Αφηρημένο

Ογκογόνες σηματοδότησης προωθεί την εισβολή και μετάσταση όγκου, εν μέρει, με την αύξηση της έκφρασης των τρι- και τετρα- διακλαδισμένης Ν-γλυκάνες. Τα διακλαδισμένα Ν-γλυκάνες δεσμεύονται με γαλεκτίνες σχηματίζοντας ένα πολυδύναμο πλέγμα που ενισχύει κυτταρική επιφάνεια κατοικίας των υποδοχέων αυξητικού παράγοντα, και εστιακή κύκλο εργασιών συγκόλλησης. Ν-ακετυλογλυκοζαμινυλοτρανσφεράση Ι (MGAT1), η πρώτη διακλάδωση ένζυμο στο μονοπάτι, που απαιτείται για την προσθήκη όλων των μετέπειτα κλάδους. Εδώ έχουμε εισαγάγει MGAT1 shRNA σε ανθρώπινα HeLa τραχήλου της μήτρας και PC-3-Κίτρινο κύτταρα όγκου προστάτη γραμμές, δημιουργώντας κυτταρικές γραμμές με μειωμένη μεταγραφή, τη δραστηριότητα του ενζύμου και διακλαδισμένα Ν-γλυκάνες στην κυτταρική επιφάνεια. MGAT1 knockdown ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων HeLa και εισβολή, αλλά δεν μετέβαλε τα ποσοστά πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Η σβαϊνσονίνη, ένας αναστολέας της α-μαννοσιδάσης II αμέσως κατάντη του MGAT1, επίσης ανέστειλε την εισβολή κυττάρων και δεν ήταν προσθετική με MGAT1 shRNA, συνεπή με ένα κοινό μηχανισμό δράσης. Εστιακή πρόσφυση και την οργάνωση μικρονηματίων σε MGAT1 νοκ ντάουν κύτταρα δείχνουν επίσης μια λιγότερο κινητικό φαινότυπο.

In vivo

, MGAT1 knockdown στο ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου του προστάτη PC-3-Κίτρινο μειώθηκε σημαντικά πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου και τη συχνότητα των πνευμονικών μεταστάσεων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το κλείδωμα MGAT1 είναι ένας πιθανός στόχος για αντικαρκινική θεραπεία

Παράθεση:. Beheshti Zavareh R, Sukhai MA, Hurren R, Gronda Μ, Wang Χ, Simpson CD, et al. (2012) καταστολή του καρκίνου Εξέλιξη από MGAT1 shRNA Νοκ ντάουν. PLoS ONE 7 (9): e43721. doi: 10.1371 /journal.pone.0043721

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 4η Μαΐου, 2012? Αποδεκτές: 23 Ιούλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 του Σεπτεμβρίου του 2012

Copyright: © Beheshti Zavareh et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα ήταν χρηματοδοτήθηκε από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (CIHR) (MOP-62975) και τον Καναδά Έρευνας πρόεδρος (CRC) (950 έως 202.079) για να JWD, και του Καναδά Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (CIHR) για τις διαφημίσεις, που είναι CIHR κλινικού επιστήμονας και λευχαιμία και λέμφωμα Κοινωνία Μελετητής στην κλινική έρευνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μεταστατικούς καρκίνους έχουν γενικά κακή πρόγνωση, και δείχνουν περιορισμένη αποκρίσεις σε χημειοθεραπεία και νεότερες στοχευμένες θεραπείες [1]. Η απόλυση σε υποδοχείς της ανάπτυξης και της σηματοδότησης συμβάλλει στην εισβολή και την αντίσταση των ναρκωτικών, ένα πρόβλημα που μπορεί να αντιμετωπιστεί με την εξέταση πρόσθετων επίπεδα ρύθμισης ανάδρασης. Από την άποψη αυτή, οι υποδοχείς είναι Ν-γλυκοζυλιωμένη στο ER και οι Ν-γλυκάνες remodeled στο Golgi στη διαδρομή προς τα κύτταρα επιφανειακά [2]. Ογκογόνο μετασχηματισμό αυξάνει Ets-καθοδηγούμενη μεταγραφή του Ν-ακετυλογλυκοζαμινυλοτρανσφεράση V που κωδικοποιείται από Mgat5, ένα μεσαίο ένζυμο Golgi που κινεί την κεραία β1,6GlcNAc σε τρι-και τετρα- διακλαδισμένο Ν-γλυκάνες [3] – [5]. Υπερ-έκφραση του Mgat5 σε αθανατοποιημένη επιθηλιακά κύτταρα έχει αποδειχθεί ότι χαλαρώνουν τους ελέγχους ανάπτυξη και την προώθηση της ογκογένεση όταν τα κύτταρα εγχέονται σε ποντικούς [6]. Η επαγόμενη ογκογόνο έκφραση του Mgat5 και β1,6GlcNAc τρι- και τετρα- διακλαδισμένο Ν-γλυκάνες προϊόντων συσχετίζονται με μακρινή μετάσταση και μειωμένη επιβίωση σε ανθρώπινους καρκίνους του μαστού και του παχέος εντέρου [7], [8]. Στα ποντίκια, την εξέλιξη του όγκου καθυστερείται στην πολυώματος-virus μεσαία Τ διαγονιδιακά (PyMT) και το ΡΤΕΝ

