Αφηρημένο

Ιστορικό

Bacillus Calmette-Guerin (BCG) είναι η πιο αποτελεσματική θεραπεία για μη-μυϊκή διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Ωστόσο, μια αποτυχία στην αρχική απάντηση ή υποτροπή εντός των πρώτων πέντε ετών της θεραπείας έχει παρατηρηθεί στο 20% των ασθενών. Έχουμε παρατηρήσει προηγουμένως ότι

in vivo

χορήγηση ενός αναστολέα του νιτρικού οξειδίου βελτίωσε την απόκριση σε BCG του όγκου κύστης ποντικών που φέρουν. Περιγράφηκε ότι αυτό το αποτέλεσμα οφείλεται σε αντικατάσταση του ιστού του όγκου από αποθήκες κολλαγόνου. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Έχουμε αποδείξει ότι το BCG διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών ΝΙΗ-3Τ3 με την ενεργοποίηση των μονοπατιών σηματοδότησης ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ και επίσης τη διαφοροποίηση προσδιορίζεται με άλφα-λείου μυός ακτίνη (α-SMA) έκφρασης.

In vivo

, εντός του όγκου εμβολιασμό BCG επίσης αυξήθηκε άλφα-SMA και την έκφραση του κολλαγόνου. Η στοματική χορήγηση της L-NAME ενίσχυσε την προ-ινωτικών επίδραση του BCG. Περιτοναϊκά μακροφάγα που λαμβάνονται από MB49 ποντίκια που φέρουν όγκο αγωγή

in vivo

με συνδυασμένη θεραπεία του BCG με L-NAME ενισχύεται επίσης τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών. Παρατηρήσαμε ότι ο FGF-2 είναι ένας από τους παράγοντες που απελευθερώνονται από BCG-ενεργοποιημένα μακροφάγα που είναι σε θέση να επάγει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών. Η εμπλοκή του FGF-2 αποδείχθηκε χρησιμοποιώντας ένα αντι-FGF2 αντίσωμα. Ταυτόχρονα, αυτός ο πληθυσμός των μακροφάγων βελτιωμένη επούλωση ρυθμό σε φυσιολογικά ποντίκια και έκφραση FGF-2 πληγή ήταν επίσης αυξημένη σε αυτές τις πληγές.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι οι ινοβλάστες είναι στοχευμένες με BCG τόσο άμεσα όσο και μέσω των ενεργοποιημένων μακροφάγων σε ένα πλαίσιο ανοσοθεραπεία ενός μοντέλου ποντικού της ουροδόχου κύστης. Έχουμε επίσης περιγράφεται, για πρώτη φορά, ότι ο FGF-2 εμπλέκεται σε ένα διάλογο μεταξύ ινοβλάστες και μακροφάγα που επάγεται μετά τη θεραπεία με BCG. Το γεγονός ότι η χορήγηση L-NAME βελτιώνει την επίδραση BCG σε ινοβλάστες, ΟΧΙ αναστολή, μπορεί να αποτελέσει μια νέα προσέγγιση για να προσθέσετε στη συμβατική θεραπεία με BCG

Παράθεση:. Lodillinsky C, langle Υ, Guionet Α, Góngora Α, Baldi Α, Sandes ΕΟ, et al. (2010) Bacillus Calmette Guerin Προκαλεί ινοβλαστών ενεργοποίηση τόσο απευθείας όσο και μέσω μακροφάγα σε ένα ποντίκι καρκίνο της ουροδόχου κύστης μοντέλο. PLoS ONE 5 (10): e13571. doi: 10.1371 /journal.pone.0013571

Επιμέλεια: Ludovic Tailleux, Institut Pasteur, Γαλλία

Ελήφθη: 5 Μαΐου, 2010? Αποδεκτές: 4, Οκτωβρίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 22 Οκτώβρη 2010

Copyright: © 2010 Lodillinsky et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y TÉCNICAS (CL, YL, ΑΒ, AME), και επιχορηγήσεις από το Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y TÉCNICAS-PIP, και Universidad de Buenos Aires -UBACYT M017 (www.conicet.gov.ar . www.uba.ar). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κατά το χρόνο της διάγνωσης, 60-80% των όγκων της ουροδόχου κύστης είναι μη επεμβατική μυών και περιορίζεται στο ουροθήλιο και /ή υμένα. Αυτές περιλαμβάνουν θηλώδες όγκους ή καρκίνωμα in situ. Και οι δύο τύποι των όγκων συχνά συμβαίνουν ταυτόχρονα. Το 1976, ο Μοράλες et al. [1] ανέφεραν για πρώτη φορά, η επιτυχής ενδοκυστική χρήση του

Bacillus Calmette Guerin (BCG)

ως συμπληρωματική θεραπεία για μη-επεμβατική μυών καρκίνου της ουροδόχου κύστης εξής διουρηθρική εκτομή. Είναι πλέον ευρέως αποδεκτό ότι η ενδοκυστική BCG είναι πιο ισχυρή θεραπεία για την πρόληψη της υποτροπής του όγκου από κάθε ενδοκυστική χημειοθεραπεία [2]. Ωστόσο, περίπου 20% των ασθενών είτε αποτυγχάνουν να ανταποκριθούν αρχικά ή υποτροπή εντός των πρώτων πέντε ετών της αγωγής [3].

