Αφηρημένο

Η μοριακή συνοδός Hsp90-εξαρτώμενη proteome αντιπροσωπεύει ένα πολύπλοκο δίκτυο πρωτεΐνης κρίσιμης βιολογικών και ιατρικών ενδιαφέρον. Γνωστή να συνδέσουν με πρωτεΐνες με μια ευρεία ποικιλία λειτουργιών ονομάζονται πελατών, Hsp90 διατηρεί βασικά απαραίτητη και ογκογόνο μονοπάτια σηματοδότησης. Κατά συνέπεια, οι αναστολείς της HSP90 δοκιμάζονται ως αντικαρκινικά φάρμακα. Χρησιμοποιώντας μια ολοκληρωμένη συστηματική προσέγγιση για την ανάλυση των επιπτώσεων της αναστολής Hsp90 στα Τ-κύτταρα, έχουμε ποσοτικά διαφορικό αλλαγές στο Hsp90-εξαρτώμενο proteome, Hsp90 interactome, και μια επιλογή από το μεταγραφικό. Kinetic συμπεριφορές στην Hsp90-εξαρτώμενη πρωτεώματος αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μία νέα στρατηγική παλμού-εκδίωξης (Fierro-Monti et al., Που συνοδεύουν το άρθρο), ανιχνεύοντας επιδράσεις τόσο σταθερότητα και την πρωτεϊνική σύνθεση. Παγκόσμια και συγκεκριμένες δυναμικές επιπτώσεις, συμπεριλαμβανομένων των proteostatic απαντήσεις, είναι λόγω της άμεσης αναστολής της Hsp90, καθώς και έμμεσες επιπτώσεις. Ως αποτέλεσμα, μια μείωση ανιχνεύτηκε στις περισσότερες πρωτεΐνες που άλλαξε τα επίπεδα τους, συμπεριλαμβανομένων των γνωστών πελάτες Hsp90. Το πιο πιθανό, συνέπειες για το ρόλο της Hsp90 στην έκφραση του γονιδίου προσδιορίζεται η συνολική μείωση των καθαρών

novo

σύνθεση de πρωτεΐνης. Η μείωση αυτή φαίνεται να είναι μεγαλύτερη σε μέγεθος από ένα ταυτόχρονα παρατηρείται συνολική αύξηση στα ποσοστά αποσύνθεσης πρωτεϊνών. Αρκετές νέες υποθετικές πελατών Hsp90 επικυρώθηκαν, και έχει ενδιαφέρον, οικογένειες πρωτεϊνών με κρίσιμες λειτουργίες, ιδιαίτερα την οικογένεια Hsp90 και τους εαυτούς τους συμπαράγοντες, καθώς και πρωτεϊνικών κινασών, εμφάνισε έντονα αυξημένα ποσοστά αποσύνθεσης λόγω της θεραπείας με αναστολέα Hsp90. Αξιοσημείωτα, έξαρση σε μονοπάτια επιβίωσης, με τη συμμετοχή μοριακοί συνοδοί και αρκετές ογκοπρωτεΐνες, και μειωμένα επίπεδα μερικών καταστολείς όγκων, έχει επιπτώσεις για αντικαρκινική θεραπεία με αναστολείς Hsp90. Η ποικιλομορφία των παγκόσμιων επιπτώσεων μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα παράδειγμα των μηχανισμών που λειτουργούν για να προστατεύσει τα κύτταρα από proteotoxic στρες, με την προώθηση της προ-επιβίωσης και αντι-πολλαπλασιαστική λειτουργίες. Τα δεδομένα είναι διαθέσιμα μέσω ProteomeXchange με αναγνωριστικό PXD000537

Παράθεση:. Fierro-Monti Ι, Echeverria P, Racle J, Hernandez C, D Picard, Quadroni Μ (2013) Δυναμική Επιπτώσεις της αναστολής της μοριακός συνοδός Hsp90 σε η T-Cell Proteome έχουν επιπτώσεις για Anti-Cancer Therapy. PLoS ONE 8 (11): e80425. doi: 10.1371 /journal.pone.0080425

Επιμέλεια: Lennart Martens, UGent /VIB, Βέλγιο

Ελήφθη: 30 Απριλίου, 2013? Αποδεκτές: 2 Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Νοεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Fierro-Monti et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τον αριθμό επιχορήγηση 31003A_127256 από το ελβετικό Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (www.snf.ch), καθώς και την εσωτερική χρηματοδότηση από το Πανεπιστήμιο της Λωζάννης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μοριακής συνοδοί είναι κεντρικής σημασίας για την κυτταρική proteostasis. Συμμετέχουν ενεργά στη θεμελιώδεις βιολογικές διεργασίες, όπως η μετάφραση, αναδίπλωση, συγκρότημα συναρμολόγησης και αποσυναρμολόγησης, μετατόπιση κατά μήκος των μεμβρανών και την υποβάθμιση των πρωτεϊνών [1], [2]. Η λειτουργική σημασία των μοριακών συνοδών και των επιπτώσεών τους σε νοσηρές καταστάσεις τους έχει επισημανθεί ως βασικοί στόχοι φάρμακο για τον καρκίνο [3], [4]. Στα ευκαρυωτικά, η πρωτεΐνη θερμικού σοκ 90 (Hsp90) παίζει ένα ξεχωριστό ρόλο ανάμεσα chaperones διευκολύνοντας την αναδίπλωση των παραγόντων μεταγραφής, ρύθμιση της ενεργοποίησης των κινασών [5], [6] και υποδοχείς στεροειδούς ορμόνης [7], βοηθώντας στο σχηματισμό συμπλέγματα πρωτεϊνών [8], [9], και παίζει ένα ρόλο στον κύκλο εργασιών και διακίνησης των πρωτεϊνών. Για την επίτευξη όλων αυτών των λειτουργιών, Hsp90 συνεργάτες με συν-συνοδούς, υποστρώματα Hsp90, και την αλληλεπίδραση των εταίρων τους [2], [6], [10]. Οι πελάτες Hsp90 ορίζονται ως πρωτεΐνες που εξαρτώνται από Hsp90. Τα καθαρά αφθονία των πολλών, αλλά όχι όλους τους πελάτες Hsp90, μειώνονται κατά αναστολή της HSP90, πιθανότατα λόγω της υποβάθμισης του πρωτεασώματος. Πελάτες με μια ευρεία ποικιλία λειτουργιών απαιτούν Hsp90 να αποκτήσει την κατάλληλη διαμόρφωση, για την ενεργοποίηση ή /και για τη σταθερότητα. Η υπερέκφραση του Hsp90 ως ενός ενεργοποιημένου συγκρότημα πολλαπλών συνοδός είναι συχνή σε κακοήθη κύτταρα [11], [12], και πολλοί πελάτες Hsp90 λάβουν μέρος σε μονοπάτια σηματοδότησης με ογκογόνο ενδιαφέρον [13], [14]. Αναστολή της Hsp90 μπορεί να εμποδίσει κλειδί οδούς για τον καρκίνο, η οποία είναι ο λόγος Hsp90 έχει προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον ως ένας στόχος για την ανάπτυξη φαρμάκων κατά του καρκίνου [12], [14], [15]. αναστολείς της HSP90, όπως γκελνταναμυκίνη (GA) είναι ανταγωνιστικοί αναστολείς της ΑΤΡ-δέσμευσης. Αυτές αναστέλλουν τη λειτουργία συνοδού, και κατά συνέπεια, μπορούν να ασκούν δραστικότητα κατά του όγκου με τη μείωση των επιπέδων των ογκογόνων πελάτες [12] – [14]. Επί του παρόντος, υπάρχουν περίπου 20 αναστολείς σε κλινικές μελέτες [13], [15].