+/- μοντέλα καρκίνου σε ανεπαρκή φόντο Mgat5 [9], [10]. Επιπλέον, ο αναστολέας σβαϊνσονίνη Golgi α-μαννοσιδάσης II αναστέλλει τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων σε μοντέλα ποντικών, και ελέγχθηκε με πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα σε κλινικές δοκιμές [11], [12].

γαλεκτίνες συνδέονται προς τα Ν-γλυκανών επί των υποδοχέων και διαλυμένης ουσίας μεταφορείς με συγγένειες ανάλογη με διακλάδωση και ο αριθμός των Ν-γλυκανών (θέσεις σύνδεσης NXS /T) [13], [14]. Γαλεκτίνη-3 έχει δειχθεί ότι συνδέονται εγκάρσια γλυκοπρωτεΐνη υποδοχείς στην κυτταρική επιφάνεια, σχηματίζοντας ένα δυναμικό πλέγμα που επιβραδύνει διακίνησης σε ενδοσώματα επικαλυμμένα-pit και σχεδίες caveolin-1 λιπιδίων, προωθώντας έτσι την επιφάνεια παραμονής και ευαισθησία σε συνδέτες [14], [15 ]. Το πλέγμα είναι ετερογενής και έχει δειχθεί να ρυθμίζει επιφάνεια συγκράτησης του EGF, ΤΟΡ-β και οι υποδοχείς του VEGF [14], [16], καθώς και GLUT-2, -4 μεταφορέων γλυκόζης και TRPV5 Ca

++ κανάλι [13 ], [17], [18] (Εικόνα 1). Διακλαδισμένης Ν-γλυκάνες ενισχύσει επίσης τον κύκλο εργασιών υπόστρωμα και κυτταρικών συμφύσεις, υποστηρίζοντας την επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) σε καρκινικά κύτταρα [19], [20]. Επιπλέον, Mgat5 έκφραση διαγονιδίου σε δέρμα ποντικού προάγει ΕΜΤ-φαινότυπο και την επούλωση τραυμάτων [21]. Mgat5

– /- PyMT-μαστικού όγκου κύτταρα σε καλλιέργεια δείχνουν μειωμένη επιφάνεια κατοικία των υποδοχέων κυτοκίνης, η οποία μπορεί να διασωθεί από (i) Mgat5 επανέκφραση, (ii) αναστολή συστατική ενδοκυττάρωση, (iii) εξάντληση των caveolin-1 και (iv) με ΟΙοΝΑο συμπλήρωση προς UDP-ΟΙοΝΑο η κοινή δότης για τα ένζυμα Mgat [13], [14]. ΟΙοΝΑο συμπληρωμάτων σε Mgat5

– /- κύτταρα αυξάνει την περιεκτικότητα των δι- και τρι-κεραίες Ν-γλυκάνες, η οποία διασώζει συγγένειες για γκαλεκτίνη-3 χωρίς το προϊόν Mgat5 [13]. Αυτό υποδηλώνει απολύσεων στο Ν-γλυκάνης δομές και τα προφίλ που μπορούν να υποστηρίξουν την κακοήθη φαινότυπο.

ολιγοσακχαρυλοτρανσφεράση (OST) αντικαθιστά NXS /T περιοχές των πρωτεϊνών στο τραχύ ενδοπλασματικό δίκτυο (RER), μεταφέροντας το προ-συναρμολογημένα γλυκάνης από GLC

3Man

9GlcNAc

2-pP-δολιχόλη στον Αδη. Γλυκοπρωτεΐνες κυκλοφορίας στο Golgi όπου ανακαινίστηκε οι Ν-γλυκάνες, και οι δομικές λεπτομέρειες εξαρτώνται από την έκφραση του ενζύμου και την παροχή UDP-GlcNAc. Τα ένζυμα διακλάδωσης Mgat1, Mgat2, Mgat4, και Mgat5 διαφέρουν σε τιμές Km για UDP-ΟΙοΝΑο «D» και για γλυκοπρωτεΐνη δέκτη «Α». Η οδός έχει εξελιχθεί για μονοπάτι ultrasensitivity να UDP-ΟΙοΝΑο. Τα επιτόπια ολοκληρωθεί το trans-Golgi (μικρό κουτί) όπου αυτό είναι αποτελεσματικό υποκατάστασης με Gal παράγει το επιτόπιο LacNAc, και μπορεί να παραταθεί με πολυ-LacNAc. Περαιτέρω επέκταση με γαλακτόζη δημιουργεί επιτόπων για γκαλεκτίνη δεσμευτικές, με επιπτώσεις στη δυναμική του υποδοχέα, οι αλληλεπιδράσεις και της εμπορίας.

