Αφηρημένο

Ιστορικό

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι μια ιδιαίτερα δεσμοπλαστικού όγκου με μια μελαγχολική πρόγνωση για τους περισσότερους ασθενείς. Ίνωση και φλεγμονή είναι το σήμα κατατεθέν της desmoplasia όγκου. Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι εμποδίζει την ενεργοποίηση των παγκρεατικών αστεροειδή κύτταρα (ΚΕΕ) και την ανακούφιση desmoplasia είναι επωφελείς στρατηγικές για τη θεραπεία PDAC. Η μετφορμίνη είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο φάρμακο μείωσης της γλυκόζης. Είναι, επίσης, συχνά συνταγογραφείται σε ασθενείς διαβητική καρκίνο του παγκρέατος και έχει δειχθεί ότι συνδέουν με ένα καλύτερο αποτέλεσμα. Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί αυτής της παροχής παραμένουν ασαφείς. Η μετφορμίνη έχει βρεθεί ότι ρυθμίζουν τη δραστικότητα αστεροειδή κύτταρα σε άλλες ρυθμίσεις ασθένεια. Σε αυτή τη μελέτη, θα εξετάσει την επίδραση της μετφορμίνης στην ΕΠΑ δραστηριότητα, ίνωση και φλεγμονή στο PDACs.

Μέθοδοι /Αποτελέσματα

Στους υπέρβαρους διαβητικούς ασθενείς PDAC και προ-κλινικά μοντέλα ποντικών, η θεραπεία με μετφορμίνη μείωσε τα επίπεδα του όγκου εξωκυττάριας ουσίας (ECM) συστατικά, ιδίως υαλουρονάνη (ΗΑ).

In vitro

, βρήκαμε ότι η μετφορμίνη μειωμένη σηματοδότηση ΤΟΡ-β και την παραγωγή του ΗΑ και κολλαγόνου-Ι σε καλλιεργημένα ΚΕΕ. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η μετφορμίνη ανακουφίζει φλεγμονή του όγκου με μείωση της έκφρασης των φλεγμονωδών κυτοκινών συμπεριλαμβανομένων των IL-1β, καθώς και διείσδυση και Μ2 πόλωση των μακροφάγων που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ)

in vitro

και

in vivo

. Αυτά τα αποτελέσματα επί των μακροφάγων

in vitro

φαίνεται να συνδέεται με μια διαμόρφωση της οδού του ΑΜΡΚ /STAT3 με μετφορμίνη. Τέλος, βρήκαμε σε προκλινικά μοντέλα μας ότι η ανακούφιση του desmoplasia από τη μετφορμίνη συσχετίστηκε με μείωση της ECM αναδιαμόρφωση, επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) και τελικά συστημική μετάσταση.

Συμπέρασμα

η μετφορμίνη μειώνει τα ινο-φλεγμονώδη μικροπεριβάλλον σε παχύσαρκα /διαβητικά άτομα με καρκίνο του παγκρέατος μέσω του επαναπρογραμματισμού ΚΕΕ και ΤΑΜ, η οποία συσχετίζεται με μειωμένη την εξέλιξη της νόσου. Η μετφορμίνη θα πρέπει να ελεγχθεί /διερευνηθούν ως μέρος της στρατηγικής της θεραπείας σε υπέρβαρους PDAC ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη

Παράθεση:. Incio J, Suboj P, Chin SM, Vardam-Kaur T, Liu H, Hato T, et al. (2015) η μετφορμίνη μειώνει Desmoplasia σε καρκίνο του παγκρέατος μέσω του επαναπρογραμματισμού αστεροειδή κύτταρα και σχετίζονται με τον όγκο μακροφάγα. PLoS ONE 10 (12): e0141392. doi: 10.1371 /journal.pone.0141392

Επιμέλεια: Keping Xie, Το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 4, Ιουλίου 2015? Αποδεκτές: 6 Οκτώβρη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 7 Δεκ, 2015

Copyright: © 2015 Incio et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Διαθεσιμότητα

Δεδομένα: Όλα τα αρχεία δεδομένων είναι διαθέσιμα από τη βάση δεδομένων HARVARD DATAVERSE (αριθμός πρόσβασης (ες) https://dx.doi.org/10.7910/DVN/LLN5FL)

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (http: //nih.gov/? R35-CA197743, CA80124, CA85140, CA96915, CA115767 και CA126642 να RKJ και DF), το Ίδρυμα Lustgarten (https://www.lustgarten.org/? επιχορήγηση για έρευνα να RKJ) και το Ίδρυμα για την Επιστήμη και την Τεχνολογία (https://www.fct.pt/? Πορτογαλίας, POPH /πρόγραμμα χρηματοδότησης FSE, συντροφικότητα και επιχορήγηση για έρευνα στο JI). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς αυτού του χειρογράφου έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα ανταγωνιστικά συμφέροντα: RKJ λάβει αμοιβές συμβούλων από Ophthotech, SPARC, και SynDevRx. RKJ κατέχει μετοχές σε Enlight, Ophthotech, SynDevRx και XTuit και εξυπηρετεί στο Διοικητικό Συμβούλιο της XTuit και των διοικητικών συμβουλίων των Tekla Healthcare Investors, Tekla Επιστήμες της Ζωής επενδυτές, και Tekla Υγείας Opportunities Fund. Δεν αντιδραστήρια ή χρηματοδότηση από τις εταιρείες αυτές χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις μελέτες. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η πρόγνωση για τους ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος είναι θλιβερή, με συνολική πενταετής επιβίωση ποσοστό 7% [1]. Η παχυσαρκία και σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔΤ2) έχουν γίνει μια πανδημία σε όλο τον κόσμο [2, 3]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι αυτές οι μεταβολικές ανωμαλίες που σχετίζονται με την αυξημένη συχνότητα εμφάνισης, την εξέλιξη και την κακή πρόγνωση της PDAC [4-9]. Κατά τη διάγνωση, περίπου το ήμισυ των ασθενών PDAC είναι υπέρβαροι ή παχύσαρκοι, και έως 80% των ασθενών παρουσιάζουν διαβήτη ή δυσανεξία γλυκόζης [10-17]. DM2 και η παχυσαρκία μπορεί να προωθήσει PDAC μέσω προ-ογκογόνο ινσουλίνη και ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα-1 (IGF-1) [18-20], καθώς και χρόνια φλεγμονή [21, 22]. Ως εκ τούτου, οι φαρμακολογικές παρεμβάσεις που στοχεύουν διαβήτης /παχυσαρκία μπορεί επίσης να παράγει αποτελέσματα κατά των όγκων. Ένας τέτοιος παράγοντας, επί του παρόντος υπό έντονη έρευνα, είναι η μετφορμίνη, το πιο ευρέως συνταγογραφούμενο αντι-διαβητικό φάρμακο γενικής χρήσης που είναι επίσης συχνά χορηγείται σε ασθενείς PDAC διαβητική [23]. Η μετφορμίνη έχει αποδειχθεί για να βελτιώσει τα αποτελέσματα της θεραπείας σε προκλινικά μοντέλα PDAC [24-30]. Επιπλέον, μειώνει τη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του παγκρέατος σε διαβητικούς ασθενείς, καθώς βελτιώνει την επιβίωση (μειωμένο κίνδυνο θανάτου κατά 32%) σε νεοδιαγνωσθέντες περιπτώσεις [31-33]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί δράσης της μετφορμίνης σε καρκίνο του παγκρέατος δεν είναι καλά κατανοητοί.