Οι πρόσφατες προσπάθειες έχουν κατευθυνθεί για τον εντοπισμό και την ποσοτικοποίηση του τμήματος του πρωτεώματος που εξαρτάται από Hsp90, συνηθέστερα με τη χρήση τυποποιημένων SILAC (σταθερό ισότοπο Επισήμανση από τα αμινοξέα στο κελί Πολιτισμού, stSILAC) -με βάση ποσοτική πρωτεομική [11], [16] – [19]. Τα αποτελέσματα από αυτές και προηγούμενες μελέτες που χρησιμοποιούν διαφορετικές προσεγγίσεις πρωτεομική έχουν βελτιώσει την κατανόηση του ρόλου των Hsp90 στον καρκίνο, καθώς και ένα στόχο υποσχόμενων αντικαρκινικών φαρμάκων [20]. Πρωτεΐνη προφίλ χρησιμοποιήθηκε μαζί με πρωτεομική διαλογής για τον εντοπισμό συστατικών του αναστολέα δεσμευμένου συμπλοκών Hsp90 [11]. Ποσοτική και στοχευμένη κινάση-χημειο-πρωτεομική ανάλυση [17], [19] της Hsp90-εξαρτώμενη proteome υπογράμμισε πελατών Hsp90, οι οποίες επηρεάζονται άμεσα από την αναστολή της, και πρωτεΐνες που έμμεσα επηρεάζονται. αναστολή της HSP90 βρέθηκε να επηρεάζει ειδικώς την αφθονία πρωτεώματος κλίμακα (stSILAC) πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο μηχανισμό αναδίπλωσης πρωτεΐνης, η απόκριση βλάβης του DNA, καθώς και η φωσφορυλίωση πρωτεϊνών και σηματοδότηση από κινάσες [18], [19]. Να επεκτείνουν τις γνώσεις μας για την Hsp90-εξαρτώμενη proteome και την επίδραση της GA-μεσολάβηση αναστολή της HSP90 σε Τ-κύτταρα, εφαρμόσαμε μια νέα ολοκληρωμένη συστηματική προσέγγιση. Πρώτα, αναλύσαμε τη δυναμική (σε χρόνο) μεταβολές στην stSILAC αφθονίες κατά τη σύντομη (έως 6 ώρες) και μακράς διάρκειας (μέχρι 20 ώρες) GA-θεραπεία, την ανίχνευση μεταβολών σε πρωτεΐνη ομάδες με διαφορετικές συμπεριφορές. Επειδή η αναστολή της Hsp90 πιστεύεται ότι επηρεάζουν μεγάλα τμήματα του proteome (1-10%) μέσω αλλαγών τόσο στην παρακμή και τη σύνθεση, εφαρμόσαμε ένα (pcSILAC) στρατηγική που παρέχονται γνώσεις σχετικά με το πώς δημιουργούνται οι αλλαγές σε πρωτεΐνες αφθονία SILAC μυθιστόρημα παλμού ( Fierro-Monti et al., που συνοδεύει το άρθρο). Διαφορικό και δυναμικές αλλαγές στο

de novo

σύνθεση και αποσύνθεση εντοπίστηκαν σε πρωτεΐνες από την άποψη των σταθερών ρυθμού αποσύνθεσης [k

d] και τα ποσοστά της σύνθεσης [V

s]. Διαπιστώσαμε μεγαλύτερη συνολική μείωση στην πρωτεϊνική σύνθεση από την σταθερότητα της πρωτεΐνης, ενώ πολλές βασικές οικογένειες πρωτεϊνών μειώθηκε ημίσειας ζωής τους οφείλεται στην αναστολή Hsp90. Μοντελοποίηση των ποσοτικών συνόλου δεδομένων μας πάνω σε μια βάση δεδομένων της αλληλεπίδρασης Hsp90 [21] βοήθησαν να διακρίνει και να αξιολογήσει πιο συγκεκριμένες δυναμικές αλλαγές επικύρωση δυνητικά μυθιστόρημα πελατών Hsp90 εντός του interactome Hsp90. Όπως πρωτεΐνη αφθονία μπορεί να επηρεαστεί από αλλαγές στο επίπεδο της μεταγραφής, οι στάθμες του mRNA καθορίζεται συνεπώς για μια επιλογή πρωτεϊνών με αυξημένη ή μειωμένη δίχτυ αφθονίες stSILAC κατόπιν GA-θεραπεία. Συνολικά, η ανάλυσή μας για αναστολή της HSP90 επιτρέπεται μια ολοκληρωμένη αξιολόγηση της δυναμικής του Τ-κυττάρων Hsp90-εξαρτώμενη proteome, δίνοντας περαιτέρω πληροφορίες σχετικά με το μηχανισμό δράσης ενός αναστολέα της Hsp90.

