Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια καταστροφική ανθρώπινη κακοήθεια και η αύξηση των λειτουργικών μεταλλάξεων στο

K-ras ογκογονιδίου

είναι παρατηρήθηκε στο 75% -90% των ασθενών. Μελέτες έχουν δείξει ότι ογκογόνος

ras

δεν είναι μόνο σε θέση να προωθήσει την ανάπτυξη των κυττάρων ή την επιβίωση, αλλά και την απόπτωση, ανάλογα με τις περιστάσεις. Χρησιμοποιώντας καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές με ή χωρίς εκφράζουν μεταλλαγμένη

K-ras

, αποδείξαμε ότι η αναστολή της ενδογενούς δραστικότητας PKC ευαισθητοποιημένα ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (MIA και PANC-1) που εκφράζουν μεταλλαγμένη

K-ras

στην απόπτωση, η οποία δεν είχε καμία επίδραση στην αποπτωτική BxPC-3 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα τα οποία περιέχουν ένα κανονικό Ras, καθώς και ανθρώπινου πνεύμονα επιθηλιακά κύτταρα BAES-2Β. Σε αυτήν την αποπτωτική διεργασία, το επίπεδο του ROS αυξήθηκε και PUMA ρυθμίζεται αυξητικά σε ρ73-εξαρτώμενη μόδας στο MIA και κύτταρα PANC-1. Στη συνέχεια, η κασπάση-3 διασπάστηκε. Μια πλήρης επαγωγή απόπτωσης απαιτούσε την ενεργοποίηση και των δύο ROS- και ρ73-διαμεσολαβούμενη οδούς. Τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η PKC είναι ένας κρίσιμος παράγοντας που καταφέρνει με παρεκκλίνουσα

K-ras

να διατηρήσει την ομοιόσταση των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων που φιλοξενούν μεταλλαγμένα

K-ras

. Ωστόσο, η καταστολή ή απώλεια της PKC διαταράσσει την ισορροπία και ενεργοποιεί ένα αποπτωτικό κρίση, στην οποία ROS και p73 φαίνεται το δυναμικό, βασικών στόχων

Παράθεση:. Shen L, Kim SH, Chen CY (2012) Ευαισθητοποίηση του Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος που φιλοξενούν Μεταλλαγμένα

K-ras

σε απόπτωση. PLoS ONE 7 (7): e40435. doi: 10.1371 /journal.pone.0040435

Επιμέλεια: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20, Μάρτη 2012? Αποδεκτές: 6 Ιούν, 2012? Δημοσιεύθηκε: 25, Ιουλ 2012

Copyright: © 2012 Shen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα ήταν εν μέρει υποστηρίζεται από ένα εσωτερικό JCRT (Κοινό Κέντρο Ακτινοθεραπείας, Harvard Medical School) και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας 1RO1CA100498 απονέμεται σε Chang Yan Chen. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων και αναλύσεις, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια ασθένεια με μια μελαγχολική προοπτικές. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, περίπου 33.000 ασθενείς που διαγνώστηκαν με καρκίνο του παγκρέατος κάθε χρόνο και σχεδόν ίσος αριθμός θα πεθάνουν από αυτήν την κακοήθη νόσο [1] – [3]. Παγκοσμίως, ο καρκίνος του παγκρέατος προκαλεί ένα σημαντικό αριθμό θανάτων ετησίως. Αρκετά χαρακτηριστικά αυτής της καταστροφική ασθένεια είναι υπεύθυνα για το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας, λόγω της δυσκολίας να ανιχνεύσει προκαρκινικές αλλοιώσεις ή παρατηρήσει τα συμπτώματα μέχρι στα προχωρημένα στάδια. Ο καρκίνος υποβάλλεται συχνά μικρο-μετάσταση, η οποία είναι υπεύθυνη για μια φτωχή πρόγνωση αυτής της ασθένειας. Επιπλέον, προχωρημένο καρκίνο του παγκρέατος είναι συχνά ανθεκτικά στην συμβατική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Όλα αυτά δείχνουν την επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών για την αντιμετώπιση αυτής της θανατηφόρας νόσου.

Γενετική, οι επιγενετικές και περιβαλλοντικούς παράγοντες που εμπλέκονται στη γένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος [1]. Η παθογένεση αυτής της ασθένειας είναι μέσω της συσσώρευσης των γενετικών και μοριακών μεταβολών, με αποτέλεσμα ελαττώματα στην ανάπτυξη, την προσκόλληση και την ενσωμάτωση των πάγκρεας. Οι μοριακές αλλαγές σε αυτήν την ανθρώπινη κακοήθεια έχει αποδειχθεί ότι περιλαμβάνει αλλαγές στα μόρια που σχετίζονται με την ανάπτυξη, καταστολείς όγκων και ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου [4] – [7]. Διαταραχές στην ενδοκυτταρική, των οδών μιτογονικής σηματοδότησης ή περιορισμών πολλαπλασιασμός παρέχουν πλεονέκτημα σε καρκινικά κύτταρα για την ανάπτυξη ή την επιβίωση τους. υποδοχέα παράγοντα (EGFR) οικογένεια επιδερμικός αυξητικός είναι η γλυκοπρωτεΐνη μεμβράνης πλάσματος και δείχθηκε να παίξει κρίσιμο ρόλο στην έναρξη του καρκίνου του παγκρέατος και της ανάπτυξης [8] – [10]. Τα μέλη του EGFR έχει αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται συχνά σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, τα οποία ενεργοποιούνται accordantly κατάντη μονοπάτια σηματοδότησης του, όπως Ras και ERK, για την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων και την επιβίωση [11].

