Αφηρημένο

Ο καρκίνος του τραχήλου (CC) προκαλείται από υψηλού κινδύνου ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων επιμονή λόγω της ανοσοκατασταλτικής μικροπεριβάλλον του όγκου προκαλούνται από τις κυτοκίνες. Κολπική μικροχλωρίδας καθορίζει την παρουσία ορισμένων κυτοκινών σε τοπικό επίπεδο. Εκτιμήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ του τραχήλου της μήτρας ποικιλομορφία μικροχλωρίδα και η ιστοπαθολογική διάγνωση κάθε σταδίου της CC, και αξιολογήσαμε τα επίπεδα του τραχήλου της μήτρας mRNA έκφραση της IL-4, IL-6, IL-10, ΤΟΡ-β1, TNF-α και ΙΡΝ-γ σε ολόκληρη η ιστοπαθολογική διάγνωση και συγκεκριμένες βακτηριακές ομάδες. Θα προσδιορίζεται η αυχενική μικροχλωρίδα με υψηλό αλληλουχίας απόδοση των 16S rDNA αναδιπλασιασμού και ταξινομούνται αλλού κοινότητας κατάσταση των τύπων (CST). Η μέση διαφορά αναλύσεις μεταξύ των α-ποικιλότητας και ιστοπαθολογική διάγνωση πραγματοποιήθηκαν, καθώς και μια ανάλυση της β-ποικιλότητας μέσα στην ιστολογική διάγνωση. έκφραση του τραχήλου της μήτρας mRNA κυτοκινών αναλύθηκε κατά μήκος των ΚΣΑ και τις ιστοπαθολογικές διαγνώσεις. Βρήκαμε μια σημαντική διαφορά στην πολυμορφία μικροχλωρίδα στο NCL-HPV αρνητικό γυναίκες vs εκείνα με πλακώδη ενδοεπιθηλιακή βλάβες (SIL) και CC (p = 0,006, p = 0,036) .Όταν β-ποικιλότητας αξιολογήθηκε, τα δείγματα CC έδειξαν την υψηλότερη διακύμανση μέσα ομάδες (p & lt? 0,0006) και η μεγαλύτερη απόσταση σε σύγκριση με αρνητικές NCL-HPV (p & lt? 0,00001). Το κυρίαρχο βακτήρια σε γυναίκες με φυσιολογική κυτταρολογία ήταν

L

.

crispatus

και

L

.

iners

, ενώ για SIL, ήταν

Sneathia spp

. και για CC,

Fusobacterium spp

. Βρήκαμε υψηλότερα διάμεση αυχενική επίπεδα IL-4 και ΤΟΡ-β1 mRNA στο CST κυριαρχείται από

Fusobacterium spp

. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αυχενική μικροχλωρίδα μπορεί να εμπλέκεται σε τραχήλου παθολογία καρκίνου. Περαιτέρω μελέτες κοόρτης που απαιτούνται για την επικύρωση αυτών των ευρημάτων

Παράθεση:. Audirac-Chalifour Α, Torres-Poveda Κ, Bahena Ρωμαϊκή Μ, Tellez-Sosa J, Martínez-Barnetche J, Cortina-Ceballos B, et al . (2016) του τραχήλου της μήτρας microbiome και κυτταροκινών προφίλ σε διάφορα στάδια της καρκίνο του τραχήλου: μια πιλοτική μελέτη. PLoS ONE 11 (4): e0153274. doi: 10.1371 /journal.pone.0153274

Επιμέλεια: Μαρία Λίνα Tornesello, Istituto Nazionale Tumori, Ιταλία

Ελήφθη: 4 Δεκέμβρη 2015? Αποδεκτές: 25 Μάρτη 2016? Δημοσιεύθηκε: 26 Απρ, 2016

Copyright: © 2016 Audirac-Chalifour et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από το Instituto Nacional de Salud Pública, το Μεξικό και επιχορηγήσεις από Consejo Nacional de Επιστήμης και Tecnología (ΜΧ) (CONACYT) Fondo Σεπτέμβριος CB -2011-01-169552, CONACYT-Fondo E0013 Apoyo complementario CATEDRAS-2014-C01-245520 και CONACYT-FONSEC SSA /IMSS /ISSSTE-2014-C01-234149, Μεξικό. Audirac-Chalifour ευχαριστεί το Consejo Nacional de Επιστήμης και Tecnología (CONACYT) για την υποτροφία MSc 2976418945. Κ Torres Poveda είναι CONACYT Research Fellow-Instituto Nacional de Salud Pública (INSP), Κουερναβάκα, Morelos, Μεξικό.

Οι ανταγωνιστικές ενδιαφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του τραχήλου (CC) είναι η τέταρτη πιο κοινός καρκίνος στις γυναίκες και η έβδομη συνολικά σε όλο τον κόσμο, με εκτιμώμενο 485 000 νέα. περιπτώσεις και 236 000 θανάτους το 2013. CC προκαλείται 6,9 εκατομμύρια αναπηρία ετών ζωής σταθμισμένων (DALYs) το 2013 [1], και ήταν η δεύτερη συνηθέστερη αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των γυναικών του Μεξικού το 2011 (10,4%) [2 ]. CC προκαλείται από μια επίμονη λοίμωξη με ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων υψηλού κινδύνου (HR-HPV). Ωστόσο, ένα HR-HPV λοίμωξη θεωρείται αναγκαία αλλά όχι επαρκής αιτία για την ανάπτυξη CC [3]. Μηχανικών παραγόντων, όπως η κολπική πλύση ή τη σεξουαλική επαφή, και βιολογικούς παράγοντες, όπως η βακτηριακή κολπίτιδα (VB) [4, 5], ή σεξουαλικά μεταδιδόμενων νοσημάτων (ΣΜΝ) [6] να αλλάξει το κολπικό μικροπεριβάλλον και έχουν χαρακτηριστεί ως συμπαράγοντες στην επιμονή της μια HPV λοίμωξη [7].

