Αφηρημένο

φαρμάκων μικροσωληνίσκους διατάραξη παρεμπόδιση της διακίνησης λυσοσωμικές και προκαλούν διαπερατότητας λυσοσωμικής μεμβράνης που ακολουθείται από καθεψίνη εξαρτώμενη από τον κυτταρικό θάνατο. Για τον προσδιορισμό των συγκεκριμένων πρωτεϊνών διακίνησης που σχετίζονται που ελέγχουν την κυτταρική επιβίωση και τη σταθερότητα λυσοσωμικής, θα προβληθεί ένα κινητήρα βιβλιοθήκη μοριακή siRNA σε ανθρώπινο MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού. SiRNAs που στοχεύουν τέσσερις κινεσίνες (KIF11 /Eg5, KIF20A, KIF21A, KIF25), μυοσίνη 1G (MYO1G), μυοσίνης βαριά αλυσίδα 1 (MYH1) και tropomyosin 2 (TPM2) ταυτοποιήθηκαν ως αποτελεσματική επαγωγείς των μη-αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Ο θάνατος των κυττάρων που προκαλείται από KIF11, KIF21A, KIF25, MYH1 ή TPM2 siRNA που προηγήθηκε διαπερατότητας λυσοσωμικής μεμβράνης, και όλα προσδιορίζονται τα siRNA που προκαλείται από αρκετές αλλαγές στην ενδο-λυσοσωμικό διαμέρισμα,

δηλαδή

αυξημένο όγκο λυσοσωμικού (KIF11, KIF20A , KIF25, MYO1G, MYH1), αυξημένη δραστηριότητα κυστεΐνη καθεψίνη (KIF20A, KIF25), μεταβάλλεται λυσοσωμική εντόπιση (KIF25, MYH1, TPM2), αυξημένη δεξτράνη συσσώρευσης (KIF20A), ή να μειωθεί αυτοφαγικά ροής (MYO1G, MYH1). Είναι σημαντικό, όλοι οι επτά siRNAs σκοτώθηκαν επίσης ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (HeLa) και οστεοσαρκώματος (U-2-OS) κύτταρα και ευαισθητοποιημένων καρκινικών κυττάρων και σε άλλες θεραπείες λυσόσωμα-αποσταθεροποίησης,

δηλαδή

φωτο-οξείδωση, siramesine, ετοποσίδη ή σισπλατίνη . Ομοίως με KIF11 siRNA, ο αναστολέας KIF11 μοναστρόλη διαπερατοποίηση επάγεται λυσοσωμιακή μεμβράνη και ευαισθητοποιημένων αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές να siramesine. Ενώ οι αναστολείς KIF11 βρίσκονται υπό κλινική ανάπτυξη ως μιτωτική αναστολείς, τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν μια νέα λειτουργία για KIF11 στον έλεγχο της σταθερότητας της λυσοσωμικής και να εισαγάγει έξι άλλων μοριακών κινητήρων ως πιθανούς στόχους του καρκίνου του φαρμάκου

Παράθεση:. Groth-Pedersen L, AITS S , Corcelle-Termeau Ε, Petersen NHT, Nylandsted J, Jäättelä Μ (2012) Στοιχεία της Κυτταροσκελετού πρωτεϊνών που σχετίζονται Απαραίτητο για Λυσοσωμική σταθερότητα και την επιβίωση των ανθρώπινων κυττάρων του καρκίνου. PLoS ONE 7 (10): e45381. doi: 10.1371 /journal.pone.0045381

Επιμέλεια: Μιχαήλ Sherman, Boston University Medical School, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3η Μαΐου, 2012? Αποδεκτές: 17 Αύγ 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 του Οκτ 2012