Αν και μία ποικιλία οι γενετικές παρεκκλίνουσα δείκτες έχουν εντοπιστεί στο ανθρώπινο παγκρεατικό καρκίνο βλάβες, οι πιο συχνές μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στο

K-ras

, και τα παρακολουθεί εκ του σύνεγγυς τα γεγονότα ήταν η αδρανοποίηση των καταστολείς των όγκων του p16, ARF, ρ53 και Smad4 [ ,,,0],12] – [14]. K-Ras ανήκει στις πρωτεΐνες της οικογένειας Ras που είναι μικρές κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες δέσμευσης GTP [15]. Τα μόνιμα ενεργών συνεργατών Ras με GTP, και προσδίδει ανεξέλεγκτη, μιτογόνο-διεγερτική σηματοδότηση σε καθοδικούς τελεστές, συμπεριλαμβανομένων Raf /MAPK, PI3K /Akt, JNK /ρ38 και RalGDS. Ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου του παγκρέατος έδειξαν ότι η έκφραση υπό όρους ενός ογκογόνου αλληλόμορφο του

K-ras

ήταν σε θέση να σχηματίσουν προ-πορογενές βλάβες που προχώρησαν σε επεμβατικές και μεταστατικού καρκίνου σε χαμηλή συχνότητα. Ταυτόχρονη νοκ-άουτ του p14 και ΤΑΠ προωθείται και να μετατραπεί αυτές τις προ-βλαβών σε πολύ επεμβατική και μεταστατικών καρκίνων [12] – [14]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενεργοποίηση K-Ras επάγει προ-παγκρεατικών βλαβών και τα καταστολείς όγκων (όπως ρ14 ARF ή) για να περιορίσει την κακοήθη μετατροπή αυτών των προδρόμων [12] – [14]. Ωστόσο, αυτό δεν έχει πλήρως διερευνηθεί αν αυτά τα ενδοκυτταρικά μονοπάτια σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μπορεί να κατευθύνεται εκ νέου για να ενεργοποιήσετε το πρόγραμμα κυτταρικού θανάτου.

Είναι γνωστό ότι η Ras μπορεί να προωθήσει όχι μόνο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή διαφοροποίηση, αλλά επίσης προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Σε ΑΡΟ1 απόπτωση που διαμεσολαβείται, η σύνδεση με ΑΡΟ1 (αντιγόνο απόπτωση 1) υποδοχέα προκάλεσε τη συσσώρευση λιπιδίων της μεμβράνης και την ενεργοποίηση του κεραμιδιού, το οποίο με τη σειρά του, διεγείρει δραστικότητα Ras για την επαγωγή της απόπτωσης [16], [17]. Στα λεμφοκύτταρα, Ras έπαιξε σημαντικό ρόλο στην IL-2 απόπτωση, η οποία εξασφάλισε την αποτελεσματική κύκλου εργασιών των λεμφοκυττάρων [18], [19]. Η απότομη ενεργοποίηση της Ras καθοδικός τελεστής ΜΑΡ κινάσης προωθείται κύτταρα να υποστούν απόπτωση [20], [21]. Σε απάντηση στο στρες που συνδέονται με τη διέγερση, JNK φαίνεται να λειτουργεί σε κατάντη του Ras και επάγουν απόπτωση σε κύτταρα όταν στρες ήταν επίμονος [22]. Έχουμε αναφερθεί ότι ογκογόνος Ηα-Ras ευαισθητοποιημένα ανθρώπινα ή ποντικού κύτταρα σε απόπτωση όταν ενδογενής δραστικότητα PKC καταστέλλεται [22]. Σε αυτήν την αποπτωτική διεργασία, το επίπεδο του ROS αυξήθηκε και αλληλουχίας κασπάσης πυροδοτήθηκε [22]. παρούσα μελέτη μας αποσκοπεί στην περαιτέρω δοκιμές εάν

K-ras

μετάλλαξη ήταν συνθετικά θανατηφόρα με την απώλεια της PKC σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

PKC (πρωτεϊνική κινάση C) οικογένεια αποτελείται από περισσότερα από 11 ισομορφές ότι ταξινομούνται βάσει των βιοχημικών λειτουργιών και δομών τους στα κλασικά (cPKCs: α, β και γ που είναι εστέρα φορβόλης και εξαρτάται από ασβέστιο), τα νέα (nPKCs: δ, ε, η και θ που είναι phobol εστέρα εξαρτώμενη μόνο ) και τα άτυπα PKCs (aPKCs: ζ και λ που είναι ανεξάρτητες από εστέρα φορβόλης και ασβεστίου). Μιτογόνα ερεθίσματα (όπως αυξητικοί παράγοντες), μέσω της αύξησης της μεμβράνης DAG (διακυλογλυκερόλη), ενεργοποιούν PKC. Ενώ οι μελέτες έχουν δείξει ότι η PKC είχε εμπλακεί σε εστέρα φορβόλης μεσολάβηση μιτογόνες αποκρίσεις, είναι πλέον σαφές ότι η ενεργοποίηση της PKC θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων ή ακόμα και να προκαλέσει την απόπτωση, ανάλογα με τους τύπους των ισομορφών, διαφορική σύζευξη με τελεστές [23], [24] . Για παράδειγμα, PKC α μεσολαβεί συχνά πολλαπλασιαστικές ή ογκογόνο αποκρίσεις. Σε εντερικά ή μαστικών κυττάρων, τα ίδια ισομορφές της PKC συμμετέχουν σε αντι-πολλαπλασιαστικές αποκρίσεις. Ωστόσο, διαφορετικές ισομορφές PKC στον ίδιο τύπο κυττάρων θα μπορούσε να λειτουργήσει αντίθετα. Σε ποντικού ΝΙΗ3Τ3, R6 αρουραίου ή φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του κόλου, η υπερέκφραση της PKC δ προκαλείται διακοπή της ανάπτυξης, ενώ αυξάνεται το επίπεδο της PKC Ε κινήθηκε διαδικασία μετασχηματισμού [25] – [27]. Αναδυόμενες αποδείξεις προτείνεται έντονα ότι PKC δ συχνά δρα ως καταστολέας των όγκων [24], [28]. Μελέτες έδειξαν ότι PKC δεν δ μόνο ήταν ένας αρνητικός ρυθμιστής της προόδου του κυτταρικού κύκλου ή θετικό μεσολαβητής της απόπτωσης, αλλά επίσης καθίστανται μια υψηλή αντίσταση στην προαγωγή όγκων του δέρματος που προκαλείται από ϋΜΒΑ-εστέρα φορβόλης σε ζωικά μοντέλα [29], [30].

