Αφηρημένο

Τα διάτομα είναι μία σημαντική κατηγορία των μονοκύτταρων φυκών που παράγουν βιοδραστικά πολυακόρεστα αλδεΰδες (PUAs) που διεγείρουν τις αμβλώσεις ή δυσπλασίες στους απογόνους των ασπόνδυλων που εκτίθενται σε αυτούς κατά τη διάρκεια της κύησης. Εδώ συγκρίνουμε τα αποτελέσματα της PUAs 2-

trans

, 4-

trans

-decadienal (DD), 2-

trans

, 4-

trans

-octadienal (OD) και 2-

trans

, 4-

trans

-heptadienal (HD) στο Α549 αδενοκαρκινώματος κυτταρικές σειρές πνεύμονα και του παχέος εντέρου COLO 205, και το κανονικό πνεύμονα /Δεκατιανό επιθηλιακά BEAS-2Β κυτταρική σειρά. Χρησιμοποιώντας τη βιωσιμότητα ΜΤΤ /μπλε Τρυπάνης δοκιμασίες, δείχνουμε ότι PUAs να έχει τοξική επίδραση τόσο Α549 και COLO 205 κύτταρα όγκου αλλά όχι φυσιολογικά κύτταρα BEAS-2Β. DD ήταν ο ισχυρότερος από τους τρεις PUAs δοκιμάστηκαν, σε όλα τα χρονικά διαστήματα θεωρούνται, αλλά HD ήταν τόσο ισχυρή όσο DD μετά από 48 ώρες. OD ήταν η λιγότερο δραστική από τις τρεις PUAs. Η επίδραση των τριών PUAs ήταν κάπως ισχυρότερη για τα κύτταρα Α549. Ως εκ τούτου, μελέτησε το θάνατο μονοπάτι δραστηριοποιείται στο Α549 που δείχνει ότι τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με DD ενεργοποιημένο νέκρωσης όγκων Factor Receptor 1 (TNFR1) και Fas Associated περιοχή θανάτου (FADD) που οδηγεί σε necroptosis μέσω σηματοδότησης της κασπάσης-3 χωρίς την ενεργοποίηση του μονοπατιού επιβίωσης Receptor-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης ( ΞΉΛΩΜΑ). Η οδός /FADD /κασπάσης TNFR1 παρατηρήθηκε επίσης με OD, αλλά μόνο μετά από 48 ώρες. Αυτό ήταν το μόνο PUA που ενεργοποιούνται ΠΕΕ, σύμφωνα με το εύρημα ότι OD προκαλεί λιγότερη ζημιά στο κύτταρο σε σύγκριση με DD και HD. Σε αντίθεση, τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με HD ενεργοποιήσει το /FADD μονοπάτι Fas /κασπάσης. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά ότι PUAs ενεργοποιεί ένα εξωγενή αποπτωτικό μηχανήματα σε αντίθεση με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα τα οποία ευνοούν την ενδογενή οδό θανάτου, χωρίς να επηρεάζει την βιωσιμότητα των φυσιολογικών κυττάρων από τον ίδιο τύπο ιστού. Τα ευρήματα αυτά έχουν ενδιαφέρουσες επιπτώσεις και από την οικολογική άποψη θεωρώντας ότι το HD είναι ένα από τα πιο κοινά PUAs παράγεται από διάτομα

Παράθεση:. Sansone C, Braca Α, Ercolesi Ε, Romano G, Palumbo Α, Casotti R, et al. (2014) διατόμων-λαμβανόμενα πολυακόρεστα αλδεΰδες ενεργοποιεί το κύτταρο Θάνατος σε ανθρώπινα καρκινικά γραμμές κυττάρων, αλλά όχι τα φυσιολογικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (7): e101220. doi: 10.1371 /journal.pone.0101220

Επιμέλεια: Srinivasa Μ Srinivasula, IISER-TVM, Ινδία

Ελήφθη: 14 του Γενάρη του 2014? Αποδεκτές: 4 Ιούνη 2014? Δημοσιεύθηκε: 3 Ιουλίου, 2014

Copyright: © 2014 Sansone et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Stazione Zoologica Anton Dohrn και από το ιταλικό Εθνικό Επιχειρησιακό Πρόγραμμα PON01_02093 Μελέτη των νέων τεχνολογιών και τεχνολογικών πλατφορμών για τη βελτίωση των διαδικασιών παραγωγής των δραστικών φαρμακευτικών ουσιών βιομηχανικού ενδιαφέροντος και αναζήτηση νέων βιοδραστικών μορίων από φυσικές πηγές. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι η συν-συγγραφέας Adrianna Ianora είναι ένα PLoS ONE ακαδημαϊκό editor, αλλά ότι αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE Editorial πολιτικές και κριτήρια.

Εισαγωγή

τα διάτομα είναι μικροσκοπικοί, μονοκύτταροι φύκια που αντιπροσωπεύουν κυρίαρχη φωτοσυνθετικοί οργανισμοί στους ωκεανούς του κόσμου. ευεργετικό ρόλο τους ως τροφή για grazers αμφισβητήθηκε πριν από μια δεκαετία μετά την ανακάλυψη ότι ορισμένα είδη διατόμων τερατογόνες ενώσεις όπως πολυακόρεστα αλδεΰδες (PUAs) που προκαλούν αμβλώσεις, γενετικές ανωμαλίες, κακή ανάπτυξη και υψηλή θνησιμότητα απογόνους εξοντωτική πλαγκτού και βενθικά ασπόνδυλα [ ,,,0],1] – [3]. PUAs είναι τα τελικά προϊόντα της λιποξυγενάσης /υδρο-λυάση μεταβολική οδό [4] ξεκίνησε από βλάβη στα κύτταρα φυκιών, όπως συμβαίνει μέσω της βόσκησης από τα αρπακτικά ζώα. βλάβη των κυττάρων ενεργοποιεί τα ένζυμα λιπάσης που ελευθερώνουν πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFA) από κυτταρικές μεμβράνες που αμέσως οξειδώνεται και διασπάται μέσα σε δευτερόλεπτα για να σχηματιστεί PUAs και μια πληθώρα άλλων ενώσεων που συλλογικά ονομάζονται oxylipins [4], [5]. Πολυάριθμες λειτουργίες έχουν προταθεί για PUAs όπως: Grazer άμυνα [6], [7]? αλληλοπάθειας [8], [9], κύτταρο σε κύτταρο σηματοδότηση [10], αντιβακτηριακή δραστηριότητα [11], [12], και ανθίζουν τερματισμού [13], [14]. Έτσι, οι ίδιες δευτερογενείς μεταβολίτες έχουν πολλαπλές λειτουργίες από τη βόσκηση άμυνα για να σηματοδοτήσει μορίων που μεσολαβούν αρκετές αλληλεπιδράσεις πλαγκτόν.