Copyright: © Groth-Pedersen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη δανική Εταιρεία Καρκίνου, το Συμβούλιο Ιατρικής Έρευνας της Δανίας, το δανικό υπουργείο Επιστημών, η Ευρωπαϊκή Επιτροπή 7ου ΠΠ (APO-SYS), το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Δανίας, η ML Jørgensen & amp? Ίδρυμα Γ Hansen, το Ίδρυμα Alfred Benzon, το Ίδρυμα Meyer, το Ίδρυμα Novo Nordisk, Ταμείο Memorial της Landshövding Ανά Westling και ο John και του Ιδρύματος Augusta του Persson. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα λυσοσώματα είναι όξινα κυστίδια που περιέχουν πολλές υδρολάσες, οι οποίες υποβαθμίζουν οργανίδια και μακρομορίων που παραδόθηκε από τους αυτοφαγία, ενδοκύτωση και φαγοκυττάρωση [1]. Ενισχυμένη σύνθεση λυσοσωματικής, διακίνηση και εξωκυτταρικό απελευθέρωση λυσοσωματικών πρωτεασών (καθεψίνες) αποτελούν σημαντικά χαρακτηριστικά του καρκίνου και συνδέονται με τον μεταστατικό και επεμβατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων [2], [3], [4]. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι αλλαγές αυτές μετασχηματισμός που σχετίζεται ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα με την οδό λυσοσωματικής κυτταρικού θανάτου [5], μία μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που μπορεί να αναλάβει όταν η απόπτωση αναστέλλεται, όπως συμβαίνει σε πολλούς καρκίνους [6]. Οι λυσοσωμικές κυτταρικό θάνατο χαρακτηρίζεται από λυσοσωματική διαπερατότητας και επακόλουθη μετατόπιση των καθεψινών στο κυτταρόπλασμα όπου ενεργοποιούν την απόπτωση ή διενεργούν θάνατο χωρίς την ενεργοποίηση της κασπάσης [3].

Μεταξύ των φαρμάκων κατά του καρκίνου που ενεργοποιούν τον θάνατο των κυττάρων είναι λυσοσωματικής μικροσωληνίσκους αποσταθεροποίησης και -stabilizing φάρμακα (

π.χ.

βίνκα αλκαλοειδή και ταξάνια), τα οποία αναστέλλουν την εμπορία λυσοσωματικής και επάγουν την επέκταση του διαμερίσματος λυσοσωματικής ακολουθούμενη από ρήξη λυσοσωματική και κυτταρικό θάνατο καθεψίνης εξαρτώμενη [7], [8]. Δυστυχώς, μια τέτοια σοβαρή διαταραχή κυτταροσκελετική επηρεάζει επίσης ζωτικές διαδικασίες σε υγιή κύτταρα οδηγώντας σε τοξικότητα σε ασθενείς [9]. Μια πιο συγκεκριμένη στόχευση της εμπορίας λυσοσωμικών θα μπορούσε έτσι να βελτιώσει τη θεραπεία σημαντικά.

Κυτταροσκελετού δυναμική και ενδοκυτταρική μεταφορά των κυστιδίων, οργανίδια και μακρομορίων κατά μήκος των μικροσωληνίσκων και ακτίνη cytoskeletons εξαρτώνται από μοριακών μηχανών κίνησης. Μπορούν να χωριστούν σε κινεσίνες, δυνεΐνες και μυοσίνες, τα οποία έχουν εμπλακεί στην εμπορία λυσόσωμα [10], [11], [12]. Επιπλέον, πολυάριθμες βοηθητικές πρωτεΐνες ρυθμίζουν τη λειτουργία των πρωτεϊνών κινητήρα [13], [14], [15]. Κινεσίνες και δυνεΐνες, τα οποία κινούνται κατά μήκος των μικροσωληνίσκων, μεταφέρουν μια ποικιλία του φορτίου και συμβάλει στη δημιουργία της μιτωτικής ατράκτου. Τα 44 γνωστά ανθρώπινα κινεσίνες κινούνται κυρίως προς συν άκρα μικροσωληνίσκων στην περιφέρεια του κυττάρου (μεταφορά προχωρητική) [13]. Αντίθετα, οι δύο γνωστοί ανθρώπινο φορτίο-μεταφοράς δυνεΐνης βαριές αλυσίδες, οι οποίες σχηματίζουν σύμπλοκα πρωτεΐνης λειτουργεί με κινητήρα με αρκετές βοηθητικές πρωτεΐνες, κινούνται προς μείον άκρα μικροσωληνίσκων στην περιπυρηνική περιοχή του κυττάρου (ανάδρομη μεταφορά) [14]. Επιπλέον, το ανθρώπινο γονιδίωμα κωδικοποιεί για δεκατέσσερα δυνεΐνες axonemal υπεύθυνη για την ολίσθηση των μικροσωληνίσκων που προκαλεί την ήττα των κροσσών και μαστιγίων. Μυοσίνες, εκ των οποίων οι άνθρωποι έχουν ~ 40, δεσμεύονται με νημάτια ακτίνης που συγκεντρώνεται κάτω από την μεμβράνη του πλάσματος. Είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τις μεταφορές μικρής εμβέλειας κατά τη διάρκεια ενδοκύττωση και εξωκύττωση. Μυοσίνες παράγουν επίσης μηχανική δύναμη για τη σύσπαση των μυών, τη μετανάστευση των κυττάρων και την κυτοκίνηση [15]. Άλλες πρωτεΐνες πρόσδεσης ακτίνης όπως τροπομυοσίνες, οι οποίες επηρεάζουν dynamicity ακτίνης και της σταθερότητας [16], ρυθμίζουν τη λειτουργία της μυοσίνης.