Η συντριπτική πλειοψηφία των HR-HPV μολυσμένων γυναικών δεν αναπτύσσουν ποτέ CC επειδή μια επαρκής ανοσολογική απόκριση είναι σε θέση να ελέγχουν τη μόλυνση και την πρόληψη της εξέλιξης της σε προκαρκινική αλλοίωση [8]. Αυτό υποδηλώνει ότι επιπρόσθετοι παράγοντες δρουν σε συνδυασμό με το HPV να επηρεάσουν τον κίνδυνο ανάπτυξης CC. Μέχρι στιγμής, οι ακόλουθες καθοριστικός παράγοντας συν-παράγοντες που έχουν συσχετισθεί με την εμφάνιση του CC: κοινωνικο-περιβαλλοντικούς παράγοντες (πολιτισμικοί φραγμοί, η ακραία φτώχεια, η κακή χώροι υγιεινής, και η περιορισμένη πρόσβαση στην υγειονομική περίθαλψη) [9], επιδημιολογικών παραγόντων (αριθμός γεννήσεων, τη χρήση από του στόματος αντισυλληπτικών για περισσότερα από πέντε χρόνια, πολλαπλούς σεξουαλικούς συντρόφους και το κάπνισμα) [10, 11], καθώς και γενετικοί παράγοντες που σχετίζονται με τον ξενιστή (πολυμορφισμοί στα γονίδια ανοσολογικής απόκρισης, τα οποία καθορίζουν μια ανεπαρκή ανοσολογική απάντηση και τοπική ανοσοκαταστολή) [12- 14] . Ως εκ τούτου, CC είναι μια σύνθετη πολυπαραγοντική νόσος, και απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να βελτιώσει την κατανόησή μας για την αιτιολογία της.

Έχει πρόσφατα προταθεί ότι ανώμαλη κολπική μικροχλωρίδα παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του τραχήλου της μήτρας νεοπλάσματος [15] . Μια επιδημιολογική μελέτη προσδιόρισε

Chlamydia trachomatis

ως συν-παράγοντας για την ανάπτυξη CC [16]. Ομοίως, άλλες μελέτες δείχνουν ότι ορισμένα είδη βακτηρίων φαίνεται να σχετίζεται με την ανάπτυξη άλλων μορφών καρκίνου, όπως ο καρκίνος του παχέος εντέρου? Αυτές οι μελέτες δείχνουν επίσης ότι διάφορα είδη βακτηρίων κατοικούν κατά προτίμηση περιοχές του όγκου [17, 18].

Υπάρχουν ακόμη πολλά κενά στις γνώσεις σχετικά με τη σχέση μεταξύ του κόλπου και του τραχήλου της μήτρας microbiomes και ανάπτυξη CC [19]. Βακτηριακή καλλιέργεια που βασίζεται σε στοιχεία δείχνουν ότι ορισμένοι δυνητικοί προ-ογκογόνο παθογόνα, τα οποία μπορούν να είναι μέλη των συμβιωτικών μικροχλωρίδας, συμβάλλουν στην έναρξη και την ανάπτυξη [20, 21] όγκου.

CC είναι μια μακρόχρονη ασθένεια, και εκεί είναι τα στάδια πριν από αυτό κατά τη διάρκεια της οποίας οι όροι του τραχήλου της μήτρας και του κόλπου περιβάλλον τροποποιημένα, συμπεριλαμβανομένων μοτίβο κολπική οξύτητα και κυτοκινών που οδηγούν σε μια τοπική κατάσταση ανοσοκαταστολής. Η παρουσία των Lactobacilli, ένα χαμηλό κολπικό ρΗ (& lt? 4,5) και αντιμικροβιακά πεπτίδια αποτελούν μέρος των μηχανισμών άμυνας που υπάρχουν στο κολπικό μικροπεριβάλλον [22]. Όταν παρουσιαστεί μια ανισορροπία του αμυντικού συστήματος, φυσικοχημικές αλλαγές προκύπτουν και παράγουν ιστολογικές μεταβολές του κολπικού βλεννογόνου και του τραχήλου της μήτρας επιθήλιο, το σύνολο των οποίων συνθήκες ένα επιλεκτική πίεση επί μικροβιοτικών [23]. Σε μια CC μικροπεριβάλλον, η παρουσία ανοσοκατασταλτικών κυτοκινών (ΤΟΡ-SS1, IL-10) ευνοεί το persistenceof λοίμωξης HPV [24, 25, 26, 27]. Οι περισσότερες μελέτες της γυναικείας microbiome γεννητικού συστήματος έχουν πραγματοποιηθεί στο κολπικό επίπεδο και λίγες μελέτες εμπλέκουν την αυχενική προφίλ μικροχλωρίδα και κυτοκίνης. Μια συγκριτική γενωμική ανάλυση του κολπικού microbiome εντόπισε αλλαγές στην πολυμορφία microbiota μεταξύ των γυναικών με γεννητικών ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV), με ή χωρίς βακτηριακή κολπίτιδα (BV) [28] και σε έγκυες γυναίκες [29]. Επιπλέον, έχει προταθεί ότι το κολπικό μικροβιακό οικοσύστημα και το προφίλ κυτοκίνης παίζουν ένα ρόλο στην προώθηση της τραχηλική δυσπλασία [30], δεδομένου ότι μια ανώμαλη κολπική μικροχλωρίδα έχει συσχετισθεί με την απόκτηση μιας λοίμωξης από HPV [31]. Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν διεξαχθεί σχετικά με την αυχενική microbiome ως τροποποιητής του HPV φυσικής ιστορίας σε σχέση με την ανάπτυξη των τραχηλικών αλλοιώσεων του τραχήλου της μήτρας και νεόπλασμα [32].

