Abstract

Ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) είναι μία από τις πιο κοινές μορφές καρκίνου σε αναπτυγμένες χώρες. Για τον προσδιορισμό των μοριακών δικτύων και βιολογικών διεργασιών που δεν διέπονται από ρυθμίσεις στο CRC σε σύγκριση με το φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου, που εφαρμόζεται Gene Set Εμπλουτισμός Ανάλυση σε δύο ανεξάρτητα σύνολα δεδομένων μεταγραφικό, συμπεριλαμβανομένων των συνολικά 137 CRC και δέκα δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου. Ογδόντα δύο σετ γονιδίων, όπως περιγράφεται από την Εγκυκλοπαίδεια του Κιότο των γονιδίων και βάσεων δεδομένων γονιδιώματος είχαν μεταβληθεί σημαντικά γονιδιακής έκφρασης σε αμφότερες τις σειρές δεδομένων. Αυτά περιλαμβάνονται δίκτυα που σχετίζονται με την κυτταρική διαίρεση, τη συντήρηση του DNA, και το μεταβολισμό. Μεταξύ των οδών σηματοδότησης με τις γνωστές αλλαγές σε βασικά γονίδια, το «δίκτυο σηματοδότησης φωσφατιδυλινοσιτόλης», η οποία περιλαμβάνει τμήμα του μονοπατιού PI3K, βρέθηκε απελευθερωθεί. Τα μειωτικά γονίδια σε αυτό το μονοπάτι περιλαμβάνονται πολλά μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών φωσφολιπάσης C, και η μειωμένη έκφραση δύο από αυτά,

PLCD1

και

PLCE1

, επιτυχώς επικυρώνονται CRC βιοψίες (n = 70) και κυτταρικές γραμμές (n = 19) με ποσοτικές αναλύσεις. Η καταστολή και των δύο γονιδίων βρέθηκε σχετίζεται με

KRAS

μεταλλάξεις (

P

= 0,005 και 0,006, αντίστοιχα), και παρατηρήσαμε ότι μικροδορυφόρων σταθερή καρκινωμάτων με μειωμένη

PLCD1

έκφρασης πιο συχνά είχαν

TP53

μεταλλάξεις (

P

= 0,002). Υποστηρικτής μεθυλίωση αναλύσεις

PLCD1

και

PLCE1

πραγματοποιηθεί σε κυτταρικές σειρές και βιοψίες όγκων αποκάλυψε ότι η μεθυλίωση του

PLCD1

μπορεί να συμβάλει στη μείωση της έκφρασης σε 40% των μικροδορυφόρων ασταθή καρκινώματα . Εν κατακλείδι, έχουμε εντοπίσει σημαντικά απελευθερωθεί περιόδων CRC, και επικυρώνονται καταστολή των

PLCD1

και

PLCE1

έκφρασης. Αυτό δείχνει ότι η προσέγγιση GSEA μπορεί να καθοδηγήσει ανακάλυψη νέων βιοδεικτών για τον καρκίνο

Παράθεση:. Danielsen Α.Ε., Cekaite L, Ågesen Θ, Sveen Α, Nesbakken Α, thiis-Evensen E, et al. (2011) φωσφολιπάσης C ισοΕυυών δεν διέπονται από ρυθμίσεις στον Καρκίνο του παχέος εντέρου – διδάγματα από Gene Σετ Εμπλουτισμός Ανάλυση της μεταγραφικό. PLoS ONE 6 (9): e24419. doi: 10.1371 /journal.pone.0024419

Επιμέλεια: Baochuan Lin, Ναυτικό Ερευνητικό Εργαστήριο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 20, 2011? Αποδεκτές: 10 Αύγ, 2011? Δημοσιεύθηκε: 1 Σεπ, 2011

Copyright: © 2011 Danielsen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το νορβηγικό Αντικαρκινική Εταιρεία (https://www.kreftforeningen.no/english) (RAL: δεν PR-2006 – 0442, συμπεριλαμβανομένων των επιχορηγήσεων διδακτορικό στην ΕΔΕ και tha? GEL:. PR-2008 με 0163? RIS : PR-2007-0166), με υποτροφία από το Συμβούλιο Έρευνας στο Rikshospitalet-Radiumhospitalet Υγείας Επιχειρήσεων (RAL: συμπεριλαμβανομένης επιχορήγησης διδακτορικό στην AS), με επιχορήγηση από το Νότιο-Ανατολική Νορβηγία Περιφερειακή Αρχή Υγείας (http: //www .helse-sorost.no /omoss /english /Sider /page.aspx) (RAL: PR-2009-093, συμπεριλαμβανομένων των επιχορηγήσεων μεταδιδακτορικοί στο LC), και επιχορήγηση από το Ίδρυμα νορβηγικό Υγείας και Αποκατάστασης (http: //www. extrastiftelsen.no/) μέσω των επιπλέον κεφαλαίων (ΕΤΕ: HF-52015/002). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC? MIM # 114500) κατατάσσεται στην τρίτη θέση στη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου σε όλο τον κόσμο με περίπου 1,2 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις ανά έτος [1]. Σύμφωνα με την αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (AJCC) τα ποσοστά 5ετούς επιβίωσης για τους ασθενείς που έχουν διαγνωστεί με σταδίου Ι και σταδίου IV CRC, είναι 93% και 8% αντίστοιχα, έτσι η πρόγνωση των ασθενών εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το στάδιο του όγκου κατά τη διάγνωση [2 ]. CRC αναπτύσσεται μέσω διακριτά στάδια ιστοπαθολογικές από καλοήθεις αλλοιώσεις πρόδρομο σε κακοήθεις όγκους, που είναι γνωστή ως η αλληλουχία αδένωμα-καρκίνωμα. Η ανάπτυξη οδηγείται από προοδευτική συσσώρευση γενετικών και επιγενετικών μεταβολές συγκεκριμένων γονιδίων, και συντηρημένα δίκτυα που ασκούν πλειοτροπικές επιδράσεις στα καρκινικά κύτταρα συχνά στοχεύουν σηματοδότησης. Τυπικά, οι κακοήθεις όγκοι χαρακτηρίζονται από το μοριακό φαινοτύπους αστάθεια μικροδορυφόρου (MSI), χρωμοσωμική αστάθεια (CIN), και ο φαινότυπος νησί methylator CpG (CIMP) [3]. Οι πιο συχνά μεταβάλλεται γονιδίων κατά την ανάπτυξη CRC αποτελούν τη βάση για αυτές τις φαινοτύπους και εμπλέκουν πολλά μονοπάτια σηματοδότησης και δικτύων (Εικόνα 1Α).