Πειραματικές Διαδικασίες

Cells

Jurkat Τ-λεμφοκύτταρα κλωνοποιήσουν J77.20 ήταν ένα είδος δώρο του Dr. Oreste Acuto, το Πανεπιστήμιο της Οξφόρδης και έχουν περιγραφεί στο παρελθόν [22], [23]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Cell Culture Technologies, Gravesano, Ελβετία) με 10% (ν /ν) σε διαπίδυση ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Invitrogen), ενώ πραγματοποιείται stSILAC ή pcSILAC πειράματα.

stSILAC πειράματα

ισοτόπων-επισημασμένα αμινοξέα (

13C

6-L-λυσίνη,

13C

6

15N

4-L- αργινίνη, Cambridge Isotope Laboratories (CIL), Andover, ΜΑ) που περιλαμβάνονται στο «βαριά stSILAC μέσο» σε 100 mg /l, ενώ προλίνη δόθηκαν σε 180 mg /l (σε 9-πλάσια περίσσεια σε σχέση με πρότυπη συγκέντρωση της σε RPMI μέσο) σε όλα τα μέσα ενημέρωσης stSILAC και pcSILAC. Βαρέα ή επισήμανση φωτός stSILAC (ίδιο όπως βαρέα stSILAC μέσο, ​​αλλά περιέχει πρότυπο λυσίνη και αργινίνη) επιτεύχθηκε με καλλιέργεια των κυττάρων για 2 εβδομάδες για να επιτραπεί τουλάχιστον 5 κυτταρικές διαιρέσεις. Πριν από την έναρξη των πειραμάτων, οι δοκιμές διεξήχθησαν για να επαληθεύσει ότι το βαρύ επισήμανση ήταν & gt? 98%, και Arg σε Pro μετατροπή ήταν χαμηλότερη από 5%. Βαριά-stSILAC σημασμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ Γκελνταναμυκίνη (GA) (Cell σηματοδότηση Danvers, ΜΑ) σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) για 6 ή 20 ώρες, και το φως-stSILAC-επισημασμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ίδιο όγκο DMSO και χρησιμοποιήθηκε ως ένας έλεγχος. Τρεις ανεξάρτητες βιολογική αντίγραφα των επεξεργασμένων (, έλεγχος φωτισμού) κύτταρα (βαριά-επισημασμένο) ή χωρίς επεξεργασία διεξήχθησαν παράλληλα. Μία από τις τρεις επαναλήψεις αναστράφηκε χρησιμοποιώντας φως σήματος για την επεξεργασία, και τα βαρέα-label για τα μη κατεργασμένα κύτταρα.

Τα κύτταρα λύθηκαν σε 4% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS), 100 mM Tris /HCl ρΗ 7.5, 100 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT) που ακολουθείται από θέρμανση στους 95 ° C. Μετά τη φυγοκέντρηση και η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήσεις, ισομοριακές αποσπάσματα από φως /βαριάς ή βαριάς /μεσαίου επισημασμένα κύτταρα συνενώθηκαν, αλκυλιώθηκε με ιωδοακεταμίδιο και χωνεύθηκαν όπως περιγράφεται [24]. Τα λαμβανόμενα μίγματα πεπτιδίων (200 μα συνολικού υλικού) αφαλατώθηκαν επί φυσίγγια SepPak C18 (Waters Corp., Milford, ΜΑ), ξηραίνεται, διαλύεται σε 4Μ Ουρία με 0,1% αμφολύτες ρΗ 3-10 (GE Healthcare) και κλασματώθηκε με off-gel εστιάζοντας όπως περιγράφεται [25]. Τα 24 κλάσματα που λαμβάνονται αφαλατώθηκαν σε μία πλάκα 96 φρεατίων microC18 (Waters Corp., Milford, ΜΑ), ξηράνθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 0.1% μυρμηκικό οξύ, 3% (ν /ν) ακετονιτρίλιο για ανάλυση LC-MS. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε ένα υβριδικό γραμμική παγίδα LTQ-Orbitrap Βέλος φασματογράφο μάζας (Thermo Fisher, Βρέμη, Γερμανία) διασυνδεθεί μέσω μιας πηγής νανοψεκασμού σε ένα Dionex RSLC 3000 σύστημα nanoHPLC (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Τα πεπτίδια διαχωρίστηκαν πάνω σε μια αντίστροφης φάσης Acclaim ΡΕΡΜΑΡ nanocolumn (75 μm ID × 15 cm, 2,0 μm, 100 μ, Dionex) με μια βαθμίδα από 5 έως 85% ακετονιτρίλιο σε 0.1% μυρμηκικό οξύ (συνολικός χρόνος: 120 λεπτά). Πλήρης σαρώσεις έρευνα MS εκτελέστηκαν σε 60.000 ανάλυση. Σε δεδομένα που εξαρτώνται από την απόκτηση ελέγχεται από Xcalibur 2.0.7 λογισμικού (Thermo Fisher), επελέγησαν οι είκοσι πιο έντονη πολλαπλώς φορτισμένα ιόντα πρόδρομος ανιχνεύτηκε σε πλήρη σάρωση έρευνα MS για προκαλούμενη από σύγκρουση διάσπαση (CID) κατακερματισμού της LTQ γραμμική παγίδα με ένα παράθυρο απομόνωση των 3,0 m /z και στη συνέχεια να αποκλείονται δυναμικά από περαιτέρω επιλογή κατά τη διάρκεια 120s. Τα στοιχεία πρωτεομική φασματομετρία μάζας έχουν κατατεθεί στην ProteomeXchange Consortium (https://proteomecentral.proteomexchange.org) μέσω του αποθετηρίου συνεργάτη PRIDE [26] με την PXD000537 αναγνωριστικό συνόλου δεδομένων

ανάλυση των δεδομένων MS:. ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση δεδομένων