Πρώτα περιγράφονται στα θαλάσσια διάτομα από Miralto et al. [15], ο οποίος έδειξε ότι η PUAs 2-

trans,

4

cis

, 7-

cis

-decatrienal, 2-

trans

, 4-

trans

, 7-

cis

-decatrienal και 2-

trans

, 4,

trans

-decadienal (DD) συνελήφθη ανάπτυξης του εμβρύου σε κωπήποδα και αχινούς, και είχε αντιπολλαπλασιαστική και αποπτωτικά αποτελέσματα σχετικά με την ανθρώπινη κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος CaCo2. Διαδοχικά, οι δύο μελέτες εργαστηριακές και έχουν αποδείξει αρνητικές επιπτώσεις της διατροφής διατόμων για κωπηπόδων Grazer αναπαραγωγική επιτυχία [6], [16] – [19]. PUAs μπορεί να απορροφάται κατά την διάρκεια της ανάπτυξης των ωοκυττάρων και να περάσει τη μητέρα στο έμβρυο, ή μπορεί να δρουν απ ‘ευθείας επί των εμβρύων. Με όποια διαδρομή, η χρονική στιγμή της αναπαραγωγής σε σχέση με τις τοξικές αφθονία διατόμων θα έχει σημαντικές συνέπειες για τα ασπόνδυλα προσλήψεων [6].

Παρόμοιες ενώσεις που παράγονται από την υψηλότερη ανθοφόρα φυτά που πιστεύεται ότι παίζουν κεντρικό ρόλο στην άμυνα των φυτών διότι λειτουργούν ως χημικές ελκυστές (π.χ. φερομόνες, επικονιαστή έλξης) ή σήματα συναγερμού από επιθέσεις φυτοφάγα (π.χ. tritrophic αλληλεπιδράσεις) και προστατευτικών ενώσεων (αντιβακτηριακό, επούλωση των πληγών) [20]. oxylipins διατόμων δείχνουν επίσης μια υψηλή ομοιότητα με τις πτητικές οργανικές ενώσεις απελευθερώνονται από καφέ φύκια, που προτείνονται να εμπλέκονται στην χημική σηματοδότηση και φερομόνη έλξη μεταξύ των γαμετών διαφορετικού φύλου [20] και φαίνεται να είναι ενδιάμεσα για έμφυτη ανοσία [21].

το PUA DD είναι η καλύτερα μελετημένα μεταβολίτη αυτής της ομάδας και έχει καταστεί ένα μοντέλο αλδεΰδη για πειραματικές μελέτες σχετικά με τις επιδράσεις της oxylipins στους θαλάσσιους οργανισμούς (αναθεωρηθούν [1], [3]). Ωστόσο, έχουν πολλά θαλάσσια διάτομα έχει αποδειχθεί ότι παράγουν PUAs εκτός από DD, συμπεριλαμβανομένων των

Skeletonema marinoi

, μια σχηματίζοντας διατόμων κοσμοπολίτικη άνθιση που παράγει 2-

trans

, 4-

trans

-heptadienal (HD), 2-

trans

, 4-

trans

-octadienal (OD) και 2-

trans

, 4-

trans

, 7-οκτατριενάλη (οκτατριενάλη) [22], [23]. Από αυτές, η πιο κοινή είναι HD [13], [24]. Ceballos και Ianora [25] διεξήγαγαν πειράματα που εξετάζουν τις επιπτώσεις της DD, OD και HD σε κωπηπόδων αυγών εκκόλαψης επιτυχίας που δείχνουν ότι όσο περισσότερο το μήκος της αλυσίδας του PUAs, τόσο ισχυρότερη είναι η βιολογική δράση αυτών των μορίων, όπως επιβεβαιώνεται και από [26] σχετικά με βακτήρια, φύκη, μύκητες, εχινόδερμα, μαλάκια και μαλακόστρακα και [27] χρησιμοποιώντας τα αυγά αχινού θάλασσα. Ribalet et al. [9] διαπίστωσε επίσης εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση μείωση του ρυθμού αύξησης του θαλάσσιου φυτοπλαγκτού, που ανήκουν σε διαφορετικές ταξινομικές ομάδες, που εκτίθενται σε PUAs με μακρύτερης αλυσίδας αλδεΰδες έχουν ισχυρότερες επιπτώσεις στην ανάπτυξη από ό, τι μικρότερο αλυσίδας αλδεΰδες.

Εδώ συγκρίνουμε τα αποτελέσματα διαφορετικών PUAs, συμπεριλαμβανομένων DD, OD, και HD στο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή, αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου προέρχονται από μεταστατικό ασκίτη COLO 205 κυτταρική γραμμή, και τον πνεύμονα /brunch φυσιολογικά επιθηλιακά κυτταρική σειρά BEAS-2Β. PUAs είναι γνωστό ότι προκαλούν απόπτωση [15], [28] – [29], αλλά σε μια προηγούμενη μελέτη [6] είχαν δείξει να ασκούν δραματικές επιπτώσεις μόνο στην πολλαπλασιαζόμενα, μη διαφοροποιημένα κύτταρα. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται δύο εξαιρετικά επιθετική καρκινικών κυτταρικών σειρών για την καλύτερη κατανόηση των οδών που εμπλέκονται στον κυτταρικό θάνατο και μια κανονική να αξιολογήσει ένα υποθετικό συγκεκριμένη δράση κατά πολλαπλασιαζόμενων κυτταρικών τύπων. Ένας άλλος σημαντικός στόχος ήταν να συγκρίνει τα αποτελέσματα της DD, ένα μοντέλο PUA σε τοξικολογικές πειράματα, αλλά όχι το πιο κοινό PUA που υπάρχουν στο θαλάσσιο φυτοπλαγκτόν (σε μια έρευνα των 51 είδη θαλάσσιων διάτομα, DD ήταν το λιγότερο ανιχνεύεται PUA, [24]) με η πιο διαδεδομένη διατόμων PUAs HD και OD. Αυτά είναι πιο πιθανό να προκαλέσει ύπουλη (sensu [15]) αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα για πλαγκτονικά και βενθικά grazers