Α) Βασικά γονίδια απευθύνονται στις διάφορες CRC φαινοτύπους κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης από προκαρκινικές αλλοιώσεις σε καρκινώματα . Γονίδια με έντονους χαρακτήρες αντιπροσωπεύουν ΜΑΡΚ, PI3K, και TP53 σηματοδότησης δικτύων, και η κατάσταση μετάλλαξης τους έχουν προηγουμένως προσδιορισθεί [38]. Β) Το σχήμα δείχνει πως μέρος του δικτύου φωσφατιδυλο ινοσιτόλη αλληλεπιδρά με την κανονική οδό ΡΙ3Κ. Τα γονίδια των οποίων τα δεδομένα κατάστασης μετάλλαξης χρησιμοποιούνται για την ένωση αναλύει στο σημερινό χαρτί χρωματισμένο με μπλε, ροζ και καφέ. Συντομογραφίες: GPCR, G-πρωτεΐνη υποδοχέα? RTK, υποδοχέα τυροσινικής κινάσης.

Η

Messenger RNA (mRNA) έκφραση προφίλ μελέτες έχουν παράσχει βελτιωμένη κατανόηση των ρόλων των διαφόρων γονιδίων σημαντικά στην έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων CRC [4]. Παρά την αυξανόμενη γνώση των προτύπων έκφρασης των μεμονωμένων γονιδίων, καθώς και υπογραφές υποσχόμενη γονίδιο, λιγότερο διορατικότητα έχει ληφθεί για μεταβολές των μοριακών δικτύων και οδών σηματοδότησης από τη μεγάλη ποσότητα των δεδομένων που παράγονται σε τέτοιες μελέτες. Εφαρμόζοντας την στατιστική προσέγγιση του Gene Set Ανάλυσης εμπλουτισμού (GSEA) σε δεδομένα γονιδιακής έκφρασης, αλληλεπιδρώντας γονίδια των οποίων τα επίπεδα έκφρασης είναι συντονισμένα αλλάξει μπορεί να εξερευνηθεί [5]. Η μέθοδος GSEA λαμβάνει υπόψη την έκφραση όλων των γονιδίων μέσα σε ένα σχολιασμένο σύνολο γονιδίων /μονοπατιού. Υπάρχουν διάφορες βάσεις δεδομένων και το γονίδιο που τους ορισμούς που συνδέει γονίδια από λειτουργικές σχολιασμούς τους. Τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα είναι η βάση δεδομένων Gene Ontology (GO), η οποία βασίζεται σε ένα συνδυασμό υπολογιστικής και χειροκίνητη εκχώρηση των γονιδίων να GO όρους [6]. Ωστόσο, αυτοί οι όροι δεν αντιστοιχούν άμεσα σε γνωστά μονοπάτια. Η εγκυκλοπαίδεια του Κιότο γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) είναι μια μοριακή βάση δεδομένων οδό χειροκίνητα επιμέλεια και ενημερώνεται συχνά μεταβολικές, κανονιστικές και μονοπατιών σηματοδότησης [7]. Χρησιμοποιώντας αυτό συντηρητικά σχολιασμένη βάση δεδομένων, η απόλυση στην ένθετη δομή των ενώσεων του γονιδίου που αντιπροσωπεύεται από τους όρους GO μπορεί να αποφευχθεί. Σε σύγκριση με αναλύσεις ατομική έκφραση γονιδίου, GSEA προσφέρει μια εικόνα για τις συντονισμένες αλλαγές έκφρασης γονιδίων εντός οδών, ως εκ τούτου, μεταβάλλεται μονοπάτια και τα γονίδια στο παρόν δεν είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην καρκινογένεση μπορούσε να προσδιοριστεί σηματοδότησης.

Η σημασία της κανονικής φωσφατιδυλινοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) μονοπατιού στον καρκίνο έχει τεκμηριωθεί σε πολυάριθμες δημοσιεύσεις κατά την τελευταία δεκαετία [8]. Αυτό το δίκτυο σηματοδότησης έχει αντίκτυπο σε πλείονα καρκίνο κρίσιμα φαινοτύπους όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, τον μεταβολισμό, και την ανάπτυξη του όγκου [8]. Ένας κλάδος του δικτύου επικαλύπτεται με το δίκτυο σηματοδότησης φωσφατιδυλινοσιτόλης η οποία μεσολαβεί σήματα μέσω φωσφολιπάσης C (PLC) πρωτεΐνες (Εικόνα 1Β). Το δίκτυο αυτό πιθανότατα crosstalks με την ΜΑΡΚ και μονοπάτια TP53, σημαντικές οδοί στην ανάπτυξη CRC. Η οικογένεια πρωτεϊνών PLC περιλαμβάνει δεκατρείς ισοένζυμα χωρίζεται σε έξι διακριτούς υποτύπους, β, γ, δ, ε, ζ, και η, με βάση την δομή και μηχανισμοί ρυθμιστικού ενεργοποίησης. Τα ισοένζυμα PLC περιέχουν πολλά κοινά πεδία, καθώς και συγκεκριμένες περιοχές υπότυπο, που μπορούν να κάνουν τους ικανά να ρυθμίζουν τις αντιδράσεις λιπάσης ανεξάρτητη [9]. Περαιτέρω, αυτές είναι διαλυτές και κυρίως εντοπισμένη στο κυτταρόπλασμα, αλλά καθίστανται μετατοπίζεται στη μεμβράνη του πλάσματος σε απόκριση στην ενεργοποίηση του υποδοχέα [10]. Κατά τη μεμβράνη που υδρολύουν φωσφατιδυλινοσιτόλη (4,5) -φωσφορικό (PIP