In vitro

μελέτες έχουν ασχοληθεί με την επίδραση της μετφορμίνης σε παράγοντες μεταγραφής, microRNAs, βλάβη στο DNA, καρκινικά βλαστικά κύτταρα και τον μεταβολισμό [34-38]. Επιπλέον, η μετφορμίνη έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν τη λειτουργία των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων, να μειώσει το οξειδωτικό στρες στον καρκίνο που σχετίζεται με ινοβλάστες, και να μειώσει τη φλεγμονή του όγκου [34, 35, 39, 40]. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι επαναπρογραμματισμό ΚΕΕ μειώνει την παραγωγή εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) συστατικά όπως κολλαγόνο-Ι και υαλουρονάνη (ΗΑ), και επιβραδύνει την πρόοδο του καρκίνου του παγκρέατος [41-45]. Ωστόσο, η επίδραση της μετφορμίνης στην ΕΠΑ ενεργοποίηση, η παραγωγή των εξαρτημάτων ECM και desmoplasia όγκων δεν έχει περιγραφεί.

Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι να διευκρινίσει τις λειτουργικές τους μηχανισμούς της μετφορμίνης εντός του ινο-φλεγμονώδη μικροπεριβάλλον του όγκου PDAC.

In vivo

μελέτες των παγκρεατικών καρκίνων μέχρι σήμερα έχουν πραγματοποιηθεί κυρίως σε μοντέλα ξενομοσχεύματος σε κανονικό βάρος /ποντίκια μη διαβητικούς όπου μετφορμίνη έχει δειχθεί ότι είναι λιγότερο αποτελεσματική [26, 46-48]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε δύο ανοσοεπαρκών συγγενικά μοντέλα ποντικού που μιμούνται στενά την παχυσαρκία /dm2, να εκπροσωπεί καλύτερα παγκρέατος ασθενείς-τον καρκίνο πλειοψηφία των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος παρόν είτε με νέα εμφάνιση DM2 ή διαταραγμένη ανοχή στη γλυκόζη κατά τη στιγμή της διάγνωσης [10-17] – και ο πληθυσμός στόχος της μετφορμίνης. Επιπλέον, συμπληρώνονται τα μοντέλα ποντικού μας με

in vitro

μελετών καθώς και με την ανάλυση των ανθρώπινων δειγμάτων του καρκίνου του παγκρέατος από το φυσιολογικό βάρος και υπέρβαρων /παχύσαρκων ασθενών. Βρήκαμε ότι η μετφορμίνη επαναπρογραμματίζει άμεσα ΚΕΕ και ΤΑΜ και ανακουφίζει ίνωση και φλεγμονή σε παχύσαρκα /διαβητικά μοντέλα PDAC. Αυτές οι επιδράσεις της μετφορμίνης συσχετίζεται με μειωμένη αναδιαμόρφωση ECM και επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), τελικά επηρεάζουν μετάσταση. Επιβεβαιώσαμε ότι τα επίπεδα της ECM σε ανθρώπινα δείγματα PDAC σε υπέρβαρους και παχύσαρκους ασθενείς ήταν πράγματι χαμηλότερες στον πληθυσμό των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα πειράματα σε ζώα

Η θεσμική Φροντίδα των ζώων και την επιστημονική επιτροπή του Γενικού Νοσοκομείου της Μασαχουσέτης ενέκρινε όλες πειραματική χρήση των ζώων σε αυτή τη μελέτη. Όλες οι διαδικασίες ζώο ακολούθησε δημόσια υγεία πολιτική υπηρεσία στην ανθρώπινη φροντίδα των κατευθυντήριων γραμμών πειραματόζωα. Άγριου τύπου (WT) C57BL /6 και FVB αρσενικά ποντίκια είχαν αρχικά ελήφθησαν από το Εργαστήριο Jackson (το The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) και εκτρέφονται και συντηρούνται εγκατάσταση των ζώων που ορίζονται-χλωρίδα μας. Οι ποντικοί διατηρήθηκαν σε ένα κύκλο φωτός-σκότους 12-h σε εγκατάσταση φράγμα ελεγχόμενης θερμοκρασίας, με

κατά βούληση

πρόσβαση σε τροφή και οξινισμένο νερό. Για τη δημιουργία παχύσαρκος /διαβητικά μοντέλα ποντικιών, ποντίκια (ηλικίας 6 εβδομάδων) έλαβαν μια δίαιτα λίπος 60% (D12492, Έρευνας Δίαιτες, New Brunswick, NJ) για 10 εβδομάδες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [49-51] (χρόνος εμφύτευσης όγκου) και συνεχίστηκε για όλη τη διάρκεια των μελετών του όγκου. Για τα πειράματα του όγκου, ο PAN02 και AK4.4 συγγενικά PDAC μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν σε C57BL /6 και FVB ποντικούς ανοσοεπαρκείς, αντίστοιχα. κύτταρα PAN02 (