MS αναλύθηκαν και ποσοτικά με τη χρήση MaxQuant έκδοση 1.0.13.13 [27], σε συνδυασμό με την μασκότ (Matrix Science, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο) έκδοση 2.3. Peaklists παρήχθησαν με MaxQuant με τυπικές παραμέτρους. αναζητήσεις βάση δεδομένων πραγματοποιήθηκαν στη βάση δεδομένων του Ανθρώπου v3.68 IPI, φιλτράρεται για να κρατήσει μόνο τις καταχωρήσεις χαρτογράφηση ένα αναγνωριστικό UniProtKB /Swiss-Prot (34743 εγγραφές στην πραγματικότητα έψαξε), προκειμένου να μεγιστοποιηθεί η ακολουθία και σχολιασμό της ποιότητας σε περαιτέρω βήματα ανάλυση. Διάσπαση ειδικότητα ήταν θρυψίνη (διάσπαση μετά από Κ, R, καμία διάσπαση σε KP, RP) με δύο αναπάντητες διασπάσεις. Μάζα ανοχές ήταν 7 ppm για τον πρόδρομο και 0,5 Da για φάσματα μάζας CID παράλληλα. Το παράγωγο της κυστεΐνης ιωδοακεταμιδίου έχει καθοριστεί ως σταθερό τροποποίηση, και οξείδωση της μεθειονίνης και της πρωτεΐνης ακετυλίωση Ν-τερματικής προσδιορίζονται ως μεταβλητή τροποποιήσεις. ταυτοποιήσεις πρωτεΐνη διηθούνται στο 1% ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) που ιδρύθηκε από MaxQuant έναντι αντιστραφεί βάση δεδομένων ακολουθίας. Τουλάχιστον ένα μοναδικό πεπτίδιο που ήταν απαραίτητο για να διακρίνουν τις αλληλουχίες οι οποίες μοιράζονται τα πεπτίδια. Σετ πρωτεϊνικές ακολουθίες οι οποίες δεν θα μπορούσαν να διακριθούν με βάση την προσδιορίζονται πεπτίδια αναφέρονται μαζί ως ομάδες πρωτεΐνη και αναφέρονται πλήρως στους πίνακες. Λεπτομέρειες των κορυφών ποσοτικοποίησης και αναλογία υπολογισμός πρωτεΐνης με MaxQuant περιγράφεται αλλού [27]. Όλες οι πρωτεΐνες με ποσοτικές τιμές (ελάχιστες αποδείξεις μετράνε = 1) διατηρήθηκαν στην αρχή, αλλά φιλτράρεται σε επόμενα στάδια (βλέπε παρακάτω)

StSILAC ανάλυση δεδομένων:. Ποιότητας φιλτράρισμα του συνόλου δεδομένων

Όλο το φιλτράρισμα βήματα έγιναν με custom-made σενάρια Perl (Perl v5.10.1, σενάρια διαθέσιμο ως συμπληρωματικά στοιχεία). πίνακες ομάδα πρωτεϊνών από MaxQuant περαιτέρω επεξεργασία για την απομάκρυνση προσμείξεων σχολιασμένο στη βάση δεδομένων και αγώνες για να αντιστραφεί ακολουθίες. Ένα επιπλέον 63 πρωτεΐνες από μια εσωτερική λίστα εργαστήριο των 65 περιβαλλοντικών ρύπων επίσης αφαιρεθεί. Περαιτέρω, οι αναλογίες απομακρύνθηκαν όταν υπολογίστηκαν με βάση ενιαία αποδείξεις, καθώς και, για κάθε χρονικό σημείο, πρωτεϊνών εάν εντοπίστηκαν μόνο σε ένα αντίγραφο. Ακραίων τιμών ομάδων πρωτεΐνη, που ορίζεται ως πρωτεΐνες με αναλογία που διαφέρει κατά περισσότερο από ένα συντελεστή 1,41 μεταξύ οποιωνδήποτε δύο επαναλήψεις σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο, αφαιρέθηκαν (28 πρωτεΐνες). Ακραία ορισμός έγινε με τη γραφική αναπαράσταση των δεδομένων και την επιλογή των σημείων με το λογισμικό Περσέα. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την «Ποιότητα-φιλτράρεται SILAC σύνολο δεδομένων» που περιέχει 4050 πρωτεΐνες (Πίνακας S2), κάθε ανιχνεύονται και προσδιορίζονται ποσοτικά σε όχι λιγότερο από δύο επαναλήψεις, τουλάχιστον σε ένα χρονικό σημείο.

T-test και ομαδοποίηση

Ξεκινώντας με την «Ποιότητα-φιλτράρεται SILAC σύνολο δεδομένων», κρατήθηκαν μόνο πρωτεΐνη ομάδες ποσοτικά και στις τρεις επαναλήψεις (3333 πρωτεΐνες) (Πίνακας S3). Για κάθε χρονικό σημείο, συνδεθείτε

2 ποσοτικοποιημένων δεικτών υποβλήθηκαν σε δύο-ουρά Welch t-test για ένα δείγμα (μηδενική υπόθεση H

0: μ = 0) που ακολουθείται από διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές (Benjamini-Hochberg ). Όλες οι πρωτεΐνες με σε ρ & lt? 0,05 (μετά την διόρθωση) θεωρήθηκαν σημαντικές. ομάδες Protein σημαντικές τουλάχιστον σε ένα χρονικό σημείο υποβλήθηκαν σε μοντέλου δικτύωσης Συσχέτιση να ανιχνεύει πρότυπα συμπεριφοράς ως συνάρτηση του χρόνου. Τ-τεστ και ομαδοποίηση διεξήχθησαν με την έκδοση του λογισμικού R 2.12.1 (2010-12-16). Μετά την προσθήκη ενός (0,0) χρονικό σημείο αναφοράς, τα δεδομένα είχαν τοποθετηθεί από τον υπολογισμό Pearson συντελεστής συσχέτισης σε ad hoc ορίζεται μοντέλα εξετάζει σε απλουστευμένη μορφή ποιοτική (0 = καμία αλλαγή, 1 = log

2 (H /L) & gt? 0, -1 = log

2 (H /L) & lt? 0) όλες οι πιθανές αλλαγές κατά τη διάρκεια των δύο χρονικά σημεία. Για να διακρίνουν τις αλλαγές ως συνάρτηση του χρόνου τέσσερα περισσότερο συμπεριφορές θεωρήθηκαν όταν μια πρωτεΐνη είχε δύο τιμών με το ίδιο πρόσημο. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα τα παρακάτω 13 μοντέλα: [0,2,1] [0,1,2] [0,1,1] [0,1,0] [0,1, -1] [0,0,1 ] [0,0, -1] [0, -1,1] [0, -1,0] [0, -1, -1] [0, -1, -2] [0, -2, – 1] [0,0,0]. ομάδες πρωτεϊνών με t-test p & gt? 0.05 σε όλα τα χρονικά σημεία ανατέθηκαν σε σύμπλεγμα 13. Πρωτεΐνες εντοπιστεί μόνο σε ένα χρονικό σημείο είχαν ανατεθεί σε σύμπλεγμα 14.