in situ

κατά τη διάρκεια φυσικών ανθίζει διατόμων, όπως αυτές που αναφέρθηκαν από [3] και εκεί παραπομπές.

Υλικό και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργειες και θεραπεία

Το Α549 (ATCC CCL185) αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου πνεύμονα και COLO 205 (ATCC CCL-222) αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου μεταστατικό ασκίτη-απορρέουν κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ ( τροποποιημένο μέσο του Dulbecco Eagle) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 μονάδες ml

-1 πενικιλλίνη και 100 μg ml

-1 στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο θάλαμο στους 37 ° C για την ανάπτυξη. Α549 και COLO 205 κύτταρα (2 χ 10

4 κύτταρα και

-1) σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκα και διατηρείται επί μία νύκτα για προσκόλληση. Την επόμενη ημέρα το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο με τρεις συγκεντρώσεις (2, 5 και 10 μΜ) για καθένα από τα τρία PUAs (DD, OD, και HD, Sigma-Aldrich Inc., Μιλάνο, Ιταλία) δοκιμάστηκαν? κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24, 48 και 72 ώρες. Μετά την επώαση, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα προσκολλημένα κύτταρα εξετάστηκαν για βιωσιμότητα. Α549 κύτταρα που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση πρωτεϊνών εξόρυξη /RNA και του κυτταρικού κύκλου 2 × 10

6 σπάρθηκαν σε τρυβλία Petri (διαμέτρου 90 mm) και αντιμετωπίζονται όπως αναφέρθηκε παραπάνω.

Σε ένα ανεξάρτητο πείραμα, κύτταρα Α549 (2 × 10

3 κύτταρα καλά-1) σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα και διατηρείται επί μία νύκτα για προσκόλληση. Την επόμενη ημέρα το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο με τρεις συγκεντρώσεις (2, 5 και 10 μΜ) για καθένα από τα τρία PUAs (DD, OD, και HD, Sigma-Aldrich Inc., Μιλάνο, Ιταλία) και δοκιμάστηκαν με κασπάση-3 αναστολέα (C

30Η

41FN

4O

12, SC-3075, Santa Cruz) σε 9,7 μΜ? κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24, 48 και 72 ώρες. Μετά τη θεραπεία αλδεΰδη, βιώσιμα κύτταρα εκτιμήθηκαν όπως περιγράφεται παρακάτω. Η BEAS-2Β (ATCC CRL-9609) του πνεύμονα /Δεκατιανό φυσιολογικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε ϋΜΕΜ (τροποποιημένο μέσο Eagle κατά Dulbecco) συμπληρωμένο με ορό 50% εμβρυϊκό ορό (FBS), 100 μονάδες ml

-1 πενικιλλίνη και 100 μg ml

-1 στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο θάλαμο στους 37 ° C για την ανάπτυξη. BEAS-2Β (2 × 10

3 κύτταρα και

-1) σπάρθηκε σε πλάκα 96 φρεατίων και διατηρήθηκε όλη τη νύκτα για προσκόλληση. Την επόμενη ημέρα το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο με τρεις συγκεντρώσεις (2, 5 και 10 μΜ) για καθένα από τα τρία PUAs (DD, OD, και HD, Sigma-Aldrich Inc., Μιλάνο, Ιταλία) δοκιμάστηκαν? κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24, 48 και 72 ώρες. Μετά την επώαση, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα προσκολλημένα κύτταρα εξετάστηκαν για βιωσιμότητα

δοκιμασίες Βιωσιμότητας

Πραγματοποιήσαμε δύο τύπους δοκιμασιών βιωσιμότητας:. ΜΤΤ και Trypan μπλε δοκιμασίας. Εμείς εδώ επιλέγουν να αντιπροσωπεύουν τις πιο σημαντικές δεδομένα που ελήφθησαν με ένα ή τον άλλο τύπο δοκιμής ανάλογα με τα χαρακτηριστικά των κατεργασμένων κυττάρων. Ειδικότερα φυσιολογικά κύτταρα (BEAS-2Β) που δεν επηρεάστηκαν από αγωγή PUAs (και ως εκ τούτου δεν υπήρχαν νεκρά κύτταρα) εξετάστηκαν με τη χρωματομετρική δοκιμασία ΜΤΤ ενώ 205 κύτταρα Α549 και COLO χρωματίστηκαν με μπλε τρυπάνης οποίο χρωματίζει μόνο τα νεκρά κύτταρα. Περαιτέρω, τα κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με PUAs παρουσία της κασπάσης-3 αναστολέα εξετάστηκαν επίσης με την δοκιμασία ΜΤΤ για αξιολόγηση της αναστολής της τοξικότητας.