Η

Mgat1 καταλύει την προσθήκη του πρώτου καταστήματος, και το προϊόν που απαιτούνται για τη δράση της α-μαννοσιδάση II και Mgat2, και στη συνέχεια Mgat4 και Mgat5 σε μια καταλυτικά διαταχθεί μονοπάτι [2] (Σχήμα 1). Χαμηλή Mgat1 δραστηριότητα περιορίζει την έξοδο της τρι και τετρα-διακλαδισμένα τελικών προϊόντων, αλλά τα υψηλά επίπεδα μπορεί επίσης να κάνει το ίδιο, αποστερώντας της προσφοράς UDP-GlcNAc να Mgat4 και Mgat5 ένζυμο αργότερα στην οδό. Πράγματι, Mgat ένζυμα οθόνη μειώνοντας συγγένεια για UDP-ΟΙοΝΑο, η οποία καταλήγει σε μονοπάτι ultrasensitivity, με χαρακτηριστικό σιγμοειδές παραγωγή προϊόντων Mgat5 σε απόκριση σε αυτό το κοινόχρηστο μεταβολίτη [13]. Τα υποστρώματα εξοζαμίνης μονοπάτι διασταυρώνονται με βασικό μεταβολισμό που είναι γνωστό ότι υφίστανται εκτεταμένη μεταβολή στα καρκινικά κύτταρα [22]. UDP-ΟΙοΝΑο σύνθεση από την οδό εξοζαμίνης εξαρτάται από γλυκόζη, γλουταμίνη, και παροχή ακετυλο-CoA προς την οδό εξοζαμίνης, όπως επίσης και ΘΙοΝΑο διάσωσης. ΟΙοΝΑο και ΟΙοΝΑο-ρ μπορεί να είναι αυξημένα σε ένα ενδιάμεσο στάδιο στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη [23], και μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην προώθηση της προόδου όγκου [24]. Ως εκ τούτου, αναστέλλοντας διακλάδωση νωρίς το μονοπάτι μπορεί να είναι μια βιώσιμη στρατηγική για την αποφυγή του μεταβολισμού αποζημίωση.

Για να ξεκινήσει τη διερεύνηση του ρόλου του MGAT1, δημιουργήσαμε ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών που εκφράζουν σταθερά MGAT1 shRNA, και πέτυχε -70% καταστολή του διακλαδισμένης

Ν

-γλυκάνες και η επεμβατική φαινότυπο, χωρίς να αλλοιώνεται ο πολλαπλασιασμός και η βιωσιμότητα σε καλλιέργεια κυττάρων. MGAT1 knockdown μειωμένη ανάπτυξη και μετάσταση ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Αν και MGAT1 απαιτείται για την ανάπτυξη του ποντικιού πέρα ​​ημέρα Ε9.5 [25], [26], τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η μερική συστημική εξάντληση των MGAT1 σε ενήλικες μπορεί να είναι ανεκτή και έχει σημαντικές αντικαρκινικές επιδράσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

HeLa ανθρώπινου τραχηλικού καρκινικά κύτταρα (αγορασμένα από την ATCC) διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο κατά Dulbecco Μέσο Eagle (DMEM). PC-3-Κίτρινο κύτταρα (μια ιδιαίτερα μεταστατική κλώνος PC-3 ανθρώπινου προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή που εκφράζει σταθερά κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (RFP) και πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), η οποία ήταν ένα δώρο από G. Glinsky, Ordway Research Institute, [27 ]) διατηρήθηκαν σε RPMI 1640. Όλα τα κύτταρα συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Hyclone, Logan, UT), αντιβιοτικά, καλλιεργείται σε ένα πρότυπο υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα.

L-PHA πρόσδεση σε κυτταρική επιφάνεια γλυκάνες

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 500 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά προσκολλώνται διάρκεια της νύχτας, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 3,7% φορμαλδεΰδη και πλένονται. Επιφανειακή τρι- και τετρα-διακλαδισμένα

N-γλυκάνες

βάφτηκαν με L-ΡΗΑ (20 μg /mL) συζευγμένο με Alexa Fluor 488 ή Alexa Fluor 647 και οι πυρήνες βάφτηκαν με 5 μg /ml του 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη, διγαλακτικό (ϋΑΡΙ, διγαλακτικό) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Η συνολική ένταση της χρώσης L-PHA σε κάθε κύτταρο ήταν ποσοτικά με τη χρήση Cellomics ArrayScan II (Cellomics, Pittsburgh, PA) [13].