ανάλυση Σχολιασμός: αφαίρεση των υποσυνόλων και την επικαιροποίηση της πρωτεΐνης σχολιασμού

Για την απλοποίηση της μετά-MaxQuant συγκρίσεις των συνόλων δεδομένων, πρωτεΐνες υποσύνολο (ταυτίζεται με ένα υποσύνολο των πεπτιδίων) αφαιρέθηκαν από τις ομάδες πρωτεϊνών. Για να εξασφαλιστεί ότι η UniProt, GO, KEGG και PFAM σχολιασμούς ήταν εντελώς up-to-ημερομηνία, ένα σενάριο Perl αυτοματοποιηθεί REST (Το αντιπροσωπευτικό μέλος Transfer) ζητά την UniProt (https://www.uniprot.org/uniprot/) και EBI ιστοσελίδες (https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/GAnnotation) και Simple Object Access Protocol (SOAP) ζητεί την KEGG (Κιότο Εγκυκλοπαίδεια γονιδίων και γονιδιωμάτων) ιστοσελίδα (https://soap.genome.jp/KEGG.wsdl), καθώς και την εκ νέου εισαγωγή αυτών των δεδομένων στον πίνακα αποτελεσμάτων βάσει των απλουστευμένων ομάδων πρωτεϊνών. Η εκχώρηση του κάθε όρου σχολιασμού σε κάθε αναγνωριστικό σε μια ομάδα πρωτεϊνών χαρτογραφήθηκε, και αναφέρεται στον Πίνακα S4. Ανάλυση όρος εμπλουτισμός Gene Ontology (GO) διεξήχθη με το online εργαλείο Gorilla (https://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il/) [28], χρησιμοποιώντας τα γονίδια πρωτεΐνης σε κάθε συστάδα ως ερώτημα, για να είναι συγκρίνεται με το σύνολο των αναγνωρισμένων πρωτεϊνών

Δίκτυο που βασίζεται οργάνωση των δεδομένων και την ανακάλυψη

Ενσωμάτωση των πειραματικών δεδομένων σε αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (PPI) δίκτυα να χτίσει explorable χάρτες χρησιμοποιώντας Cytoscape (http.: //www.cytoscape.org) έχει περιγραφεί προηγουμένως [29], [30]. Υποθέσαμε ότι η στατιστική σημαντικότητα είναι λιγότερο σημαντικό σε μια ανάλυση του δικτύου, το οποίο προνόμια συνδέσεις και τα πρότυπα και έτσι χρησιμοποιήσαμε μια λιγότερο αυστηρά φιλτράρεται σύνολο δεδομένων ως είσοδο. Χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων ΡΡΙ ανθρωποκεντρική [21], ήταν δυνατόν να εξαχθεί ένα δίκτυο με τις 1.263 πρωτεΐνες που πέρασαν το t-test (ρ & lt? 0,05) πριν από πολλαπλές διόρθωση δοκιμής είναι τουλάχιστον σε ένα από τα δύο χρονικά σημεία (6Η ή 20 ώρες). Ένα «κόμβος» σε αυτό το δίκτυο αντιστοιχεί σε μία πρωτεΐνη και η σύνδεση μεταξύ τους ονομάζεται «άκρη» και αναφέρεται στην ΠΠΑ μεταξύ αυτών των δύο κόμβων. Οι κανονικοποιημένες αναλογίες H /L για τις 6 ώρες και 20 ώρες σύνολα δεδομένων stSILAC φορτώθηκαν μετά αυτό το δίκτυο. Κόμβοι ήταν χρωματισμένο με ένα κόκκινο-to-μπλε κλίση (θερμότητα χάρτη θερμογράφημα) σύμφωνα με το ημερολόγιο τους

2 αναλογίες /fold-αλλαγή αξιών, όπως το κόκκινο και το μπλε αντιπροσωπεύουν τον εμπλουτισμό και την εξάντληση, αντίστοιχα. Πληροφορίες για τα διάφορα μέλη του δικτύου ήταν επίσης φορτωμένα από διαφορετικές βάσεις δεδομένων (UniProt, Gene Ontology, ΟΜΙΜ) να έχουν διαθέσιμο στο γράφημα ως μεταδεδομένα. Με βάση την οργάνωση του δικτύου, ενοποίησης δεδομένων stSILAC και πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία της πρωτεΐνης, ο Cytoscape plugin Mcode [31] επέτρεψε την ανίχνευση των ιδιαίτερα διασυνδεδεμένων ομάδων κόμβων (υπογράφων), που μπορούν να θεωρηθούν ως σύμπλοκα πρωτεΐνης και λειτουργικές ενότητες για διαφορετικές διεργασίες του ενδιαφέροντος. Μόλις εντοπίστηκε μια λειτουργική μονάδα ενδιαφέροντος (με παρόμοιες λειτουργίες και παρόμοια συμπεριφορά στα δεδομένα stSILAC), αυτό το υπο-δίκτυο διερευνηθεί περαιτέρω να βρουν άλλες συνδεδεμένες ενότητες (που υπάρχει στο κύριο δίκτυο) που συμμετέχουν σε σχετικές βιολογικές διεργασίες στην υγεία ή την ασθένεια. Οι προσπάθειες αυτές στη συνέχεια συμπληρώνονται από την εξόρυξη βιβλιογραφία για την καλύτερη κατανόηση της βιολογικής σημασία αυτών συνδέεται ενότητες.

Ευθυγράμμιση των συνόλων δεδομένων

ομάδες Πρωτεΐνη σε αναλύονται σύνολα δεδομένων από pcSILAC και stSILAC αντιστοιχήθηκαν με IPI αναγνωριστικά . Μόνο όταν όλα τα αναγνωριστικά IPI σε μια ομάδα πρωτεϊνών ήταν πανομοιότυπες σε δύο σύνολα δεδομένων, οι ομάδες των πρωτεϊνών και ποσοτικές τιμές συμφωνημένα και ευθυγραμμισμένα σε ένα κοινό τραπέζι.

Αντισώματα

Το πολυκλωνικό αντι-OGT αντιορός ένα δώρο από Winship Herr, CIG, Πανεπιστήμιο της Λωζάννης. Πολυκλωνικά αντι-BRAT1, αντι-ΙΤΚ, αντι-eIF2α και αντι-φωσφο-eIF2α αντιοροί λήφθηκαν από την Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, ΜΑ, ΗΠΑ).