Για Trypan blue, Α549 και COLO 205 κύτταρα (2 χ 10

4 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 24 φρεατίων και διατηρήθηκε όλη τη νύκτα για προσκόλληση με την παρουσία μέσου Dulbecco. Την επόμενη ημέρα, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 0, 2, 5 ή 10 μΜ DD, OD ή HD. Τα επεξεργασμένα κύτταρα επωάστηκαν για 24, 48 και 72 ώρες. Μετά την επώαση, το υπερκείμενο συλλέχθηκε και απορρίφθηκε, ενώ τα προσκολλημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα διάλυμα κυανού τρυπάνης 0,4% (Hyclone, Τμήμα αριθ: JRH27098) σύμφωνα με την δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου Dye [30]. Μετά το βάψιμο, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη, φυγοκεντρήθηκαν και το σφαιρίδιο πλύθηκε με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS)? 10 μΐ αυτού του διαλύματος τοποθετήθηκε σε ένα θάλαμο καταμέτρησης Burker. Μπλε κύτταρα (υποδεικνύοντας νεκρά κύτταρα) μετρήθηκαν σε κάθε περιοχή και σε σύγκριση με ελέγχους για τον υπολογισμό της βιωσιμότητας% των κυττάρων.

Για ΜΤΤ, Α549 και BEAS2B κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα (2 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο), μετά χρόνους θεραπείας, και επωάστηκαν με 10 μΙ (10 mg /ml) ΜΤΤ (3- [4,5-μεθυλοθειαζολ-2-υλ] -2,5-διφαινυλ-tetrazoliumbromide, Applichem A2231). Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετά αλδεΰδη (DD, OD, HD) θεραπείας αξιολογήθηκε με δοκιμασία φασματοφωτομετρική ΜΤΤ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και υπολογίζεται ως η αναλογία μεταξύ μέσης απορρόφησης (λ = 570 nm) του δείγματος και η μέση απορρόφηση ελέγχου και εκφράζεται ως ποσοστό βιωσιμότητας.

ακριδίνης πορτοκαλί /βρωμιούχου αιθιδίου διπλό τεστ χρώση για μορφολογική ανάλυση

Έλεγχος και επεξεργασία προσκολλημένα κύτταρα Α549 θρυψινοποιήθηκαν και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 500 g για 5 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν 3 χ με PBS και αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων ανιχνεύθηκαν με το πορτοκαλί βρωμιούχο αιθίδιο δοκιμή ακριδίνη /χρώση. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 25 μΙ χρωστικής (100 μg ml

-1 του πορτοκαλί ακριδίνης και 100 μg ml

-1 του βρωμιούχου αιθιδίου παρασκευάστηκε εντός PBS και αναμιγνύεται ήπια). 10 μλ βαμμένα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μια πλάκα μικροσκοπίου, καλύπτεται με καλυπτρίδα και εξετάστηκαν κάτω από ένα συνεστιακό μικροσκόπιο (Zeiss LSM 510, λέιζερ 488 με φίλτρο LP505 για το πράσινο φθορισμό? Λέιζερ 543 με LP 560 φίλτρο για κόκκινο φθορισμό) με 25 × στόχο. Ακριδίνης πορτοκαλί διεισδύει τόσο ζωντανών και νεκρών κυττάρων που εκπέμπουν πράσινο φθορισμό όταν παρεμβάλλονται σε κανονική δίκλωνο νουκλεϊκών οξέων (DNA) και κόκκινο φθορισμό όταν δεσμεύονται με κατεστραμμένα μονόκλωνα νουκλεϊκά οξέα. Βρωμιούχο αιθίδιο εισχωρεί μόνο τα νεκρά κύτταρα με κατεστραμμένο μεμβράνες που εκπέμπουν κόκκινο φθορισμό. Τέσσερις τύποι κυττάρων προσδιορίστηκαν σύμφωνα με το [31], με βάση εκπομπής φθορισμού και μορφολογικών πτυχή της χρωματίνης συμπύκνωση σε χρωματισμένων πυρήνων: (1) βιώσιμων κυττάρων με ομοιόμορφα φωτεινό πράσινο πυρήνες και οργανωμένη δομή (έλεγχος)? (2) πρώιμα αποπτωτικά κύτταρα με ακανόνιστο πράσινο πυρήνων με συμπυκνωμένη χρωματίνη και με αποπτωτικά σώματα βάφονται με κόκκινο, (3) αργά αποπτωτικά κύτταρα με πορτοκαλί σε κόκκινο πυρήνες με εξαιρετικά κατακερματισμένη χρωματίνης? (4) ομοιόμορφα πορτοκαλί σε κόκκινο πυρήνες με μια οργανωμένη δομή που αποδίδονται σε νεκρωτικές κύτταρα.

απομόνωση RNA και RT

2 Profiler PCR Πίνακες

Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα Α549 πλένονται σε ιστοκαλλιέργεια πιάτο προσθέτοντας ψυχρό PBS και αναταράσσοντας ελαφρά. Τα κύτταρα πλύθηκαν άμεσα σε ένα δίσκο καλλιέργειας με την προσθήκη 1 ml αντιδραστηρίου ΤπζοΙ (τεχνολογίες Life, κατ. 10296-010) ανά δίσκο διαμέτρου 10 cm και απόξεση με ξέστρο κυττάρων. RNA απομονώθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση του RNA και η καθαρότητα εκτιμήθηκε με τη χρήση του NanodroP nanophotomer (EuroClone). RNA (400 ng) υποβλήθηκε σε αντίστροφη αντίδραση μεταγραφής χρησιμοποιώντας το RT

2 πρώτα σετ σκέλος (Qiagen, cat.330401) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Για να εκτιμηθεί η έκφραση των αποπτωτικών γονιδίων, σε πραγματικό χρόνου ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής (qRT-PCR) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του RT

2 Profiler PCR Πίνακες κιτ (Qiagen, cat.330231). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για Α549 κυτταρική γραμμή κατεργάζεται με PUAs στα 5 μΜ συγκέντρωση για 2 ώρες χρόνο έκθεσης.

Οι πλάκες τρέχει σε μια VIIa 7 (Applied Biosystems 384 και μπλοκ), Πρότυπο Fast πρωτόκολλο PCR ποδηλασία με 10 μλ όγκους αντίδρασης. Οι συνθήκες κύκλων που χρησιμοποιήθηκαν ήταν – έναρξη 1 κύκλος στους 95,0 ° C για 10 λεπτά και ακολούθησε ενίσχυση για 40 κύκλους στους 95,0 ° C για 15 s και 60,0 ° C για 1 λεπτό. στοιχεία ενίσχυσης συλλέχθηκαν μέσω VIIa 7 RUO Λογισμικού (Applied Biosystems). Οι Ct τιμές αναλύθηκαν με PCR σε απευθείας σύνδεση λογισμικό ανάλυσης δεδομένων array (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen).