MGAT1 αποσιώπηση από λεντοϊού-παραδοθεί RNA

παρεμβολές

Κατασκευή φορείς φουρκέτα-pLKO.1 (φέρει ένα πουρομυκίνη γονίδιο αντίστασης σε αντιβιοτικά) που περιέχει μικρή φουρκέτα RNA ακολουθίες και την παραγωγή των ιών shRNA (shRNA) έχουν περιγραφεί λεπτομερώς [28]. Οι Τα siRNAs που στοχεύουν στην κωδικοποιητικές αλληλουχίες MGAT1 έχουν ως εξής:

MGAT1

-sh1 (NM_002406), 5′-CCCTGAGATCTCAAGAACGAT-3 ‘? και

MGAT1

-sh2 (NM_002406), 5′-GCACCTCAAGTTTATCAAGCT-3 ‘. Οι shRNA ελέγχου αλληλουχίες κωδικοποίησης έχουν ως εξής: RFP, 5’-CTACAAGACCGACATCAAGCT-3 ‘και LacZ, 5′-CCGTCATAGCGATAACGAGTT-3’. Λεντοϊών μολύνσεις έγιναν ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Εν συντομία, προσκολλημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5 mL του ιού που ακολουθείται από ολονύκτια επώαση (37 ° C, 5% CO

2) χωρίς την αφαίρεση του ιού. Την επόμενη ημέρα, ιικό μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιείχε πουρομυκίνη (1 μg /mL) για να επιλέξετε έναν πληθυσμό ανθεκτικών κυττάρων.

ανάστροφης τρανσκριπτάσης PCR πραγματικού χρόνου

πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε από 1 μα επεξεργασμένου με ϋΝάση ολικό κυτταρικό RNA με χρήση τυχαίων εκκινητών και SuperScript II αντίστροφη μεταγραφάση (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. PCR δοκιμασίες σε πραγματικό χρόνο πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν με 5 ng του RNA ισοδύναμο cDNA, SYBR Green PCR κύριο μείγμα (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), και 400 ηΜ του γονιδίου-ειδικών εκκινητών. Οι αντιδράσεις υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και αναλύθηκαν σε έναν ΑΒΙ 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Εμπρός /πίσω ζεύγη εκκινητών PCR για την ανθρώπινη cDNA που είχαν ως εξής: ανθρώπινα ΟΙοΝΑο-TI: Προώθηση 5′-CGGAGCAGGCCAAGTTC-3 ‘, 5′-Αντίστροφη CCTTGCCCGCAGTCCTA-3′, 18S: προς τα εμπρός 5’-ΑΟΟ ΑΑΤ TGA CGG ΑΑΟ GGC AC- 3 ‘, αντίστροφη 5′-GGA CAT CTA ΑΓΓ GCA TCA CA-3’. Σχετική έκφραση mRNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCT όπως περιγράφεται.

δραστηριότητες

ΟΙοΝΑο-τρανσφεράση

Η ενζυματική δράση της MGAT1was μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα συνθετικό υποδοχείς όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Εν συντομία, κυτταρολύματα επωάστηκαν με αποδέκτη MGAT1 Manα (1,3) [Manα (1,6)] Glcβ1-Ο- (CH

2)

7CH

3 (Toronto Research Chemicals, Toronto, ON ), σε διάλυμα που περιέχει 0,5 mM UDP- [6

3Η] GlcNAc (44,400 dpm /nmol), 125 mM MES (ρΗ 6,5), 50 mM ΟΙοΝΑο, 1 mM UDP-ΟΙοΝΑο, 0.8 mM ΑΜΡ και 10 mM MnCl2 . Μετά την επώαση, η αντίδραση διεκόπη με την προσθήκη παγωμένου H

2O. Μεταφορά [6

3Η] ΟΙοΝΑο στον δέκτη ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση υγρού σπινθηρισμού.

Μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες

εισβολή και τη μετανάστευση δοκιμασίες σε κύτταρα HeLa έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30 ]. Εν συντομία κύτταρα HeLa (2 × 10

5) συλλέχθηκαν και εμβολιάστηκαν σε μη επικαλυμμένα θαλάμους εισβολή για την δοκιμασία μετανάστευσης ή σε BIOCOAT Matrigel εισβολής Επιμελητήρια (BD Biosciences, Mississauga, ΟΝ) για αναλύσεις εισβολή. Για δοκιμασίες τόσο η μετανάστευση και εισβολή, μέσο ανάπτυξης που περιείχε 10% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκτικό στον πυθμένα καλά. Μετά από 48 ώρες επώασης, τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει ή εισβάλει στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης βάφτηκαν με Diff-Quik Stain (BD Biosciences). Ο αριθμός των μεταναστεύει ή εισβάλλοντας κυττάρων απεικονίστηκαν και μετρήθηκαν με τη χρήση της Aperio ScanScope CS ολόκληρο το σαρωτή διαφανειών (AperioTechnologies, Vista, CA) και Image-Pro Plus λογισμικό (έκδοση 4.5? Media Κυβερνητικής Inc., Silversprings, MD). Προκειμένου να δοκιμαστεί η επίδραση του ταυτόχρονη αναστολή MGAT1 και θεραπεία σβαϊνσονίνη, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2 μΜ σβαϊνσονίνη για 72 ώρες πριν από τη μετανάστευση και την εισβολή προσδιορισμός όπως περιγράφεται ανωτέρω.

Για να εκτιμηθεί εισβολή και μετανάστευσης σε PC- 3-Κίτρινο κύτταρα, τα κύτταρα του ορού στερηθεί τη διάρκεια της νύχτας και σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο 16 φρεατίων CIM-Plate (Roche Applied Sciences) για δοκιμασίες μετανάστευσης ή Matrigel (BD Biosciences, Mississauga, ΟΝ) επικαλυμμένο πλακίδιο για δοκιμασίες εισβολή. Το χαμηλότερο θάλαμο που περιέχει 20% FBS ως χημειο-προσέλκυσης και τις πλάκες τοποθετήθηκαν στην Roche xCELLigence Real-Time κυττάρων πλατφόρμα Analyzer (RTCA) DP (Roche Applied Sciences). μετρήσεις σε πραγματικό χρόνο έγιναν κάθε πέντε λεπτά επί 36 ώρες. Η RTCA Analyzer μετρά την ηλεκτρική αντίσταση των κυττάρων που κινούνται προς την κάτω επιφάνεια της μεμβράνης, και συγκρίνει καλά με την μέθοδο κύτταρο-καταμέτρηση παραπάνω.

Η ανοσοκυτταροχημεία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν επί επικαλυμμένων με ινονηκτίνη καλυπτρίδες (Sigma-Aldrich, Oakville, ON). Μετά προσκολλώνται διάρκεια της νύχτας, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 2% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά, που ακολουθείται από διαπερατοποίηση χρησιμοποιώντας 0,2% Triton-X-100. Μετά τον αποκλεισμό με 5% BSA για 1 ώρα, τα κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντι-β1 ποντικού ιντεγκρίνης (1:200, Millipore) ή αντι-φωσφο-παξιλλίνη (pY31) αντίσωμα (1:400, Epitomics). Οι καλυπτρίδες πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-ποντικού IgG-Cy3 δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο γαϊδάρου (1:200, Millipore) για β1 ιντεγκρίνης ή αντι-κουνελιού IgG-FITC συζευγμένο αντίσωμα (1:500, Millipore) για παξιλλίνη. Χρώση για ακτίνη έγινε με phalloidin συζευγμένο με τετραμεθυλροδαμίνη Β ισοθειοκυανική (TRITC, Sigma-Aldrich) για 10 λεπτά. Μετά την πλύση με PBS, καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε διαφάνειες χρησιμοποιώντας μέσο στερέωσης φθορισμού και απεικονίζεται χρησιμοποιώντας το φακό της Zeiss LSM700 συνεστιακό μικροσκόπιο (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Germany) 40 ×.

In vivo μοντέλο του προστάτη καρκίνο μετάστασης

σχηματισμό Distant όγκου αξιολογήθηκε

in vivo

όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Εν συντομία, PC-3-Κίτρινο κύτταρα που εκφράζουν σταθερώς RFP με και χωρίς MGAT1 knockdown, εγχύθηκαν ορθοτοπικά στα προστάτες του ακτινοβοληθεί με υποθανάτια δόση (3,5 Gy) ποντίκια SCID. Ποντικοί ενέθηκαν με καρκινικά κύτταρα διατηρήθηκαν για 4 εβδομάδες μετά την έγχυση, στον οποίο χρόνο, τα ζώα θανατώθηκαν μέσω αυχενικής εξάρθρωσης για την πλήρη εξέταση. Red όγκοι φθορισμού ανιχνεύθηκαν μέσω ολόκληρο το σώμα απεικόνισης και απεικόνισης ολόκληρου του οργάνου χρησιμοποιώντας ένα στερεομικροσκόπιο φθορισμού Leica MZ FLIII με μια λάμπα 100 W υδραργύρου, ένα φίλτρο 560/40 διέγερσης, και ένα φίλτρο εκπομπής 610 μακράς-pass. Εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή της Olympus DP70 σε 0,8 × μεγέθυνση και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Image 6.0 (Κυβερνητικής Media) Pro Plus. Ένα ενιαίο κοινό όριο αυτό εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμό και τη μέτρηση του φθορισμού σε κάθε όργανο όπως ο αριθμός των φθοριζόντων κηλίδων ανά πνεύμονα λοβό. Τα ποντίκια ελήφθησαν από ένα πρόγραμμα αναπαραγωγής in-house και στεγάζεται σε ράφια κλουβί στρωτή ροή υπό τυποποιημένες περιβαλλοντικές συνθήκες με το