Για τον προσδιορισμό μοριακών κινητήρων και σχετικών πρωτεϊνών που απαιτούνται για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, μπορούμε διαλογή μιας βιβλιοθήκης siRNA που στοχεύει 136 μοριακό κινητήρες και σχετικών πρωτεϊνών για siRNAs που μειώνουν την βιωσιμότητα των κυττάρων MCF7. Οι επτά πρωτεΐνες εντοπίστηκαν στη συνέχεια χαρακτηρίζονται για το ρόλο τους σε κυτταρικό θάνατο, κυτταρικού κύκλου, δομή κυτταροσκελετού, αυτοφαγία, λειτουργία και την ακεραιότητα λυσοσωμική λυσοσωματικής. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η εξάντληση όλων των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών ενεργοποιείται μη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προηγήθηκε δραματικές αλλαγές στη σταθερότητα λυσοσωμικής και τη λειτουργία.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού που σχετίζεται των οποίων εξάντληση επάγει μη-αποπτωτικών θάνατο των καρκινικών κυττάρων

Κυτταροσκελετού διαταραχής φάρμακα είναι ισχυροί επαγωγείς της λυσοσωμικής κυτταρικό θάνατο [7], [8]. Για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού-ρύθμιση είναι αναγκαία για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, που προβλήθηκε ένα Ambion Silencer® Μοριακής Motor Βιβλιοθήκη (Πίνακας S1) για τοξικές επιδράσεις στα κύτταρα καρκίνου του μαστού MCF7 χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία μείωσης ΜΤΤ. Οι πρωτεΐνες θεωρούνται υποψήφιοι εάν ≥2 /3 siRNAs μειώνεται η πυκνότητα των κυττάρων με & gt? 40% σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τέσσερα κινεσίνη μέλη της οικογένειας (KIF11, KIF20A, KIF21A, KIF25), δύο μυοσίνες (MYO1G και MYH1) και tropomyosin 2 (TPM2) πληρούνται τα κριτήρια αυτά (Εικ. 1Α) και αναλύθηκαν περαιτέρω μετά την επιβεβαίωση νοκ ντάουν από τα siRNAs (Εικ. S1) .

(Α, Β) MCF7 (Α), HeLa (Β) και U-2-OS κύτταρα (Β) αφέθηκαν χωρίς θεραπεία, θεραπεία με Oligofectamine (ολιγο) ή επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (CT) ή τρεις ανεξάρτητες siRNAs κατά τις υποδεικνυόμενες στόχων ατομικά (8 ηΜ? Α) ή σε πισίνες (3 χ 6,67 ηΜ? Β). Η κυτταρική πυκνότητα μετρήθηκε μετά από 72 ώρες με την δοκιμασία μείωσης ΜΤΤ. (C) MCF7-Bcl-2 ή MCF7-ρΟΕΡ κύτταρα (έλεγχος) επιμολύνθηκαν όπως στο (Β).

Αριστερά κάτω

, Μετά από 96 ώρες, ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίστηκε μετρώντας Hoechst 33342-χρωματισμένα κύτταρα με συνοπτικές πυρήνες (τρία τυχαία πεδία των 100 κυττάρων). TNF (20 ng /ml, 24 ώρες) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για Bcl-2 ευαίσθητα αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

Αριστερά κορυφή

, κηλίδα Western επιβεβαιώνει η υπερέκφραση του Bcl-2 σε μη επεξεργασμένα κύτταρα MCF7-Bcl-2.

Δεξί

, Παραδείγματα των εικόνων του Hoechst 33342-χρωματισμένων πυρήνων των κυττάρων MCF7-Bcl-2 MCF7-ρΟΕΡ και 96 ώρες μετά την επιμόλυνση με ενδεικνυόμενη siRNAs. κύτταρα (D) MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (Β).