εξόρυξη Πρωτεΐνη

λύμα Α549 κυττάρων , μετά τη θεραπεία, παρασκευάστηκε με απόξεση των κυττάρων από κάθε τρυβλίο Petri σε 1 ml RIPA ρυθμιστικό λύσης (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,6, 5 mM EDTA, 0,5% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1 % SDS) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης (1 μΜ PMSF και Ολοκλήρωση δισκία κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, η Roche, Μόντσα, Ιταλία) και αναστολείς φωσφατάσης (πίνακες κοκτέιλ PhosSTOP, Roche). Το κυτταρόλυμα επωάστηκε σε πάγο για 15 λεπτά και στη συνέχεια διαυγάζεται με φυγοκέντρηση στα 14.000 g για 20 λεπτά. Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια πρωτεΐνη Bio-Rad Αντιδραστήριο Assay (Bio-Rad, Μιλάνο, Ιταλία) με αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) ως πρότυπο. Το εκχύλισμα πρωτεΐνη αποθηκεύτηκε στους – 80 ° C μέχρι τη χρήση

Ηλεκτροφόρηση

Πριν την ηλεκτροφόρηση, δείγματα πρωτεΐνης επωάστηκαν στους 100 ° C για 5 λεπτά.. Μετά 10% SDS-PAGE, τα πηκτώματα χρωματίστηκαν με Coomassie ή στυπώθηκαν σε νιτροκυτταρίνη μεμβράνη (Hybond, GE Healthcare). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε 1Χ αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS), με 0,1% Tween-20 με 5% β /ο άπαχο ξηρό γάλα, και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα πρωτογενή αντισώματα αραιωμένα σε 1Χ TBS, 0,1% Tween -20 με 5% BSA. Πρωτογενή αντισώματα ήταν από την Death Receptor Antibody Sampler Kit (Cell Signaling Technology, 8356S), συμπεριλαμβανομένων των αντι-TNFR1 (1:1000), αντι-TNFR2 (1:1000), αντι-FADD (1:1000), αντι-RIP (1 :1000), αντι-Ραδ /FasL (1:1000). Anti-ενεργό Cas-3 (1:1000) αγοράστηκε από BioVision. Θετικός έλεγχος ελήφθη με τη χρήση αντι-ακτίνης αντίσωμα (1:500) (Sigma). Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για κάθε πρωτεΐνη που αναλύθηκε. Εδώ μπορούμε να δείξουμε μόνο ένα αντιπροσωπευτικό gel για ακτίνη. Μετά την επώαση, οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές για 5 λεπτά το καθένα με 15 ml TBS /Tween και κατόπιν επωάστηκε με συζευγμένο με HRP αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα (1:2000, Cell Signaling Technology) με ήπια ανάδευση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση, οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές για 5 λεπτά το καθένα με 15 ml TBS /Tween. Κηλιδωμένη μεμβράνες ανοσοανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας ECL πρωθυπουργός δυτική αντιδραστηρίου κηλίδωσης ανίχνευσης (GE Healthcare). Πρωτεΐνες έγιναν ορατές με Amersham Hyperfilm (GE Healthcare). Η πυκνομετρική ανάλυση των ανοσοθετικών ζωνών διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό Image J.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Α549 κύτταρα συλλέχθηκαν από πλάκες χρησιμοποιώντας 1 κ.εκ. Τρυψίνης-ΕϋΤΑ (Lonza, Ιταλία), μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλης και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS, επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 1 mg ml

-1 RNase Α (Qiagen, Cat.19101), επωάστηκαν στους 37 ° C για 45 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίζονται με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ, 10 μg ml

-1) για 15 λεπτά. Η κατανομή του DNA μέσα στα κύτταρα στη συνέχεια εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (BD Biosciences Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). Το ποσοστό των κυττάρων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Η στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ των κατεργασμένων και των κυττάρων ελέγχου για μετρήσεις βιωσιμότητας των κυττάρων προσδιορίστηκαν με μονόδρομη ANOVA και της εξέτασης πολλαπλού Σύγκριση Dunn με σημαντικές τιμές ρ ≤0.05 χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego California USA).

δεδομένα γονιδιακή έκφραση αναλύθηκαν με δεδομένα συστοιχία PCR σε απευθείας σύνδεση λογισμικό ανάλυσης (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen). Τα ιστογράμματα δείχνουν σχετικές αναλογίες έκφραση των γονιδίων αναλύθηκαν σε σχέση με τους ελέγχους χωρίς PUAs. Μόνο έκφραση τιμές μεγαλύτερες από μια 1.55-πλάσια διαφορά σε σχέση με τους ελέγχους θεωρήθηκαν σημαντικές.

έκφραση ανοσοκηλίδωση πρωτεΐνης υπολογίστηκε ως το ποσοστό των ολοκλήρωμα έκταση του κάθε μονή ζώνη γέλης σε σχέση με το συνολικό εμβαδόν λωρίδα γέλης, που αντιπροσωπεύεται ως pixel. Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ των κατεργασμένων και των ελέγχων προσδιορίστηκαν με ανάλυση Τ-μαθητή με σημαντικές τιμές ρ ≤0.05. Δεδομένα σημαντικά διαφορετικές από τους ελέγχους, με τιμές ρ & lt?. 0.001 σημειώνονται με 2 αστερίσκους στα σχήματα

Αποτελέσματα

Η βιωσιμότητα των Α549 και COLO 205 καρκινικές κυτταρικές γραμμές, και φυσιολογικό κύτταρο BEAS-2Β γραμμή μετά την επεξεργασία με την δεκαδιενάλης PUA (DD)

Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α-1Β, η θεραπεία της Α549 και COLO 205 κύτταρα με 2, 5 ή 10 μΜ DD οδήγησε σε μια σημαντική δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε σύγκριση με τους ελέγχους (ρ & lt? 0,05). Μετά από 24 ώρες, μια μείωση στο ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων Α549 παρατηρήθηκε με όλες τις δόσεις που δοκιμάστηκαν (70%, 50% και 18% βιώσιμα κύτταρα σε συγκεντρώσεις 2, 5 και 10 μΜ DD, αντίστοιχα). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κύτταρα COLO 205 (80%, 44% και 26% βιώσιμα κύτταρα σε συγκεντρώσεις 2, 5 και 10 μΜ DD, αντίστοιχα). Μετά από 48 ώρες αγωγής, η περαιτέρω μείωση παρατηρήθηκε, ειδικά σε υψηλότερες συγκεντρώσεις DD των 5 και 10 μΜ για τα κύτταρα Α549? COLO 205 βιωσιμότητα μειώθηκε πιο αργά (67%, 43% και 23% βιώσιμα κύτταρα σε συγκεντρώσεις 2, 5 και 10 μΜ DD, αντίστοιχα). Στα 10 μΜ κύτταρα Α549 έδειξε εμφανή μορφολογικές αλλοιώσεις, όπως η απώλεια της προσκόλλησης επαφή με άλλα κύτταρα, καθώς και με το υπόστρωμα πλάκα. Μετά από 72 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 μειώθηκε στο 0% με 5 και 10 μΜ DD και έως 26% με 2 μΜ DD? βιωσιμότητα των κυττάρων COLO-205 ήταν 30%, 21% και 13% με 2, 5 και 10 μΜ DD, αντίστοιχα.

(D) Επίδραση του DD σε κυτταρική σειρά Α549 με την παρουσία του αναστολέα της κασπάσης-3 ( 9,7 μΜ). Ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων για Α549 και COLO 205 υπολογίζεται με το μπλε δοκιμασία βιωσιμότητας Trypan και για BEAS-2Β με τη δοκιμασία ΜΤΤ βιωσιμότητα. Οι τιμές αναφέρονται ως μέσος όρος ± Τ.Α σύγκριση με τους ελέγχους (100% βιωσιμότητα)? ▴ 2 μΜ? ▪ 5 μΜ, ♦ 10 μΜ.

Η

Η επεξεργασία των κυττάρων BEAS-2Β με 2, 5 ή 10 μΜ της ΑΔ δεν μείωσε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 1 C). Μετά από 24 ώρες θεραπείας DD BEAS-2Β βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε ελαφρά (74%, 65% και 85% βιώσιμα κύτταρα σε 2, 5 και 10 μΜ συγκεντρώσεις DD, αντίστοιχα), αλλά μετά από 48 και 72 ώρες η βιωσιμότητα των κυττάρων ανακτάται και ήταν συγκρίσιμη με τους μάρτυρες , υποδεικνύοντας ήπια τοξικά αποτελέσματα μετά από μόνο 24 ώρες. Τέλος, για να εκτιμηθεί η ειδική κυτταροτοξική δράση που καταγράφεται για το Α549 κυτταρική γραμμή, το πείραμα ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη υπό την παρουσία ενός αναστολέα κασπάσης-3 για όλες τις θεραπείες αλδεΰδη. Το Σχήμα 1D δείχνει ότι το ποσοστό της βιωσιμότητας των κυττάρων μπορεί να συγκριθεί με κύτταρα κατεργασμένα με PUAs χωρίς αναστολέα σε 2 μΜ? στα 5 και 10 μΜ υπάρχει μια βραδύτερη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε σύγκριση με τη θεραπεία χωρίς κασπάσης-3 αναστολέα μετά από 48 h (Σχήμα 1Α), αλλά μετά από 72 ώρες οι ίδιες συγκεντρώσεις προκάλεσε μια αύξηση σε κυτταρικό θάνατο.

η βιωσιμότητα των Α549 και COLO 205 καρκινικές κυτταρικές γραμμές και κανονικά κυτταρική σειρά BEAS-2Β μετά από θεραπεία με το PUA οκταδιενάλη (OD)

η επεξεργασία των κυττάρων Α549 με 2, 5 ή 10 μΜ OD ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με το χρόνο, ειδικά σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (10 μΜ), όταν η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σε 35% μετά από 72 ώρες (Σχ. 2Α). Στις 2 μΜ συγκεντρώσεις, η επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου μετά από 24 ώρες δεν ήταν σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με τους μάρτυρες, αλλά έγινε έτσι μετά από 72 ώρες (ρ & lt? 0,05). Ενώ COLO 205 κυττάρων βιωσιμότητας μετά από 24 ώρες δεν μειώθηκαν σημαντικά (Εικ. 2Β), κυτταροτοξικά αποτελέσματα έγινε ισχυρότερη μετά από 72 ώρες και για τις τρεις OD συγκεντρώσεις (60%, 60% και 41% βιώσιμα κύτταρα σε συγκεντρώσεις OD 2, 5 και 10 μΜ , αντίστοιχα, ρ & lt?. 0.05)

(D) Επίδραση της OD σε Α549 κυτταρική γραμμή υπό την παρουσία του αναστολέα κασπάσης-3 (9,7 μΜ). Ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων για Α549 και COLO 205 υπολογίζεται με το μπλε δοκιμασία βιωσιμότητας Trypan και για BEAS-2Β με τη δοκιμασία ΜΤΤ βιωσιμότητα. Οι τιμές αναφέρονται ως μέσος όρος ± Τ.Α σύγκριση με τους ελέγχους (100% βιωσιμότητα)? ▴ 2 μΜ? ▪ 5 μΜ, ♦ 10 μΜ.

Η

Η επεξεργασία των κυττάρων BEAS-2Β με 2 και 5 μΜ OD δεν μείωσε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα σε σύγκριση με τους ελέγχους μετά από 24, 48 και 72 ώρες (Σχ. 2C ), ενώ στα 10 μΜ OD, η βιωσιμότητα των κυττάρων BEAS-2B μειώθηκε ελαφρά μετά από 72 ώρες (75% βιώσιμα κύτταρα). Η επεξεργασία των κυττάρων Α549 με OD με την παρουσία του αναστολέα κασπάσης-3 δεν είχε ως αποτέλεσμα σημαντικές διαφορές στη βιωσιμότητα ποσοστό των κυττάρων (Σχ. 2D).