Η στιχομυθία μεταξύ PKCs και το Ras οδών σηματοδότησης έχει παρατηρηθεί [31]. Σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων, PKC και Ras αλληλεπιδρούν είτε σε ιεραρχική γραμμική ή συνεργατική παράλληλη σχέση. Σε απάντηση στην μιτογονική διέγερση, PKC φωσφορυλιώθηκε σε διάφορες σερίνης και στη συνέχεια συνδέονται με τον τομέα SH2 του Grb-2. Το συγκρότημα συμπεριλαμβανομένων Grb-2 /Sos ήταν, με τη σειρά, που σχηματίζεται για την ενεργοποίηση Ras σηματοδότησης σε Τ λεμφοκύτταρα [32]. Η ενεργοποίηση της PKC και Ras σε λεμφοκύτταρα ήταν τότε σε θέση να κινητοποιήσουν κινάσης ΡΙ3 να δημιουργήσει ΡΙΡ3 και περαιτέρω να προκαλέσει διάφορα καταρράκτες κινάσης πρωτεΐνης, που οδηγεί στην ενεργοποίηση της ΑΚΤ και Rac για την προώθηση της ανάπτυξης των δραστηριοτήτων που σχετίζονται με κύτταρο. Αναφέρθηκε επίσης ότι μέσα που επηρεάζουν δραστηριότητα Rel, PKC είχε αρνητική επίδραση στην Ras μεσολάβηση σηματοδότηση [31]. Σε ορισμένα κακοήθη κύτταρα, PKC ενεργοποιήθηκε και είναι σε θέση να μεσολαβεί φωσφορυλίωσης Bcl-2 για την προώθηση της επιβίωσης [33], [34]. Με την αναστολή προ-αποπτωτικά μονοπάτια σηματοδότησης, PKC-επαγόμενη ενεργοποίηση του Bcl-2, προτάθηκε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στον πνεύμονα ογκογένεση. Αναστολή της PKC με φαρμακολογικά αναστολείς σε καλλιεργημένα ανθρώπινα πνεύμονα καρκινικά κύτταρα προκάλεσε αποπτωτική απόκριση [35]. τρέχουσα μελέτη μας έδειξε ότι Ras προτίμηση απόπτωση που επάγεται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που φιλοξενούν ένα ενεργό

K-ras

μετά τον αποκλεισμό της PKC. Τα στοιχεία μας πρότεινε ότι η συνεργασία της PKC εμφανίστηκε ζωτικής σημασίας για τον καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα που φιλοξενούν μεταλλαγμένα K-Ras για να επιβιώσουν.

Αποτελέσματα

Ευαισθητοποίηση του παγκρέατος καρκινικών κυττάρων που φιλοξενούν Μεταλλαγμένα K-ras σε απόπτωση μετά τη θεραπεία με GO6976

Οι λειτουργίες μονομαχία του Ras για την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων και την απόπτωση ήταν καλά τεκμηριωμένες [20], [22]. Προηγουμένως, δείξαμε ότι η συν-αναστολή της PKC α και η έκφραση β ή δραστηριότητα ήταν θανατηφόρος για κύτταρα ποντικού που υπερεκφράζουν

ν-ras

[22], [28]. Δεδομένου ότι

K-ras μεταλλάξεις

ανιχνεύονται στις περισσότερες των παγκρεατικών βλαβών αδενοκαρκινώματος [1], μας οδήγησε να εξετάσει την επιδεκτικότητα του παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε απόπτωση σε ανταπόκριση προς την αγωγή με GO6976 (έναν αναστολέα PKC ειδικό για PKC α και β). Η έκφραση και ενεργοποίηση κατάσταση του K-Ras σε διαφορετικούς ανθρώπινους παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και τα επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου πνεύμονα δοκιμάστηκαν. Το επίπεδο έκφρασης Ras σε ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου ΜΙΑ ή κύτταρα PANC-1 ήταν συγκρίσιμο με εκείνο στον πνεύμονα επιθηλιακά κύτταρα BEAS-2A και μία ελαφρώς μειωμένη ποσότητα Ras ανιχνεύθηκε στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος BxPC-3 (Εικ. 1Α). Στη συνέχεια, τα προϊόντα λύσης από αυτά τα κύτταρα καταβυθίστηκαν με RBD (περιοχή δέσμευσης του Ras της Raf) -GST πρωτεΐνη σύντηξης για να δοκιμαστεί η κατάσταση ενεργοποίησης του Ras. Ένα ενεργοποιημένο Ras συν-καθιζάνει με την πρωτεΐνη σύντηξης σε MIA και PANC-1 κύτταρα, αλλά όχι σε BxPC-3 ή κύτταρα BEAS-2Β (Εικ. 1Β). Το μέγεθος της ενεργοποίησης Ras σε MIA ήταν υψηλότερη από ότι στα κύτταρα PANC-1.

A. Η έκφραση του Ras εξετάστηκε με ανάλυση ανοσοκηλίδωσης σε ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος BxPC-3, MIA, PANC-1 ή του πνεύμονα επιθηλιακά κύτταρα BEAS-2Β. Οι πτυχώσεις των επιπέδων έκφρασης της Ras σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε σχέση προς εκείνη σε κύτταρα BEAS-2Β μετρήθηκαν και υποδεικνύεται. Ίση φόρτωση των συνολικών πρωτεϊνών ανά λωρίδα προσδιορίστηκε με β-ακτίνη. Β Ras σύνδεσης GTP δραστικότητα ήταν μέτρο σε αυτά τα κύτταρα με τη δοκιμασία Ras-GTP. Η κηλίδα επανα-διερευνήθηκαν με αντι-Ras αντίσωμα να κρίνουν ομοιόμορφα φόρτωση του συνόλου των πρωτεϊνών.