Αριστερά

, Μετά από 60 ώρες, το DNA χρωματίστηκε με ιωδιούχο προπίδιο και διανομή του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FL-2Α).

Δεξί

, Παραδείγματα ιστογράμματα που δείχνουν τη διανομή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων 60 ώρες μετά την επιμόλυνση με ενδεικνυόμενη siRNAs. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο + SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων (A, C, D) ή τριπλούν σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα (Β, η = 3). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001, έναντι ελέγχουν κύτταρα siRNA επιμολυσμένα ή όπως υποδεικνύεται ( C).

η

για τα επόμενα πειράματα οι τρεις siRNAs για κάθε στόχο συνενώθηκαν εάν δεν υποδεικνύεται διαφορετικά. Όπως και σε κύτταρα MCF7, η εξάντληση των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών μείωσε την πυκνότητα του καρκινώματος τραχήλου HeLa και κύτταρα οστεοσαρκώματος U-2-OS σημαντικά ακόμη και αν το πρότυπο διέφερε κάπως από αυτή που παρατηρήθηκε σε κύτταρα MCF7 (Σχ. 1Α, Β). Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε με τη χρήση ενιαίου siRNAs στα κύτταρα U-2-OS (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, εξετάσαμε κατά πόσο η παρατηρούμενη θάνατος κυττάρων ήταν Bcl-2-ευαίσθητα (αποπτωτικών) με επιμόλυνση Bcl-2 που υπερεκφράζουν και του φορέα-επιμολυσμένα κύτταρα MCF7 [17] με τα siRNAs και ποσοτικοποίηση του θανάτου που σχετίζεται με συμπύκνωση της χρωματίνης μετά από 96 ώρες. Οι επτά siRNAs που προκαλείται συμπύκνωση της χρωματίνης σε 20-60% των κυττάρων. Bcl-2 ανέστειλε συμπύκνωση χρωματίνης μόνο μετά τον παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNF) θεραπεία (έλεγχος για αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο), και εν μέρει σε KIF21A siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 1 C). Αξιοσημείωτα, KIF21A siRNA ακόμη επάγεται πυρηνική συμπύκνωση σε ~ 40% των Bcl-2-κύτταρα που υπερεκφράζουν (Εικ. 1 C). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με ενιαία siRNAs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

KIF11 και KIF20A είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν μιτωτική σχηματισμός ατράκτου και κυτταροκίνηση, αντίστοιχα [18], [19]. εξάντληση KIF11 συνελήφθησαν των κυττάρων σε G2 /M φάση, όπως αναμενόταν, ενώ KIF20A siRNA επιμολυσμένα κύτταρα συσσωρεύονται στο G1 φάση (Σχ. 1D). Τα άλλα siRNAs δεν προκάλεσε σημαντικές αλλαγές στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου (Εικ. 1D).