Είναι γνωστό ότι το BCG παράγει μία τοπική ανοσολογική αντίδραση με την ενεργοποίηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, καθώς και την έκκριση κυτοκινών που περιλαμβάνουν Th1 κυτταροτοξικότητα κυττάρων [4]. Έχει παρατηρηθεί μια σημαντική αύξηση πολυμορφοπύρηνων και μονοπύρηνων κυττάρων που διηθούν σε όγκους της ουροδόχου κύστης μετά από τη θεραπεία με BCG [5]. Δεδομένου ότι τα μακροφάγα (MAC) είναι φαγοκυτταρικά και κύτταρα που εμφανίζουν αντιγόνο και έχουν την ικανότητα να εκκρίνουν κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες, θεωρούνται τα καλύτερα εξοπλισμένα κύτταρα που εμπλέκονται σε BCG ανοσοθεραπεία. Ανάλογα με το μικροπεριβάλλον, τη φύση και την ένταση, όπου τα MAC διαφοροποίηση λαμβάνει χώρα, αυτά τα κύτταρα είναι ικανά να ενεργοποιήσουν διαφορετικές οδούς και να οδηγήσουν σε συγκεκριμένα προφίλ [6]. Οι απαντήσεις του MAC, μετά από τραυματισμό ή μόλυνση είναι παραδείγματα πολλά διαφορετικά ερεθίσματα που προκαλούν τα MAC ενεργοποίηση σε ιστούς, εμφανίζοντας μεγάλη πλαστικότητα. BCG, όταν χρησιμοποιείται ως ανοσοθεραπεία για όγκους της ουροδόχου κύστης, υποβάλλεται σε επεξεργασία από τα MAC και ουροθηλίου κύτταρα, με αποτέλεσμα την πρόωρη αποδέσμευση των φλεγμονωδών κυτοκινών, μερικά από τα οποία μπορεί να είναι υπεύθυνη για ορισμένες ανεπιθύμητες ενέργειες που παρατηρούνται σε ασθενείς [7], [8]. Ένας από τους μεσολαβητές της φλεγμονώδους διαδικασίας είναι το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ), που παράγεται από μια οικογένεια ΝΟ συνθασών (NOSs). Φλεγμονώδεις κυτοκίνες ή /και βακτηριακά προϊόντα ενεργοποιούν συνήθως την έκφραση του διεγέρσιμη NOS (iNOS) ισομορφή, δημιουργώντας μεγάλες ποσότητες ΝΟ. iNOS δεν εκφράζεται σε φυσιολογικό επιθήλιο της ουροδόχου κύστης, αλλά έχει ανιχνευθεί σε πρώιμο υποτροπές όγκου κύστης [9] και έχει αναφερθεί ότι η έκφραση iNOS σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να συνδεθεί με απάθεια να BCG [10]. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι η ίη νίνο χορήγηση του BCG να MB49 ποντίκια που φέρουν όγκο μειωμένη ανάπτυξη του όγκου και ότι η συνδυασμένη θεραπεία του BCG με την NOS αναστολέα L-NAME βελτιωθεί σημαντικά υποχώρηση του όγκου με την αντικατάσταση του ιστού του όγκου από τις αποθήκες του κολλαγόνου, που μοιάζει με την επούλωση τραυμάτων [11] . παρόντα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ο έλεγχος των υποτροπών των όγκων της ουροδόχου κύστης από τη θεραπεία με BCG περιλαμβάνει την αναδιοργάνωση στρώμα και ότι η αναστολή ΝΟ μπορεί να βελτιώσει την αναδιαμόρφωση των ιστών. Η επούλωση των τραυμάτων είναι ένα παράδειγμα της αναδιοργάνωσης των ιστών, αφού γενεά μετά πληγών, παράγοντες ανάπτυξης που απελευθερώνεται στο εξωκυτταρικό πλέγμα επάγει μια φλεγμονώδη διεργασία η οποία επιτρέπει τη μετανάστευση των κυττάρων [12]. Μεταξύ άλλων, τα MAC και ινοβλαστών είναι σημαντικά κύτταρα που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία. Ινοβλαστών μεταναστεύουν προς την κατεστραμμένη περιοχή, διαφοροποιούνται σε μυοϊνοβλάστες και να συνθέσει πρωτεΐνες εξωκυττάριας μήτρας που επιτρέπουν τη συστολή και τελικά την πληγή κοντά. Σε ένα επούλωσης τραύματος πλαίσιο, αυξητικούς παράγοντες όπως ένας αυξητικός fibloblast παράγοντα-2 (FGF-2) και αυξητικό παράγοντα εξαλλαγής βήτα (ΤΟΡ-β) που εκκρίνεται από τα MAC, διεγείρουν ινοβλάστες οι οποίες είναι υπεύθυνες για την σύνθεση, απόθεση και την αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας μήτρας [13]. FGF-2 εντοπίσθηκε αρχικά ως βασικό παράγοντα ανάπτυξης που διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των ΝΙΗ-3Τ3 ινοβλάστες. Εκτός αυτού, πολλές μελέτες έχουν δείξει έναν ρόλο του FGF-2 στην ίνωση ιστού, όπου αυτός ο παράγοντας είναι αυξημένη σε οξέα τραύματα και παίζει ένα ρόλο στο σχηματισμό κοκκιώδους ιστού, reepithelization και την αναδιαμόρφωση του ιστού [12], [14].

για τις γνώσεις μας, δεν υπάρχουν πληροφορίες σχετικά με το ρόλο στην αναδιαμόρφωση ιστού του BCG όταν χρησιμοποιείται στη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Ως εκ τούτου, ο σκοπός της εργασίας μας ήταν να αξιολογηθεί η επίδραση της BCG στην ενεργοποίηση των ινοβλαστών, μετρούμενη με ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ μονοπάτια και κολλαγόνο Ι, και α-λείου μυός ακτίνη (α-SMA) έκφραση σηματοδότησης. Δεδομένου ότι οι MACs εμπλέκονται τόσο απόκριση BCG και σε αναδιοργάνωση ιστών όπως παρατηρείται κατά τη διαδικασία της επούλωσης του τραύματος [6], [15] αξιολογήσαμε επίσης το ρόλο της MAC, υπό θεραπεία με BCG και θεραπεία καμία αναστολή, στην ενεργοποίηση των ινοβλαστών σε μια επουλωτική των πληγών μοντέλο . Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι, στο πλαίσιο των μηχανισμών ελέγχου του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, το BCG επάγει την ενεργοποίηση των ινοβλαστών, είτε άμεσα είτε μέσω των MAC, ότι με την απελευθέρωση διαλυτά προϊόντα, μπορούν μόνα τους να ενεργοποιούν τους ινοβλάστες. Η συμμετοχή του ΝΟ ως αρνητικός ρυθμιστής της διαδικασίας αυτής αποδείχθηκε επίσης.