Η

Στη συνέχεια, εξετάσαμε την έκφραση της PKC σε αυτά τα κύτταρα, καθώς και τις απαντήσεις τους σε PKC ενεργοποιητής ΡΜΑ (φορβόλη οξικό μυριστικό) ή αναστολέα GO6976. Ένα συγκρίσιμο επίπεδο έκφρασης της PKC ανιχνεύθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 2Α). Η δραστηριότητα επαγωγή PKC με ΡΜΑ και ανασταλτική επίδραση της GO6976 επί προκαλείται από ΡΜΑ δραστικότητα PKC εξετάστηκαν επίσης χρησιμοποιώντας ένα κιτ δραστικότητα κινάσης PKC (Σχ. 2Β). Σε μη επεξεργασμένα ή κύτταρα MIA PANC-1, δραστικότητα PKC ήταν ελαφρώς υψηλότερο από ότι σε μη επεξεργασμένα κύτταρα BxPC-3 ή BEAS-2Β. Η θεραπεία με ΡΜΑ αυξηθεί δραματικά τη δραστικότητα αυτής της κινάσης σε όλες τις κυτταρικές σειρές, η οποία αναστέλλεται από GO6976, υποδεικνύοντας ότι PKC ήταν λειτουργικό σε όλα τα κύτταρα που εξετάστηκαν.

A. Κυτταρολύματα απομονώνονται από μη επεξεργασμένα κύτταρα ανοσοστυπώθηκαν με αντι-παν-PKC αντίσωμα.

β-ακτίνη

χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί ίση φόρτωση ολικής πρωτεΐνης ανά λωρίδα. B. κυτταρολύματα από τα κύτταρα με ή χωρίς επεξεργασία με ΡΜΑ ή ΡΜΑ συν GO6976, ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-παν-PKC αντίσωμα. Τα ανοσοσύμπλοκα επωάστηκαν με [

32Ρ] γ-ΑΤΡ και τα υποστρώματα πεπτιδίου για την ανάλυση της δραστικότητας της PKC. Οι μπάρες σφάλματος εκπροσωπούνται SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα (n = 3,

ρ

& lt? 0,05).

Η

PKC και το Ras είναι τα κρίσιμα μετατροπείς ενδοκυττάριο σήμα και να συμμετέχουν στη μετάδοση σημάτων σε ρυθμίζουν διάφορες βιολογικές ή παθο-βιολογικές δραστηριότητες. Η επαγωγή της απόπτωσης από καταστολής PKC αναφέρθηκε σε ποντικού ή ανθρώπινα κύτταρα που εκφράζουν ογκογόνο

ras

[20], [22], [28]. Για να ελεγχθεί αν GO6976 ήταν σε θέση να διεγείρει απόπτωση σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές με ή χωρίς εκφράζουν μεταλλαγμένη

K-ras

, δοκιμασία αννεξίνης V εκτελέστηκε (Εικ. 3Α και Β). θεραπεία GO6976 ευαισθητοποιημένα δραματικά MIA και τα κύτταρα PANC-1 στην απόπτωση και δεν έπαιξαν κανένα ρόλο στην επαγωγή απόπτωσης σε BxPC-3 κύτταρα που περιέχουν φυσιολογικό σηματοδότησης Ras, καθώς και σε ανθρώπινο πνεύμονα επιθηλιακά κύτταρα BEAS-2Β. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα κύτταρα στα οποία MIA δραστικότητα Ras ήταν υψηλότερη ήταν περισσότερο επιρρεπή σε GO6976 απόπτωση που επάγεται από τα κύτταρα PANC-1. Για να προσδιοριστεί εάν Ras ήταν υπεύθυνη για την επαγωγή της απόπτωσης, χρησιμοποιήθηκε αναστολέας φαρνεζυλτρανσφεράσης (FTI) για την καταστολή της δραστηριότητας Ras (Σχ. 3C). Με την παρουσία του FTI, θεραπεία GO6976 δεν ήταν σε θέση να επάγει απόπτωση σε κύτταρα MIA ή PANC-1. Τα δεδομένα πρότειναν ότι μεταλλαγμένο K-Ras, μαζί με απώλεια της λειτουργίας PKC, εμφανίστηκε θανατηφόρα και αυτό θανατηφόρο αντίδραση θα μπορούσε να ρυθμίζεται από μεταλλαγμένη Ras.

A. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GO6976 (1 μΜ) για 48 ώρες και στη συνέχεια συλλέγονται για προσδιορισμό αννεξίνης V. Οι ράβδοι σφάλματος SD από 5 ανεξάρτητα πειράματα (η = 5,

ρ

& lt? 0,05). Β προφίλ των κυττάρων μετά από χρώση με αννεξίνη V. C. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FTI για 30 λεπτά πριν από τη θεραπεία GO6976. Στη συνέχεια, δοκιμασία αννεξίνη V διεξήχθη. Οι ράβδοι σφάλματος SD από 5 ανεξάρτητα πειράματα (η = 5,

ρ & lt?

0.05)

Η

Προς τα πάνω ρύθμιση ROS από GO6976 σε καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα που φιλοξενούν Μεταλλαγμένα K-ras για την. Διέγερση απόπτωσης

ROS (αντιδραστικά είδη οξυγόνου) είναι γνωστό ότι απαιτείται για την ανάπτυξη των κυττάρων και αντιθέτως, ένας επίμονα αυξημένη σε ROS δείχθηκε να είναι σε θέση να προκαλέσουν βλάβη του DNA ή να προκαλέσει την απόπτωση [36]. Μελέτες αποκάλυψαν ότι ROS σε κύτταρα που εκφράζουν ογκογονίδια (όπως

ras

) έχουν συχνά επαυξημένης, η οποία μπορεί να οφείλεται στην υψηλή μεταβολική ανάγκες της νεοπλαστικής ανάπτυξης [36]. επίπεδα ROS σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και BEAS-2Β μετρήθηκαν υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης ή μετά τη θεραπεία με GO6976 (Σχ. 4Α). Μια μέτρια ποσότητα ROS ανιχνεύθηκε σε MIA ή PANC κύτταρα, τα οποία ήταν εντυπωσιακά αυξημένα μετά την προσθήκη του GO6976. ROS ήταν σε επίπεδα βασικής γραμμής σε μη επεξεργασμένα κύτταρα και η θεραπεία με τον αναστολέα PKC δεν επηρέασε την παραγωγή ή τη συσσώρευση ROS BxPC-3 ή BEAS-2Β.