Επίδραση των ταυτοποιημένων siRNAs σε λυσοσώματα και κυτταροσκελετού

Από το μη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο μπορεί να προκύψει από βλάβη λυσοσωμικής, μελετήσαμε την επίδραση την επόμενη των ταυτοποιημένων siRNAs επί λυσοσώματα σε κύτταρα MCF7. KIF11, KIF20A, KIF25, MYO1G και MYH1 siRNAs αύξησε σημαντικά το ποσοστό των κυττάρων με μια διευρυμένη ενδο-λυσοσωμική (όξινα) διαμέρισμα (Σχ. 2Α), και σε κύτταρα εξαντλούνται για KIF20A, KIF25 ή MYO1G αυτή η αύξηση συσχετίστηκε με αυξημένη πρωτεάση λυσοσωματικές δραστηριότητα (Εικ. 2Β). Αντιθέτως, KIF11, MYH1 και TPM2 siRNAs μειωμένη δραστικότητα καθεψίνης πιθανώς λόγω διαπερατοποίηση λυσοσωμιακή μεμβράνη (βλέπε παρακάτω). Τα λυσοσώματα διασκορπίσθηκαν σε όλο το κυτταρόπλασμα σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο, KIF11, KIF21A ή MYO1G siRNAs (Σχ. 2C). Αντιθέτως, KIF20A-εξαντλημένο κύτταρα εμφάνισαν μεγάλες προεξοχές που συχνά πυκνοκατοικημένες από λυσοσώματα, και KIF25, TPM2 και MYH1 siRNAs προκάλεσε περιφερική συσσωμάτωση λυσοσωμική (Σχ. 2C). Παρόμοια διανομή λυσοσωματικής παρατηρήθηκε κατά τη μορφομετατροπή με όλα τα τρία μονά siRNAs που στοχεύουν KIF20A, KIF25 και MYH1 και siRNAs 1 και 3 στόχευσης TPM2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α-Δ) κύτταρα MCF7 αφέθηκαν χωρίς θεραπεία, θεραπεία με Oligofectamine (ολιγο) ή επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (CT) ή αναφέρεται πισίνες siRNA. (Α) Μετά από 60 ώρες, τα κύτταρα με διευρυμένη όξινο διαμέρισμα (τέλη ενδοσωμάτων και λυσοσώματα) προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής (FL-2A) του LysoTracker Red-χρωματισμένα κύτταρα. Το όριο για την υψηλή ένταση χρώσης ορίστηκε έτσι ώστε το 90% του ελέγχου κυττάρων siRNA επιμολυσμένα ήταν κάτω. (Β) Μετά από 72 ώρες, η συνολική δραστηριότητα κυστεΐνη καθεψίνη (διάσπαση zFR-AFC) προσδιορίστηκε. HSPA1 και CTSB siRNA που υπηρέτησε ως εσωτερικοί έλεγχοι. (C, D) Μετά από 60 ώρες, τα κύτταρα χρωματίστηκαν για Lamp-2 (C) ή F-ακτίνης (D) και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία. Αντιπροσωπευτικά εικόνες.

Βέλη

, ο συνυπολογισμός των δομών λυσοσωμικών στο κελί προεξοχές /περιφέρεια.

Bars

, 20 μm. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο + SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0.001, έναντι ελέγχουν κύτταρα siRNA επιμολυσμένα

στη συνέχεια, εξετάσαμε κατά πόσον το τροποποιημένο λυσοσωμική εντόπιση συσχετίστηκε με αλλαγές στην κυτταροσκελετού της ακτίνης ή μικροσωληνίσκων, που εμπλέκονται τόσο στη διακίνηση λυσοσωμική [20]. Η εξάντληση των KIF25 και MYH1 αυξηθεί δραματικά F-ακτίνης επίπεδα και ίνες στρες που μπορεί να συμβάλει στην λυσοσωματική επανατοπικοποίηση (Σχ. 2D). Μικρότερη αύξηση σε φυτικές ίνες στρες παρατηρήθηκε κατά την αγωγή με MYO1G και TPM2 siRNAs, ενώ καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε με τα άλλα τα siRNA (Σχ. 2D). Καμία από τις προσδιοριζόμενες siRNAs είχαν ανιχνεύσιμα αποτελέσματα επί μικροσωληνίσκων, όπως κατέστησαν ορατά με βαφή α-τουμπουλίνης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Επίδραση των ταυτοποιημένων siRNAs επί αυτοφαγία και δεξτράνη συσσώρευση

Τα λυσοσώματα λαμβάνουν το φορτίο τους, κυρίως μέσω αυτοφαγία και ενδοκύτωση. Για να δοκιμαστεί η επίδραση των ταυτοποιημένων siRNAs επί αυτοφαγία, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα MCF7 που εκφράζουν tfLC3, ένα ευαίσθητο στο ρΗ tandem φθορίζουσα πρωτεΐνη που αποτελείται από μονομερικές κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (mRFP), ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (eGFP) και σχετίζεται με τους μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη 1 ελαφριάς αλυσίδας 3 (LC3) [21]. Στην αρχική αυτοφαγικά κενοτόπια (AVI) tfLC3 εκπέμπει πράσινο και κόκκινο φθορισμό, ενώ σε εκφυλιστικές αυτοφαγικά κενοτόπια (AVD) που φθορίζει κόκκινο μόνο αφού eGFP φθορισμού χάνεται σε όξινα amphisomes και autolysosomes. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [22], εξάντληση των αρπακτικών, ένα συστατικό του στόχου θηλαστικού του συμπλόκου ραπαμυκίνης 1 που κανονικά μπλοκ αυτοφαγία, αύξησε τον αριθμό των τόσο AVI και AVD ενδεικτικό της αυξημένης ροής αυτοφαγικά (Σχ. 3Α, Β). Σε αντίθεση, MYO1G και MYH1 siRNA πισίνες, καθώς και τα τρία μονά siRNAs που στοχεύουν MYH1 και siRNAs 1 και 3 που στοχεύουν MYO1G αυξημένη AVI, αλλά όχι AVD. SiRNAs που στοχεύουν τις άλλες πέντε υποψήφιοι δεν είχε εμφανή αποτελέσματα σε αυτή τη δοκιμασία (Σχ. 3Α, Β και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ικανότητα των MYO1G και MYH1 siRNAs να αναστέλλουν ροή αυτοφαγικά επίσης υποδεικνύεται από την αύξηση του ρ62 /sequestesome (ρ62 /SQSTM1, μία πρωτεΐνη αποικοδομείται αποτελεσματικά από αυτοφαγία) επίπεδα και μειωμένη ικανότητα ενός επαγωγέα αυτοφαγία, ραπαμυκίνη, για τη μείωση των ρ62 επίπεδα /SQSTM1 μετά siRNA θεραπείες (Σχ. 3C).