Ανοσοκαταβύθιση

Cells λύθηκαν για 15 λεπτά σε πάγο σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 150 mM ΚΟΙ, 0.2 mM MgCl

2, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, 2% Triton Χ-100). Τα εκχυλίσματα σε επεξεργασία με υπερήχους και εκκαθαρίζονται με φυγοκέντρηση σε 12’000 rpm για 30 λεπτά στους 4 ° C. 1 mg πρωτεϊνών του υπερκειμένου (σε 1 ml) επωάστηκε με κάθε αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά από πλύση των ανοσοϊζήματα με Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, πρωτεΐνες εκλούστηκαν σε ρυθμιστικό δείγματος SDS-PAGE χωρίς DTT με βρασμό. 50 mM DTT προστέθηκε στα υπερκείμενα και πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανοσοκηλίδωση. Για την εκ νέου ανιχνεύοντας τα στυπώματα με ένα διαφορετικό αντίσωμα, είχαν αφαιρεθεί για 2 ώρες στους 65 ° C με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 0.2% Tween-20.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Cells ( 2 × 10

6) σταθεροποιήθηκαν με 2% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε RT, και έγιναν διαπερατά μετά από αγωγή με ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) που περιέχει 0.5% σαπωνίνη (Sigma), 2% FCS και 2 mM EDTA, για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτά στη συνέχεια επωάστηκαν με Hoechst 33342 (20 μg /ml? Invitrogen) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν σε LSR II (Becton Dickinson) και αναλύθηκαν με λογισμικό FlowJo (TreeStar)

RNA:. NanoString nCounter ποσοτική ανάλυση

Από κάθε βιολογική επανάληψη (3 για stSILAC και 2 για pcSILAC) και χρονικό σημείο, δύο ανεξάρτητα δείγματα κυττάρων ελήφθησαν και επεξεργασία χωριστά. RNA καθαρίστηκε από εκχυλίσματα κυττάρου χρησιμοποιώντας μίνι στήλες spin (RNeasyPlus Mini Kit από Qiagen, Hilden, Germany). 200 ng του ολικού RNA υβριδοποιήθηκαν με ανιχνευτές πολυπλεξίας Nanostring και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία δείγματα σύμφωνα με δημοσιευμένη διαδικασία [32]. Barcodes μετρήθηκαν για 1150 οπτικά πεδία ανά δείγμα. διόρθωση Ιστορικό έγινε με αφαίρεση της μέσης συν δύο τυπικές αποκλίσεις από τους αρνητικούς μάρτυρες για κάθε δείγμα. Αξίες & lt? 1 καθορίστηκαν προς 1. Οι θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν ως αξιολόγηση της ποιότητας. Αυτό έγινε ελέγχοντας ότι η αναλογία μεταξύ του υψηλότερου και του χαμηλότερου θετικοί έλεγχοι κατά μέσο όρο μεταξύ δειγμάτων ήταν κάτω από 3. Κατόπιν, μετράει για γονίδια στόχους κανονικοποιήθηκαν με τη γεωμετρική μέση των γονιδίων 12 αναφοράς (κατάλογος γονίδιο) που επιλέγεται ως το πιο σταθερό χρησιμοποιώντας ο αλγόριθμος geNorm [33]. Πολλαπλών μεταβολών υπολογίστηκαν ως λόγοι του γεωμετρικού μέσου των μετρήσεων σε πειραματικές συνθήκες (GA) έναντι εκείνης του κατάσταση ελέγχου (DMSO) και εκφράστηκαν ως log

2 τιμές.

Αποτελέσματα

Πειραματικό σύστημα

Η κυτταρική γραμμή Jurkat Τ-λεμφοκυττάρων έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως ως πρότυπο για τον καθορισμό των μηχανισμών της ευαισθησίας των καρκίνων σε φάρμακα [34] και για την ανάλυση των επιπτώσεων των αναστολέων Hsp90 σε μεμονωμένες πρωτεΐνες ή κυτταρικές λειτουργίες [35] – [39]. Τα μέλη της οικογένειας hsp90 σε ευκαρυωτικά κύτταρα αντιπροσωπεύεται από κυτοσολικής Hsp90β (συστατικός, που κωδικοποιείται από HSP90AB1) και Hsp90α (επαγώγιμη, που κωδικοποιείται από HSP90AA1), ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) Grp94 (endoplasmin) και τη μιτοχονδριακή ισομορφή Trap1. Η θεραπεία των κυττάρων με GA έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει Hsp90β, Hsp90α, και Grp94, ενώ Trap1 είναι πιθανώς λιγότερο ή δεν επηρεάζονται από GA σε ακέραια κύτταρα [40].

Πρώτον, πραγματοποιήσαμε ένα πρότυπο SILAC (stSILAC) σφαιρική ανάλυση των αποτελεσμάτων της αναστολής Hsp90 κατά τη διάρκεια της θεραπείας, που εκφράζεται ως μεταβολές των σχετικών αφθονίες σε GA-αγωγή έναντι κυττάρων DMSO ελέγχου. Χρησιμοποιήσαμε μια υπο-θανατηφόρος συγκέντρωση του φαρμάκου [1 μΜ] στο μέσο (κάτω από την αναμενόμενη συγκέντρωση ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης Hsp90). Η συγκέντρωση της GA που χρησιμοποιήθηκε ήταν βρέθηκε ότι μειώνει τους αριθμούς των κυττάρων σε t = 20 ώρες μετά τη θεραπεία. Αυτό συνέβη πιθανότατα προκαλώντας μια διακοπή του κυτταρικού κύκλου, η οποία ανιχνεύεται από ένα ανάλυση κυτταρομετρίας ροής ως εμπλουτισμός των κυττάρων μπλοκαριστεί είτε σε G1 ή σε φάση G2 /M (Εικ. S1 Α-Β), και συνοδεύονταν από αφαίρεση κυττάρων σε φάση S. Εκτιμήσαμε την επαγωγή απόπτωσης με ανοσοκηλίδωση, ανιχνεύοντας τη διάσπαση του υποστρώματος πολυ κασπάσης (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP1), αλλά παρατηρήθηκε καμία ισχυρή επαγωγή της απόπτωσης κάτω από τις συνθήκες δοκιμασίας (Σχ. S1c). Η δυναμική των αποτελεσμάτων του αναστολέα Hsp90 επί αφθονίες πρωτεΐνη παρακολουθήθηκε με δειγματοληψία δείγματα κυττάρων και εκχύλιση των πρωτεϊνών σε χρονικά σημεία t = 6 ώρες και t = 20 ώρες μετά την προσθήκη του φαρμάκου. Τα δείγματα συλλέχθηκαν επίσης σε t = 5 ώρες και t = 19 ώρες για το σύνολο καθαρισμό mRNA για να προσδιορισθούν τα επίπεδα μεταγραφής (Σχήμα 1Α). Δεδομένα από stSILAC ενσωματώθηκαν με τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών για την κατασκευή ενός δικτύου και με την σύνθεση και αποσύνθεση τιμές από pcSILAC και mRNA των δεδομένων για την ανάλυση πολλαπλών παραμέτρων του συστήματος (Εικόνα 1Β).