Θεωρώντας ότι έχει αποδειχθεί ότι συγκεκριμένα είδη του cervicovaginal μικροχλωρίδας ρυθμίζουν τη φλεγμονώδη ανοσολογική αντίδραση στο γυναικείο γεννητικό σύστημα των υγιών μαύρων της Νότιας Αφρικής γυναίκες [33], είναι πιθανό ότι η αυχενική microbiome εμπλέκεται στην προαγωγή της έκφρασης των ανοσοκατασταλτικών κυτοκινών [34] Εμείς έχουν υποθέσει ότι η μόλυνση HPV και η ανάπτυξη των SIL και CC συνδέονται με τις αλλαγές στην πολυμορφία μικροχλωρίδα και με μοτίβα έκφρασης κυτταροκινών στην αυχενική μοίρα. Η μελέτη μας εξέτασε τη σχέση μεταξύ του τραχήλου της μήτρας ποικιλομορφία microbiota και σύνθεση, σύμφωνα με μία ιστοπαθολογική διάγνωση κάθε σταδίου της φυσικής ιστορίας της CC, και οι τραχήλου επίπεδα έκφρασης της IL-4, IL-6, IL-10, ΤΟΡ-β1, TNF -α και IFN-γ mRNA.

Υλικό και Μέθοδοι

σχεδιασμός μελέτης και πληθυσμό

μια συγχρονική μελέτη διεξήχθη, χρησιμοποιώντας δείγματα από ένα βιολογικό τράπεζα χτίστηκε μεταξύ 2008 και 2011 από τα πρόσφατα κρούσματα της πλακώδους ενδοεπιθηλιακής βλάβες (SIL) (n = 268 HPV-θετικά δείγματα)? γυναίκες με αρνητικό Παπανικολάου και ένα κανονικό κολποσκόπηση ως μάρτυρες (n = 205, 81 του HPV-αρνητικά και 124 HPV-θετικά δείγματα), που έχουν προσληφθεί από την υγειονομική περίθαλψη Κέντρο Γυναικών στο κράτος Morelos (

Centro de Atención para la Salud de la Mujer del Estado de Morelos

) στο Μεξικό από τον Ιούνιο του 2008 και Νοέμβριο του 2011, καθώς και από τις περιπτώσεις του τραχήλου της μήτρας πλακώδες καρκίνωμα (n = 171 HPV-θετικά δείγματα), που προσλαμβάνονται από την Υπηρεσία Γυναικολογίας στο Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (Ίνκας) στην Πόλη του Μεξικού, μεταξύ Σεπτεμβρίου 2010 και τον Δεκέμβριο του 2011. η Βιοηθική και επιτροπές Ερευνών στο Ίνκας (αριθμός αναφοράς. Ίνκας /CC /326 /10CB /609) και στο Εθνικό Ινστιτούτο Δημόσιας Υγείας (

Instituto Nacional de Salud Pública

-INSP? αριθμός αναφοράς: CI814) ενέκρινε τη βασική μελέτη κατά την οποία χτίστηκε το βιολογικό τράπεζα. Επιπλέον, όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν την συγκατάθεση τους να χρησιμοποιούν βιολογικά δείγματα τους για περαιτέρω έρευνες. Κάθε θέμα έδωσε συνέντευξη για τον τρόπο ζωής, κοινωνικο-δημογραφικές και αναπαραγωγικούς παράγοντες που είναι γνωστό ότι σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο CC [12].

Για μεθοδολογικές ευκολία, επιλέξαμε 32 περιπτώσεις για αυτή τη μελέτη, μη τραχηλικών αλλοιώσεων (NCL : n = 10 HPV-αρνητικό? n = 10 HPV-θετικά), SILs (n = 4 HPV-θετικά) και CC (n = 8 HPV-θετικά). κριτήρια ένταξης για την επιλογή επιμέρους δείγμα που σχετίζονται με το ιατρικό ιστορικό ήταν: πρόσληψη του ασθενή την ίδια μέρα της εμμήνου ρύσεως (επτά postretirement έμμηνο ημέρες περίοδο), τη μη χρήση των douches και καμία σεξουαλική δραστηριότητα των προηγούμενων ημερών από τη δειγματοληψία. Επίσης, δεν έχουν τα αρχεία του αντιβιοτικού ή αντιμυκητιακή χρήση τις τελευταίες 30 ημέρες πριν από τη δειγματοληψία. Άλλα κριτήρια ένταξης περιλαμβάνονται: μοριακή HPV + διάγνωση? DNA και η καθαρότητα του RNA και την ακεραιότητα κατάλληλο για αλληλούχιση και ποσοτικοποίηση του mRNA από qRT-PCR, και να του Μεξικού με το μεξικάνικο τους γονείς και τους παππούδες να εξασφαλίσει παρόμοια καταγωγή. Το μόνο κριτήριο αποκλεισμού δεν έχουν επαρκή διαβάζει. «Θεωρήσαμε 1 000 ως το όριο, μετά την εκτέλεση της ανάλυσης βιοπληροφορικής ακολουθία. Τα κοινωνικο-δημογραφικά και αναπαραγωγικής-σεξουαλικά χαρακτηριστικά του υπό μελέτη πληθυσμού παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Όλα τα άτομα της μελέτης ήταν Μεξικού οι γυναίκες των οποίων η ηλικία κυμαινόταν 22-61 χρόνια. Υπήρξε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων αναφορικά με την αντισυλληπτική μέθοδο και το θετικό τεστ HPV. ασθενείς CC δεν ανέφεραν χρήση αντισυλληπτικών μεθόδων πιο συχνά από τους ασθενείς NCL. Όσον αφορά τις περιπτώσεις SIL, οι πιο διαδεδομένες HPV γονότυπων ήταν HR-HPV (μη-HPV16 ή 18), ενώ μεταξύ των ασθενών CC η πιο διαδεδομένη γονότυπο ήταν HPV 16.