Smad4-M174

) [52] ελήφθησαν από την ATCC. κύτταρα AK4.4 (

KrasG12D

και

p53

+/-

) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr. Nabeel Bardeesy στο MGH. Αυτά τα κύτταρα απομονώθηκαν από ποντίκια παράγουν αυθόρμητα όγκους του παγκρέατος (

Ptf1-Cre /LSL-Kras

G12D

/p53

Lox /+

) [53]. Ορθοτοπική παγκρεατικών όγκοι που δημιουργούνται από την εμφύτευση ένα μικρό κομμάτι (1 mm

3) του βιώσιμου ιστού όγκου (από όγκο πηγή σε ένα ξεχωριστό ζώο δότης) μέσα στο πάγκρεας αρσενικών άπαχο ή παχύσαρκοι FVB (μοντέλο AK4.4) ή C57BL /6 (PAN02 μοντέλο) του ποντικιού. Και τα δύο μοντέλα όγκων που χρησιμοποιήθηκαν επικυρώνονται από IDEXX Laboratories. (PAN02: IDEXX Radil υπόθεση # 22.366 – 2.013 AK4.4:. IDEXX Radil υπόθεση # 27.818 – 2.014).

μελετών ανάπτυξης του παγκρέατος όγκου

Στις 7 ημέρες μετά την εμφύτευση, τα ποντίκια που φέρουν ορθοτοπική PAN02 ή AK4.4 όγκους του παγκρέατος τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες ελέγχου ή θεραπεία με μετφορμίνη. Την ημέρα 21, δείγματα πλάσματος και όγκου συλλέχθηκαν, και οι όγκοι ζυγίστηκαν και υπέστησαν επεξεργασία για περαιτέρω ανάλυση.

μετφορμίνη θεραπεία

Η συνήθης δόση μετφορμίνης για την αγωγή ανθρώπων είναι 1000 με 2500 mg, συνήθως χορηγούμενη δύο φορές ημερησίως. Στην παρούσα μελέτη, η μετφορμίνη χορηγήθηκε σε 300 mg /kg στο πόσιμο νερό. Αυτό μπορεί να μεταφραστεί με την ανθρώπινη ισοδύναμη δόση με τη χρήση της μεθόδου Reagan-Shaw [54]. Σύμφωνα με τον τύπο για το ανθρώπινο ισοδύναμο της δόσης [(mg /kg) = δόση ζώο (mg /kg) x ζώο (km) /ανθρώπου (km). Χιλιομέτρων για ένα 60 kg ενήλικες ανθρώπους ισούται με 37 και για ισούται με ένα 20 g ποντίκι 3], το ανθρώπινο ισοδύναμο του ποντικού δόση των 300 mg /kg είναι 1459 mg για έναν μέσου μεγέθους 60 kg ενήλικα άνθρωπο. Ως εκ τούτου, η επιλεγμένη δόση στην παρούσα μελέτη είναι μέσα στην ασφαλή θεραπευτικού εύρους καταγράφονται σε ανθρώπους. Επιπλέον, η παρούσα μελέτη προσδιορίστηκε η θεραπευτική περίοδος να είναι 2 εβδομάδες για να αξιολογηθεί η αντικαρκινική δράση της μετφορμίνης. Αυτό ήταν συμβατή με τις θεραπευτικές περιόδους που αναφέρθηκαν σε προηγούμενες μελέτες [55, 56]. Φρέσκο ​​μετφορμίνη χορηγήθηκε σε πόσιμο νερό κάθε 3 ημέρες. Η ποσότητα που προστίθεται σε κάθε κλουβί ζώο υπολογίστηκε με βάση τη μέση ημερήσια πρόσληψη νερού για το εν λόγω κλωβού κατά τη διάρκεια περιόδου 2 εβδομάδες πριν από την έναρξη της θεραπείας, και να ρυθμίζεται κάθε τρεις ημέρες με βάση την κατανάλωση νερού και το σωματικό βάρος των ζώων. Η κατά προσέγγιση συγκέντρωση πλάσματος μετφορμίνης σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 λήψη αυτού του φαρμάκου είναι 0.05 mM, αν και μπορεί να συσσωρεύεται σε ιστούς και να φθάσει τοπικά υψηλότερες συγκεντρώσεις [35]. Για

in vitro

πειράματα, μια σειρά συγκέντρωσης 0,05 έως 25 mm ανάλογα με την κυτταρική σειρά που χρησιμοποιείται (δείτε παρακάτω για περισσότερες λεπτομέρειες).

Επίδραση της μετφορμίνης στο ΚΕΕ και των μακροφάγων

in vitro

Η

Πρότυπο προσδιορισμοί ΜΤΤ πραγματοποιήθηκαν σε ΚΕΕ και τα μακροφάγα που έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη σε μια σειρά από 0.05-25mM, για να εξετάσει τις πιθανές επιπτώσεις στη βιωσιμότητα των κυττάρων. RAW 264.7 (ποντικού λευχαιμικά μονοκύτταρα-μακροφάγα) ελήφθησαν από την ATCC και χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η επίδραση της μετφορμίνης επί μακροφάγων

in vitro

. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 10 cm

2 τρυβλία Petri σε μέσα ορού /χωρίς ορό και έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη για 48 ώρες σε συγκεντρώσεις κυμαινόμενη από 0,05 έως 0,4 mM (συγκεντρώσεις που δεν επηρεάζουν ουσιαστικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων). Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για RNA και πρωτεϊνική εκχύλιση, προκειμένου να εκτελέσει την εν συνεχεία ανάλυση του γονιδίου έκφραση κυτοκινών και δεικτών πόλωση, και για την ανάλυση των σημάτων και μεταβολικές οδούς. Ανθρώπινα ΚΕΕ σπάρθηκαν σε 10 cm