Α) Σήμανση και το δείγμα σχήμα παρασκευής. Γκελνταναμυκίνη ή DMSO προστέθηκαν σε t = 0. Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίσματα συλλέχθηκαν σε t = 6 ώρες και 20 ώρες, ενώ η συνολική mRNA ελήφθη σε t = 5 ώρες και t = 19 ώρες. Β) Ανάλυση δεδομένων και την ερμηνεία συνδυασμένα δεδομένα σχετικά με μεταβολές πρωτεΐνη αφθονία (stSILAC) με αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (ΡΡΙ) αναλύθηκε ως δίκτυο, σύνθεση και οι τιμές απόσβεσης για πρωτεΐνες στα δύο συνθήκες και τα επίπεδα μεταγραφής. Εμπλουτισμός της Gene Ontology όρους σχολιασμό χρησιμοποιήθηκε για την εξαγωγή λειτουργικών πληροφοριών σχετικά με τις κατηγορίες πρωτεϊνών με κοινές συμπεριφορές.

Η

Παγκόσμια χαρακτηριστικά των συνόλων δεδομένων stSILAC

Από την ανάλυση των δεδομένων MS με MaxQuant με τυπικές παραμέτρους προσδιορίζονται 5707 ομάδες πρωτεϊνών (Πίνακας S1) πριν από τη διήθηση. Σετ ταυτοποιημένες πρωτεΐνες ήταν πολύ παρόμοια μεταξύ επαναλήψεων, με το 73% της συνολικής πρωτεΐνης ομάδες που προσδιορίζονται στις τρεις επαναλήψεις σε κάθε χρονικό σημείο. συσχέτιση του Pearson για επεξεργασμένων αναλογίες /ελέγχου μεταξύ επαναλήψεων σε 20h ήταν μεγαλύτερη από 0,85 (Σχ. S2A-Β), υποδεικνύοντας καλή αναπαραγωγιμότητα. Οι διαφορές μεταξύ των GA-θεραπεία και τον έλεγχο των κυττάρων αυξήθηκε με το χρόνο, όπως φαίνεται από την διεύρυνση της κατανομής των δεικτών κατά τη μετάβαση από 6 ώρες έως 20 ώρες (Εικ. 2Α). Η συσχέτιση μεταξύ διάμεσου αναλογίες σε 6 ώρες και 20 ώρες ήταν μόνο μερική (r = 0.59, Σχ. S2C), γεγονός που υποδηλώνει ότι, αν και στις περισσότερες περιπτώσεις, επίπεδα πρωτεΐνης άλλαξε προς την ίδια κατεύθυνση, θα μπορούσε να παρατηρηθεί πιο πολύπλοκα σχήματα των αλλαγών στο χρόνο.

Α) ιστογράμματα των ομαλοποιηθεί αντιμετωπίζονται αναλογίες /ελέγχου για την 6h stSILAC (κίτρινο), και 20h (πράσινο) σύνολα δεδομένων (4050 πρωτεΐνες). Β) Δώδεκα πιθανά πρότυπα της αλλαγής κατά την αγωγή GA ορίστηκαν (μικρά αγροτεμάχια) ως πρότυπα για την ομαδοποίηση συσχέτιση. Πρόσθετες συστάδες (δεν φαίνεται) που περιλαμβάνεται πρωτεΐνες χωρίς σημαντικές αλλαγές (cluster 13) και πρωτεϊνών με δεδομένα μόνο σε ένα χρονικό σημείο (cluster 14). Ο αριθμός των γονιδίων (που κωδικοποιούν πρωτεΐνες) που προσδιορίζονται σε κάθε σύμπλεγμα που αναγράφεται στο κουτί.

Η

Ανάλυση και ομαδοποίηση των δεδομένων stSILAC

Για την ανάλυση του συνόλου των δεδομένων proteome, η stSILAC σύνολο δεδομένων διηθήθηκε για να διατηρήσει μόνο πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν σε τρεις επαναλήψεις (Πίνακας S3) και στη συνέχεια υποβάλλεται σε t-test για τον εντοπισμό πρωτεϊνών που ποικίλει σημαντικά μεταξύ ελέγχου και αναστολέα-κατεργασμένα δείγματα. 565 πρωτεΐνες (17%) πέρασε το t-test (ρ & lt? 0.05 με διόρθωση Benjamini-Hochberg) τουλάχιστον σε ένα από τα δύο χρονικά σημεία και έτσι έδειξαν στατιστικά σημαντικές μεταβολές κατά την κατεργασία GA. Αυτό το σύνολο δεδομένων είχε τοποθετηθεί στο

ad hoc

ορίζεται μοτίβα που προκύπτουν σε 12 συμπλέγματα, το καθένα αντιπροσωπεύει ποιοτικά διακριτά πρότυπα των διακυμάνσεων στην αφθονία, ή συμπεριφορές στις 6 και 20 ώρες (Εικ. 2Β) (Εικ. S3, Πίνακας S3). Πρωτεΐνες δεν επηρεάζεται σημαντικά από την GA παραλείφθηκαν από την ανάλυση διασποράς. Το πλεονέκτημα αυτής της προσέγγισης σε σχέση με μέθοδοι ομαδοποίησης είναι ότι μια κοινή συμπεριφορά των πρωτεϊνών σε κάθε συστάδα θα μπορούσε εύκολα να συναχθεί. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι τέσσερις μεγαλύτερες συστάδες (clusters 2, 6, 7, και 11) περιέχονται το καθένα περισσότερες από 80 πρωτεΐνες και μαζί αντιπροσώπευαν το 94,3% του συνόλου των συγκεντρωμένα πρωτεϊνών. Αυτά τα 4 συστάδες αντιστοιχούσαν, αντίστοιχα, με τις πρωτεΐνες αυξάνοντας ή μειώνοντας συνεχώς από 6 έως 20 ώρες (αντιστοίχως, συστάδες 2 [0: 1: 2] και 11 [0: -1: -2]), ή σε πρωτεΐνες διαφέρουν σημαντικά μόνο στο 20h (σύμπλεγμα 6 [0: 0: 1] και 7 [0: 0: -1]) (Εικ. 2Β). Όλα τα άλλα συμπλέγματα που περιέχονται μικρότερους αριθμούς των πρωτεϊνών, με μέγιστο αριθμό 10 για cluster 5.