Η

Χαρακτηριστικά του βιολογικά δείγματα τράπεζα

τα δείγματα ελήφθησαν από γυναικών τράχηλο επτά ημέρες μετά την έμμηνο ρύση απόσυρσης. Η βιολογική τράπεζα που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη αυτή αποτελείται από δείγματα DNA και cDNA που προέρχονται από το αυχενικό επιθηλιακά απόξεση επιχρίσματα από γυναίκες διαγιγνώσκονται με NCL και από φρέσκα κυττάρων βιοψίες από γυναίκες διαγιγνώσκονται με SIL και CC. Το γονιδιακό DNA εκχυλίζεται από καρκίνο του τραχήλου επιθηλιακά ξέσματα και βιοψίες προηγουμένως πέψη με πρωτεϊνάση Κ, με τη χρήση του γονιδιακού DNA Καθαρισμός Kit (Fermentas Life Sciences, Βίλνιους, Λιθουανία). ελήφθησαν όλα τα δυνατά μέτρα για να αποφευχθεί η διασταυρούμενη επιμόλυνση των δειγμάτων κατά την εκχύλιση του DNA. συγκέντρωση DNA και η καθαρότητα αξιολογήθηκε με Thermo Scientific NanoDropTM 1000 Φασματοφωτόμετρο (260/280) και η ακεραιότητα του DNA προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτές αγαρόζης 1%. Ολικό RNA απομονώθηκε από τα δείγματα του τραχήλου της μήτρας χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ από την Invitrogen. cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκε με την παρουσία 200 U Μ-ΜΙΛ αντίστροφης μεταγραφάσης και 2.5 ug ολικού RNA χρησιμοποιώντας πρότυπες συνθήκες. Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν σε ένα όγκο αντίδρασης 25 μL που περιέχει 1 μΙ cDNA, 0,2 mM dNTPs, 15 pmol από κάθε εκκινητή, 2,5 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης and1U ανασυνδυασμένης Taq πολυμεράσης DNA. Αστάρια για το ανθρώπινο καθαριότητας αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης GAPDH (450 pb) χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιώσει την ακεραιότητα του cDNA.

τραχήλου της μήτρας δείγματα είχαν προηγουμένως ελεγχθεί για τον ιό HPV. Viral θραυσμάτων DNA από τα δείγματα ενισχύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές συναινέσεως ΜΥ09 /ΜΥ11 [35], LIC1 /LIC2 [36], και GP5 /GP6 [37], που πλευρίζουν την περιοχή L1 του HPV του καψιδίου. PCR ενίσχυση του GAPDH (556pb) χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για την ποιότητα του DNA. Οι κυτταρικές σειρές που εκφράζουν HPV-16 (SiHa) και HPV-18 (HeLa) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι. Απιονισμένο H

2O χρησίμευσε ως αρνητικός μάρτυρας. Όλα τα προϊόντα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα ακρυλαμιδίου σε 6%. Τα θετικά δείγματα οπτικοποιήθηκαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1,5%. Η ζώνη DNA που λαμβάνεται εκχυλίζεται και καθαρίζεται με την MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany) και την αλληλουχία τους χρησιμοποιώντας την μέθοδο Sanger. Οι αλληλουχίες HPV αναλύθηκαν με BLAST. HPV κατηγοριοποιήθηκε σύμφωνα με φυλογενετική μοτίβα της σε είδη χαμηλού και υψηλού κινδύνου: HPV16 και HPV18. κατάσταση HPV επιβεβαιώθηκε με τη δοκιμασία ανίχνευσης ΥΕ ΙΙ HPV Anyplex

TM από Seegene

®, βασισμένο σε multiplex PCR πραγματικού χρόνου, Toce και ΥΠΔ τεχνολογία ζεύγη εκκινητών, σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. [38]

Ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Εγκρίθηκε από την έρευνα, τη δεοντολογία και τη βιοασφάλεια Επιτροπές σε INSP (CI: 1143). Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες

Ανάλυση της έκφρασης mRNA κυτοκίνης τραχήλου

Μια ενίσχυση qRT-PCR διεξήχθη εις διπλούν για την ανάλυση γονιδιακής έκφρασης με τους ακόλουθους ανιχνευτές TaqMan:. GAPDH (ID -Hs99999905_mL), IL-4 (ID-Hs00174122_mL), IL-6 (ID-Hs00174131_mL), IL-10 (ID-Hs00961622_mL), ΤΟΡ-β1 (ID-Hs00961622_mL), ΤΝΡ-α (ID-Hs00174128_mL) και IFN -γ (ID-Hs00174143_mL). Το μίγμα πολλαπλασιασμού παρασκευάστηκε με προσθήκη 100 ng από κάθε δείγμα cDNA σε ένα τελικό μίγμα αντίδρασης 10 μΐ που περιέχει 5 μΐ του TaqMan PCR Master Mix για έκφραση, 0,5 μΙ ιχνηλάτη και 3,5 μΙ ϋΝάσης ελεύθερης βαθμού νερό μοριακό. Οι κύκλοι ενίσχυσης (πραγματοποιείται σε ένα StepOnePlus ™ από την Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ήταν ως ακολούθως: 94 ° C για 10 λεπτά, 40 κύκλους στους 94 ° C επί ένα λεπτό, 54 ° C για ένα λεπτό, 72 ° C για ένα λεπτό και 30 δευτερόλεπτα που ακολουθείται από 72 ° C για 15 λεπτά. GAPDH χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει την ποσότητα της IL-4, IL-6, IL-10, το mRNA του ΤΟΡ-β1, TNF-α και ΙΡΝ-γ που υπάρχει σε κάθε δείγμα [39]. Μονοπυρηνικά κύτταρα του αίματος διεγερμένα με φυτοαιμαγλουτινίνη για 72 ώρες χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των δυναμικών καμπύλες φάσμα IL-4, IL-6, IL-10, ΤΟΡ-β1, TNF-α και IFN-γ έκφραση? όλα τυπικές καμπύλες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Το επίπεδο έκφρασης του mRNA για κάθε κυτοκίνης estudied υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας σχετική ποσοτικοποίηση με τη συγκριτική Ct (2-ΔCt) μέθοδο, λαμβάνοντας GAPDH ως το ενδογενές γονίδιο. Τα δείγματα αναλύθηκαν εις διπλούν.