2 τρυβλία Petri σε μέσο με 2,5% ορό και έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη για 48 ώρες σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 0,1 έως 10 mm. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για εκχύλιση πρωτεΐνης για ανάλυση της ενεργοποίησης των οδών ίνωσης που σχετίζονται. Επιπλέον, ΚΕΕ σπάρθηκαν σε ένα slide θάλαμο 8 φρεατίων (20.000 κύτταρα /φρεάτιο), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μετφορμίνη (1 mM, μια συγκέντρωση που δεν επηρεάζει την κυτταρική βιωσιμότητα) για 48 ώρες, και χρώση ανοσοφθορισμού εκτελέσθηκε ακολουθώντας τυποποιημένα πρωτόκολλα. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και δεσμεύτηκαν με 5% φυσιολογικό ορό γαϊδάρου για 1 ώρα. Αυτά επωάστηκαν με τις ορισθείσες πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C και στη συνέχεια για 2 ώρες με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα σε RT. PBS χρησιμοποιήθηκε για όλες τις πλύσεις, και τα χρωματισμένα δείγματα στερεώθηκαν με Prolong Χρυσό με DAPI. Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται και οι ρυθμίσεις απόκτησης εικόνας που περιγράφεται παρακάτω. Και οι δύο τύποι κυττάρων αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (Sigma, St. Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με 5% (ν /ν) θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS? Sigma), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5%, CO

2

Ανθρώπινα δείγματα

Ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του παγκρέατος ελήφθησαν από το αποθετήριο ιστό MGH (http:. //www.massgeneral.org/research/resourcelab.aspx?id=31) κάτω από ένα ενεργό IRB πρωτόκολλο (αριθμός έγκρισης Partners Healthcare IRB: 2013P001969). Γραπτή συγκατάθεση από τον δότη ή τον πλησιέστερο συγγενή λήφθηκε για τη χρήση αυτών των δειγμάτων για ερευνητικούς σκοπούς. Οι όγκοι που επιλέγεται δεν έλαβαν προηγούμενη χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία πριν από τη χειρουργική δείγμα συλλέχθηκε κατά τη στιγμή της εκτομής του όγκου. Συνολικά 28 δείγματα επιλέχθηκαν τυχαία από αυτό το υποσύνολο των δειγμάτων. Ο δείκτης μάζας σώματος λήφθηκε για το αντίστοιχο δείγμα. 7 από τα δείγματα (25%) αντιστοιχούν σε ασθενείς, οι οποίοι αντιμετωπίζονται με μετφορμίνη κατά το χρόνο της εκτομής. Παραφίνης τομές χρωματίσθηκαν για κολλαγόνο-Ι και ΗΑ όπως περιγράφεται παρακάτω. Εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία και ποσοτικά με τη χρήση Matlab. Τα δεδομένα αναλύθηκαν ανώνυμα.

Γονιδιακής Έκφρασης

Αμέσως μετά εκτομή, ιστός όγκου ήταν snap-κατεψυγμένα και αποθηκεύονται σε υγρό άζωτο. Ολικό RNA εκχυλίστηκε και σχετική γονιδιακή έκφραση μακροφάγων δεικτών Μ1 /Μ2 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο πρωτόκολλο SYBR πράσινο βάση. Επιπλέον, το συνολικό RNA εκχυλίζεται, και η σχετική γονιδιακή έκφραση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας σύστημα RT2 Profiler PCR Arrays (Qiagen) σε ένα Stratagene Mx3000P QPCR System με τη χρήση προκατασκευασμένων συστοιχίες μονοπάτι εστιασμένη ( «ίνωσης»-CAT Number:. PAMM011Z? «Επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) «- Cat Αριθμός:. PAMM090Z?» TGF-β στόχους σηματοδότησης «-PAMM235Z?» Εξωκυττάρια Matrix & amp? Πρόσφυση Μόρια:? κοινή κυτοκινών »-CAT Αριθμός: PAMM021Z«-CAT Αριθμός PAMM013Z και. «. ).

Έκφραση πρωτεΐνης

ανάλυση κηλίδος Western.

Κάθε δείγμα όγκου ομογενοποιήθηκε άμεσα με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για εκχύλιση των πρωτεϊνών. 20ug μετουσιωμένης πρωτεΐνης ανά δείγμα φορτώθηκε σε 7%, 10%, και 12% πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν: φωσφο-ρ38 MAPKT

180 /Y182 και p38? φωσφο-ΙΝΚ (SAPK /JNK)

Thr183 /Tyr185 και JNK? φωσφο-AKT

Ser473 και AKT, φωσφο-ΕΚΚ (ρ44 /42 ΜΑΡΚ)

T202 /Y204 και ERK? φωσφο-NF-κΒ

Ser536 και ΝΚ-κΒ? p65

Ser536? φωσφο-Smad2

Ser465 /467 και Smad2? φωσφο-IGF-I Receptor SS

Tyr1135 και IGF? Φωσφο-IRS-1

Ser612 και IRS? IR? phpspho-STAT3

Tyr705 και STAT3? Φωσφο-AMPKα

Thr172 και Ampkα? φωσφο-Ampkβ

Ser108 και ΑΜΡΚ? φωσφο-ACC

Ser79 και ACC? Φωσφο-PDGF υποδοχέων SS

Tyr751 και PDGF υποδοχέων SS και σαλιγκάρι, e-cadherin και βιμεντίνης, TGF-β, β-κατενίνης, συστροφή, LC3B. Όλα τα αντισώματα που αναφέρονται παραπάνω ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ), και αραιώνεται 1: 1000 με την εξαίρεση της φωσφο-ΙΝΚ (SAPK /JNK)

Thr183 /Tyr185, φωσφο-NF-κΒ ρ65

Ser536 , φωσφο-Smad2

Ser465 /467, φωσφο-IGF-I Receptor SS

Tyr1135, Διασπασμένη κασπάση-3, φωσφο-IRS-1

Ser612. Άλλα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: αSMA και φωσφο-Υποδοχέα Ινσουλίνης

Y972 (1: 1000 και 1: 500, Abcam, ΜΑ)? COL-1 (1: 1000)? MMP-9 και MMP-2 (1: 500 και 1: 200, EMD Millipore-Billerica, ΜΑ), ΑΤ1 (1: 1000, Διάρκεια ζωής BioSciences Inc, WA), ZEB1 (1: 1000, Novus Biologicals, CO), και SS-ακτίνη (1: 5000, Sigma, ΜΟ). Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης της πρωτεΐνης σε σχέση με το συνολικό υποδοχέα ή β-ακτίνης ελήφθη με τη χρήση του λογισμικού J Image.