Η βιωσιμότητα των Α549 και COLO κυτταρικές σειρές 205 του καρκίνου και κανονική BEAS-2Β κυτταρική γραμμή μετά την αγωγή με το PUA επταδιενάλης (HD)

Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, η θεραπεία με 2, 5 και 10 μΜ HD σε κύτταρα Α549 πολλαπλασιασμό ελαφρώς ανέστειλε κύτταρο μετά από 24 ώρες, αλλά η επίδραση ήταν ακόμη σημαντικά διαφορετική σε σχέση με τους ελέγχους (ρ & lt? 0,05). Η επίδραση ήταν πιο εμφανής με το χρόνο. Ειδικότερα, στα 10 μΜ μόνο το 10% των κυττάρων ήταν βιώσιμα μετά από 48 ώρες και 0% μετά από 72 ώρες. θεραπεία HD σε COLO 205 κύτταρα προκάλεσε επίσης μία μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων, αλλά το αποτέλεσμα δεν ήταν τόσο ισχυρή όσο με κύτταρα Α549. Μετά από 48 και 72 ώρες (Εικ. 3Β), ένα σημαντικά τοξική επίδραση παρατηρήθηκε σε υψηλές συγκεντρώσεις HD (40% και 28% βιωσιμότητα των κυττάρων σε 10 μΜ HD).

(D) Επίδραση της HD στην κυτταρική Α549 γραμμή με την παρουσία του αναστολέα της κασπάσης-3 (9,7 μΜ). Ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων για Α549 και COLO 205 υπολογίζεται με το μπλε δοκιμασία βιωσιμότητας Trypan και για BEAS-2Β με τη δοκιμασία ΜΤΤ βιωσιμότητα. Οι τιμές αναφέρονται ως μέσος όρος ± Τ.Α σύγκριση με τους ελέγχους (100% βιωσιμότητα)? ▴ 2 μΜ? ▪ 5 μΜ, ♦ 10 μΜ.

Η

Όπως και στην περίπτωση του DD και OD, κατεργασία των κυττάρων BEAS-2Β με HD δεν προκάλεσε τοξικότητα (Σχ. 3C). Θεραπεία της Α549 κυττάρων με HD παρουσία του αναστολέα κασπάσης-3 δεν είχε ως αποτέλεσμα διαφορές σε ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων σε υψηλότερες συγκεντρώσεις HD (5 και 10 μΜ) (Σχ. 3D). Στις 2 μΜ, υπήρξε μια σημαντική αύξηση της θνησιμότητας των κυττάρων παρουσία της κασπάσης-3 αναστολέα μετά από 72 h (Σχήμα 3D).

Μορφολογικά αποτελέσματα της διατόμου PUAs DD, OD και HD σε κυτταρική σειρά Α549

για να παρατηρήσουμε μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα κατεργασμένα με DD, OD και HD και να επαληθεύουν εάν μειωμένη βιωσιμότητα μετά την αγωγή συσχετίστηκε με επαγωγή απόπτωσης, θα διπλασιάσει τα προετοιμασμένα κύτταρα με τις φθορίζουσες χρωστικές για τα νουκλεϊκά οξέα, ακριδίνη πορτοκαλί (AO) και βρωμιούχο αιθίδιο (ΕΟ) μετά από 48 ώρες θεραπείας. Τα βιώσιμα κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με έντονο πράσινο πυρήνες σε ανέπαφα κύτταρα (AO). Πρόωρη αποπτωτικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με ακανόνιστα δομημένα πράσινο πυρήνων με συμπυκνωμένη χρωματίνη και πορτοκαλί ή κόκκινο φως μπαλώματα. Αργά αποπτωτικά κύτταρα περιείχαν θετικά βάφονται πυρήνες με τα δύο χρώματα (ΕΒ και ΑΟ), εμφανίζονται πορτοκαλί ή κόκκινο φως σε συνδυασμό με αποπτωτικά σώματα. Πυρήνες νεκρωτικών κυττάρων είχαν άθικτο χρωματίνη και εμφανίστηκε κόκκινη. Όλες οι πυρήνες έλεγχος εμφανίστηκε πράσινο με ένα κανονικό σφαιρική δομή και την οργάνωση της χρωματίνης εκτός από μερικές γηρασμένα κύτταρα σε μια νεκρωτική στάδιο που έδειξε κόκκινη φθορίζουσα πυρήνες (Εικ. 4Α). Στα 10 μΜ DD, όλα τα κύτταρα βρίσκονταν στο στάδιο αργά απόπτωσης και χαρακτηρίστηκαν με κίτρινο-πορτοκαλί διπλή χρώση (ΑΟ /ΕΒ), λόγω συμπύκνωση χρωματίνης και απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης (Σχ. 4Β). Στα 10 μΜ OD, κυτταρική βλάβη ήταν λιγότερο προφανής με διακριτές αλλαγές στη μορφολογία και την παρουσία ερυθρών χρώσης σε μερικά κύτταρα, υποδεικνύοντας την πρόοδο σε απόπτωση των κυττάρων (βέλη στο Σχ. 4C). Στα 10 μΜ HD, η μορφολογία των κυττάρων ήταν ουσιαστικά μεταβληθεί με διασκορπισμένη χρωματίνη στους πυρήνες που εμφανίστηκε σε μεγέθυνση. Χαρακτηριστικά των καθυστερήσεων απόπτωσης όπως πυρηνική κατακερματισμός ήταν επίσης ορατή (βέλη στο Σχ. 4D).

Έλεγχος και επεξεργασία των κυττάρων διπλή χρώση με πορτοκαλί της ακριδίνης και βρωμιούχου αιθίδιο μετά από 48 μΜ DD, OD και HD παρατηρείται στο συνεστιακό μικροσκόπιο . Οι αριθμοί δείχνουν (1) φυσιολογικά κύτταρα? (2) πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων? (3) αργά αποπτωτικά κύτταρα? (4) νεκρωτικών κυττάρων (βλέπε υλικό και μεθόδους για λεπτομέρειες). Τα βέλη δείχνουν κυττάρων με κατακερματισμένο πυρήνες.