Αποτελέσματα

BCG επάγει τον πολλαπλασιασμό των ΝΙΗ-3Τ3

Έχει περιγραφεί ότι το BCG είναι σε θέση να προκαλέσουν κελί σύλληψη του κύκλου και την απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές όγκου κύστης [15], [16]. Ωστόσο, ένα υπόλοιπο ερώτημα θα μπορούσε να είναι αυτό που θα ήταν η επίδραση της BCG σε ινοβλάστες; Για να απαντήσουμε σε αυτό το ερώτημα κύτταρα ΝΙΗ-3Τ3 καλλιεργήθηκαν κάτω από διαφορετικές συγκεντρώσεις της BCG. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α και 1Β, BCG επαγόμενη τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΝΙΗ-3Τ3, αξιολογήθηκαν τόσο με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων και με τον προσδιορισμό MTS. Επαγωγή του πολλαπλασιασμού των ινοβλαστών ανιχνεύθηκε με συγκεντρώσεις BCG από 1,5 × 10

6 CFU /ml έως 3 × 10

6 CFU /ml, μειώνοντας για συγκεντρώσεις υψηλότερες από 6 × 10

6 CFU /ml. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν αποκλίσεις όταν ο καθορισμός του πολλαπλασιασμού έγινε είτε με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων ή με MTS (σχήμα 1 Α και Β αντίστοιχα) για τις συγκεντρώσεις ίση ή μεγαλύτερη από 6 × 10

6 CFU /ml. Πιστεύουμε ότι αυτή η διαφορά σχετίζεται με την ενίσχυση της μιτοχονδριακής δραστηριότητας που προκαλείται από υψηλές ποσότητες BCG. Έτσι, τα ακόλουθα πειράματα διεξήχθησαν με 3 × 10

6 CFU /ml του BCG για την οποία υπάρχει συμφωνία μεταξύ των δύο μορφών του ποσοτικού προσδιορισμού. Για να αξιολογηθεί κατά πόσον οι πορείες PI3K και ΜΑΡΚ που εμπλέκονται στην BCG που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών, αναλύσαμε τα αποτελέσματα της LY 294002 και PD 98059, αναστολείς της PI3K και ΜΑΡΚ αντίστοιχα, στον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών που προκαλείται από BCG. Αξιολογήσαμε επίσης τη φωσφορυλίωση της ERK και AKT, δύο ενεργοποιημένα μόρια που είναι το κλειδί σε αυτές τις οδούς. Παρατηρήσαμε ότι LY (20 μΜ) ήταν σε θέση να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό που επάγεται από BCG μετά από 24 ώρες θεραπείας (Εικ. 1 C), και ότι PD (50 μΜ) ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό που επάγεται από BCG μετά από 48 ώρες της αγωγής (Σχ. 1D ). Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Ε και 1F, θεραπεία BCG προκάλεσε ταχεία φωσφορυλίωση της ERK και ΑΚΤ εντός 5 λεπτών. Οι αναλύσεις στυπώματος Western αποκάλυψε ότι η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ διεγέρθηκε μεταξύ 5-10 λεπτά, μειώνοντας μετά από 20 λεπτά (Σχ. 1Ε). BCG που προκαλείται επίσης ERK1 και ERK2 φωσφορυλίωση μετά από 5 λεπτά, η οποία στη συνέχεια μειώνεται μετά από 30 λεπτά (Σχ. 1 F). Αυτή η αλληλεπίδραση μεταξύ BCG και ινοβλαστών περιλαμβάνει τόσο πολλαπλασιασμό και ένα μονοπάτι επιβίωσης. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το BCG στόχοι όχι μόνο τα καρκινικά κύτταρα και τα MAC, αλλά επίσης και των ινοβλαστών.

(Α) ΝΙΗ-3Τ3 ινοβλάστης υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετική συγκέντρωση του BCG για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετρήθηκαν ή (Β) κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε με μη ραδιενεργό μέθοδο κύτταρο χάχανα (MTS), vs μάρτυρα: ρ & lt? 0.05. (C) Επίδραση της LY 294002 και (Δ) PD 98059 αξιολογήθηκε από MTS σε ινοβλάστες διεγείρονται με BCG (3 χ 10

6 CFU /ml) για 24 και 48 ώρες αντίστοιχα, α: ρ & lt? 0,05 vs ελέγχου, b: vs BCG. Ινοβλαστών διεγείρεται με BCG (3 χ 10

6 CFU /ml) και ρ-ΑΚΤ (Ε) και ρ-ΕΚΚ (F) προσδιορίστηκε με στύπωμα Western. Σχετικά επίπεδα φωσφορυλίωσης κανονικοποιήθηκαν για ολική πρωτεΐνη και αναφέρονται ως φορές μεταβολής ελέγχου,: σελ. & Lt? 0,05

Η

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων NHI-3Τ3 ενισχύθηκε από την L-NAME από 0,5 έως 4 mm (ρ & lt? 0,05) σε μια συγκέντρωση-ανεξάρτητο τρόπο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όταν ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε αγωγή με ένα συνδυασμένο πρωτόκολλο, η υψηλότερη δραστικότητα πολλαπλασιασμού ανιχνεύεται με BCG 3 × 10

6 CFU /ml συν L-ΝΑΜΕ 2mM (Σχήμα 2). Αυτή η επίδραση παρεμποδίστηκε από LY 294002 και PD 98059, υποδεικνύοντας έτσι ότι η L-NAME είναι σε θέση να βελτιώσει BCG-επαγόμενο πολλαπλασιασμό σε κύτταρα ΝΙΗ-3Τ3 που διαμεσολαβείται από ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ μονοπάτια σηματοδότησης.

ΝΙΗ-3Τ3 ινοβλαστών έλαβαν θεραπεία με BCG (3 χ 10

6 CFU /ml), L-NAME (2 mM) ή BCG και L-NAME σε παρουσία LY 294002 και PD 98059 για 24 και 48 ώρες αντίστοιχα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με MTS. α: p & lt? 0.01 vs ελέγχου? β: p & lt? 0,05 vs BCG ή L-NAME και μόνο? γ: σελ. & lt? 0.01 vs αντίστοιχες ελέγχου τους

Η

BCG διεγείρει ΝΙΗ-3Τ3 διαφοροποίηση

Η ενεργοποίηση των ινοβλαστών σε μυοϊνοβλάστες, ένα κρίσιμο βήμα στη διαδικασία της επούλωσης των πληγών, χαρακτηρίζεται από η ανάπτυξη της ενδοκυτταροπλασματική ινών στρες που προσδίδουν σε αυτά τα κύτταρα την ικανότητα των αναπτυσσόμενων ένταση, και η αυξημένη σύνθεση συστατικών εξωκυτταρικής μήτρας, όπως το κολλαγόνο τύπου Ι [17], [18]. Το πιο σημαντικό δείκτη της μετάβασης φαινοτυπική ινοβλάστη /μυοϊνοβλάστη είναι η novo Expresion του άλφα-λείου μυός ακτίνη [19]. Έτσι, αναλύσαμε άλφα-SMA και κολλαγόνο Ι ως δείκτες ινογόνων δραστηριότητας και αξιολόγησε την έκφραση αυτών των μορίων σε κύτταρα ΝΙΗ-3Τ3 που έλαβαν θεραπεία με BCG.