(Α-Δ) κύτταρα tfLC3-MCF7 (Α, Β) ή κύτταρα MCF7 (C, D) έχουν αφεθεί χωρίς θεραπεία, θεραπεία με Oligofectamine (ολιγο) ή επιμολυσμένα με ελέγχου siRNA (CT) ή υποδεικνύονται πισίνες siRNA (3 × 6,67 nM). (Α, Β) Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα tfLC3-MCF7 αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία. Εκπρόσωπος εικόνες (Α?

Bars

, 10 μm) και ποσοτικοποίηση των puncta (Β) φαίνονται. Raptor siRNA (RPTOR) χρησίμευσε ως έλεγχος για την αύξηση της ροής αυτοφαγικά. Κλειστά βέλη δείχνουν AVD, ανοιχτά βέλη δείχνουν AVI. (Γ) Μετά από 60 ώρες, το επίπεδο του ρ62 /SQSTM1 (ρ62), το οποίο αποικοδομείται από αυτοφαγία, εξετάστηκε με στύπωση Western. Η ραπαμυκίνη (20 ηΜ, 4 h) χρησιμοποιήθηκε για την επαγωγή αυτοφαγία. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν Ρ62 επίπεδα ως ποσοστό του επιπέδου στα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου siRNA επιμολυσμένα. (D)

Επάνω

, Μετά από 60 ώρες, τα κύτταρα MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μg /ml Alexa Fluor 488-δεξτράνης (δεξτράνη-488) για 1 ώρα και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FL1-Η). Το όριο για την υψηλή ένταση χρώσης ορίστηκε έτσι ώστε το 88% του ελέγχου κυττάρων siRNA επιμολυσμένα ήταν κάτω.

μεσαία

, Παράδειγμα ιστογράμματα που δείχνουν δεξτράνη-488 περιεχόμενο των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο ή KIF20A siRNA. M1 = πύλη για την υψηλή ένταση χρώσης. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο + SEM των 20 κυττάρων σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα (Β, η = 3) ή μέσο + SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων (D). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0.001, έναντι ελέγχουν κύτταρα siRNA επιμολυσμένα

στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση των εντοπίζονται siRNAs για την πρόσληψη των 10 kDa Alexa Flour 488-δεξτράνης με κυτταρομετρία ροής. εξάντληση KIF20A αύξησε τη συσσώρευση των δεξτράνης σημαντικά, ενώ KIF11 siRNA προκάλεσε μικρή (p = 0,066) αύξηση. Οι άλλες πέντε siRNAs δεν είχε καμία επίδραση σε αυτόν τον προσδιορισμό (Σχ. 3D). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτή η δοκιμασία δεν μπορεί να διακρίνει μεταξύ της αυξημένης ενδοκυτώσεως και μειωμένη εξωκύττωση.