Α. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GO6976 ή συν-θεραπεία με GO6976 συν NAC (2,5 mM). Αφού βάφονται με DCF, τα επίπεδα των ROS στα κύτταρα αναλύθηκαν με ένα κυτταρόμετρο ροής. B. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GO6976 (1 μΜ) ή GO6976 συν NAC. Ακολούθως, τα δείγματα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν για δοκιμασία αννεξίνη V. Οι ράβδοι σφάλματος SD από 5 ανεξάρτητα πειράματα (n = 5,

ρ

& lt? 0,05).

Η

Για να προσδιορίσετε αν ROS έπαιξε ρόλο στην επαγωγή της απόπτωσης μετά την αναστολή PKC σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο

K-ras

, δοκιμασία αννεξίνης V διεξήχθη (Εικ. 4Β). Και πάλι, MIA και PANC-1 κύτταρα ήταν ευαίσθητα σε θεραπεία GO6976, η οποία ήταν εν μέρει, αλλά σημαντικά μπλοκαριστεί από NAC (Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη, έναν αναστολέα ROS). Δεδομένου ότι NAC δεν καταστέλλεται εντελώς απόπτωση σε αυτά τα κύτταρα, πρότεινε τη συμμετοχή των άλλων οδών στην εκτέλεση αυτού του προγράμματος κυτταρικού θανάτου. Σταθερά, παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα χωρίς να εκφράσει μεταλλαγμένη

K-ras

ή ανθρώπινου πνεύμονα επιθηλιακά κύτταρα BEAS-2Β ήσαν μη αποκρινόμενα σε GO6976 καθώς και για τη θεραπεία συνδυασμού GO6976 συν NAC.

Ενεργοποίηση της κασπάσης 3 σε αυτό το Lethal αντίδραση έλαβε χώρα σε MIA ή PANC-1 κύτταρα

οικογένειας κασπάσης αποτελείται από περισσότερα από 10 μέλη [37]. Σε απάντηση προς αποπτωτικό ερεθίσματα, κασπάσης-3 δείχθηκε να λειτουργεί ως δήμιος σε καταρράκτη κασπάσης για την ολοκλήρωση του προγράμματος κυτταρικού θανάτου [37]. Σε αυτή τη διαδικασία, η κασπάση-3 απαιτείται να διασπάται σε ένα μικρό, δραστικό θραύσμα. Για να ελεγχθεί η κατάσταση ενεργοποίησης της κασπάσης 3, η παρουσία του διασπασμένη κασπάση 3 σε MIA ή κύτταρα PANC-1 αναλύθηκε με ανοσοστύπωση (Σχ. 5Α). Μετά τη θεραπεία με GO6976, ένα μικρό, διασπασμένη κασπάση 3 ήταν πράγματι παρόν σε αυτές τις δύο παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Η δραστική μορφή αυτής της κασπάσης ήταν ανιχνεύσιμη σε GO6976 επεξεργασμένο BxPC-3 ή BEAS-2Β κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να εξεταστεί περαιτέρω η ενεργοποίηση της κασπάσης 3 υπό τις ίδιες πειραματικές ρύθμιση, δραστικότητα κασπάσης 3 αναλύθηκε (Σχ. 5Β). Μετά τη θεραπεία με τον αναστολέα, η δραστηριότητα αυτής της πρωτεάσης ρυθμίζεται αυξητικά σε MIA και κύτταρα PANC-1, η οποία καταστέλλεται μερικώς με την προσθήκη NAC. Σταθερά, η δραστηριότητα της κασπάσης 3 ήταν απούσα σε GO6976 επεξεργασμένο BxPC-3 κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένα χωρίς

K-ras

ή κύτταρα BEAS-2Β. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κασπάσης 3 συμμετείχαν στην εκτέλεση της GO6976 επαγόμενη απόπτωση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που φιλοξενούν ογκογόνο

K-ras

.

A. Με ή χωρίς θεραπεία GO6976, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-κασπάσης 3 αντίσωμα. B. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν στη θεραπεία με GO6976 ή GO6976 συν NAC. Στη συνέχεια, δοκιμασία αννεξίνης V εκτελέστηκε. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα (η = 3,

ρ

& lt? 0,05).

Η

Προς τα πάνω ρύθμιση της αποπτωτικής Παράγοντα PUMA σε ρ73-εξαρτώμενο τρόπο Κατά GO6976- επαγόμενη απόπτωση

p73 ανήκει στην οικογένεια p53 και μοιράζεται ομολογία με p53 όχι μόνο στις ακολουθίες τους, αλλά και την διενεργοποίηση, λειτουργίες δέσμευσης DNA ή ολιγομερισμό [38]. Στην ρ73 απόπτωση που διαμεσολαβείται από το αποπτωτικό συγγενή παράγοντα PUMA συχνά ρυθμίζεται αυξητικά [38]. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι μετά την αναστολή της PKC, p73 σε ινοβλάστες ποντικού εκτοπικά εκφράζοντας

Ha-ras

ενεργοποιήθηκε και υπεύθυνη για την έναρξη της απόπτωσης [28]. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας το θάνατο των κυττάρων, ρ73 φωσφορυλιώθηκε στα υπολείμματα σερίνης του [28]. Για να ελεγχθεί αν p73 φωσφορυλιώθηκε σε GO6976 επεξεργασμένα ΜΙΑ ή κύτταρα PANC-1, ανάλυση ανοσοκηλίδος διεξήχθη (Σχ. 6Α). είχε συμβεί Η φωσφορυλίωση του ρ73 σε υπολείμματα σερίνης της στα κατεργασμένα κύτταρα, αλλά όχι στα κύτταρα ελέγχου. Η GO6976 μεσολάβηση ρ73 φωσφορυλίωση δεν μεταβάλλεται με την προσθήκη του NAC. Στη συνέχεια, η έκφραση του p73-ρυθμιζόμενη