2) και παράγει το σημαντικό δεύτερο διακυλογλυκερόλη αγγελιοφόρος (DAG) και ινοσιτόλη 1,4,5-τριφωσφορική (IP

3). Ανισορροπία των επιπέδων φωσφατιδυλοϊνοσιτολικής (PIP

2 και PIP

3), έχει δειχθεί ότι επάγει τα ελαττώματα της δραστηριότητας κανάλι, την εμπορία και την κανονική πολικότητα των κυττάρων [9]. Έτσι, η σωστή ρύθμιση των φωσφοϊνοσιτίδιων από π.χ. PLC ένζυμα είναι απαραίτητη και παρεκκλίνουσα ρύθμιση συμβάλλει σε διάφορες ανθρώπινες παθήσεις, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [9].

Με τη διερεύνηση γονιδιακή έκφραση των προκαθορισμένων βιολογικών διεργασιών και μοριακών κυκλώματα σε δύο CRC και φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου σύνολα δεδομένων που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας διαφορετικές πλατφόρμες μικροσυστοιχιών, ταυτοποιήθηκε ένας κατάλογος οδών μεταβάλλονται σημαντικά με διαφορική γονιδιακή έκφραση σε CRC. Έχουμε επιλέξει το «δίκτυο σηματοδότησης φωσφατιδυλινοσιτόλης» και δύο από τα απελευθερωμένης συστατικά σ ‘αυτό,

PLCD1

(HGNC: 9060) και

PLCE1

(HGNC: 17175), για λεπτομερείς μελέτες και σύγκριση των ευρημάτων με κλινικοπαθολογοανατομικών δεδομένα και την κατάσταση μετάλλαξης πολλών γονιδίων που είναι γνωστό ότι μεταβάλλεται σε CRC.

Αποτελέσματα

μονοπάτια Απελευθερωμένης KEGG σε CRCs

Συνολικά, 152 σύνολα γονιδίων KEGG ήταν παρόντες και στα δύο σύνολα δεδομένων γονιδιακής έκφρασης. Από αυτά, GSEA αποκάλυψε 33 σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω και 49 ρυθμίζεται προς τα κάτω σημαντικά τις βιολογικές διαδικασίες και περιόδων CRC σε σύγκριση με φυσιολογικά κολονικό βλεννογόνο (

P

≤0.05? Σχήμα 2). Έντεκα σημαντικά μεταβληθεί δίκτυα είχαν αντίθετη βαθμολογίες εμπλουτισμό μεταξύ των συνόλων δεδομένων, ενώ 44 είχαν βρέθηκαν μεταβληθεί σημαντικά σε μόνο ένα από τα σύνολα δεδομένων. Τα δίκτυα KEGG σημαντικά απελευθερωμένη στο CRC σε σύγκριση με το φυσιολογικό βλεννογόνο και στα δύο σύνολα δεδομένων που παρατίθενται στον πίνακα S1 (n = 82). Το γεγονός ότι αυτές οι οδοί βρέθηκαν μεταβλήθηκαν σημαντικά (

P

≤0.05) σε δύο ανεξάρτητα σύνολα δεδομένων που αναλύθηκαν, που προέρχονται από διαφορετικές πλατφόρμες μικροσυστοιχιών, δίνει κίνδυνο μόνο 1/400 για κάθε διαδρομή που πρόκειται να συμπεριληφθεί ως έχει τροποποιηθεί σημαντικά απλώς κατά τύχη. Ως εκ τούτου, δεν απαιτείται επιπλέον διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές εκτελείται (αυτό αντιπροσωπεύει επίσης για το άνω μέρος του Πίνακα 1). Τα 82 δίκτυα περιλαμβάνουν το γονίδιο σύνολα υπεύθυνου για γενική χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων, διάφορες μεταβολικές κυκλώματα καθώς και πιο διάσημο καταρράκτες σηματοδότησης, όπως το ΤΡ53 και μονοπάτια ΜΑΡΚ. Αγροτεμάχια των επιπέδων έκφρασης γονιδίου σε δείγματα CRC

Οι έναντι

κανονικό κολονικό βλεννογόνο δείγματα για όλα τα γονίδια στα τρία πιο απορυθμίζεται και τα τρία πιο μειωτικά δίκτυα σε CRC φαίνεται στο Σχήμα S1, και είναι στατιστικά διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια που απαριθμούνται στο Πίνακας S2.

το διάγραμμα δείχνει ότι τα αποτελέσματα της GSEA ήταν υψηλή επαναληψιμότητα με 33 και 49 πορείες από κοινού πάνω και προς τα κάτω ρυθμισμένη στις δύο σύνολα δεδομένων, αντίστοιχα.

Η

Το «σύστημα σηματοδότησης φωσφατιδυλινοσιτόλης»

Το «σύστημα φωσφατιδυλινοσιτόλης σηματοδότησης» ήταν μια από τις μοριακές διαδρομές βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε σύγκριση με το CRC φυσιολογικό βλεννογόνο,

δηλαδή

που έχουν περισσότερα από μειωτικά ρυθμισμένη προς τα πάνω γονίδια. Ένα σύνολο 22/59 και 27/76 γονίδια που διέρχεται από τα κριτήρια ποιότητας ήταν σημαντικά απελευθερωμένη στο CRC στα ΑΒ και HuEx σύνολα δεδομένων, αντίστοιχα (Σχήμα 3, Πίνακας 1). Από τα 11 γονίδια που βρέθηκαν απελευθερωθεί σε δύο σειρές, που περιλαμβάνουν κινάσες ινοσιτόλη, κινάσες διακυλογλυκερόλη, και φωσφολιπάσες, δύο σημαντικά ρυθμίζεται προς τα πάνω, ενώ εννέα μειωτικά. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε τέσσερις μειωτικά λιπάσες (

PLCD1

,

PLCD3

,

PLCE1

, και

PLCG2)

που συνδέονται στενά με τα ισοένζυμα που ανήκουν στην φωσφολιπάσης C (PLC) της οικογένειας των πρωτεϊνών.