αλληλούχιση υψηλής απόδοσης του 16S rDNA αμπλικόνια

ελήφθησαν

Αμπλικόνια του ~ 456 bp που περιέχει V3-V4 μεταβλητές περιοχές από 16S rRNA γονίδια για το DNA βιβλιοθήκες προετοιμασία. Εκκινητές 347F Forward 5′-GGAGGCAGCAGTRRGGAAT-3 ‘και 803R αντίστροφη 5′-CTACCRGGGTATCTAATCC-3’, που περιγράφεται από Nossa, χρησιμοποιήθηκαν [40]. Μια πρώτη, PCR πραγματοποιήθηκε με τις ακόλουθες συνθήκες: 50 ng του εκμαγείου από κάθε δείγμα DNA προστέθηκαν σε ένα τελικό μίγμα αντίδρασης 30 μΐ που περιέχει ρυθμιστικό αντίδρασης 1χ, 2,5 mM MgSO

4, 1 mM dNTP, 0.2 U Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) και 5 pmol /μL των εκκινητών. Το πρόγραμμα ενίσχυσης ήταν η ακόλουθη: 94 ° C για 3 λεπτά, στη συνέχεια 30 κύκλους στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 68 ° C για 30 δευτερόλεπτα, που ακολουθείται από 68 ° C για 5 λεπτά. Αμπλικόνια οπτικοποιήθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης σε 1%. Οι ζώνες του DNA που ελήφθησαν καθαρίστηκαν με MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany).

Αμπλικόνια επανα-ενισχύθηκαν και υποβάλλονται σε επεξεργασία με τα ίδια αρχικά τεμάχια που συνδέονται με προσαρμογέα A του πρωτοκόλλου 454 αλληλούχισης που ακολουθείται από μια 6- αναγνωριστικό multiplex mer και από το έναυσμα 347F. Ο αντίστροφος εκκινητής ήταν το ίδιο για όλες τις αντιδράσεις που συνδέονται με προσαρμογέα Β του πρωτοκόλλου 454 αλληλούχιση. Οι συνθήκες αντίδρασης ήταν ως ακολούθως: 0,0625 ng από κάθε δείγμα DNA σε ένα τελικό μίγμα αντίδρασης 30 μΐ που περιείχε 1Χ ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης, 2.5 mM θειικό μαγνήσιο

4, 1 mM dNTP, 0.2 U Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) και 5 pmol /μL εκκινητών 347F και 803R. κύκλοι ενίσχυσης ήταν οι εξής: 94 ° C για 3 λεπτά, στη συνέχεια 15 κύκλους στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 68 ° C για 30 δευτερόλεπτα, που ακολουθείται από 68 ° C για 5 λεπτά. ηλεκτροφόρηση γέλης διεξήχθη σε γέλη αγαρόζης σε 1,5% για να απεικονίσει την ακεραιότητα των ενισχυμένων προϊόντων. DNA θραύσματα καθαρίστηκαν με MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany) και στη συνέχεια ποσοτικοποιούνται και να αξιολογούνται. Αμπλικόνια συνενώθηκαν σε οκτώ βιβλιοθήκες και αναμιγνύονται σε ισομοριακή τρόπο. Στη συνέχεια, οι βιβλιοθήκες καθαρίστηκαν με Ampurebeads XP (Beckman Coulter, Inc.). Υπολογισμός της τιτλοδότησης και απόδοση Γαλάκτωμα PCR στη συνέχεια διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί ο όγκος των σφαιριδίων για να φορτώσει σε πλάκες προσδιορισμού αλληλουχίας. Στη συνέχεια, η μαζική αλληλούχιση εκτελέσθηκε επί της πλατφόρμας Γονιδίωμα Sequencer Titanium Roche-454 (AppliedScience).

Βιοπληροφορική ανάλυση

Οι πρώτες αλληλουχίες της περιοχής V3-V4 από το γονίδιο 16SrRNA παράγονται για κάθε αμπλικόνιο υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το συμπληρωματικό λογισμικό Roche-454, και * .sff αρχεία δημιουργήθηκαν. Υψηλής ποιότητας διαβάζει επιλέχθηκαν με βάση τα ακόλουθα κριτήρια: διαβάζει με περισσότερα από πέντε συνεχόμενες βάσεις με βαθμολογίες κάτω από 20 στην κλίμακα Qphred σε μια 30 βάσεις κινούνται παράθυρο απορρίφθηκαν. ποιοτικού ελέγχου (QC) εποπτεύεται με το σενάριο R Thomas Τζιρκ του που χρησιμοποιεί ένα fastq βιβλιοθήκη Quality.R να σχεδιάσετε τη διανομή της αξιολόγησης εκχωρηθεί σε κάθε βάση, σύμφωνα με τη θέση του σχετικά με την λογαριθμική κλίμακα Qphred [41]. Μόλις τα αρχεία και οι ακολουθίες της ποιότητας ελήφθησαν χωριστά από τις πρώτες * αρχεία .sff, αποπολύπλεξη διεξήχθη σε QIIME για τον εντοπισμό των ακολουθιών που ανήκουν σε κάθε δείγμα ανάλογα με το μοριακό αναγνωριστικό τους (MID) [42].

Οι ακολουθίες ήταν ομαδοποιούνται σε λειτουργικές ταξινομικές μονάδες (Otus) χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο PyNAST για την ευθυγράμμιση ακολουθίας. Όλες οι αλληλουχίες οι οποίες είχαν ομοιότητα 99% ή περισσότερο θεωρήθηκαν ένα ενιαίο OTU [43]. Μια αντιπροσωπευτική αλληλουχία του κάθε OTU επιλέχθηκε για αργότερα ταξινομική αναγνώριση. Taxa έχουν ανατεθεί με τον αλγόριθμο Uclust [44], χρησιμοποιώντας την Πράσινη βάση δεδομένων Genes (απελευθέρωση 99% το Μάιο του 2013) ως σημείο αναφοράς, έτσι ώστε κάθε αντιπροσωπευτική αλληλουχία ευθυγραμμίζονται με ομοιότητα 99% με μια αλληλουχία αναφοράς θα εκχωρηθεί το όνομα ίδιου είδους [ ,,,0],45].