Multiplex σειρά.

Κάθε δείγμα όγκου ομογενοποιήθηκε άμεσα σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για εκχύλιση των πρωτεϊνών. 2 μικρογραμ /ul του δείγματος που χρησιμοποιείται. Ένας πολυχώρος φλεγμονώδεις κυτοκίνες σειρά πολλαπλών πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε (κιτ ποντικού V-PLEX Προφλεγμονώδεις Panel1, Cat Αριθμός:. K15048D). Για την ανάλυση ELISA

ανοσοφθορισμού /Ανοσοϊστοχημεία

Για την ανάλυση των κατεψυγμένων τμημάτων του ποντικιού ιστούς όγκων, οι όγκοι αποκόπηκαν και καταψύχθηκαν σε βέλτιστη ένωση θερμοκρασίας κοπής (Tissue-Tek). Εγκάρσια τμήματα του όγκου, πάχους 10 μm, ανοσοχρωματίστηκαν με ειδικά αντισώματα. Για να αποκτήσετε μωσαϊκό εικόνων των τμημάτων όγκων, χρησιμοποιήθηκε ένα Olympus FV1000 ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ. Ένας αντικειμενικός 10χ αέρα αποκτήθηκαν 1260-μm τετράγωνα πλακίδια, και ένα αυτοματοποιημένο στάδιο σαρώνεται σε όλη τη διατομή του ιστού του όγκου. Οι απεικονίζεται κεραμίδια ήταν ραμμένο σε μία τελική μωσαϊκό εικόνα χρησιμοποιώντας το λογισμικό της Olympus. έκφραση αντιγόνου προσδιορίστηκε ποσοτικά με μέτρηση της περιοχής που καταλαμβάνεται από το λεκέ ενδιαφέροντος κανονικοποιηθεί από την περιοχή του ϋΑΡΙ-χρωματισμένων πυρήνων (δηλαδή, αδιάστατη), και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο αλγόριθμο σε MATLAB (Οι MathWorks). Ταυτόσημα ρυθμίσεις και τα κατώτατα όρια για ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν για όλους τους όγκους. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοφθορισμό ήταν τα ακόλουθα: Το κολλαγόνο-Ι [LF-68 αντίσωμα, 1:50 αραίωση, που παρέχονται από τον Δρ Larry Fisher (NIDCR)]? Η υαλουρονάνη (βιοτινυλιωμένο υαλουρονάνη πρωτεογλυκάνης θραύσμα, 385911, Calbiochem, αραίωση 1: 200)? αSMA (αντίσωμα C6198, Sigma, αραίωση 1: 500)? και F4 /80 (MCA497A488 αντίσωμα, ABDserotec, 1: 200 αραίωση). Cy3-, Cy5- ή συζευγμένο με FITC δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των σημάτων με συνεστιακή μικροσκόπηση. Διαφάνειες Ακολούθησε χρώση με DAPI για την πυρηνική χρώση.

MMP δραστηριότητα δοκιμασία

Κάθε δείγμα όγκου ομογενοποιήθηκε άμεσα σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για εκχύλιση των πρωτεϊνών. Ένα πρότυπο εμπορική δοκιμασία (Abcam ab112146) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της γενικής δραστηριότητας των ΜΜΡ στα δείγματα του όγκου. λύματα όγκων επωάστηκαν με ένα φθορίζον υπόστρωμα [φθορισμού μεταφοράς ενέργειας συντονισμού (FRET) πεπτίδιο] για 1, 2, και 16 ώρες, και ο φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακός φθορισμού.

Κυτταρομετρίας Ροής

φέροντα-όγκους ποντίκια διαποτίστηκαν μέσω ενδοκαρδιακή ένεση του PBS και θυσιάστηκαν. Παγκρέατος ιστούς όγκων συλλέχθηκαν, κιμά, και χωνεύεται σε 37 ° C για 1 ώρα με DMEM που περιείχε κολλαγενάση τύπου 1Α (1,5 mg /ml), υαλουρονιδάση (1,5 mg /mL), και DNase (2 μg /mL). Τα μίγματα πέψης διηθείται μέσω σουρωτήρια κυττάρου 70-μm. Single-κυτταρικά εναιωρήματα επωάστηκαν με αντι-ποντικού αρουραίου CD16 /CD32 mAb για το κλείδωμα και βάφτηκαν με συζευγμένο με ένα φθοριόχρωμα αντισώματα σε ψυχρό ρυθμιστικό (1% BSA, 0,1% NaN3 σε PBS). 7-αμινο-ακτινομυκίνη D (7ΑΑϋ) αντιδραστήριο (eBioscience) προστέθηκε με την λεκιασμένη σωλήνες ανά τις οδηγίες του κατασκευαστή αμέσως πριν από την εκτέλεση της ανάλυσης ροής. Η κυτταρομετρία ροής δεδομένων αποκτήθηκαν σε μία ροή LSRII κυτταρόμετρο (Becton Dickinson) και αναλύθηκαν με λογισμικό FACSDiva. FSC-A εναντίον FSC-W και SSC-Α ως προς SSC-W εφαρμόστηκαν σε διακρίσεις τα δυάδα /συγκεντρωτικά γεγονότα. Τα ακόλουθα μονοκλωνικά αντισώματα αντι-ποντικού χρησιμοποιήθηκαν: CD45-ΡΕ, CD45-PE-Cy7, CD45-FITC, CD11b-APC-Cy7, CD11b-APC, F4 /80-APC (BD Biosciences) και F4 /80-FITC και F4 /80-ΡΕ (eBioscience).