PLCD1

και

PLCE1

, οι δύο γονίδια PLC στο «σύστημα σηματοδότησης φωσφατιδυλινοσιτόλης» πιο σημαντικά μειωτικά σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνου στα σύνολα δεδομένων HuEx και ΑΒ, αντίστοιχα, επιλέχθηκαν για περαιτέρω επικύρωση .

Συνολικά 38 γονίδια στο «σύστημα σηματοδότησης φωσφατιδυλινοσιτόλης» άλλαξαν σε ένα ή δύο σετ δεδομένων, έντεκα γονίδια βρέθηκαν απορύθμιση και στις δύο σύνολα δεδομένων.

η

Επικύρωση

PLCD1

και

PLCE1

έκφραση του mRNA

Από ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-PCR,

PLCD1

και

PLCE1

σαφώς κατασταλεί σε δείγματα καρκινικού ιστού σε σύγκριση με την κανονική βλεννογόνου (

P

= 3 × 10

-16 και

P

= 4 × 10

-15), επιβεβαιώνοντας την αρνητική ρύθμιση που βρέθηκαν στα δεδομένα έκφρασης μικροσυστοιχιών (Σχήμα 4) . Όλα τα δεκαεννέα αναλύθηκαν καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές που εμφανίζονται επίσης σημαντική καταστολή των δύο γονιδίων σε σύγκριση με φυσιολογικά βλεννογόνο (

P

= 2 × 10

-10 και

P

= 1 × 10

-8).

Τα επίπεδα έκφρασης του

PLCD1

και

κυτταρικές σειρές PLCE1

στο CRC και καρκίνου του παχέος εντέρου αξιολογούνται με RT-PCR ήταν σημαντικά ρυθμίζεται προς τα κάτω σε σχέση με την κανονική του παχέος εντέρου βλεννογόνο.

Η

PLC

τιμές έκφραση που σχετίζονται με γενετικές και κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές

Είναι ενδιαφέρον, υπήρχαν ισχυρές συσχετίσεις μεταξύ χαμηλή έκφραση και των δύο

PLCD1

και

PLCE1

και

KRAS

μεταλλάξεις σε δείγματα CRC (Πίνακας 2). Επιπλέον, μείωσε τα επίπεδα έκφρασης του

PLCD1

συσχετίστηκε σημαντικά με τον

TP53

μεταλλάξεις και το φαινότυπο MSS. Και για τα δύο γονίδια PLC, τα επίπεδα έκφρασης μειώθηκαν σε πιο προχωρημένα στάδια της νόσου. τιμές έκφραση του

PLCE1

μειώθηκαν στο στάδιο ΙΙ (

P

= 0,06) και μειώθηκε σημαντικά σε όγκους σταδίου ΙΙΙ (

P

= 0.005), σε σύγκριση με το στάδιο Ι όγκους . Ωστόσο, αυτό δεν ήταν η περίπτωση για μακρινή μεταστατική νόσο (στάδιο IV). Η ίδια τάση παρατηρήθηκε επίσης για

PLCD1

, όπου τα επίπεδα έκφρασης μειώθηκαν σημαντικά κατά το τρίτο στάδιο σε σχέση με το στάδιο Ι (

P

= 0,03). Δεν συσχετίσεις βρέθηκαν μεταξύ

PLCD1

και

PLCE1

έκφραση και μεταλλάξεις στο

BRAF

,

PIK3CA

, ή

PTEN

. Για τον πίνακα 2 θα πρέπει να σημειωθεί ότι λόγω των πολλαπλών δοκιμών (n = 16), υπάρχει ο κίνδυνος ψευδών σημαντικές συσχετίσεις.

Η ανάλυση

Ανάδοχος μεθυλίωση του

PLCD1

και

PLCE1

Η

PLCD1

και

PLCE1

θα μπορούσε να είναι στόχοι για μεθυλίωση υποστηρικτής αφού τα επίπεδα έκφρασής τους ήταν χαμηλή σε CRC σε σύγκριση με την κανονική του παχέος δείγματα βλεννογόνου. Αμφότερα τα γονίδια έχουν νησίδες CpG σε υποκινητές τους και την έκφρασή τους απορυθμίζεται έγινε σε κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με παράγοντες επιγενετικές επανενεργοποίηση (5-αζα-2’δεοξυκυτιδίνη? ΑΖΑ και τριχοστατίνη Α? TSA). Πλήρης ή μερική μεθυλίωση του

PLCD1

υποστηρικτής βρέθηκε στο 79% (15/19) των κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου, ανιχνεύεται από ποιοτική όσο και ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεθυλίωσης-ειδική (MSP και qMSP, αντίστοιχα ). Οι υπόλοιπες τέσσερις κυτταρικές γραμμές ήταν εντελώς μεθυλιωμένη. Η κατάσταση μεθυλίωσης των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του παχέος εντέρου επιβεβαιώθηκε με όξινο θειώδες αλληλούχιση χρησιμοποιώντας δύο μη επικαλυπτόμενα σύνολα ζευγών εκκινητών που καλύπτουν συνολικά 69 θέσεις CpG. Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης και MSI-καθεστώς των κυτταρικών σειρών. Για πρωτογενή καρκινώματα, μόνο εννέα από τα 70 (13%) δείγματα μεθυλιωμένη, όπως εκτιμάται από MSP και qMSP. Η πλειονότητα των όγκων θεωρείται θετικό για μεθυλίωση εμφανίζονται χαμηλές τιμές PMR (διάμεση 5,69). Είναι ενδιαφέρον ότι, οκτώ από τα εννέα μεθυλιωμένων όγκους ήταν MSI, αποδίδοντας ένα συχνότητα μεθυλίωση του 40% (8/20) σε αυτή την υποομάδα. Επιπλέον, όλοι οι μετουσιωμένο όγκοι MSI παρουσίασε μεταλλάξεις στο