Για να καθοριστεί η καλύτερη δόση του BCG, ανοσοφθορισμού και των δύο πρωτεϊνών ήταν διεξάγεται σε ινοβλάστες σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του BCG για 24 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ισχυρότερη έκφραση τόσο άλφα-SMA και κολλαγόνο Ι παρατηρήθηκε με 3 × 10

6 CFU /ml του BCG (σχ. 3Α), έτσι, αυτή η συγκέντρωση επιλέχθηκε για τη διεξαγωγή των κηλίδων Western αναλύσεις. Το Σχήμα 3Β δείχνει ότι 3 × 10

6 CFU /ml του BCG ήταν ικανό να επάγει την έκφραση κολλαγόνου Ι μετά από 6 ώρες θεραπείας, είναι η έκφραση 2,5 φορές υψηλότερη από ό, τι οι έλεγχοι μετά από 12 ώρες θεραπείας. Μια σημαντική επαγωγή της άλφα-SMA μετά παρατηρήθηκε 12 ώρες της θεραπείας με BCG, παραμένοντας αυξημένη στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία. Στο σύνολό τους τα στοιχεία που έδειξαν μέχρι τώρα, θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι η ενεργοποίηση των ινοβλαστών μπορεί επίσης να λάβει χώρα in vivo.

(Α) Immunofluoresce χρώση των ΝΙΗ-3Τ3 που έλαβαν θεραπεία με BCG (3 × 10

6 CFU /ml) για 24 ώρες αποκαλύφθηκε με αντι-κολλαγόνο Ι και αντι-άλφα-SMA αντίσωμα. Κλίμακα: bar = 100 um. (Β) Western Blot από ομογενοποιήματα ινοβλαστών σε επεξεργασία με BCG (3 χ 10

6 CFU /ml) σε διαφορετικούς χρόνους για το προκαθορίζουν κολλαγόνου Ι και επαγωγή άλφα-SMA. (C) μονάδες πυκνομετρική κολλαγόνου Ι ή (Δ) α-SMA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης, σχετικοποιείται σε β-ακτίνη και αναφέρονται ως φορές μεταβολής του ελέγχου ενός: p & lt? 0,05, β: ρ. & Lt? 0,01

BCG επάγει την ενεργοποίηση των ινοβλαστών μέσω των μακροφάγων

in vitro

και προκαλεί το κολλαγόνο και την έκφραση α-SMA στην MB49 όγκους

in vivo

η

Δεδομένου ότι η άμεση θεραπεία με BCG επάγει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών και τα MAC είναι μερικά από τα πιο σημαντικά κύτταρα σε αποκρίσεις BCG, υποθέσαμε ότι υπάρχει ένα παράθυρο διαλόγου ανάμεσα ινοβλάστες και τα MAC υπό θεραπεία με BCG. Για να δοκιμαστεί αυτό, διερευνήσαμε αν MAC, που έλαβαν θεραπεία με BCG μπορεί να επηρεάσει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των ινοβλαστών. Κατ ‘αρχάς, αξιολογήσαμε την παραγωγή ΝΟ στα MAC που έλαβαν θεραπεία με BCG. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, περιτοναϊκή MACs από ποντίκια που φέρουν όγκο αγωγή in vivo με BCG παράγονται μεγαλύτερες ποσότητες ΝΟ από εκείνα από μη επεξεργασμένα αυτά. In vitro, η θεραπεία της MAC, κυτταρική σειρά RAW 264.7 με BCG αύξησε επίσης την παραγωγή του ΝΟ. Για να αξιολογηθεί ο ρόλος των διαλυτών προϊόντων που απελευθερώνεται από τα MAC, λάβαμε την ρυθμισμένα μέσα (CM) από την περιτοναϊκή MAC από ποντίκια που φέρουν όγκο είτε υποβάλλεται σε επεξεργασία vivo ή όχι με BCG +/- L-NAME. Παρατηρήσαμε ότι ο CM από την περιτοναϊκή MAC, από ποντίκια που φέρουν όγκο (MAC-T) των διαφόρων ομάδων που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών. Ιδιαίτερα, το CM των MAC, από ποντίκια που φέρουν όγκο αγωγή in vivo με BCG (MAC-Τ-BCG) συν L-ΝΑΜΕ επαγόμενη το υψηλότερο ποσοστό ινοβλάστες πολλαπλασιασμού in vitro. Ο CM από ακατέργαστα 264.7 δεν μετέβαλε τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών. Ωστόσο, η in vitro επεξεργασία του RAW 264.7 με BCG σε συνδυασμό είτε ή όχι με L-NAME, παρομοίως με περιτοναϊκή τα MAC, επίσης επαγόμενο πολλαπλασιασμό ΝΙΗ-3Τ3 (Σχ. 4Β).