Ακολουθίες που δεν ευθυγραμμίζονται με την αναφορά εξήχθησαν σε άλλο αρχείο για

de novo

συνέλευση και να εξεταστεί στο λογισμό ποικιλομορφία. Για να προσδιορίσετε αν σύνθεση μικροχλωρίδας ήταν σε θέση να συγκεντρώνονται δείγματα από τη διάγνωση, μια ανεξέλεγκτη ιεραρχική ομαδοποίηση με βάση την ανομοιότητα Bray Curtis μεταξύ OTU αφθονία του κάθε δείγματος (S1 πίνακα) πραγματοποιήθηκε με πακέτα R και παρίσταται ως Heatmap. Η Alpha ποικιλομορφία περιγράφηκε χρησιμοποιώντας ένα φυλογενετικό ποικιλομορφία (PD) όλο το δέντρο και τον υπολογισμό ενός δείκτη ποικιλότητας Shannon (H’) και αραίωσης τους. Ένας πίνακας απόσταση και τις κύριες συνιστώσες (PC) υπολογίστηκαν με UniFrac να καθορίσει βήτα ποικιλομορφία [46]. Επιπλέον, μια συντεταγμένη ανάλυση (PCoA) ήταν γράφημα με σενάρια QIIME και οπτικοποιούνται στο αυτοκράτορας [47].

Είμαστε κατατάσσονται σύνθεση μικροχλωρίδας σύμφωνα με την κοινοτική κατάσταση τύπου (ΚΣΑ) με βάση την κυρίαρχη taxa που βρέθηκαν στα δείγματα. Μια τραχήλου της μήτρας CST είναι ένα σύμπλεγμα από κοινότητα κρατών (σύνθεση των ειδών και της αφθονίας του τραχήλου της μήτρας κοινότητα) που είναι παρόμοια όσον αφορά τα είδη και τη σχετική αφθονία των παρατηρούμενων phylotypes [48]. Η ομαδοποίηση των κοινοτικών κρατών πραγματοποιήθηκε μέσω μιας ιεραρχικής ομαδοποίησης με βάση την ανομοιότητα Bray Curtis μεταξύ όλων των ζευγών των κοινοτικών κρατών και ένα μέσο σύνδεσης.

Η στατιστική ανάλυση

Οι σχετικές μεταβλητές συγκρίθηκαν μεταξύ NCL vs SIL και NCL vs CC, χρησιμοποιώντας το

χ

2 και Kruskal-Wallis test για τις κατηγορικές και συνεχείς μεταβλητές, αντίστοιχα. δοκιμές Τ-φοιτητής διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η μέση διαφορά μεταξύ του δείκτη ποικιλότητας Shannon ή το φυλογενετικό δένδρο ποικιλομορφία ολόκληρο και το ιστοπαθολογική διάγνωση. Μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η σχέση μεταξύ της ιστοπαθολογική διάγνωση και ο δείκτης ποικιλότητας Shannon και την ιστοπαθολογική διάγνωση (NCL ανεξάρτητα από την κατάσταση του HPV και SIL /CC) και PD όλο το δέντρο, ρυθμίζοντας ανάλογα με την ηλικία, ισοτιμία, η αντισυλληπτική μέθοδο και HPV-γονότυπο .

εκτιμώμενος κίνδυνος διαφορετικότητα άλφα ως αναλογία πιθανοτήτων (OR), με διάστημα εμπιστοσύνης 95% (CI). Η εκτιμώμενη μέση διαφορά των bits μονάδων (δείκτης ποικιλότητας Shannon) στο τράχηλο της μήτρας μεταξύ SIL ή CC και NCL ανεξάρτητα από την κατάσταση του HPV αξιολογήθηκε από μια γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης για την προσαρμογή ανάλογα με την ηλικία, η αντισυλληπτική μέθοδο και HPV-γονότυπο. Αξιολογήσαμε τη μεταβολή των σταθμισμένων αποστάσεων UniFrac χρησιμοποιώντας ένα τεστ Kruskal-Wallis για να ελέγξετε την ποικιλομορφία βήτα σε κάθε ιστοπαθολογική ομάδα διάγνωση. Μια δοκιμή Wilcoxon Mann-Whitney πραγματοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η στατιστική σημαντικότητα των σταθμισμένων αποστάσεων UniFrac μεταξύ SIL /CC vs NCL-HPV αρνητικό.

τραχήλου της μήτρας έκφραση της IL-4, IL-6, IL-10, TGF -β1, TNF-α και mRNA της IFN-γ αναλύθηκε με ιστοπαθολογική διάγνωση (NCL vs SIL και NCL vs CC) χρησιμοποιώντας το τεστ Wilcoxon Mann-Whitney. Τραχήλου της μήτρας έκφραση της IL-4, IL-6, IL-10, ΤΟΡ-β1, TNF-α και IFN-γ mRNA αναλύθηκε σε όλη συστάδες CST με τη βοήθεια της δοκιμής Kruskall Wallis. Τέλος, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις άμεση συσχέτιση μεταξύ του δείκτη ποικιλότητας Shannon και αυχενικής έκφραση της IL-4, IL-6, IL-10, ΤΟΡ-β1, TNF-α και mRNA της ΙΡΝ-γ. Πραγματοποιήσαμε όλες τις στατιστικές αναλύσεις με τη χρήση Stata στατιστικό λογισμικό, έκδοση 13.0 (StataCorp, Σταθμός Κολάζ, TX, USA).