κατά βούληση

πρόσβαση σε τροφή και νερό. Όλα τα πειράματα έχουν εγκριθεί από το τοπικό θεσμικό ηθική αναθεώρηση της επιτροπής (επιτροπή του Πανεπιστημίου Υγείας Network-Οντάριο Ινστιτούτο Καρκίνου των ζώων Φροντίδα και Χρήση) και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους κανονισμούς του Καναδικού Συμβουλίου Φροντίδας Ζώων. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

MGAT1 shRNAi μειώνει Ν-γλυκάνη διακλάδωση, η μετανάστευση κυττάρων και εισβολή

Για την αξιολόγηση των κυττάρων αυτόνομη συνέπειες της εξάντλησης MGAT1 σε κακοήθη κυτταρική ανάπτυξη και εισβολή, HeLa ανθρώπινου τραχηλικού καρκινικά κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό φορείς shRNA αλληλουχίες στόχευσης MGAT1 ή ελέγχου, και σταθερούς πληθυσμούς κυττάρων επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη. Target knockdown χρήση δύο ανεξάρτητων αλληλουχιών shRNA επιβεβαιώθηκε με qRT-PCR (Σχήμα 2Α). shRNA1 και shRNA2 μείωσε επίσης MGAT1 ενζυματική δραστηριότητα και μειωμένη χρώση κυτταρικής επιφάνειας L-ΡΗΑ σε αναλογία με την εξάντληση του mRNA και ενζυμικής δραστικότητας (Σχήμα 2Β, C). L-PHA δεσμεύεται με προϊόντα κατάντη του MGAT1, το τρι- β1,6GlcNAc και τετρα-διακλαδισμένο Ν-γλυκάνες [32]. MGAT1 knockdown δεν μετέβαλε την κυτταρική βιωσιμότητα ή τον πολλαπλασιασμό (σχήμα 2D και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α) κύτταρα HeLa μολύνθηκαν με φορείς λεντοϊού στόχευση MGAT1 (shRNA1 ή shRNA2) ή τον έλεγχο shRNA αλληλουχίες. πληθυσμοί σταθερές κυτταρικές επιλέχθηκαν με την προσθήκη πουρομυκίνης (1 μg /mL). Α) MGAT1 mRNA μετρήθηκαν με qRT-PCR, Β) ενζυμική δραστηριότητα MGAT1, C) L-PHA αντιδραστική επιφάνεια Ν-γλυκανών από Array μικροσκόπιο σάρωσης, D) Ο πολλαπλασιασμός επί 4 ημέρες Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD σχετική έκφραση του mRNA σε σχέση με το αλληλουχία ελέγχου (n = 3 ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν).

η

για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της MGAT1 shRNA2 knockdown για τη μετανάστευση των κυττάρων HeLa και εισβολή, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε θαλάμους σε πορώδη φίλτρα σε ελεύθερο ορού μέσο, ​​και 10% FBS τοποθετήθηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειο-προσελκυστικό. μετανάστευση των κυττάρων στον κάτω θάλαμο μετρήθηκε 48 ώρες αργότερα. Παρόμοιες μελέτες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας επικαλυμμένα με Matrigel φίλτρα για τη μέτρηση της κυτταρικής εισβολής μέσω ενός φράγματος. Εξόντωση MGAT1 μειώθηκε κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, κατ ‘αναλογία προς εξάντληση MGAT1 (Σχήμα 3Α, 3Β). Ο αποκλεισμός του μονοπατιού ένα βήμα προς τα κάτω των MGAT1, σε α-μαννοσιδάση II, χρησιμοποιώντας σβαϊνσονίνη επίσης ανέστειλε την εισβολή, όπως έχει ήδη αναφερθεί [33], [34]. θεραπεία σβαϊνσονίνη μόνος παρεμπόδισε τη μετανάστευση και την εισβολή, αλλά σε μικρότερο βαθμό από ό, τι shRNA2. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο παράλογο α-μαννοσιδάσης IIx, η οποία είναι λιγότερο ευαίσθητη σε σβαϊνσονίνη. Είναι σημαντικό, η σβαϊνσονίνη δεν είχε επιπλέον επιδράσεις στα κύτταρα MGAT1 shRNA2, γεγονός που υποδηλώνει ότι η βέλτιστη καταστολή της μετανάστευσης και της εισβολής με τη στόχευση της οδού διακλάδωση παρατηρείται με εξάντληση ~ 70% των MGAT1 (Σχήμα 3C, 3D).