(Α) προσδιορίστηκε παραγωγή ΝΟ στα υπερκείμενα των δύο περιτοναϊκής MAC από MB49 ποντικών που φέρουν όγκο (MAC-T) και RAW 264.7 κύτταρα επεξεργασμένα in vivo με BCG (6 × 10

6 CFU /ml) ή in vitro (3 χ 10

6 CFU /ml) αντίστοιχα, αξιολογήθηκαν στο υπερκείμενο με αντιδραστήριο Griess. α: p & lt? 0,0001 έναντι του ελέγχου. RAW 264.7 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BCG (3 χ 10

6 CFU /ml) για 24 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν διεξοδικά με PBS. Άνευ ορού μέσο προστέθηκε και η επώαση συνεχίστηκε για 24 ώρες για να ληφθεί το CM. (Β) ινοβλάστες σε αγωγή για 48 ώρες με το CM από την περιτοναϊκή ή RAW 264.7 κύτταρα προηγούμενη θεραπεία με BCG (3 χ 10

6 CFU /ml) συν L-ΝΑΜΕ (2 mM). βιωσιμότητα ινοβλαστών αξιολογήθηκε με MTS και αναφέρεται ως ποσοστό του ελέγχου (RAW 264.7 ή ΝΙΗ-3Τ3 ανεπεξέργαστων κυτταρικές σειρές), Α: ρ & lt? 0,05 και b: ρ & lt? 0,01 vs ελέγχου, c: ρ & lt? 0,05 vs ελέγχου τα MAC-T. (Γ) Western Blot για να προσδιοριστεί το κολλαγόνο Ι και άλφα-SMA από ομογενοποιήματα ινοβλαστών θεραπεία για 24 ώρες με CM από RAW 264,7 προηγουμένως υποβληθεί σε θεραπεία για 24 ώρες με BCG συν ί-ΝΑΜΕ. Σχετικό επίπεδο έκφρασης ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη και αναφέρονται ως φορές μεταβολής του ελέγχου, σε: p & lt? 0,05, β: p & lt? 0,01. (D) Masson trichome (άνω πίνακας) και την ανοσοϊστοχημική χρώση (κάτω πίνακας), για να προσδιοριστεί ίνες κολλαγόνου και άλφα-SMA αντίστοιχα, διεξήχθησαν σε MB49 όγκους που μεγαλώνει υποδόρια σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με BCG, L-NAME ή BCG + L-NAME. Λευκά βέλη δείχνουν την κυάνωση των ινών κολλαγόνου. Κίτρινα βέλη δείχνουν καφέ θετική χρώση για την α-SMA. Κλίμακα:. Bar = 100 um

Η

Το CM που λαμβάνεται από RAW 264.7 επαγόμενη έκφραση κολλαγόνου Ι σε ινοβλάστες. Η έκφραση ήταν υψηλότερη όταν το CM ήταν από τα MAC που έλαβαν θεραπεία με BCG, και το αποτέλεσμα αυτό διατηρήθηκε σε υψηλά επίπεδα υπό προσθήκη L-NAME. Το CM που λαμβάνεται από RAW 264.7 θεραπεία με BCG συν L-NAME, επίσης, που προκαλείται από την έκφραση α-SMA (Εικ. 4C). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι υπάρχουν μερικοί διαλυτών παραγόντων που εκκρίνονται από τα MAC, ενεργοποιούνται από BCG η οποία μπορεί να προκαλέσει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών και την ενεργοποίηση. Με στόχο να αξιολογηθεί αυτή η επίδραση in vivo αναλύσαμε απόθεση κολλαγόνου και την έκφραση άλφα-SMA σε MB49 ποντικούς που φέρουν όγκο υπό θεραπεία με BCG και L-NAME. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι και οι δύο BCG και L-NAME και του συνδυασμού τους που προκαλείται από την απόθεση των ινών κολλαγόνου σε αυτούς τους όγκους. BCG και L-NAME προκάλεσε επίσης την έκφραση του άλφα-SMA σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Ωστόσο, πιο έντονη χρώση των άλφα-SMA παρατηρήθηκε σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με BCG συν ί-ΝΑΜΕ. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το BCG μπορεί να προκαλέσει την ενεργοποίηση των ινοβλαστών σε βιολογικό περιβάλλον, και ότι αυτό το αποτέλεσμα ενισχύεται από την αναστολή της παραγωγής ΝΟ.

αναστολή νιτρικό οξείδιο βελτιώνει

in vivo

επούλωση τραυμάτων που προκαλούνται από την περιτοναϊκή MACs από ποντίκια που φέρουν όγκο σε επεξεργασία με BCG

Για τον προσδιορισμό της λειτουργικής ικανότητας της MAC, υπό θεραπεία με BCG και η ρύθμισή της από ΝΟ, μια in vivo πείραμα επούλωσης τραύματος διεξήχθη. Περιτοναϊκή MACs-T είτε επεξεργασμένο ή όχι με BCG in vivo τοποθετήθηκαν σε ραχιαίο δέρμα πληγή φυσιολογικών ποντικών. Οι αναστολείς L-NAME και 1400W προστέθηκαν στις πληγές είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με τα MAC. Η επιφάνεια της πληγής μειώθηκε σημαντικά όταν οι MAC από την κανονική (τα δεδομένα δεν φαίνονται) ή Mac-T προστέθηκαν πάνω στην πληγή σε σύγκριση με τους ελέγχους, όπου προστέθηκε μόνο διάλυμα PBS-γλυκερόλη. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η προσθήκη του ΝΟ αναστολέων L-NAME ή 1400W μόνο ήταν σε θέση να μειώσει σημαντικά την επιφάνεια του τραύματος. Όταν περιτοναϊκή MACs από ποντίκια που φέρουν όγκο που είχαν λάβει BCG εντός του όγκου προστέθηκαν (MAC-Τ-BCG) πάνω στην πληγή, το ποσοστό κλεισίματος τραύματος ήταν μειωμένη, σε σύγκριση με τα τραύματα με τα MAC-T. Ωστόσο, όταν αυτά τα MAC-T-BCG προστέθηκαν με 1400 W, ο ρυθμός επούλωσης του τραύματος αυξήθηκε σημαντικά (Εικ. 5Α).

(Α) Περιτοναϊκή MAC από ποντίκια που φέρουν όγκο είτε αγωγή ή όχι με BCG ( MACs-T-BCG και Mac-Τ, αντίστοιχα), τοποθετήθηκαν σε ραχιαία δέρμα πληγή φυσιολογικά ποντίκια. L-NAME (2 mM) ή 1400 W (1 μΜ) προστέθηκε πάνω στο τραύμα. Το κλείσιμο της πληγής υπολογίσθηκε ως το ποσοστό της αρχικής περιοχής του τραύματος (ημέρα μηδέν), ένα: p & lt? 0,01, b: ρ & lt? 0,001 vs PBS-Gli, c: ρ & lt? 0,05 vs MACs-T-BCG ελέγχου. (Β) Περιτοναϊκή MACs-Τ-BCG τοποθετήθηκαν σε ραχιαίο δέρμα πληγή των ποντικών που έλαβαν από του στόματος με L-NAME (0,2 g /kg ποντικού), α: ρ & lt? 0,0001 έναντι PBS-Gli, b: ρ & lt? 0,01 vs MAC-T -BCG ελέγχου.