μακροφάγων απομόνωση

Μετά την κοπή του ιστού του όγκου σε τεμάχια 0,5 mm σε διάμετρο, οι όγκοι διαχωρίστηκαν με κολλαγενάση και υαλουρονιδάση για μία ώρα. Διαχωρισμένα όγκοι πλύθηκαν με ρυθμιστικό διαλογής (0.5% BSA σε PBS) και πέρασε μέσα από κυτταρικές σουρωτήρια πριν αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας Fcr και στη συνέχεια επωάστηκαν με μια F4 /80 βιοτινυλιωμένο πρωτεύον αντίσωμα (eBiosciences) για 15 λεπτά. Αντι-βιοτίνης συζευγμένα μαγνητικά σφαιρίδια (Miltenyl Biotech) προστέθηκαν στο κυτταρικό εναιώρημα και επωάζεται για 15 λεπτά πριν από την έκθεση των κυττάρων σε μαγνητικές στήλες (MACS LS-στήλες από Miltenyl Biotech) για διαχωρισμό των κυττάρων.

Στατιστική ανάλυση

οι στατιστικές διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν από μια δύο ουρών Student t-test. Αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση του σωματικού βάρους την πάροδο του χρόνου μεταξύ του ελέγχου και των ομάδων που έλαβαν μετφορμίνη. Η συχνότητα εμφάνισης της μετάστασης και τοίχου εισβολή αναλύθηκε χρησιμοποιώντας chi-square. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού Prism Graphpad. Όλα τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν η τιμή Ρ ήταν μικρότερη από 0,05 όταν υπολογίζεται με την κατάλληλη στατιστική δοκιμή. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα.

Αποτελέσματα

μετφορμίνη μειώνει desmoplasia σε ποντικού και ανθρώπου PDACs

Έχουμε δείξει ότι η μείωση του desmoplasia ελάττωσης συστατικών ECM όπως ως ΗΑ και κολλαγόνου-Ι-in PDACs ενισχύουν θεραπείες κατά του όγκου [41-43]. Ως εκ τούτου, εμείς εξέτασε τη σχέση μεταξύ της θεραπείας με μετφορμίνη και desmoplasia σε PDACs στην χημειο /ακτινοθεραπεία αφελείς χειρουργικά δείγματα PDAC. Βρήκαμε ότι σε υπέρβαρους ή παχύσαρκους ασθενείς υπό αγωγή με μετφορμίνη, τα επίπεδα της HA ήταν 30% χαμηλότερα από ό, τι σε ασθενείς που δεν λαμβάνουν μετφορμίνη (Σχήμα 1i και 1II). Είναι ενδιαφέρον, καμία διαφορά στα επίπεδα ΗΑ παρατηρήθηκε σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη με φυσιολογικό βάρος. Από την άλλη πλευρά, η θεραπεία με μετφορμίνη δεν φάνηκε να έχει καμία επίδραση στην έκφραση του κολλαγόνου-Ι είτε σε ομάδα βάρος σώματος (S1 Σχήμα).

(i) Αντιπροσωπευτικές εικόνες ιστολογία που δείχνει την επίδραση της μετφορμίνης στα επίπεδα όγκου σε υαλουρονάνη φυσιολογικό βάρος [δείκτη μάζας σώματος (ΔΜΣ) & lt? 25)] ή παχύσαρκοι ασθενείς υπέρβαρων /(ΒΜΙ & gt? 25) (n = 22 ελέγχους, 7 μετφορμίνη). (Ii) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των συνολικών επιπέδων υαλουρονάνης όγκου. Η μετφορμίνη μειώνει την υαλουρονάνη-θετικό κλάσμα περιοχής (%) σε υπέρβαρα /παχύσαρκα άτομα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα. * P & lt? 0,05 έναντι ελέγχου σε ασθενείς με ΔΜΣ & gt?. 25

Η

Για να αξιολογηθεί αν θα μπορούσαμε να συνοψίσουμε τα ευρήματα αυτά σε προ-κλινικά μοντέλα, που χρησιμοποιούνται FVB και C57BL /6 ποντίκια που τρέφονταν με μια δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά . Εμείς, μαζί με άλλους έχουν δείξει ότι μια διατροφή υψηλή σε λιπαρά επάγει την παχυσαρκία και μεταβολικές ανωμαλίες που χαρακτηρίζουν DM2, αυξημένα επίπεδα γλυκόζης, ινσουλίνης και IGF-1 [50, 57-60] σε αυτά τα στελέχη. Μετά από 10 εβδομάδες στο υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά δίαιτα, AK4.4 και οι όγκοι είχαν PAN02 ορθοτοπικά εμφυτεύθηκαν σε παχύσαρκους FVB και C57BL /6 ποντίκια, αντίστοιχα. Τα ζώα κατανεμήθηκαν τυχαία σε μετφορμίνη σε πόσιμο νερό (300 mg /kg) ή καμία αγωγή την ημέρα 7 έως την ημέρα 21, όταν συλλέχθηκαν πλάσμα και όγκους. Η θεραπεία με μετφορμίνη συσχετίζεται με μειωμένη έκφραση του ΗΑ κατά 64% (Σχ 2Ai και 2Aii) και του κολλαγόνου-Ι κατά 35% (Σχ 2Ai και 2Aiii) σε AK4.4. όγκων. Επιπλέον, το ποσοστό των ενεργοποιημένων ΚΕΕ (όπως προσδιορίζεται από την έκφραση του άλφα-λείου μυός αντιγόνο, αSMA) λόγω συν-εκφράζουν ΗΑ και κολλαγόνου-Ι μειώθηκαν κατά 58 και 38%, αντίστοιχα (Σχ 2Bi-2Biii). Σε μια δεύτερη, λιγότερο δεσμοπλαστικού μοντέλο (PAN02), μετφορμίνη μείωσε την έκφραση του ΗΑ κατά 40% και του κολλαγόνου-Ι κατά 22%, αν και δεν ήταν στατιστικά σημαντική (S2i-S2iii σχήμα). Παρ ‘όλα αυτά, η μετφορμίνη μείωσε σημαντικά την πυκνότητα του κολλαγόνου-Ι θετικών ενεργοποιημένων ΚΕΕ σε όγκους κατά 54% σε αυτό το μοντέλο (Σχ S2V). Η πυκνότητα του ΗΑ θετική ενεργοποιηθεί ΚΕΕ σε όγκους PAN02 μειώθηκε επίσης κατά 57% (S2iv σχήμα), αλλά δεν έφτασε σημασία. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι υποδοχέων της αγγειοτασίνης-II 1 (ΑΤ1) είναι κρίσιμη για το ΗΑ και την παραγωγή κολλαγόνου-Ι σε PDACs [43]. Πράγματι, παρατηρήσαμε ότι η μετφορμίνη ήταν σε θέση να μειώσει την έκφραση των ΑΤ1 (Σχήμα 2C). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η μετφορμίνη μειώνει desmoplasia σε PDACs στα υπέρβαρα /παχύσαρκα οικοδεσπότες.