Αποτελέσματα

Γενική μοτίβο των αυχενικών κοινοτήτων δείγμα

Μετά QC, υπήρχαν 311.863 υψηλής ποιότητας διαβάζει κατανέμονται άνισα μέσα από τα δείγματα. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, 1000 τυχαία υπο-δείγματα ελήφθησαν από τα ανεπεξέργαστα δεδομένα της κάθε δείγμα, και χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση περαιτέρω βιοπληροφορική. καμπύλες ποικιλομορφία της Alpha αραίωσης (σχήμα Α στο S1 αρχείου) δείχνουν ότι μετά τον υπολογισμό H’in περισσότερα από 400 διαβάζει, ποικιλομορφία υπο-δείγμα δεν αυξάνει? Ως εκ τούτου, 1.000 αλληλουχίες είχε αρκετό βάθος ανάλυση αλληλουχίας για αυτή τη μελέτη. Από την χωρίς επίβλεψη heatmap (Σχήμα 1), δείγματα από το σύμπλεγμα NCL μαζί και ανεξάρτητα από την κατάσταση του HPV, έδειξαν ότι ο HPV-αρνητικές γυναίκες είχαν υψηλότερο ποσοστό

Lactobacillus crispatus

(46%) και ένα μικρότερο από

Lactobacillus iners

(14,9%), ενώ HPV-θετικές γυναίκες είχαν αναλογίες 13,3% και 2,1%, αντίστοιχα. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα ποσοστά αυτά φάνηκε να στραφούν με την παρουσία του HPV. Επιπλέον,

L

.

crispatus

βρέθηκε σε μικρότερες αναλογίες στο SIL (14,4%) και CC (1,3%), ενώ

L

.

iners

μειώθηκε στο 2,1% το SIL και δεν ανιχνεύθηκε σε CC.

Ανεξέλεγκτη heatmap της σχετικής αφθονίας των μικροβιακών taxa που βρέθηκαν στην αυχενική μικροβιακές κοινότητες των 29 ατόμων, που βασίζεται στο Bray Curtis ανομοιότητας μετρικό. Τα είδη που υπάρχουν στην σχετική αφθονία του 1% σε τουλάχιστον ένα δείγμα που απαριθμούνται στον άξονα Χ. Η πρώτη γραμμή στην αριστερή πλευρά αντιπροσωπεύει την αγωγή ως εξής: κόκκινο-HPV-αρνητικό, χωρίς βλάβη? μπλε-HPV-θετικών χωρίς βλάβη? πορτοκαλί-πλακώδη ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση του τραχήλου της μήτρας? πράσινο-καρκίνου του τραχήλου. CST απεικονίζονται στο δεύτερο αριστερό barside? ροζ-CST III, που κυριαρχείται από

Pseudomonas οΙθονοΓθηε

? κυανό-CST II κυριαρχείται από

L

.

iners

? πορτοκαλί-CST I κυριαρχείται από

L

.

crispatus

? πράσινο-CST IV κυριαρχείται από

Sneathia

? μπλε-CST V κυριαρχείται από

G

.

vaginalis

? κίτρινο-CST VIII κυριαρχείται από

Fusobacterium spp

.? κόκκινο-CST VI κυριαρχείται από

S

.

agalactiae

, και μοβ-CST VII κυριαρχείται από

Fusobacterium necrophorum

. Δείγμα ονόματα εμφανίζονται στη δεξιά πλευρά του γραφήματος. Οι cladograms στην κορυφή των ονομάτων είδους δείχνουν τα κατά προσέγγιση εξελικτικών σχέσεων μεταξύ των ειδών. CST: κράτος μέλος της Κοινότητας Τύπος. DX:. Ιστοπαθολογική διάγνωση

Η

Άλλα είδη

Lactobacillus

,

L

.

jensenii

και

L

.

vaginalis

βρέθηκαν μόνο σε δείγματα από γυναίκες με NCL.

Gardnerella vaginalis

βρέθηκε κυρίως σε HPV-αρνητικές γυναίκες με NCL (11,5%) και μειώθηκε σταδιακά κατά μήκος των HPV-θετικών (6,9%), SIL (8,1%) και CC (3,3%) ομάδες.

S

.

agalactiae

αντιπροσώπευαν πάνω από το 90% της σύνθεσης μικροχλωρίδας των δύο από τα δείγματα.

Pseudomonas οΙθονοΓθηε

παρατηρήθηκε σε σχετική αφθονία του 19% μόνο μεταξύ HPV-θετικές γυναίκες με NCL. Τα βακτήρια από το

Fusobacteriales

ώστε βρέθηκαν μόνο στις ομάδες SIL και CC. Στην ομάδα SIL,

Fusobacterium spp

. εμφανίζεται μια σχετική αφθονία του 6,3%?

Sneathia spp

, 26,6%.?

Shuttleworhia satelles

, 8,7%? και

Megasphaera elsdenii

, 10,4%? ενώ η σχετική αφθονία των ίδιων μικροοργανισμών στην ομάδα CC είχε ως εξής: 14%, 12,9%, 0% και 2,2%, αντίστοιχα.

Fusobacterium necrophorum

παρατηρήθηκε μόνο στην ομάδα CC (14,2%). Αυτό επισημαίνει το γεγονός ότι η πολυμορφία μικροχλωρίδα και η σύνθεση είναι διαφορετική μεταξύ των αναλύονται ομάδες. Για να επιβεβαιωθεί αυτό, άλφα και βήτα ποικιλομορφία αναλύθηκαν.

Οι τραχήλου της μήτρας κοινότητες ταξινομήθηκαν σε οκτώ ΚΣΑ, σύμφωνα με τις κυρίαρχες βακτήρια, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. ΚΣΑ μπορώ isdominated από

L

.

crispatus

(21%), CST II από

L

.

iners

(17%), CST III από

Pseudomonas οΙθονοΓθηε

(10%), CST IV από

Sneathia spp

. (17%), CST V με

G

.

vaginalis

(7%), CST VI από

Streptococcus agalactiae

(7%), CST, VII από

F

.

necrophorum

(7%), και CST VIII από

Fusobacterium spp

. (14%). Εκτός από CST VI, όλα τα δείγματα ήταν συγκεντρωμένα σύμφωνα με την ιστοπαθολογική διάγνωση. CST Ήμουν αποτελείται κυρίως από HPV-αρνητικών γυναικών με NCL? CST ΙΙ και ΙΙΙ ήταν κατά κύριο λόγο αποτελείται από HPV-θετικές γυναίκες με NCL? CST IV ήταν κατά κύριο λόγο αποτελείται από περιπτώσεις SIL? CST V αποτελείται κυρίως από γυναίκες με NCL, ανεξάρτητα από την κατάσταση του HPV τους? CST VIII αποτελούνταν κυρίως από τις περιπτώσεις CC, και CST VII περιλαμβάνονται μόνο περιπτώσεις CC (Εικόνα 2).