η

Όταν το τραύμα ραχιαίο δέρμα παρήχθη σε ποντικούς πίνοντας το ΝΟ αναστολέα L-NAME, η επιφάνεια του τραύματος ελαττώθηκε σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. MACs-T-BCG προσθήκης επάγεται επίσης την επιτάχυνση της αποκατάστασης τραύματος. Εκτός αυτού, MACs-T-BCG προσθήκης βελτίωσε την επισκευή πληγής όταν ποντικοί έλαβαν L-ΝΑΜΕ από το στόμα (Σχ. 5Β).

FGF-2 μεσολαβεί στην διεγερτική δράση του BCG-ενεργοποιημένων μακροφάγων σε ινοβλάστες

έχει αποδειχθεί ότι ο FGF-2 είναι ένας από τους κύριους παράγοντες ανάπτυξης που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών [20]. Εκτός αυτού, έχει αποδειχθεί ότι ο FGF-2 είναι σε θέση να αναστέλλουν την απόπτωση σε κύτταρα ΝΙΗ-3Τ3 που έλαβαν θεραπεία με φάρμακα χημειοθεραπείας [21]. Έτσι έχουμε υποθέσει ότι ο FGF-2 θα μπορούσε να είναι μία από τις διαλυτές παράγοντες που εκκρίνονται από ενεργοποιημένα τα MAC σε θέση να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών. Για να επιβεβαιώσετε αυτήν την ιδέα, πρέπει πρώτα να αναλυθεί αν ο FGF-2 διαμορφώνεται στα MAC RAW 264.7 κύτταρα υπό θεραπεία με BCG. Το Σχήμα 6Α δείχνει, με χρώση ανοσοφθορισμού, ότι ο FGF-2 είναι αυξημένη στα MAC RAW 264,7 σε επεξεργασία με BCG σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα. Αυτό παρατηρήθηκε επίσης και με δοκιμασία κηλίδος western (Σχήμα 6Β), όπου μπορεί να δει κανείς μια ζώνη από 17.2 kDa είναι συμβατό με τις εκκριτική FGF-2. Συγκροτήματα του υψηλότερου μοριακού βάρους αντιπροσωπεύει μη-εκκριτικά FGF-2. Στη συνέχεια πραγματοποιείται μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού με CM που προέρχεται από RAW 264.7 ενεργοποιημένα με BCG, εξαντλημένο ή όχι του FGF-2. CM από RAW 264,7 σε επεξεργασία με BCG αυξημένο πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών, ενώ η εξάντληση των FGF-2, μείωσε σημαντικά τη διέγερση των ινοβλαστών, γεγονός που υποδηλώνει ότι το BCG ενεργοποιούμενη MACs μπορούσε να επάγει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών, τουλάχιστον εν μέρει, από την έκκριση FGF-2. Οι ινοβλάστες μεταναστεύουν εντός του τραύματος, όπου πολλαπλασιάζονται και παράγουν μεγάλες ποσότητες εξωκυτταρικής μήτρας. Μερικά ινοβλάστες differentiante σε μυοϊνοβλάστες, τα οποία είναι υπεύθυνα για την συστολή του τραύματος και την απόθεση των πρόσθετων μήτρας [22]. Για να αξιολογηθεί εάν τα MAC από ποντικών που φέρουν όγκο σε επεξεργασία με BCG είναι ικανά να επάγουν FGF-2 ίη νίνο, η έκφραση του FGF-2 αξιολογήθηκε είτε σε δοκιμασίες επούλωσης πληγών. Δίπλα, αξιολογήσαμε επίσης την έκφραση FGF-2 σε όγκους MB49. Οι ιστολογικές αναλύσεις από τις πληγές του δέρματος έδειξαν αυξημένη έκφραση του FGF-2 σε τραύματα με τα MAC-T-BCG. Όταν αυτά τα MAC, τοποθετήθηκαν μαζί με NO αναστολείς στις πληγές, η έκφραση FGF-2 παρέμεινε σε υψηλά επίπεδα (Σχ. 6D). Το υψηλό επίπεδο FGF-2 ήταν συνεπής με το αυξημένο ποσοστό ίασης που έδειξαν στο Σχ. 5. Εξάλλου, παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στην MB49 όγκους, όπου η έκφραση του FGF-2 ήταν υψηλότερη σε όγκους από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή είτε με BCG ή με L-NAME από ότι στους ελέγχους. Οι όγκοι που προέρχονται από ποντικούς που λαμβάνουν τη συνδυασμένη θεραπεία παρουσίασαν πιο εντοπισμένη και εντατική FGF-2 χρώση (Εικ. 6E). Σε αυτό το μοντέλο, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η FGF-2 συνδέεται με μηχανισμό BCG δράσης ανοσοθεραπείας.

(Α) χρώση ανοσοφθορισμού με αντι-FGF-2 αντισώματος της RAW 264.7 MAC, που έλαβαν θεραπεία με BCG (3 × 10

6 CFU /ml) για 24 ώρες. (Β) κηλίδας Western από προϊόντα λύσης RAW 264,7 σε επεξεργασία με BCG (3 χ 10

6 CFU /ml) για 8 και 24 ώρες. 20 ng καθαρισμένου FGF-2 ποντικού χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Σχετική επίπεδο έκφρασης κανονικοποιήθηκε προς GAPDH και αναφέρονται ως φορές μεταβολής του ελέγχου, α: ρ & lt? 0,05 (Γ) ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CM από κύτταρα RAW 264.7 προηγούμενη θεραπεία με BCG (3 χ 10

6 CFU /ml), L-NAME ή BCG συν L-ΝΑΜΕ για 24 ώρες. Έλεγχος διεξήχθη με εξαντλημένο μέσο καλλιέργειας (CM 3Τ3, από τα ίδια κύτταρα ΝΙΗ-3Τ3). 0,5 ng /ml FGF-2 σε CM 3Τ3 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. πολλαπλασιασμό ΝΙΗ-3Τ3 παρακολουθήθηκε από