Μετά από 10 εβδομάδες υψηλή σε λιπαρά διατροφή, οι όγκοι AK4.4 ήταν ορθοτοπικώς εμφυτεύονται σε παχύσαρκα ποντίκια FVB. Τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε μετφορμίνη σε πόσιμο νερό (300 mg /kg) ή καμία αγωγή την ημέρα 7 έως την ημέρα 21, όταν συλλέχθηκαν όγκους. (Α-ί) Αντιπροσωπευτικές εικόνες ανοσοϊστοχημεία που δείχνει την επίδραση της μετφορμίνης επί υαλουρονάνης όγκου και τα επίπεδα του κολλαγόνου-Ι σε όγκους AK4.4 (n = 3-4). (Α-ΙΙ) Ποσοτικοποίηση της έκφρασης υαλουρονάνης σε όγκους AK4.4. Η μετφορμίνη μειώνει την υαλουρονάνη-θετικό κλάσμα περιοχής (%). (Α-ΙΙΙ) Ποσοτικοποίηση της έκφρασης κολλαγόνου-Ι σε όγκους AK4.4. Η μετφορμίνη μειώνει το κολλαγόνο-Ι-θετικό κλάσμα περιοχής (%). (Bi) Αντιπροσωπευτικές εικόνες ανοσοϊστοχημεία που δείχνει την επίδραση της μετφορμίνης επί της έκφρασης (συν-εντοπισμό) επιπέδων υαλουρονάνη και κολλαγόνο-Ι σε ενεργοποιημένα (αSMA-θετικό) παγκρεατικά αστεροειδή κύτταρα (ΚΕΕ) σε όγκους AK4.4 (n = 3-4) . (Β-ii) Ποσοτικοποίηση της έκφρασης υαλουρονικού στο ΚΕΕ. Η μετφορμίνη μειώνει το ποσοστό των ενεργοποιημένων ΚΕΕ εκφράζουν υαλουρονάνη. (Β-ΙΙΙ) Ποσοτικοποίηση της έκφρασης κολλαγόνου-Ι σε ΚΕΕ. Η μετφορμίνη μειώνει το ποσοστό των ενεργοποιημένων ΚΕΕ που εκφράζουν κολλαγόνο-Ι. (C-i) Αντιπροσωπευτική Western blots για υποδοχέα-1 (ΑΤ1) έκφραση της αγγειοτασίνης-II σε όγκους AK4.4. SS-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης. (C-ii) Η πυκνομετρική ανάλυση των ΑΤ1 έκφρασης κανονικοποιούνται SS-ακτίνης. Η μετφορμίνη μειώνει την έκφραση του ΑΤ1. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα. * P & lt? 0,05 ενάντια στον έλεγχο.

Η

μετφορμίνη επηρεάζει desmoplasia με την άμεση μείωση της σηματοδότησης ΤΟΡ-β και την παραγωγή κολλαγόνου-Ι /ΗΑ με ΙΕΑ

Το κολλαγόνο-Ι και ΗΑ παράγονται κυρίως από ενεργοποιημένα ΚΕΕ σε PDACs [43, 61]. Για να προσδιοριστεί αν η θεραπεία με μετφορμίνη μπορεί να μειώσει άμεσα το κολλαγόνο-Ι έκφραση /ΗΑ στο ΚΕΕ, επωάσαμε ΚΕΕ

in vitro

με μετφορμίνη. Βρήκαμε ότι, σε μία δόση (1 mM) που δεν επηρεάζει ουσιαστικά την βιωσιμότητα των ΚΕΕ (S3 Εικ), μετφορμίνη μείωσε την έκφραση του ΗΑ και κολλαγόνου-Ι (Εικ 3ΑΙ-3Aiii). Αυτό δείχνει μετφορμίνη δρα στο ΚΕΕ για τη μείωση της παραγωγής αυτών των κρίσιμων στοιχείων ECM. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η μετφορμίνη (0,1-1 mM) μειωμένη έκφραση των ΑΤ1, TGF-β και κατάντη σηματοδότησης μέσω SMAD-2, καθώς και PDGF-β, όλους τους βασικούς παίκτες στην παραγωγή ECM από την ΚΕΕ (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, η μετφορμίνη επηρέασε επίσης την ενεργοποίηση των κανονικών μονοπατιών σηματοδότησης που προωθούν PSC ενεργοποίηση και ίνωση [62], και ιδίως ERK, ρ38, και STAT3, αν και σε σχετικά υψηλότερες δόσεις (1-10 mM) (σχήμα 3Β). Είναι σημαντικό ότι, σε ολόκληρο όγκους, μετφορμίνη μειωμένη ενεργοποίηση της STAT3 και στα δύο μοντέλα, με μια τάση για μειωμένη ενεργοποίηση ρ38 σε PAN02 (S4i-S4iii Σχήμα), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μετφορμίνη μπορεί να συσσωρεύονται σε συγκεντρώσεις αρκετά υψηλές ώστε να επηρεάσει αυτά τα μονοπάτια σηματοδότησης

in vivo

. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η μετφορμίνη επηρεάζει desmoplasia με άμεση μείωση των ΑΤ1 /TGF-β /STAT3 σηματοδότηση και την παραγωγή κολλαγόνου-Ι /ΗΑ με ΚΕΕ.

