί να εξηγήσει την παρατήρηση αυτή, αλλά δεν έχει ακόμη επιβεβαιωθεί από άλλο εργαστήριο. έκφραση NaBC1 επαγόμενο πολλαπλασιασμό σε κύτταρα ΗΕΚ και Hela κυττάρων με την ενεργοποίηση της οδού ΜΑΡΚ 16 ώρες μετά τη θεραπεία [13]. Είναι άγνωστο αυτή τη στιγμή αν NaBC1 εκφράζεται σε κυτταρικές γραμμές όγκου του προστάτη και μη-όγκου, αλλά οι διαφορές στην έκφραση του έχει προταθεί ως μια πιθανή εξήγηση για την μεταβολή στην κυτταρική ευαισθησία στην BA μεταξύ των καρκινικών κυττάρων του προστάτη και μη-όγκου [10 ].

Για να διερευνήσουν περαιτέρω την ικανότητα της ΒΑ να αναστέλλει αποθηκεύονται Ca

2+ απελευθέρωση δοκιμάσαμε τα αποτελέσματά της με την παρουσία του CPA (Εικ. 7-8). CPA αναστέλλει το κανάλι SERCA με αποτέλεσμα την εκκένωση του Ca

2+ καταστήματα [44]. Η μελέτη μας έδειξε ότι η δόση BA εξαρτώμενο μπλοκάρει CPA μεσολάβηση Ca

2+ απελευθέρωση στο DU-145 κύτταρα. Παρατηρήσαμε επίσης μείωση της αποθήκευσης Ca

2+ επίπεδα από 22% έως 32% σε 10 έως 50 μΜ ΒΑ αντιμετωπίζονται DU-145 κύτταρα σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Οι STIM πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση Ca εισροή

2+ στο ER [45] – [48]. Αν BA μειώνει Ca

2 + διαρροή μέσω των καναλιών RyR η σημαντική απώλεια από διαρροή μπορεί να συμβεί μέσω προσενιλίνες και άλλες πρωτεΐνες μη κανάλι που δεν διεγείρουν STIM πρωτεΐνες. Αυτό θα οδηγήσει σε μειωμένη αποθηκεύονται Ca

2+ επίπεδα που δεν είναι σε θέση να σηματοδοτήσει την επαναπλήρωση.

Η σημασία του Ca

2+ στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και του πολλαπλασιασμού είναι ένα καθιερωμένο χώρο της έρευνας για τον καρκίνο, αλλά δεν έχει μελετηθεί ως τρόπος δράσης στην πρόληψη του καρκίνου [49] – [51]. ικανότητα της ΒΑ να ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων έχει συνδεθεί με αλλαγές στην έκφραση των κυκλινών και της οδού ΜΑΡΚ σε κύτταρα DU-145, ΗΕΚ293 και HeLa [13], [16], [26]. Ωστόσο, είναι δυνατόν αυτές οι επιδράσεις συμβαίνουν σε απάντηση σε μειώσεις Ca απελευθέρωση ή την αποθήκευση

2+. Στην καρκίνου του προστάτη LNCaP κυτταρική σειρά, Humez παρατήρησε ότι ο IGF (5 ng /ml), η οποία αυξάνει την κυτταρική ανάπτυξη, αυξημένη ER [Ca

2 +]

ER, ενώ TNF άλφα (1 ng /ml), η οποία μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, μειωμένη [Ca

2 +]

ER [52].

εν κατακλείδι, η ΒΑ έχει προηγουμένως αναφερθεί για τη μείωση του κινδύνου καρκίνου του προστάτη σε ανθρώπους και να μειώσει την ανάπτυξη του όγκου και του προστάτη πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση, και διείσδυση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι φυσιολογικά επίπεδα αγωνιστή αναστολή ΒΑ διεγείρεται απελευθέρωση της αποθηκευμένης Ca

2+ με δοσοεξαρτώμενο τρόπο και χαμηλόμισθους αποθηκεύονται Ca

2+ επίπεδα αποθήκευσης.