Μείωση της σταθερότητας λυσοσωμικής από τις προσδιοριζόμενες siRNAs και μοναστρόλη

Τα μη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και πολυάριθμες λυσοσωμικών αλλαγές που παρατηρήθηκαν ανωτέρω μας ώθησε να μελετήσει την επίδραση των ταυτοποιημένων siRNAs στη σταθερότητα λυσοσωμικής. Πρώτα, μετρήθηκε η ικανότητα του να διατηρεί λυσοσώματα πορτοκαλί ακριδίνης, μια μεταχρωματική βασική βαφή, όταν προκλήθηκαν με μπλε φως [23]. KIF11, KIF20A, KIF21A, MYH1 και TPM2 siRNAs ευαισθητοποιημένα κύτταρα MCF7 ουσιαστικά στην διαρροή λυσοσωματική φωτο-οξείδωση που προκαλείται και KIF25 siRNA εμφάνισαν μια παρόμοια τάση 60 ώρες μετά την επιμόλυνση (Σχ. 4Α, Β). Όταν αναλύθηκαν μετά από 72 ώρες, όλα τα siRNAs είχε προκαλούμενη διαρροή λυσοσωμική (εμφάνιση λυσοσωματικές πρωτεάσες στο κυτταρόπλασμα), αν και η επίδραση της KIF20A και MYO1G siRNAs δεν έφθασαν αρκετά στατιστική σημασία (Σχ. 4C). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η θεραπεία των κυττάρων MCF7 με μοναστρόλη, καλώς χαρακτηρισμένης μικρό αναστολέας μόριο του KIF11 [24], επίσης επάγεται διαπερατοποίηση λυσοσωμιακή μεμβράνη (Εικ. 4D). Έτσι, η εξάντληση του καθενός από τα επτά πρωτεΐνες καθώς και τα αποτελέσματα της θεραπείας μοναστρόλη σε λυσοσωμική αποσταθεροποίηση.

κύτταρα (Α-Ο) MCF7 αφέθηκαν χωρίς θεραπεία, θεραπεία με Oligofectamine (ολιγο) ή επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (CT ) ή υποδεικνύονται πισίνες siRNA (3 × 6,67 nM). (Α και Β) Μετά από 60 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πορτοκαλί της ακριδίνης και αναλύθηκαν με την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων για να μετρηθεί η απώλεια της ακεραιότητας λυσοσωμικών (αυξημένη πράσινο φθορισμό) κατά την αγωγή με λέιζερ. Ένα miminum 25 κυττάρων από προκαθορισμένες περιοχές εξετάστηκε για κάθε πείραμα. Τρία ανεξάρτητα πειράματα φαίνεται στα Α και τιμές στη Β αντιπροσωπεύουν μέσο + SD αυτών των πειραμάτων στο χρονικό σημείο των 60 sec. (Γ) Μετά από 72 ώρες, κυτοσολικές και συνολικό δραστηριότητες κυστεΐνη καθεψίνη μετρήθηκαν με ανάλυση της διάσπασης του zFR-AFC. Οι δραστηριότητες σε εκχυλίσματα κυτοσολίου παρουσιάζονται ως ποσοστά των δραστηριοτήτων στα αντίστοιχα ολικά εκχυλίσματα. HSPA1 και CTSB siRNAs χρησίμευσαν ως μάρτυρες για την επαγωγή διαρροής λυσοσωματικής και την αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής, αντίστοιχα. (D) κυτοσολίου δραστηριότητες καθεψίνης κυστεΐνης σε κύτταρα MCF7 αφεθεί χωρίς θεραπεία ή αγωγή με φορέα (2% διμεθυλοσουλφοξείδιο, DMSO) ή ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του μοναστρόλη για 72 ώρες προσδιορίσθηκαν όπως στο (C). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο + SD πέντε (C) ή τρεις (D) ανεξάρτητων πειραμάτων. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001, έναντι του ελέγχου siRNA-επιμολυσμένα (B, C) ή κύτταρα υπό αγωγή με όχημα (D).

η

Ευαισθητοποίηση για λυσόσωμα διαταραχές φαρμάκων από τις προσδιοριζόμενες siRNAs και μοναστρόλη