3 (Η) ενσωμάτωση θυμιδίνης. Το CM προεπωάστηκε 1 ώρα με 10 μg /ml του αποκλεισμού μονοκλωνικού αντισώματος αντι FGF-2 (ϋΒ3), ή κανονική IgG ως μάρτυρα, ένα: ρ & lt? 0,001 vs CM ΝΙΗ-3Τ3, b: ρ & lt? 0,001 vs IgG. (Δ) Η ανοσοϊστοχημική χρώση για καθορισμένη έκφραση FGF-2 διεξήχθη σε πληγές του δέρματος. Τα τραύματα υπέστησαν αγωγή με περιτοναϊκή MACs από ποντικούς που φέρουν όγκο αγωγή ή όχι με BCG (MAC-Τ και MAC-Τ-BCG respectivesly) μόνο ή σε συνδυασμό με τοπικά καθόλου αναστολείς (Ε). Η ανοσοϊστοχημική χρώση του FGF-2 διεξήχθη σε s.c. MB49 όγκους από τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με BCG, L-NAME ή BCG συν L-NAME. Κλίμακα:.. Bar = 100 um

Η

Συζήτηση

Ενδοκυστική θεραπεία με BCG παίζει σημαντικό ρόλο στη θεραπεία και την προφύλαξη των επαναλαμβανόμενων μη-μυϊκή διηθητικό καρκίνωμα της ουροδόχου κύστης [23]

Shelley et al. [24] περιέγραψαν πρόσφατα σε μια μετα-ανάλυση της μελέτης ότι BCG χρησιμοποιείται ως ενισχυτικό μετά από διουρηθρική εκτομή μείωσε τον κίνδυνο υποτροπής κατά 67% στους 12 μήνες σε σύγκριση με μόνη διουρηθρική εκτομή? ωστόσο, ορισμένες παρενέργειες όπως κυστίτιδα, πυρετό και αιματουρία, συνδέθηκαν με τη χορήγηση BCG. Ο ακριβής μηχανισμός της αντικαρκινικής δραστηριότητας του BCG δεν είναι πλήρως κατανοητή, αλλά φαίνεται ότι το BCG αφορά τόσο τις άμεσες επιδράσεις στα κύτταρα του όγκου [16] και έμμεσες επιδράσεις που προκαλούνται από κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος [7].

Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι Wass BCG σε θέση να επάγουν την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων όγκου κύστης MB49 είτε in vitro ή εμβολιάστηκαν νίνο σε συγγενή ποντίκια ΝΟ που παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα MB49 αγωγή με BCG επαγόμενη MACs και σπληνοκύτταρα θάνατο, υποδεικνύοντας έτσι μία in vivo ανοσοκατασταλτική λειτουργία του ΝΟ. Τα πειράματά μας έδειξαν επίσης μια μεγαλύτερη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με BCG σε συνδυασμό με L-NAME σε σύγκριση με BCG μόνο. Στην πρώτη περίπτωση, ελάχιστα εναπομείναντα καρκινικά κύτταρα περιβάλλεται πλήρως από ίνες κολλαγόνου [11].

Στην παρούσα εργασία, ερευνούμε ορισμένοι από τους μηχανισμούς με τους οποίους BCG και L-NAME παράγουν την ουλή που περιγράψαμε προηγουμένως. Τα μονοπάτια σηματοδότησης ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ μελετηθεί ευρέως σε διαφορετικά μοντέλα. Αυτά ενεργοποιούνται από διάφορα ερεθίσματα όπως αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες [25], [26]. παρούσα ευρήματά μας δείχνουν ότι το BCG είναι σε θέση να επάγει άμεσα τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών ΝΙΗ-3Τ3 μέσω ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ μονοπάτια σηματοδότησης, έκφραση κολλαγόνου και της διαφοροποίησης των ινοβλαστών, όπως προσδιορίζεται με έκφραση α-SMA. Εκτός αυτού, ανοσοϊστοχημεία όγκων από BCG αγωγή ποντίκια, έδειξαν αυξημένη έκφραση των ινών κολλαγόνου και άλφα-SMA, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενεργοποίηση των ινοβλαστών θα μπορούσε επίσης να πραγματοποιηθεί.

Πιστεύουμε ότι BCG μπορεί να δράσει πάνω στο στρώμα που περιβάλλει τα καρκινικά κύτταρα που μπορεί να παραμένουν μετά την εκτομή του όγκου ή σε μια νέα αύξηση των όγκων. Έτσι, η κοινή δράση των ινοβλαστών και κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος ενεργοποιούνται από BCG και την άμεση δράση σε καρκινικά κύτταρα θα μειώσει τον κίνδυνο υποτροπής. Η συγκέντρωση του BCG που χρησιμοποιείται σε κάθε ενστάλαξη σε ασθενείς, είναι περίπου 10

7 CFU /ml (συνολικός όγκος 50 ml). Δεν γνωρίζουμε την ακριβή δόση που λαμβάνει το στρώμα, παρ ‘όλα αυτά, στα πειράματά μας χρησιμοποιούμε 3 × 10

6 CFU /ml, η οποία είναι η καλύτερη δόση που προκαλεί την proliferaton ινοβλαστών in vitro, είναι ένα χαμηλότερο σειρά από εκείνη που χρησιμοποιείται στην ενστάλαξη του ασθενούς. Έτσι, εικάζουν ότι οι ποσότητες BCG που απασχολούν in vitro είναι σχεδόν φυσιολογικά.