PUMA

γονιδίου σε MIA ή κύτταρα PANC-1 εξετάστηκε με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση (σχ. 6Β). Το επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης στα κύτταρα ήταν σημαντικά αυξημένη μετά την αγωγή με GO6976. Η προς τα πάνω ρύθμιση του γονιδίου ήταν και πάλι αμετάβλητο με την παρουσία του NAC, αλλά εντελώς κατασταλεί από την παροδική μόλυνση του

shRNA-p73

. Σταθερά, η έκφραση πρωτεΐνης επαυξημένης μετά την αγωγή με τον αναστολέα PKC (Εικ. 6Β). Η εισαγωγή του

shRNA-p73

στα κύτταρα μπλοκάρει επίσης την επαγωγή του PUMA πρωτεΐνη, η οποία δεν επηρεάστηκε από την προσθήκη του NAC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Φάνηκε ότι PUMA είχε εμπλακεί στον άξονα του p73 με τη μεσολάβηση σηματοδότησης σε αυτή αποπτωτική διαδικασία.

Α. Με ή χωρίς την κατεργασία με GO6976 ή GO6976 συν NAC, προϊόντα λύσης ανοσοκαταβυθίζονται με αντίσωμα αντι-ρ73. Τα ανοσοϊζήματα στη συνέχεια υποβάλλονται σε ανοσοκηλίδωση με τη χρήση του αντι-φωσφορυλιωμένης αντίσωμα σερίνη. Το επίπεδο των ανοσοϊζήματα κρίθηκε από εκ νέου ανίχνευση του στυπώματος με αντίσωμα αντι-ρ73. B. Ολικά RNAs από τα κύτταρα με ή χωρίς επεξεργασία με GO6976, GO6976 συν NAC ή GO6976 συν

shRNA-p73

μόλυνση απομονώθηκαν. Ίση ποσότητα RNAs μεταγράφηκε αντίστροφα, και η έκφραση του

PUMA

ελέγχθηκε με RT-PCR. C. Με ή χωρίς θεραπεία GO6976, MIA ή PNAC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδωσης για έκφραση PUMA. Ίση φόρτωση του συνόλου των πρωτεϊνών προσδιορίστηκαν από ύφασμα-σχολαστικά το blot με αντίσωμα αντι-β-ακτίνης.

Η

Η συνεργασία των ROS και p73 για την επαγωγή της GO6976 μεσολάβηση απόπτωση

είναι καλά γνωστό ότι πολλαπλές, αποπτωτικά μονοπάτια σηματοδότησης ενσωματώνονται για την πλήρη εκτέλεση του προγράμματος κυτταρικού θανάτου. Από ROS και p73 εμφανίστηκε συμμετέχει στην επαγωγή της απόπτωσης σε κατεργασμένα GO6976 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που φιλοξενούν μεταλλαγμένα

K-ras

, ελέγξαμε πρώτα εάν ρ73 παίξει κανένα ρόλο στην ρύθμιση προς τα άνω των ROS στα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ( Σχ. 7Α). Και πάλι, μια μέτρια μεταξύ των ROS ανιχνεύθηκε στα μη επεξεργασμένα ή κύτταρα MIA PANC-1, η οποία αυξήθηκε περαιτέρω μετά την αναστολή PKC. Η παροδική λοίμωξη του

shRNA-p73

δεν είχε καμία επίδραση στην επαγωγή των ROS, γεγονός που υποδηλώνει ότι η p73 σε πειραματικό περιβάλλον μας δεν συμμετείχε στη σηματοδότηση ROS. Στη συνέχεια, η δραστικότητα κασπάσης-3 αναλύθηκε μετά την knockdown του ρ73 ή συν-αναστολή της ρ73 και ROS (Εικ. 7Β). Η εισαγωγή του

shRNA-p73

μπλοκάρει εν μέρει τη δράση της κασπάσης-3 σε GO-6976-αγωγή ΜΙΑ ή PANC-1 και η δραστικότητα αυτής της πρωτεάσης καταργήθηκε πλήρως μετά την συν-καταστολή των ρ73 και ROS. Η εμφάνιση της απόπτωσης μετά από τις ίδιες θεραπείες στη συνέχεια αναλύθηκε με προσδιορισμό αννεξίνης V (Σχ. 7C). Το νοκ ντάουν του

p73

ανέστειλε εν μέρει την GO6976 που προκαλείται αποπτωτική διαδικασία MIA ή κύτταρα PANC-1. Σε περίπτωση απουσίας και των δύο

p73

και ROS, GO6976 δεν ήταν σε θέση να ξεκινήσει απόπτωση σε αυτά τα κύτταρα. Τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τουλάχιστον δύο αποπτωτικά μονοπάτια:. P73 και ROS έλαβαν μέρος σε αυτή τη θανατηφόρα αντίδραση

Το επίπεδο των ROS στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με GO6976 ή GO6976 συν

shRNA-p73

μόλυνσης ήταν αναλύθηκαν. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα (η = 3,

ρ

& lt? 0,05). B. Η δραστικότητα της κασπάσης 3 σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με GO6976, GO6976 συν

shRNA-p73

λοίμωξη ή GO6976 συν NAC συν

shRNA-p73

μόλυνση αναλύθηκε. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα (η = 3,

ρ

& lt? 0,05). Γ Annexin V δοκιμασία σε ΜΙΑ και PANC-1 κύτταρα επεξεργασμένα με GO6976, GO6976 συν

shRNA-p73

λοίμωξη ή GO6976 συν NAC συν

shRNA-p73

μόλυνση πραγματοποιήθηκε. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα (n = 3,