Η

ανοσοκηλίδας αναλύσεις των υποδοχέων θανάτου (TNFR1, TNFR2, RIP, FADD) και τελεστές (κασπάσης-3) στην Α549 κυτταρική γραμμή που έλαβαν θεραπεία με PUAs (DD, OD και HD )

Μετά από 24 ώρες θεραπείας, DD προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην έκφραση του Παράγοντα Νέκρωσης Ογκου Receptor 2 (TNFR2) ειδικά στα 5 και 10 μΜ, σε σύγκριση με ελέγχους, όπως αποκαλύπτεται με πυκνομετρική ανάλυση των φωτογραφικού φύλλου (Σχ. 5Α) της μεμβράνης ανοσοκηλίδωση. Αντιθέτως, οι παράγοντες που σχετίζονται υποδοχέα TNF (TRAF 1 και TRAF2) δεν ενεργοποιήθηκαν υποδεικνύοντας την απουσία μίας οδού επιβίωσης. Επιπλέον, DD προκάλεσε μια ενεργοποίηση των ΤΝΡΚ1 σε κύτταρα κατεργασμένα με 5 και 10 μΜ συγκεντρώσεις (Σχ. 5Α). Οι μεταγενέστεροι Fas-πρωτεΐνη που συνδέεται με πεδίου θανάτου (FADD) επίσης ισχυρά ενεργοποιημένο στα 10 μΜ συγκεντρώσεις, ενώ τα επίπεδα του υποδοχέα-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης (RIP) μειώθηκε δραματικά σε τρεις συγκεντρώσεις DD (Εικ. 5Α). Μείωση στην έκφραση του RIP αντιπροσωπεύει ένα πρώιμο θάνατο μονοπάτι σηματοδότησης όπως υποδεικνύεται από την απουσία των πρωτεϊνών προσαρμογέα όπως νέκρωσης όγκου τύπου υποδοχέα παράγοντα πρωτεΐνη 1-Associated πεδίου θανάτου (TRADD) ή TNF Υποδοχέα συναφείς παράγοντες TRAF1 και TRAF2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). DD ενεργοποιείται επίσης κασπάσης-3 επιβεβαιώνοντας κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης μετά από 24 ώρες (Σχ. 5Α). Άλλοι υποδοχείς θανάτου εμπλέκονται στην εξωγενή αποπτωτικό μονοπάτι (Fas, DR3, DR4, DR5), καθώς και ορισμένοι παράγοντες ενεργοποιούνται σε ενδογενή αποπτωτικά μονοπάτια (Akt1, Akt2, PARP, Apaf1) δεν εμπλέκεται στην κυτταρική απόκριση σε DD (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα ).

ανάλυση ανοσοστυπώματος δείχνουν ότι PUAs επάγει σηματοδότηση TNF μετά από 24 (ΑΔ και HD) και 48 ώρες (OD) της θεραπείας με την ακτίνη. Αστερίσκος υποδηλώνει σημαντική αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης μετρήθηκε. ** P ≤ 0,05 έναντι του ελέγχου? μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SD.

Η

Το ίδιο μονοπάτι παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία OD, αλλά μόνο μετά από 48 ώρες. έκφραση TNFR2 ελαφρώς αυξημένη σε σύγκριση με τους μάρτυρες, αλλά η διαφορά δεν ήταν σημαντική. TNFR1 και FADD έδειξαν σημαντική απόκριση στις υψηλότερες συγκεντρώσεις (5 και 10 μΜ) (Σχ. 5Β). Σε αντίθεση με DD, OD επεξεργασμένα κύτταρα έδειξαν μία ισχυρή και επίμονη έκφραση του RIP, υποδεικνύοντας την συνύπαρξη μιας επιβίωσης και του θανάτου σηματοδότησης απόκριση (Εικ. 5Β). Caspase-3 επίσης ενεργοποιείται με DD (Εικ. 5Β).

HD δεν αύξησε σημαντικά την έκφραση του TNFR2 (Σχ. 5C) και δεν ενεργοποιούν καμία απάντηση σε TNFR1 μετά από 24 ώρες και 48 ώρες. Μετά από 24 ώρες HD αύξησε έντονα την έκφραση του υποδοχέα Fas (Fas /FasL-Ligand System) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η μέγιστη επίδραση της HD σε Fas παρατηρήθηκε στα 5 και 10 μΜ συγκεντρώσεις (Σχ. 5C). HD αυξήθηκε επίσης έκφραση FADD και της ενεργοποιημένης κασπάσης-3 (Σχ. 5C). Αντίθετα, τα επίπεδα της RIP μειωθεί δραματικά μετά από 24 ώρες (Σχ. 5C). Επιπλέον, Apaf1 δεν αποκαλύφθηκε μετά τη θεραπεία HD στις 24 και 48 h (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

ανάλυση έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν για τους υποδοχείς θανάτου (TNFR1, TNFR2, RIP, FADD) και τελεστές (κασπάση-3, AIFM1) στην Α549 κυτταρική γραμμή που έλαβαν θεραπεία με PUAs (DD, OD και HD)

για να κατανοήσουμε καλύτερα τις τοξικές επιδράσεις σε μοριακό επίπεδο, τα κύτταρα Α549 αναλύθηκαν μετά από 2 ώρες θεραπείας PUAs επειδή όλες οι πρωτεΐνες για τις DD και HD είχαν ήδη εκφράσει και ενεργοποιείται μετά από 24 ώρες. Επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε 5 μΜ συγκέντρωση δεδομένου ότι σε υψηλότερες επιδράσεις συγκεντρώσεις ήταν πολύ σοβαρή.

γονίδια ελέγχου σε πραγματικό χρόνο qPCR ήταν ακτίνη-βήτα (ACTB), βήτα-2-μικροσφαιρίνη (Β2Μ), φωσφοριβοσυλτρανσφεράση της υποξανθίνης (HPRT1