BRAF

, ενώ το μετουσιωμένο όγκου MSS ήταν άγριου τύπου. Για

καρκινικές κυτταρικές σειρές PLCE1,

μόνο ένα από τα 19 του παχέος εντέρου έδειξε μεθυλίωση του υποκινητή. Αυτό επιβεβαιώθηκε από θειώδους αλληλουχίας που καλύπτουν 47 περιοχές CpG. Λόγω της χαμηλής

PLCE1

συχνότητα μεθυλίωση προαγωγού μεταξύ των κυτταρικών σειρών, δείγματα ιστού που δεν υπόκεινται σε μεθυλίωση αναλύσεις.

Συζήτηση

Με τη διερεύνηση της έκφρασης γονιδίων εντός προκαθορισμένων μοριακών οδών σε δύο ανεξάρτητα σύνολα δεδομένων μεταγραφικό CRC, έχουμε εντοπίσει πολλά μοριακά δίκτυα και τα συστατικά εκεί που δεν διέπονται από ρυθμίσεις στο CRC και μπορεί να συμβάλει στην καρκινογένεση.

η «κυτταρικού κύκλου» δεν ήταν έκπληξη η πιο εκτεταμένα αλλαγμένο γονίδιο που στις αναλύσεις μας. σωστή ρύθμιση του είναι απαραίτητη για τη διασφάλιση της ορθής μεταφοράς της γενετικής πληροφορίας από τη μια γενιά στην επόμενη, έτσι απορρύθμιση των πολλών συστατικών του κυτταρικού κύκλου ορίζεται ως χαρακτηριστικά του καρκίνου. Το εύρημά μας είναι σύμφωνη με αρκετές συγκρίσιμες μελέτες της CRC όπου γονιδίου σύνολα περιορίζεται αποκλειστικά σε οδούς σχετίζονται με τον καρκίνο [11] και πολλαπλές ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων που περιλαμβάνουν περισσότερες γενικές πορείες, έχουν διερευνηθεί [12] – [14]. CRCs εμφανίζονται μεταβολές έκφρασης σε πολλές μεταβολικές οδούς,

δηλαδή

«φωσφορυλίωση Οξειδωτικό» ήταν η πιο σημαντικά μειωτικά δίκτυο μεταβολικές και στα δύο σύνολα δεδομένων, ενώ το μεταβολισμό των πουρινών, πυριμιδινών, και Ν-γλυκάνες, εκτός από το «φωσφορικής πεντόζης μονοπάτι «ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω. Ο μεταβολισμός πουρίνης και πυριμιδίνης έχουν πρόσφατα βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω και σε αδενώματα σύγκριση με τα φυσιολογικά βλεννογόνο, υποδεικνύοντας ότι οι μεταβολές των εν λόγω δικτύων είναι πρώιμα γεγονότα στην ογκογένεση [14]. Επαναπρογραμματισμό του μεταβολισμού της ενέργειας ξεκίνησε πρόσφατα ως μια αναδυόμενη χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου, και τα ευρήματα είναι επίσης σε συμφωνία με ό, τι Otto Warburg περιγράφεται πριν από μισό αιώνα, αναφέρεται ως το «φαινόμενο Warburg». Προσδιόρισε μια μετατόπιση στο μεταβολισμό της γλυκόζης από οξειδωτική φωσφορυλίωση σε αερόβια γλυκόλυση σε κύτταρα όγκου [15]. Ο περιορισμός του μεταβολισμού σε μεγάλο βαθμό στην γλυκόλυση επιτρέπει τη μετατροπή των γλυκολυτικών ενδιάμεσων σε νουκλεοσίδια και αμινοξέα. Αυτό με τη σειρά διευκολύνει βιοσύνθεση μακρομορίων και των οργανιδίων που απαιτείται για την αύξηση της παραγωγής νέων κυττάρων. Βιολογικές διεργασίες που περιλαμβάνουν την αντιγραφή του DNA και τις διάφορες μορφές των μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA βρέθηκαν επίσης απελευθερωθεί σε σύνολα δεδομένων μας. Αυτά τα θεμελιώδη συστήματα συχνά τεθεί εκτός παιχνιδιού, όχι μόνο στον καρκίνο, αλλά και σε άλλες ασθένειες και σύνδρομα, υπογραμμίζοντας τη σοβαρότητα του να μην είναι σε θέση να αντιγράψετε τα λάθη του DNA ή επισκευή σε ένα σωστό τρόπο.

Εκτός από γενικότερη γνωρίσματα των καρκινικών κυττάρων, την κεντρική κυκλώματα CRC όπως MAPK-, TP53- και η φωσφατιδυλινοσιτόλη συστήματα, όπου συνήθως μία ή λίγες εξέχοντες παράγοντες αναφέρονται να τροποποιηθεί συχνά στο επίπεδο του DNA (λόγω μεταλλάξεις σημείου σηματοδότησης, πολλαπλασιασμοί, και /ή διαγραφές? [8], [16]), βρέθηκαν σημαντικά απορυθμισμένη στις αναλύσεις μας. Αυτό σημαίνει ότι η τροποποιημένη γονιδιακή έκφραση αρκετών λιγότερο «διάσημο» μέλη στα μονοπάτια συμβάλλουν επίσης στην παχέος καρκινογένεση. Στη μελέτη αυτή παρατηρήσαμε ότι τα γονίδια, όπως

PIK3CA

και

PTEN

εκφράστηκαν σε δείγματα όγκων, αλλά όχι σε πολύ διαφορετικά επίπεδα από το φυσιολογικό ιστό του παχέος εντέρου σε δύο σύνολα δεδομένων. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι αυτά τα γονίδια συχνά υποφέρουν από μεταβολές στις DNA- ή επίπεδα πρωτεΐνης και όχι από τις αλλαγές στην έκφραση του mRNA [8], [17] – [19]