ρ

& lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια καταστροφική ανθρώπινη κακοήθεια και μία από τις κύριες αιτίες θανάτου από καρκίνο [1]. Πρόγνωση της ασθένειας αυτής είναι ζοφερή, λόγω της έλλειψης αποτελεσματικών θεραπειών. Είναι γνωστό ότι η αύξηση των λειτουργικών μεταλλάξεων σε

K-ras

συμβαίνουν στα πρώτα στάδια σε ανθρώπινα παγκρεατικά ασθενείς με καρκίνο ή μοντέλα ποντικών που δημιουργήθηκαν από knockout του όγκου γονίδια καταστολής του

p16, ΑΠΦ

, ή

p53

, αντιστοίχως ή σε συνδυασμούς [12] – [14]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν τη σημασία της K-Ras στη γένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος. Ο στόχος της μελέτης μας ήταν να διερευνήσει τη νέα στρατηγική στόχευση ογκογόνους Ras για παγκρέατος θεραπευτική. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η παρεκκλίνουσα, μεταλλαγμένα

K-ras

ήταν σε θέση να αποκαταστήσει άμεση παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με κατεύθυνση προς την απόπτωση μετά την καταστολή της PKC. Σε αυτή την αποπτωτική διαδικασία, πολλαπλές οδούς σηματοδότησης συμμετείχαν. Μετά την επεξεργασία με τον αναστολέα PKC, το επίπεδο των ROS στα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο

K-ras

αυξήθηκε, συνοδεύεται από την επαγωγή της απόπτωσης. Ωστόσο, η προσθήκη του NAC μπλοκάρει εν μέρει τη διαδικασία κυτταρικού θανάτου. p73 ήταν φωσφορυλιωμένη και, PUMA γονιδίου και της πρωτεΐνης ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω. Επιπλέον, κασπάσης 3 διασπάστηκε για την εκτέλεση του προγράμματος κυτταρικού θανάτου. Η συν-αναστολή των ROS και p73 επιτευχθεί ένα τελικό αποτέλεσμα αποκλεισμό της απόπτωσης σε GO6976 επεξεργασμένα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που φέρουν μεταλλαγμένα

K-ras

. Έτσι, η μελέτη μας δείχνει ότι παρεκκλίνουσα Ras, μαζί με την απώλεια της PKC είναι συνθετικά θανατηφόρος στα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Τα δεδομένα πρότεινε επίσης μια πιθανή ισορροπία μεταξύ Ras και PKC που καθορίζει το όριο της απόπτωσης στα κύτταρα.

μεταλλάξεων ενεργοποιήσεις του

ras

γονίδια είναι ένα από τα βασικά γεγονότα κατά την έναρξη και την ανάπτυξη της διαφόρων τύπων ανθρώπινων κακοηθειών [15]. Κατά τη διαδικασία της μετατροπής, συνεχείς αυξήσεις στις διακόπτης δραστικότητα Ras επί διαφόρων καθοδικών πορειών τελεστή, οδηγώντας σε αλυσιδωτές αντιδράσεις φωσφορυλίωσης για την ενεργοποίηση των προ-ανάπτυξης μεταγραφικοί παράγοντες [39]. Παρά την ουσιαστική συμμετοχή στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση των κυττάρων, υπερκινητικά Ras, υπό ορισμένες συνθήκες, μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί κατευθύνεται σε απόπτωση. Πολυάριθμες μελέτες έχουν αναδείξει τους ρόλους της Ras στη ρύθμιση της απόπτωσης [20]. Ειδικότερα, έχει παρατηρηθεί ότι οι θεραπείες με αναστολείς PKC θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση σε ινοβλάστες ποντικού ή επιθηλιακά κύτταρα πνεύμονα αρουραίου που υπερεκφράζουν ογκογόνο

ras

[22], [28]. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι η δραστηριότητα PKC στα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που φέρουν μεταλλαγμένα

K-ras

ελαφρώς αυξηθεί, η οποία μπορεί να είναι αναγκαία για την αντιμετώπιση έκτροπα υψηλή δραστηριότητα Ras για την επιβίωση. Μετά PKC καταστάλθηκε, μεταλλαγμένο K-Ras δεν θα μπορούσε να διατηρήσει υψηλό μεταβολικές ανάγκες των καρκινικών κυττάρων και την έναρξη της θανατηφόρου αντίδραση. Δεδομένου ότι υψηλά ποσοστά καρκίνων του ανθρώπου που φιλοξενεί ογκογόνο

ras

, PKC φαίνεται ένα ιδανικό ενδοκυτταρικό στόχο για την επαγωγή της απόπτωσης, με χαμηλή ή καμία τοξική επίδραση στην περιβάλλουσα φυσιολογική ιστών ή κυττάρων.

Περισσότερα από 11 σερίνης πρωτεϊνικές κινάσες /θρεονίνης ανήκουν στην οικογένεια PKC, μερικά από τα οποία είναι δομικά διαφορετικά ή λειτουργικά διαφορετικές. Ωστόσο, υπάρχει ένα λειτουργικό πλεονασμό μεταξύ αυτών των ισοενζύμων PKC για την αποκατάσταση της κανονικής φυσιολογικής κατάστασης, όταν ένα ή περισσότερα ισοένζυμα PKC νοκ άουτ ή μη λειτουργικές. Οι ρόλοι των PKC ισομορφών στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης ή θανάτου είναι μάλλον αμφιλεγόμενη, ανάλογα με διαφορετικούς τύπους κυττάρων ή κυτταρικών πλαίσια. Για παράδειγμα, έχει προταθεί ότι PKC α, β, δ κατείχε ρόλους μονομαχία στη ρύθμιση της ανάπτυξης του καρκίνου ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, υποδεικνύοντας την πολυπλοκότητα αυτών των ισοενζύμων PKC [24]. Cross-συνομιλίες μεταξύ των PKC ισομορφών και με άλλα ενδοκυτταρικά μετατροπείς σήματος ήταν συχνά παρούσα σε μια ιεραρχία τάξη ή διαφορετικά διαμερίσματα για να καθοδηγήσει τα κύτταρα για να επιτευχθεί διαφορετικά αποτελέσματα. Αποδείχθηκε επίσης ότι PKC και Ras μονοπάτια σηματοδότησης είχαν διασυνδεθεί, ιδιαίτερα στα λεμφοκύτταρα [24], [40]. Κατά μιτογονική διέγερση, οι θέσεις σύνδεσης SH2 της PKC φωσφορυλιούνται, η οποία με τη σειρά της στρατολογεί το σύμπλοκο Grb2 /SOS και περαιτέρω ενεργοποιημένο Ras σηματοδότησης σε Τ λεμφοκύτταρα [24]. PKC αναφέρθηκε σε ρυθμιζόμενες αρνητικά Ras μονοπάτι, μέσα που επηρεάζουν τελεστή του Rel [24]. Σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν εκτοπικά