Είναι γνωστό ότι η βακτηριακή ερεθίσματα είναι ικανά να επάγουν την παραγωγή του ΝΟ στα MAC [27]. Εδώ δείξαμε ότι μετά τη θεραπεία με BCG, RAW 264.7 και Mac-T ήταν σε θέση να αυξήσει επίπεδα ΝΟ in vitro και in vivo, αντίστοιχα, και CM από RAW 264,7 αγωγή in vitro με BCG επαγόμενο πολλαπλασιασμό ινοβλαστών και αυξημένη έκφραση κολλαγόνου Ι. Λόγω της εμπλοκής του ΝΟ σε διάφορες πτυχές της φυσιολογικών και παθολογικών διαδικασιών, οι αναστολείς NOS έχουν αποκτήσει προεξοχή στους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην επούλωση των πληγών, στην αγγειογένεση και φλεγμονώδη απόκριση σε κυτοκίνες [28], [29], [30]. Από CM από τα MAC-T-BCG-L-NAME επάγεται τον υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού των ινοβλαστών, θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι σε αυτόν τον πληθυσμό κυττάρων, η αναστολή της ΝΟ επάγει την απελευθέρωση ορισμένων διαλυτών παραγόντων, σε θέση να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών και την ενεργοποίηση. Εκτός αυτού, δεν μπορούμε να απορρίψει ότι η αναστολή ΝΟ μπορεί επίσης να τροποποιήσει το πρότυπο έκκρισης αυτών των διαλυτών παραγόντων. Για τις γνώσεις μας, δεν υπάρχουν αναφορές που δείχνουν την αλληλεπίδραση μεταξύ Mac και ινοβλαστών στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Ωστόσο, σε συμφωνία με τα αποτελέσματα μας, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο πνευμονικής φυματίωσης, έχει περιγραφεί ενισχυμένο πολλαπλασιασμό των πνευμονικών ινοβλαστών με CM από τα κυψελιδικά μακροφάγα διεγείρονται με BCG [31]. Παράλληλα, παρατηρήσαμε συμφωνία μεταξύ της επίδρασης της θεραπείας in vivo του tumos κύστης και την δοκιμασία in vitro. Μια αξιοσημείωτη έκφραση των ινών κολλαγόνου και άλφα-SMA παρατηρήθηκε σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με BCG, L-NAME και BCG συν ί-ΝΑΜΕ, είναι το αποτέλεσμα εντονότερη με τη συνδυασμένη θεραπεία.

Ο ρόλος του ΝΟ στην δερματικής πολλαπλασιασμός ινοβλαστών έχει περιγραφεί προηγουμένως από τους Chen et al [32], ο οποίος πρότεινε ότι η αναστολή του πολλαπλασιασμού των δερματικών ινοβλαστών από υπεριώδες φως, θα μπορούσε να σχετίζεται με την αυξητική ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων iNOS και συνεπώς να ΝΟ υπερβολική έκκριση σε συμφωνώ με αυτά τα αποτελέσματα , μπορούμε να προτείνουμε ότι η παραγωγή ΝΟ είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του πολλαπλασιασμού των ινοβλαστών και ενεργοποίηση όταν BCG χρησιμοποιείται στη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Οι όγκοι και πληγές μοιράζονται μερικά εξαρτήματα, όπως το φλεγμονώδες περιβάλλον [22]. Ωστόσο, ενώ στις πληγές φλεγμονή είναι παροδική, σε όγκους η διαδικασία αυτή διαιωνίζεται στο χρόνο, την πραγματοποίηση αυτής της αναστροφής, ένα στόχο για τον έλεγχο της ανάπτυξης του όγκου. Το 1986, Dvorak αξίωσαν την έννοια της «όγκοι είναι πληγές που δεν επουλώνονται» και υπέθεσαν ότι η σύνθεση του στρώματος του όγκου μοιάζει με το ιστό κοκκοποίησης της επούλωσης του τραύματος του δέρματος, γεγονός που υποδηλώνει ότι επιθηλιακών όγκων προάγουν το σχηματισμό στρώματος τους ενεργοποιώντας το τραύμα επούλωση απόκριση του ξενιστή [22], [33]. Με βάση αυτή την υπόθεση, θα δημιουργείται μια δοκιμασία πληγή ραχιαίο δέρμα, για να αξιολογηθεί ο ρόλος των μακροφάγων υπό διαφορετικές θεραπείες σε ένα μοντέλο όπου οι ινοβλάστες έχουν μία λειτουργία κλειδί. Αξιολογήσαμε την ικανότητα του MAC,-T-BCG για να βοηθήσουν στην επούλωση των πληγών. Παρατηρήσαμε ότι η εξωγενής τα MAC-T επιτάχυνε τη διαδικασία επούλωσης, αλλά, αντιθέτως, τα MAC-Τ-BCG μειωμένο ρυθμό επούλωσης σε σύγκριση με τα MAC-T. Ωστόσο, υπό την παρουσία ενός αναστολέα ΟΧΙ, το κλείσιμο του τραύματος επιταχύνθηκε, υποδηλώνοντας ότι η ΝΟ που απελευθερώνεται από τα MAC-T-BCG καθυστερεί τη διαδικασία επούλωσης. Για να αξιολογηθεί ο ρόλος του ενδογενούς ΝΟ του ξενιστή, L-NAME χορηγήθηκε στοματικά σε πληγών που φέρουν τα ποντίκια, το κλείσιμο της πληγής ήταν σημαντικά υψηλότερη όταν τα MAC-T-BCG τοποθετήθηκαν στις πληγές. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι, εκτός από το ΝΟ που απελευθερώνεται πάνω στο τραύμα με τα MAC-T-BCG, άλλα κύτταρα που παράγουν ΝΟ σε ποντίκια που φέρουν τραύμα παίζουν αρνητικό ρόλο στη διαδικασία επούλωσης. Οι πληροφορίες που σχετίζονται με την δραστηριότητα του ΝΟ στην επούλωση των πληγών είναι αμφιλεγόμενη. Μερικοί συγγραφείς έχουν δείξει ότι το ΝΟ προκαλεί αγγειογόνο διεργασία αναγκαία για την καλή επούλωση [29], [34], ενώ άλλοι έχουν αποδείξει ότι η απόπτωση που επάγεται από το ΝΟ είναι ικανή να αναστέλλει την επούλωση του τραύματος [30]. Με βάση τα αποτελέσματά μας, μπορούμε να υποθέσουμε ότι ο ΝΟ που παράγεται από τα MAC-Τ-BCG ή από τα εναπομείναντα καρκινικά κύτταρα μπορεί να καθυστερήσει την αναδιοργάνωση του ιστού κατά τη διάρκεια της ανοσοθεραπείας με BCG.

Αποκλίνουσες λειτουργίες των αυξητικών παραγόντων, όπως FGF-2 ή ΤΟΡ-β, στην επούλωση πληγών και του καρκίνου έχουν επίσης αναφερθεί.