Προκειμένου να αποκαλύψει επιπρόσθετα γονίδια σε. το «σύστημα σηματοδότησης φωσφατιδυλινοσιτόλης» που εμπλέκονται στην καρκινογένεση, θα διερευνηθεί το επίπεδο έκφρασης όλων των συνιστωσών της, όπως σχολιασμένο KEGG. Τόσο ινοσιτόλη φωσφατάσες, κινάσες διακυλογλυκερόλη, και φωσφολιπάσες βρέθηκαν να έχουν αλλαγμένη έκφραση. Μεταξύ των ενζύμων φωσφολιπάσης, τα μέλη της οικογένειας φωσφολιπάσης C αντιπροσωπεύθηκαν καλά, υποδεικνύοντας ένα σημαντικό ρόλο για αυτή την οικογένεια στην CRC. Αυτό υπογραμμίστηκε με RT-PCR αναλύσεις επικύρωση ότι τα επίπεδα έκφρασης του

PLCD1

και

PLCE1

εκτενώς μειωτικά σε CRC σύγκριση με το φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου. Η καταστολή των

PLCD1

είναι σύμφωνα με τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται από Nomoto και οι συνεργάτες του το 1995, όπου αναφέρουν μη ανιχνεύσιμα επίπεδα της πρωτεΐνης PLCD1 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου οκτώ και μειωμένα επίπεδα σε δώδεκα από τα δεκατρία καρκινώματα του παχέος εντέρου σε σύγκριση με τους σε συνδυασμό κανονικό δείγμα βλεννογόνου [20]. Αρκετές ομάδες έχουν προτείνει έναν ρόλο για PLCD1 στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου G

1 /S-σημείου ελέγχου, ωστόσο, υπάρχουν αντιφατικές αποτελέσματα αν έχει ογκογόνο ή όγκου λειτουργία κατασταλτική [21] – [23]. Με βάση τα παρόντα ευρήματα, προτείνουμε την τελευταία λειτουργία του

PLCD1

στο CRC. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν επίσης αναφερθεί για οισοφάγου καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (ESCC), γαστρικό και του καρκίνου του μαστού [21], [24] – [26]. Είναι ενδιαφέρον, τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης του

PLCD1

έντονα σχετίζεται με μεταλλάξεις στο

TP53

και

KRAS

καθώς και σε όγκους του φαινοτύπου MSS? αν και η βιολογική σημασία αυτών των ενώσεων μένει να καθοριστεί.

Η παρατηρούμενη καταστολή της

PLCE1

, το δεύτερο γονίδιο διερευνηθεί λεπτομερώς, υποστηρίζεται από τα αποτελέσματα Sørli

et al

. ο οποίος κατέδειξε επίσης σημαντικά μειωμένα επίπεδα έκφρασης του mRNA σε δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου και του ορθού και κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, όπως επίσης και από τους Wang και συνεργάτες που ανέφεραν μια συχνότητα απώλεια 36% της ετεροζυγωτίας (ΑΕ) του 10q23 όπου

PLCE1

βρίσκεται και προς τα κάτω ρύθμιση PLCE1 σε 21/50 παχέος δείγματα καρκίνου, σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικό ιστό [27] – [29]. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του

PLCE1

μειώνονταν με πιο προχωρημένα στάδια, υποδεικνύοντας ότι η καταστολή αυτού του γονιδίου είναι ευεργετική για την πρόοδο του καρκίνου. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το επίπεδο φαίνεται να αυξάνεται όταν φτάσει μεταστατική νόσο (στάδιο IV), ένα φαινόμενο που περιγράφηκε προηγουμένως για

PLCD1

και

PLCD3

στον καρκίνο του μαστού [24]. Παρ ‘όλα αυτά, προσοχή θα πρέπει να γίνει κατά την ερμηνεία των αποτελεσμάτων για το παρόν στάδιο IV της ομάδας, καθώς μόνο επτά όγκους που περιλαμβάνονται. Τα επίπεδα έκφρασης του

PLCD1

και

PLCE1

συσχετίστηκαν, και όπως αναμενόταν, μειωμένη έκφραση των δύο γονιδίων συσχετίστηκε σε πιο προχωρημένα στάδια όγκων (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Ωστόσο, τα επιμέρους επίπεδα έκφρασης και τα επίπεδα έκφρασης των δύο γονιδίων συνδυασμένα δεν συσχετίστηκαν με την επιβίωση των ασθενών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Περιέργως, όπως για

PLCD1

, χαμηλή έκφραση του

PLCE1

συνδέθηκε έντονα με μεταλλάξεις στο

KRAS

. Από PLCE1 έχει βρεθεί να είναι τόσο ένα ανάντη και κατάντη του τελεστή οικογένεια πρωτεϊνών Ras [30], η συσχέτιση του μεταλλαγμένου

KRAS

με τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης πιθανότατα παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση CRC. Περαιτέρω, αναφέρθηκε πρόσφατα ότι η υπερέκφραση του PLCE1 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του όγκου, μείωση του αριθμού των αποικιών που σχηματίστηκαν, μειωμένη μετανάστευση, και αυξημένη απόπτωση [29], υποδηλώνοντας έναν ρόλο κατασταλτικό όγκου για το γονίδιο αυτό σε CRC.