ν-Ha-ras

, ρ73 λειτούργησε κατάντη ΡΚΟα και β και ως αισθητήρα για να προσδιοριστεί το όριο της απόπτωσης [22]. Χρησιμοποιώντας τον αναστολέα GO6976 PKC που αναστέλλει τον εστέρα φορβόλης που εξαρτάται από ισόμορφα PKC, εμείς σε αυτή τη μελέτη έδειξε ότι τα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος με υπερδραστήρια K-Ras θα μπορούσε να ευαισθητοποιηθούν αποτελεσματικά στην απόπτωση. Η έρευνα για τον εντοπισμό βασικών ισομορφή (ες) PKC στη ρύθμιση αυτής της αποπτωτικών διαδικασία βρίσκεται σε εξέλιξη.

ROS συχνά δρα ως ενδοκυτταρική μετατροπέας σήματος των αυξητικών παραγόντων [36]. Μερικά μιτογόνα ερεθίσματα είναι ικανά να αυξήσουν το επίπεδο της ενδοκυτταρικής ROS, με αποτέλεσμα την αλλαγή της δομής του κυτταροσκελετού και περαιτέρω επαγωγής μετασχηματισμός [36]. Σε κύτταρα PC12, Ras δείχθηκε να ρυθμίζει αυξητικά την παραγωγή ROS κατά EGF διέγερση [41]. Μελέτες έδειξαν επίσης ότι ογκογονίδια (όπως

myc

ή

ras

), μέσω επίμονα διαταράσσουν την κατάσταση της ενδοκυτταρικής οξειδοαναγωγής, ήταν σε θέση να προκαλέσουν χρωμοσωμικές ανωμαλίες και στη συνέχεια να διακόψει τη γενετική ακεραιότητα να προωθήσει ογκογένεση [36 ]. Παρά ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και μετασχηματισμού, μια αύξηση στην ROS προτάθηκε να διαδραματίσει υποχρεωτικό ρόλο στην επαγωγή της απόπτωσης [22]. Στην επαγόμενη από τον ΤΝΡα προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, NF-κΒ και ΙΝΚ συνεργαστεί για την τόνωση της παραγωγής ROS, οδηγώντας σε αλληλουχίας κασπάσης και μιτοχονδριακή αποπόλωση [42]. Η έκτοπη έκφραση του

Ha-ras

σε ινοβλάστες ποντικού που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο μέσω της εκμαίευσης ER (ενδοπλασματικό δίκτυο) το άγχος και την ενεργοποίηση UPR (εκτυλίχθηκε απάντηση πρωτεΐνη) [22]. Η τρέχουσα μελέτη κατέδειξε ότι παρόλο ROS ήταν μετρίως αυξημένα σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο

K-ras

υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης, η αναστολή της PKC διαταραχθεί σοβαρά η ισορροπία της οξειδοαναγωγικής κατάστασης και προκάλεσε μια σημαντική συσσώρευση των ROS στην κύτταρα. Έτσι, PKC φαίνεται ένας σημαντικός παράγοντας για τη διατήρηση της ομοιόστασης του καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα που φιλοξενούν μια παρεκκλίνουσα

K-ras

.

p73 ανήκει στην οικογένεια p53 πρωτεϊνών και, συμμερίζεται την δομική και λειτουργική ομόλογο με p53 [38]. Μελέτες έδειξαν ότι ρ73 έπαιξε σημαντικό ρόλο στην ΒΛΑΒΗ DNA ή στρες που προκαλείται από απόπτωση. Πυρηνική c-Abl ενεργοποιήθηκε με γενοτοξικό στρες και περαιτέρω φωσφορυλιωμένη ρ73 για την επαγωγή της απόπτωσης [43]. Σε αυτή τη διαδικασία κυτταρικού θανάτου, η πυρηνική c-Abl αλληλεπιδρούν με p73 και περαιτέρω διεγείρονται δραστηριότητες p73-ρυθμίζονται. Αποδείχθηκε επίσης ότι σε απόκριση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία ή σισπλατίνη θεραπεία, ρ73 διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο στη μετάδοση του αποπτωτικού σηματοδότησης [44]. Σε ινοβλάστες ποντικού που υπερεκφράζουν

ν-Ha-ras

, PKC δ αλληλεπιδρούν με και περαιτέρω ενεργοποιείται p73 να ενεργοποιήσει ένα αποπτωτικό κρίσης [28]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι ρ73 φωσφορυλιώθηκε σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που φιλοξενούν μεταλλαγμένα

K-ras

, και στη συνέχεια ρυθμίζεται προς τα πάνω το επίπεδο της έκφρασης του αποπτωτικού παράγοντα PUMA. Ο υποκείμενος μηχανισμός με τον οποίο PUMA συμμετέχει σε αυτή την αποπτωτική διαδικασία παραμένει να διερευνηθεί περαιτέρω.

Εν ολίγοις, γενετικές μεταλλάξεις στο

K-ras

εμφανίζονται μοναδικά που υπάρχουν στο 90% των ανθρώπινων παγκρεατικών αλλοιώσεων του καρκίνου και αυτή η ασθένεια είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου από καρκίνο. Επομένως, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για ανακαλύψεις αποτελεσματικών θεραπειών κλινικά.