(Α) ΚΕΕ επωάστηκαν

in vitro

με μετφορμίνη (1 mM) για 48 ώρες. (Α-ί) Αντιπροσωπευτικές εικόνες ανοσοκυτταροχημεία δείχνει την επίδραση της μετφορμίνης επί υαλουρονάνης όγκου και τα επίπεδα του κολλαγόνου-Ι σε ανθρώπινα παγκρεατικά αστεροειδή κύτταρα (ΚΕΕ)

in vitro

(n = 2). (Α-ΙΙ) Ποσοτικοποίηση της έκφρασης υαλουρονικού στο ΚΕΕ. Η μετφορμίνη μειώνει την έκφραση του υαλουρονικού στο ΚΕΕ. (Α-ΙΙΙ) Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του κολλαγόνου-Ι σε ΚΕΕ. Η μετφορμίνη μειώνει την έκφραση του κολλαγόνου-Ι σε ΚΕΕ. αSMA δηλώνει ενεργοποιηθεί ΚΕΕ. (Β) Αντιπροσωπευτική στυπώματα Western για την έκφραση των δεικτών ίνωσης που σχετίζονται και πρωτεΐνες σηματοδότησης σε ΚΕΕ έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη σε 0, 0,1, 1 και 10 mM. Η μετφορμίνη μειώνει την έκφραση των δεικτών ίνωσης που σχετίζονται και πρωτεΐνες σηματοδότησης σε ΚΕΕ. Η πυκνομετρική ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε SS-ακτίνης ή ολική πρωτεΐνη (στην περίπτωση των φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών) απεικονίζεται ως αριθμοί κάτω από τις αντιπροσωπευτικές μπάντες. Τα δεδομένα στο Α παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα. * P & lt? 0,05 ενάντια στον έλεγχο.

Η

Η μετφορμίνη βελτιώνει επίσης desmoplasia εμποδίζοντας την πρόσληψη και Μ2 πόλωση των μακροφάγων σε PDACs

Η φλεγμονή που εμφανίζεται σε PDACs είναι ένα σημαντικό συστατικό της desmoplasia [63]. Ειδικότερα, τα μακροφάγα σχετίζονται με τον όγκο (ΤΑΜ) αποτελούν σημαντική πηγή κυτοκινών που επιδεινώνουν desmoplasia στο PDACs [64] και να επηρεάσει αρνητικά την έκβαση της νόσου [65]. Ως εκ τούτου, έχουμε προσδιορίζεται εδώ η επίδραση της μετφορμίνης σε ΤΑΜ διείσδυση σε όγκους. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα TAM ήταν 60% χαμηλότερα με τη θεραπεία με μετφορμίνη στο μοντέλο AK4.4 (Σχήμα 4Α). Μπορούν επίσης έτειναν να είναι χαμηλότερες (~ 30%, όχι σημαντική) στο μοντέλο PAN02 (S5A σχήμα). Για να προσδιορίσετε μια άμεση επίδραση της μετφορμίνης σε μακροφάγα, που επωάζονται τα μακροφάγα με μετφορμίνη

in vitro

για 48 ώρες σε αυξημένες συγκεντρώσεις. Βρήκαμε ότι η μετφορμίνη επηρέασε την βιωσιμότητα των μακροφάγων σε δόσεις των 0,4 mM ή υψηλότερη (S6 Εικ). Η μετφορμίνη σε μια συγκέντρωση 0,05 mM (παρόμοια με την συγκέντρωση που μετράται σε πλάσμα των ασθενών που λαμβάνουν μετφορμίνη) μείωσε τους δείκτες Μ2 όπως Arg-1 και IL-10, ενώ η μετφορμίνη σε δόσεις υψηλότερες από 0,2 mm μειώνεται τόσο Μ1 και δείκτες Μ2 (Εικ 4Β ). Σε ΤΑΜ ροής διαλέγεται από όγκους PAN02

in vivo

, μπορούμε πράγματι επιβεβαίωσε επίδραση της μετφορμίνης για την έκφραση του Μ2 Σημάδια Arg-1 (~ 1/2) και IL-10 (~ 2/3) χωρίς που επηρεάζουν σημαντικά την έκφραση των δεικτών Μ1 (Σχήμα 4C). Στη συνέχεια προσπάθησε να καταλάβει πώς η μετφορμίνη επηρεάζει τα κύτταρα αυτά. Αρκετές κανονικά και μη κανονικά μονοπάτια σηματοδότησης μπορεί να ενεργοποιηθεί σε PDACs κατά την διάρκεια της φλεγμονής και την προώθηση της έκφρασης δεικτών Μ2 επί ΤΑΜ [66-69]. Συνεπής με τις επιδράσεις στην ΤΑΜ, μετφορμίνη μειωμένη ενεργοποίηση των STAT3, JNK, ρ38 ΑΚΤ και στα μακροφάγα

in vitro

σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες από 0,2 mM (Σχήμα 4D). Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, στο σύνολό τους όγκους μετφορμίνη μειωμένη ενεργοποίηση της STAT3 και στα δύο μοντέλα, με μια τάση για μειωμένη ενεργοποίηση της ρ38 σε PAN02, σύμφωνα με μας

in vitro

αποτελέσματα (S4i-S4iii Εικ). Έχει δειχθεί ότι η δραστηριότητα της STAT3 μειώνεται με μετφορμίνη μέσω ενεργοποίησης των μεταβολικών αισθητήρα ενέργειας AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (AMPK) σε πολλαπλούς τύπους κυττάρων [70]. Πράγματι, διαπιστώσαμε ότι τα ανασταλτικά αποτελέσματα της μετφορμίνης επί σηματοδότηση STAT3 σε μακροφάγα

in vitro

σχετίζεται με ενεργοποίηση AMPKα και κατάντη ένζυμο ακετυλ-ΟοΑ καρβοξυλάση (ACC) (το τελευταίο εμφανής μόνο σε μέσα προστίθενται ορού) σε αυτές κύτταρα (Σχ 4D και S7 Εικ). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η μετφορμίνη μειώνει ΤΑΜ διείσδυση, καθώς και την έκφραση των δεικτών Μ2, η οποία μπορεί να προκαλείται τουλάχιστον εν μέρει μέσω ΑΜΡΚ /STAT3 αναστολή σηματοδότησης στα μακροφάγα. Επιπλέον, η φλεγμονή σε όγκους χαρακτηρίζεται από μία περίσσεια των φλεγμονωδών κυτοκινών που προωθούν desmoplasia, και η μετφορμίνη έχει δειχθεί ότι επηρεάζουν πολλαπλές φλεγμονώδεις μεσολαβητές [34, 35]. 0.05, ** p & lt? * P & lt? * P & lt? 0.05, ** p & lt?