Α) HeLa κύτταρα τοποθετήθηκαν σε θαλάμους με πόρους 8-μm και 10% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκτικό. κύτταρα Β) HeLa απλώθηκαν σε θαλάμους εισβολή με Matrigel. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου των πόρων σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν αυτόματα. Γ) μετανάστευση και Δ) δοκιμασίες εισβολή με ή χωρίς προκατεργασία για 72 ώρες με 2 μΜ σβαϊνσονίνη (SW) για 72 ώρες πριν. Ο μέσος αριθμός κυττάρων μετανάστευσαν ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν απεικονίστηκαν γραφικά. (Ε) η μορφολογία των κυττάρων με χρώση με φωσφο-παξιλλίνη και TRITC-συζευγμένο phalloidin για το F-ακτίνη, εμφανίζεται ως νέα εικόνα.

Η

ποσοστά μετανάστευσης των κυττάρων εξαρτώνται εν μέρει από α5β1 επαφές υποδοχέα ιντεγκρίνης με υπόστρωμα ινονεκτίνη , τα οποία διεγείρουν εστιακό συμφύσεις σηματοδότησης, ο κύκλος εργασιών και πρόωσης [35]. Τα διακλαδισμένα Ν-γλυκάνες προϊόντα MGAT5 υπάρχουν σε α5β1, μεταξύ άλλων υποδοχείς και πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας, και έχει αποδειχθεί ότι για την προώθηση της α5β1 ενεργοποίηση, σηματοδότηση, και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων [19]. Ιντεγρίνης αποτελέσματα ενεργοποίηση σε φωσφορυλίωση παξιλλίνης με FAK και Src, που οδηγεί σε F-ακτίνη αναδιαμόρφωση και κυτταρική κινητικότητα [36]. Σε κύτταρα HeLa με MGAT1 νοκ ντάουν, τα F-ακτίνης ίνες στρες ήταν μικρότερο σε διάμετρο, λιγότερο συγκλίνουσες σχετικά με τις προβλέψεις των κυττάρων, και έτειναν να περιορίζουν το κύτταρο (Σχήμα 3Ε). Χρώση ρ-παξιλλίνη αποκάλυψε μικρότερες και περισσότερες συστοιχίες στην άκρη του κυτταρικές προεξοχές. Σε αντίθεση, ο έλεγχος κύτταρα HeLa είχε εμφανή και μακριές ίνες στρες που προεξέχει μέσα ψευδοπόδια τελειώνει με μεγαλύτερα χρώση εστιακές συμφύσεις φωσφο-παξιλλίνης, χαρακτηριστικό ενός πιο κινητικό φαινότυπο από τα MGAT1 knockdown κυττάρων.

MGAT1 knockdown μειώνει την ανάπτυξη του όγκου και μετάσταση

in vivo

Η

Για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της MGAT1 νοκ ντάουν σε ένα ζωικό μοντέλο της μετάστασης του καρκίνου, χρησιμοποιήσαμε τα ανθρώπινα PC-3-Κίτρινο καρκινικά κύτταρα του προστάτη, μια καθιερωμένη μοντέλο ξενομοσχεύματος. PC-3-Κίτρινο κύτταρα μολύνθηκαν με τον φακοϊό περιέχει MGAT1 shRNA2 ή αλληλουχίες ελέγχου, και σταθερούς πληθυσμούς κυττάρων επιλέχθηκαν ως ανωτέρω. MGAT1 mRNA, ενζυματική δραστικότητα και κυτταρική επιφάνεια διακλάδωση ήταν όλα εξαντλημένο από ~ 70% (Σχήμα 4Α-C). MGAT1 knockdown μειωθεί τόσο κυτταρική μετανάστευση και η κυτταρική εισβολή σε ένα in vitro και in vivo μοντέλο (Σχήμα 4D, E). MGAT1 knockdown δεν μεταβάλλει την ανάπτυξη και τη βιωσιμότητα των PC-3-Κίτρινο κύτταρα (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, οι