Στη συνέχεια διερευνήθηκε κατά πόσον τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης του

PLCD1

και em

PLCE1

θα μπορούσε να οφείλεται σε υπερμεθυλίωση προαγωγού. Αυτός είναι ένας συνηθισμένος τρόπος για την αδρανοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων, και οι δύο φωσφολιπάσες προταθεί ως υποψήφιες για υπερμεθυλίωση προαγωγού [27]. Ωστόσο, αυτό έχει μέχρι στιγμής μόνο έχει επιβεβαιωθεί σε

PLCD1

μέσα σε ένα εύρος 52-62% μεθυλίωσης στο ESCC, γαστρικός και καρκίνος μαστού [21], [25], [26]. Τα αποτελέσματά μας από qMSP και διθειώδες αλληλούχιση δεν μπορεί να επιβεβαιώσει

PLCE1

ως στόχος για αυτό το είδος των επιγενετικών σίγησης, και παρά υψηλή συχνότητα μεθυλίωσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, μεθυλίωση στο

PLCD1

υποκινητής μπορεί εξηγήσουν μόνο μειωμένη έκφραση σε μία υποομάδα των καρκινωμάτων. Είναι ενδιαφέρον όμως, ανακαλύψαμε ότι όλοι αλλά ένα από τα μεθυλιωμένα όγκους ήταν MSI, αποδίδοντας ένα συχνότητα μεθυλίωσης σχεδόν σαράντα τοις εκατό μεταξύ καρκινώματα με επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων ελάττωμα. Επιπλέον, τα μεθυλιωμένα όγκοι MSI εντοπίστηκαν στη δεξιά πλευρά του εντέρου και είχε

BRAF

μετάλλαξη, σύμφωνα με τον φαινότυπο CIMP [3].

Με την υποβολή δύο σύνολα δεδομένων μεταγραφικό CRC να GSEA , έχουμε εντοπίσει μια σειρά από στατιστικά σημαντική απελευθερωμένης σύνολα γονιδίων σε CRC, και φαίνεται ότι αυτή η προσέγγιση μπορεί να καθοδηγήσει ανακάλυψη νέων μοριακών στόχων και βιοδείκτες για τον καρκίνο. αναλύει την επαλήθευση των επιλεγμένων γονιδίων σε μία από τις πανομοιότυπες οδούς απελευθερωμένη σηματοδότησης,

PLCD1

και

PLCE1

, επιβεβαίωσε μειωμένα επίπεδα αυτών των μεταγραφών στο CRC σε σύγκριση με φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνου. Τόσο η κατασταλτική του όγκου και του όγκου προώθηση του ρόλου των γονιδίων αυτών και τα προϊόντα πρωτεΐνης έχουν προταθεί σε σχέση με την ανάπτυξη του καρκίνου, ανάλογα με ιστό προέλευσης [9]. Τα παρόντα δεδομένα υποστηρίζουν ένα κατασταλτικό όγκου ρόλο του

PLCD1

και

PLCE1

στην CRC, που για

PLCD1

ενδεχομένως μπορεί να εξηγηθεί από μια επιγενετική μηχανισμό μικροδορυφόρων ασταθή καρκινώματα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα άτομα που περιλαμβάνονται. Όλα τα δείγματα προέρχονται από την έρευνα βιοτράπεζες ως μέρος των ερευνητικών προγραμμάτων που έχουν εγκριθεί σύμφωνα με την εθνική τους ηθικούς κανόνες. Οι σειρές βιοτράπεζας έχουν καταχωρηθεί σύμφωνα με την εθνική νομοθεσία και έχει εγκριθεί από την Περιφερειακή Επιτροπή για την Ιατρική Έρευνα Ηθικής (REK South-East S-09282c2009 /4958, Βιοτράπεζα 2781? REK Νότια: 2003, S-02126, Βιοτράπεζας 296-2005-174211 ).

σύνολα δεδομένων μεταγραφικό

Δύο ανεξάρτητες ομάδες δεδομένων του παχέος μεταγραφικό ιστού προφίλ που δημιουργούνται στο παρελθόν στο εργαστήριο μας χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη GSEA [31], [32]. Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα είναι προσβάσιμα μέσω του Gene Expression του NCBI του Omnibus δημόσια αποθήκη για τα δεδομένα μικροσυστοιχιών (αριθμοί πρόσβασης GSE25071 και GSE24550). Το πρώτο σύνολο δεδομένων περιλαμβάνει τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης από 46 CRCs και τέσσερις κανονικές του παχέως δείγματα βλεννογόνου ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το 1700 πλατφόρμα Applied Biosystems (Applied Biosystems από Life Technologies, Foster City, CA, USA? ΑΒ) [31]. Το δεύτερο σύνολο δεδομένων γονιδιακής έκφρασης περιέχει 91 CRCs και έξι κανονικό κολονικό βλεννογόνο δείγματα που παράγονται χρησιμοποιώντας τις συστοιχίες Affymetrix GeneChip Human εξόνιο 1.0 ST (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA? HuEx) [32]. Δεν υπήρχαν επικάλυψη δειγμάτων μεταξύ των δύο συνόλων δεδομένων μικροσυστοιχίας. Μια περίληψη των κλινικών δεδομένων για ασθενείς που περιλαμβάνονται στα σύνολα δεδομένων μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα S3.

δείγματα ιστών και κυτταρικών σειρών καρκίνου

Ο ασθενής δείγματα που περιλαμβάνονται στην επαλήθευση στόχο αναλύσεις αποτελούσε ένα υποσύνολο του όγκους που χρησιμοποιούνται στη δέσμη στοιχείων HuEx (n = 70), και 17 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου του κόλου (συμπεριλαμβανομένων έξι από το σύνολο δεδομένων HuEx). Όλα τα δείγματα ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε πρωτογενή χειρουργική επέμβαση για CRC στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Όσλο, Aker, Όσλο, μεταξύ 2005 και 2008. Οι κανονικές παχέος δείγματα βλεννογόνου λήφθηκαν από περιοχές απαλλαγμένες από ασθένειες στο περιθώριο εκτομή των δειγμάτων CRC (≥10 cm από ο όγκος). Ένα κλινικοπαθολογοανατομικές περιγραφή μπορεί να βρεθεί στον Πίνακα S4.

κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου Δεκαεννέα (Co115, Colo320, EB, ΙΝΑΛΕ, HCT15, HCT116, ΗΤ29, IS 1, IS2, iS3, LoVo, LS1034, LS174T, RKO, SW48, SW480, TC7, TC71, και V9P) συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη, και περιγράφονται λεπτομερώς στο [33]. Αυτά καλλιεργήθηκαν κάτω από πρότυπες συνθήκες που θα δοθούν κατόπιν αιτήματος. Έξι από τις κυτταρικές σειρές (HCT15, RKO, SW48, ΗΤ29, LS1034, και SW480) υποβλήθηκαν σε επιγενετικές θεραπεία χρησιμοποιώντας την απομεθυλίωσης φάρμακο ΑΖΑ (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA? 1 μΜ για 72 ώρες), το αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης TSA (Sigma-Aldrich? 0.5 μΜ για 12 ώρες), και ένας συνδυασμός των δύο φαρμάκων (1 μΜ ΑΖΑ για 72 ώρες και 0,5 μΜ TSA προστίθενται τα τελευταία 12 ώρες). Παράλληλα, οι ίδιες κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν χωρίς θεραπεία για 72 ώρες. Όλα τα εμπορικά διαθέσιμα κυτταρικές σειρές επικυρώνονται χρησιμοποιώντας AmpFLSTR Identifiler Ενίσχυση PCR Kit (Applied Biosystems).

Απομόνωση νουκλεϊκών οξέων

DNA από φρέσκο ​​κατεψυγμένο κολονικό ιστό κυτταρικές γραμμές καρκίνου του παχέος εντέρου και εκχυλίζεται με ένα πρότυπο πρωτόκολλο φαινόλη /χλωροφόρμιο. RNA από ιστό όγκου εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το Qiagen AllPrep DNA /RNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Γερμανία), ενώ RNA από κανονικό κολονικό δείγματα βλεννογόνου και κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου, απομονώθηκε από το κιτ Ambion RiboPure ™ (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) και ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), αντίστοιχα. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών.

Γονιδιακή Ρύθμιση Εμπλουτισμός Ανάλυση (GSEA)

Για σύνολα γονιδίων GSEA ορίστηκαν σύμφωνα με την συλλογή οδού KEGG (Homo sapiens (άνθρωπος) Release 53.0 ) [7]. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο GSEABase στο Bioconductor /R έκδοση 2.9.2 [34]. Τα δύο σύνολα δεδομένων γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών της CRC

έναντι

φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου ήταν ανεξάρτητα υποβληθεί σε GSEA. προεπεξεργασία των δεδομένων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31], [32]. Διατεταρτημοριακό εύρος (IQR) χρησιμοποιήθηκε σαν ένα μέτρο της μεταβλητότητας. Γονίδια με IQR & lt? 0.5 αποκλείστηκαν από περαιτέρω αναλύσεις με GSEA. Για τα γονίδια στόχαστρο πολλών συμπλέγματα μεταγραφής (HuEx) ή ανιχνευτές (ΑΒ), χρησιμοποιήθηκε ο δημοσιογράφος με μεγαλύτερη μεταβλητότητα. Γονίδια δεν αποδίδεται σε οποιοδήποτε μονοπάτια KEGG εξαιρέθηκαν επίσης από την ανάλυση. Ένα σύνολο 3.361 και 4.797 γονίδια με ένα σχολιασμένο ρόλο στην 205 και 220 πορείες KEGG αξιολογήθηκαν για τα σύνολα δεδομένων ΑΒ και HuEx, αντίστοιχα. Οδούς που περιλαμβάνονται λιγότερο από 10 σχολιασμένα γονίδια απομακρύνθηκαν από την περαιτέρω ανάλυση, αφήνοντας 167 και 185 πορείες στα αντίστοιχα σύνολα δεδομένων. Διπλής όψης, πραγματοποιήθηκαν δύο-class t-τεστ υποθέτοντας ίσες διακυμάνσεις σε ολόκληρη την CRC και φυσιολογικά δείγματα για όλους τους περιλαμβάνονται τα γονίδια. Ένα γονίδιο που εμπλουτισμός βαθμολογία υπολογίστηκε ως το άθροισμα των παρατηρούμενων t-στατιστικές για τα γονίδια στο σύνολο, διαιρούμενο με την τετραγωνική ρίζα του αριθμού των γονιδίων στο σύνολο. σετ Gene

P

-τιμές υπολογίστηκαν με βάση το διάνυσμα των πιθανοτήτων των t-στατιστικών στοιχείων σε όλη την συμπεριλαμβάνονται γονίδια [35].

Εκκαθάριση των επιπέδων έκφρασης PLCD1 και PLCE1 με ποσοτική αντίστροφη Transcription- PCR

το συνολικό RNA από CRC ιστό και φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνου μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας το υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Το cDNA δύο ενδογενών ελέγχων,

ACTB

(Hs99999903_m1) και

GUSB

(Hs99999908_m1), καθώς επίσης και cDNA των γονιδίων

PLCD1

(Hs00979908_m1) και

PLCE1

(Hs00275279_m1) ενισχύθηκε ξεχωριστά σε 384 φρεατίων, όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (Applied Biosystems). Η γονιδιακή έκφραση μετρήθηκε σε πραγματικό χρόνο με τη χρήση του 7900 ΗΤ Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems). Τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και η μέση τιμή χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων. Μία σειριακή αραίωση του cDNA από το Παγκόσμιο Ανθρώπινο RNA αναφοράς (Agilent, Santa Clara, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία της πρότυπης καμπύλης. Τα επίπεδα έκφρασης του

PLCD1

και

PLCE1

ομαλοποιήθηκαν έναντι της μέσης τιμής των ενδογενών ελέγχων.

Bisulfite επεξεργασία και ανάλυση μεθυλίωσης υποστηρικτής σχεδιασμό

Πριν για ποιοτική και ποσοτική MSP και διθειώδες αλληλουχίας, 1,3 μg DNA από κάθε δείγμα ήταν όξινο θειώδες νάτριο σε επεξεργασία με τη χρήση του Epitect Bisulfite Kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. F, θηλυκό?