Bar διάγραμμα της σχετικής αφθονίας των ειδών ανά ομάδα.

Η

σύγκριση του τραχήλου της μήτρας ποικιλομορφία μικροχλωρίδας σε όλη στάδια CC

Άλφα ποικιλομορφία.

Ακόμα κι αν οι καμπύλες αραίωσης για τον δείκτη Shannon (Σχήμα Α στο S1 File) έδειξε μια υψηλότερη ποικιλομορφία στις ομάδες CC και SIL από ό, τι μεταξύ των οι HPV-αρνητικά και -θετικό γυναίκες με NCL, βρήκαμε ότι η ποικιλομορφία αυτή καθαυτή, η οποία αντιπροσωπεύει μόνο για τον πλούτο και τη σχετική αφθονία, δεν αρκεί για να καθορίσει το στάδιο της developmentof CC. Παρ ‘όλα αυτά, όταν πρόκειται για δείκτες που θεωρούν φυλογενετικές μετρήσεις ως PD όλο το δέντρο, βρήκαμε μια σημαντική διαφορά όσον αφορά την φυλογενετική ποικιλία μεταξύ HPV-αρνητικών NCL και SIL και μεταξύ των HPV-αρνητικών NCL και CC (σελ τιμές: 0.006 και 0.036, αντίστοιχα) (Πίνακας 3). Με άλλα λόγια, η σύνθεση της αυχενικής μικροχλωρίδας είναι διαφορετική μεταξύ των ομάδων. Τα οικόπεδα κουτί στο σχήμα 3 δείχνουν την κατανομή του δείκτη ποικιλότητας Shannon και ολόκληρο το δέντρο PD σε όλη την ιστοπαθολογική ομάδες διάγνωση. Ο δείκτης ποικιλότητας Shannon παρουσιάζει αυξητική τάση, αλλά αυτό δεν είναι σημαντικό. Η όλη δέντρο PD δείχνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ του HPV-αρνητικών NCL και SIL και μεταξύ των HPV-αρνητικών NCL και CC. SIL και CC ομάδες εμφανίσει τα πιο διαφορετικά τραχήλου της μήτρας μικροχλωρίδας. Δεν βρήκαμε σύνδεσης μεταξύ της ιστοπαθολογική διάγνωση και ο δείκτης ποικιλότητας Shannon (NCL ανεξάρτητα από την κατάσταση του HPV και SIL /CC), ούτε μεταξύ του PD ολόκληρο το δέντρο και την ιστοπαθολογική διάγνωση, σύμφωνα με την ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης (Πίνακας 4). Κατά την αξιολόγηση της συσχέτισης μεταξύ του δείκτη Shannon ποικιλομορφία για τα δείγματα του τραχήλου της μήτρας microbiome και την ιστοπαθολογική διάγνωση, η μέση εκτιμώμενη διαφορά των μονάδων λίγο μεταξύ CC και NCL ήταν 1,11 (95% CI, 0,057 – 2,165 (p = 0,04) (Πίνακας 5) . Αυτό επιβεβαιώνει ότι η διαφορετικότητα μικροχλωρίδας σε περιπτώσεις CC είναι υψηλότερη από ό, τι στην ομάδα NCL.

Οι Boxplots δείχνουν την κατανομή της η ‘(μονάδες bit) και τιμών PD σε όλα τα δείγματα.

η

η

β-ποικιλότητας.

η PCoA οδηγεί σταθερά έδειξαν ότι η αυχενική microbiome είναι ιδιαίτερα διαφορετική σε κάθε στάδιο της φυσικής ιστορίας των CC (Εικόνα 4Α). οι τρεις υπολογιστές, όπου απεικονίζονται σε 2D για σύγκριση ανά ζεύγος? PC1 αντιπροσώπευαν το 33,44% της διακύμανσης μεταξύ των δειγμάτων? PC2 για 26,85% και PC3 για 10,38% η παρουσία του

Fusobacterium spp

,

Sneathia spp

. και

Megasphaera spp

. σχετιζόταν με PC1. Η παρουσία του

Bifidobacteria spp

. και

Pseudomonas spp

. σχετιζόταν με PC2. Η απουσία του

Pseudomonas spp

.,

Fusobacterium spp

. και η παρουσία βακτηρίων από το

Bifidobacteriaceae

οικογένεια σχετίζονταν με PC3, σύμφωνα με την μήτρα φόρτωσης υπολογίζονται παράγοντα (Πίνακας Α σε S1 File).

A. PCoA προφίλ του ιστοπαθολογική διάγνωση εμφανίζεται με σταθμισμένη αποστάσεις UniFrac. Κάθε αριθμός αντιπροσωπεύει ένα δείγμα χρωματισμένα σύμφωνα με ιστοπαθολογική διάγνωση. Κόκκινοι κύκλοι αντιπροσωπεύουν HPV αρνητικά δείγματα NCL? μπλε τετράγωνα αντιπροσωπεύουν HPV-θετικά δείγματα NCL? πορτοκαλί τρίγωνα αντιπροσωπεύουν SIL και πράσινα τρίγωνα αντιπροσωπεύουν CC. Α1. Κύριο συστατικό (PC) -1 αντιπροσώπευαν το 33,44% της διακύμανσης στη σύνθεση της μικροχλωρίδας λόγω της παρουσίας του

Sneathia spp

. και

Fusobacterium spp

. Α2. PC-2 αντιπροσώπευαν το 26,85% της διακύμανσης inthe σύνθεση της μικροχλωρίδας λόγω της παρουσίας του

Bifidobacteria spp

. και

Pseudomonas spp

. Α3. PC-3 αντιπροσώπευαν 10,38% της διακύμανσης στη σύνθεση της μικροχλωρίδας λόγω της παρουσίας του

Lactobacillus spp

. και

Streptococcus spp

. Β Β1. Μεταβολή της σταθμισμένης αποστάσεις UniFrac σε κάθε ιστολογικό ομάδα διάγνωση. Β2.