in vitro

φαινοτύπους ήταν αξιοσημείωτα παρόμοια με τα αποτελέσματα του MGAT1 knockdown σε κύτταρα HeLa. Για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της MGAT1 knockdown σε μετάσταση, τον έλεγχο ή MGAT1 knockdown PC-3-Κίτρινο καρκίνου του προστάτη κύτταρα εγχύθηκαν ορθοτοπικά σε αδένες του προστάτη του υπο-θανατηφόρα ακτινοβολημένων SCID ποντικών (η = 15 ανά ομάδα). Τέσσερις εβδομάδες μετά την ένεση, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και μακρινό σχηματισμό όγκων στα όργανα φωτογραφήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού. Οι όγκοι αναπτύσσονται στον προστάτη σε όλα τα ποντίκια που ενέθηκαν με MGAT1 knockdown και ελέγχου RFP-επισημασμένο PC-3-Κίτρινο κύτταρα. Σε ποντικούς που ενέθηκαν με κύτταρα ελέγχου, σχηματισμό όγκου ανιχνεύθηκε σε κλινικά σχετικές θέσεις των μεταστάσεων, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, τους λεμφαδένες και ήπαρ. Ωστόσο, ο όγκος των όγκων μειώθηκε και λιγότερες απομακρυσμένων μεταστάσεων πνεύμονα παρατηρήθηκε σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με MGAT1 knockdown κυττάρων (Σχήμα 4F, G). Συνολικά, περισσότερο από τα ποντίκια στην ομάδα knockdown MGAT1 ήταν απαλλαγμένοι μεταστάσεων. Έτσι, στο σύνολό τους, MGAT1 νοκ ντάουν αναστέλλει τον σχηματισμό μακρινό όγκου

in vivo

.

PC-3-Κίτρινο κύτταρα με MGAT1-shRNA2 ή τον έλεγχο shRNA σειρές αξιολογήθηκαν για Α) επίπεδα MGAT1 mRNA από qRT-PCR. Β) ενζυμική δραστηριότητα MGAT1, C) L-PHA αντιδραστική επιφάνεια Ν-γλυκανών με Arrayscan μικροσκόπιο, D) εισβολή μέσω ενός φράγματος Matrigel και τη μετανάστευση (Ε) με τη χρήση του xCELLigence Real-Time Κυττάρων Analyzer. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD δείκτης κυττάρου (3 ανεξάρτητα πειράματα με τετραπλούν). (F) Το μέγεθος του όγκου και (G) μετάστασης σε ποντικούς που ενέθηκαν με PC-3-Κίτρινο κυττάρων με MGAT1-shRNA2 ή τις αλληλουχίες ελέγχου shRNA. Οι ποντικοί εγχύθηκαν ορθοτοπικά, με 0,5 × 10

6 κύτταρα ανά ποντικό, στον προστάτη των ποντικών SCID υπο-θανατηφόρα ακτινοβολημένα. Τέσσερις εβδομάδες μετά την ένεση, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και τα όργανά τους απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Οι αριθμοί των μεταστατικών οζιδίων σε όλες τις πέντε λοβούς των πνευμόνων ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης εικόνας. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει ένα ποντίκι.

Η

Εν ολίγοις, ~ 70% MGAT1 νοκ ντάουν καταστέλλουν Ν-γλυκάνης διακλάδωση και η επεμβατική φαινότυπο σε HeLa και PC-3-Κίτρινο κύτταρα. Σημαντικά, MGAT1 knockdown μειωμένη ανάπτυξη και μετάσταση του PC-3-Κίτρινο κύτταρα σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου του προστάτη. Κάθε ένα από τα Ν-γλυκάνης κλαδιά είναι ένα επιτόπιο για γαλεκτίνες, και σωρευτικά μπορούν να υποστηρίξουν την ανάπτυξη σηματοδότηση στην κυτταρική επιφάνεια. Αποζημίωση και διάσωσης του πλέγματος γκαλεκτίνη με μεταφορά επιτόπου μεταξύ των υποκαταστημάτων έχει παρατηρηθεί σε Mgat5

– /- τα καρκινικά κύτταρα [13] και στην Mgat4

– ιστών του ποντικιού [37] – /. Οι ογκογόνοι σηματοδότηση σε καρκινικά κύτταρα up-ρυθμίζει τη μεταγραφή και τις δραστηριότητες του MGAT4 και Mgat5 [4], [5], [38], καθώς και ενδιάμεσα εξοζαμίνης μονοπάτι [23], αλλά στοχεύουν MGAT1 αποφεύγει αυτά μηχανισμούς διάσωσης. Ως εκ τούτου, MGAT1 μπορεί να είναι χρήσιμη στόχοι στη θεραπεία του καρκίνου για να εμποδίσει τη μετάσταση, καθώς και την ανάπτυξη του όγκου.