Συνέπειες της αναστολής της Hsp90 με βάση τους όρους GO εμπλουτισμένο σε συστάδες και επιπλέον πειράματα

Για να προσδιορίσετε αν λειτουργικά ή δομικά συγγενείς πρωτεΐνες διακύμανση με τον ίδιο τρόπο μετά από φαρμακευτική αγωγή, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση εμπλουτισμού σχολιασμό σχετικά με κάθε ένα από τα 12 συμπλέγματα (Πίνακας S4, μια επιλογή των συστάδων και μερικοί από τους όρους που συνδέονται GO τους παρουσιάζεται στον πίνακα 1). Παγκοσμίως ήπια (μεγ. 4-πλάσια αύξηση στο μέγιστο. 5-φορές μείωση) ανιχνεύθηκαν αποτελέσματα επί πρωτεϊνών και πρωτεϊνικών συμπλόκων που εμπλέκονται σε μια ευρεία ποικιλία διαδικασιών και σηματοδοτικών μονοπατιών.

Η

Clusters με την αύξηση των επιπέδων κατά την Hsp90 αναστολή

κατά τα πρώτα στάδια της αναστολής Hsp90 από GA (cluster 2), εντοπίσαμε ένα έξαρση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην απόκριση σε αναδίπλωση του στρες στο κυτταρόπλασμα, αλλά και στο ER, σε συμφωνία με προηγούμενα αποτελέσματα στην μυέλωμα κύτταρα κατεργασμένα με αναστολείς Hsp90 [41], [42]. Πολλές πρωτεΐνες που βρίσκονται στα διαμερίσματα των κυστιδίων αυξήθηκαν επίσης. Οι ίδιες ή συναφείς όροι GO επίσης εμπλουτισμένο σε μεταγενέστερο αυξανόμενο πρωτεϊνών σε σύμπλεγμα 6, μαζί με κυτταροσκελετικές συστατικά, δεσμευμένη σε μεμβράνη μικρό GTPases (πρωτεΐνες Rab), πρωτεΐνες Golgi και του πρωτεασώματος. Συνολικά, μια αυξητική ρύθμιση της συσκευής αναδίπλωσης στο κυτταρόπλασμα και ER, μαζί με ένα γενικό άγχους και απόκριση προ-επιβίωσης αναδύονται από το σύνολο της αυξημένης πρωτεϊνών. Λαμβάνοντας υπόψη την παρατηρούμενη ER αντίδραση στο στρες, αξιολογήσαμε τη φωσφορυλίωση της α υπομονάδας του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης 2 (eIF2α), είτε με κινάσες πρωτεΐνης που εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα (PKR), ή στη μεμβράνη ER (PERK), καθώς διαθέτει έχει καθιερωθεί ως ένα μηχανισμό αντίδρασης στο στρες να αναστέλλουν τη σύνθεση των πρωτεϊνών [43]. Επιβεβαιώσαμε μια ήπια αύξηση της φωσφορυλίωσης της eIF2α λίγο μετά GA-θεραπεία (Εικ. S4), σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που έγιναν σε κύτταρα HeLa [44].

Clusters με μείωση των επιπέδων κατά την Hsp90 αναστολή

Παρατηρήσαμε μια απότομη μείωση (μέχρι 6 ώρες) της ΑΤΡ-δέσμευσης πρωτεϊνών και πρωτεϊνικών κινασών (cluster 11). Μεταξύ αυτών των πρωτεϊνικών κινασών, παρατηρήσαμε μια συνεχή και προοδευτική μείωση των μελών του Τ-κυττάρου μονοπάτι σηματοδότησης υποδοχέα. Παρατηρήσαμε ένα σημαντικό αριθμό πρωτεϊνών που συνδέονται με κινητοχώρου και συμπυκνωμένο λειτουργίες χρωμόσωμα. Οι περισσότερες από αυτές τις πρωτεΐνες ήταν πρωτεΐνες πυρηνικού πόρου εμπλέκεται σε πυρηνο-κυτταροπλασματική μεταφορών. Αργά αποτελέσματα (cluster 7) αντανακλά τον εμπλουτισμό των πολλών όρων GO συνδέονται με ριβοσωμάτων βιογένεση (επεξεργασία rRNA, πυρηνισκικός πρωτεΐνες). Ορισμένες βασικές για την αντιγραφή του DNA (στάδιο επιμήκυνσης) παράγοντες ήταν επίσης μειωμένη σε μεταγενέστερους χρόνους. Ribosome βιογένεση, ένα από τα πιο ακριβά κυτταρικές διαδικασίες όσον αφορά την ενέργεια, είναι γνωστό ότι συσχετίζεται με την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου μέσω της οδού MDM2-p53 [45]. Συνολικά, μια αρνητική ρύθμιση της μηχανής σύνθεσης πρωτεϊνών σε συνδυασμό με τις αλλαγές που συνδέονται με την διακοπή του κυτταρικού κύκλου φαίνεται να αναδύονται από το σύνολο της μείωσης των πρωτεϊνών.

Ανάλυση Δικτύου

Η φαρμακευτική αγωγή οδήγησε σε μειωμένη αφθονία και των δύο γνωστοί και πολλοί εν δυνάμει νέους πελάτες Hsp90. Εμείς αιτιολογημένη ότι η εξάντληση δεν μπορεί να ληφθεί από την ίδια την έννοια ότι μια πρωτεΐνη είναι ένα πελάτη Hsp90, και εμείς διερευνηθούν άλλες στρατηγικές για να αναλύσουμε τα γεγονότα. Έτσι διαμόρφωσε τις ποσοτικοποιηθεί σύνολα δεδομένων stSILAC στο δίκτυο προηγουμένως κατασκευαστεί αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης Hsp90 (ΠΠΑ) Hsp90Int [21]. Αρκετές εξαιρετικά διασυνδεδεμένο υπογράφων και λειτουργικές ενότητες εξήχθησαν από τη βάση δεδομένων Hsp90Int να εμφανιστούν δυναμικές αλλαγές με βάση το σύνολο δεδομένων stSILAC.

Οι μοριακοί συνοδοί Hsp70 και Hsp40 εντοπίστηκαν Συστατικά της Hsp90 μοριακός συνοδός μηχανή