από τα siRNAs αποσταθεροποίησε τα λυσοσώματα, εξετάσαμε αν θα ευαισθητοποιήσει επίσης κύτταρα να λυσόσωμα διαταραχές φάρμακα. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα MCF7 διαμολύνθηκαν με τα siRNA για 48 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται για επιπλέον 48 ώρες με siramesine, ετοποσίδη ή σισπλατίνη, τα οποία είναι ικανά να προκαλέσουν λυσοσωμικών κυτταρικού θανάτου [5], [25]. Όλα τα siRNAs εκτός KIF25 siRNA ευαισθητοποιημένα κύτταρα να siramesine με την ισχυρότερη επίδραση παρατηρήθηκε για KIF11 και KIF21A siRNAs (Εικ. 5Α, Β). Για KIF11, αυτό επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας τα τρία ενιαία siRNAs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ευαισθητοποίηση σε ετοποσίδη παρατηρήθηκε με KIF11, KIF21A, KIF25, MYH1 και TPM2 siRNAs (Εικ. 5Α, Β). KIF20A siRNA δεν είχε καμία επίδραση, ενώ MYO1G siRNA μειωμένη θάνατο κυττάρου σε απόκριση προς ετοποσίδη, πιθανώς λόγω της ικανότητάς της να αναστέλλει την αυτοφαγία, το οποίο μπορεί να συμβάλει στην ετοποσίδη θάνατο που προκαλείται [26]. Επιπλέον, KIF11, KIF21, MYH1 και TPM2 siRNAs ενισχυμένη σισπλατίνη που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο, αλλά λόγω των διακυμάνσεων μεταξύ των πειραμάτων η επίδραση ήταν σημαντική μόνο για KIF21A siRNA. Περαιτέρω, συνδυάζοντας μοναστρόλη και siramesine οδήγησε σε συνεργιστική επαγωγή κυτταρικού θανάτου σε MCF7, HeLa, U-2-OS και DU-145 κύτταρα (Σχ. 5C, S2). Έτσι, όλα τα siRNAs ευαισθητοποιημένα καρκινικά κύτταρα σε έναν ή περισσότερους λυσόσωμα διαταράκτη φάρμακα με τις ισχυρότερες επιδράσεις που παρατηρούνται σε κύτταρα που στερούνται KIF11 ή KIF21A.

(Α, Β) τα κύτταρα MCF7 αφέθηκαν χωρίς θεραπεία, θεραπεία με Oligofectamine (ολιγο) ή επιμολυνθεί με siRNA ελέγχου ή υποδεικνύονται πισίνες siRNA (3 × 6,67 nM). Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή επεξεργασία με 2 μΜ siramesine (

κορυφή

), 50 μΜ ετοποσίδη (

μεσαία

) ή 10 μΜ cisplatin (

κάτω

) για επιπλέον 48 ώρες πριν από το φως εικόνων μικροσκοπίας λήφθηκαν (εκπρόσωπος εικόνες σε Β) και τον κυτταρικό θάνατο ποσοτικοποιήθηκε με την δοκιμασία απελευθερώσεως LDH (Α). κύτταρα (C) MCF7 αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν 2 μΜ siramesine μαζί με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις μοναστρόλη για 72 ώρες και θάνατο των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με την δοκιμασία απελευθερώσεως LDH. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο + SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001, έναντι ελέγχουν κύτταρα siRNA-επιμολυσμένα (Α) ή κύτταρα αντιμετωπίζονται μόνο με 2 μΜ siramesine (C).

η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε KIF11, KIF20A, KIF21, KIF25, MYO1G, MYH1 και TPM2 ως πρωτεΐνες των οποίων η εξάντληση προκαλεί αναστολή της ανάπτυξης και μη-αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα (Πίνακας 1). Για τις γνώσεις μας, η μελέτη αυτή είναι η πρώτη για τον εντοπισμό KIF21A, KIF25, MYO1G, MYH1 και TPM2 ως πρωτεΐνες απαραίτητες για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, ενώ άλλα έχουν προηγουμένως αναφερθεί κυτταρικό θάνατο κατά την εξάντληση των KIF11 [27], [28], [29 ] και KIF20A [30] και σε άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ομοίως με τα ευρήματα στην προηγούμενη μελέτη μας δείχνει ότι η εξάντληση των KIF5B είναι πιο τοξικό για τα κύτταρα HeLa από ό, τι στα κύτταρα MCF7 [31], παρατηρήσαμε κάποιες διαφορές στις ευαισθησίες των διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών με τις προσδιοριζόμενες siRNAs. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε διαφορές στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων στόχων ή συναφή γονίδια με περιττές λειτουργίες.

Η

Αξίζει να σημειωθεί ότι, έκτοπη έκφραση της Bcl-2 απέτυχε να διασώσει τα κύτταρα MCF7 από την κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από όλα τα εντοπισμένα siRNAs εκτός KIF21A siRNA. Ακόμη και σε κύτταρα KIF21A εξαντλημένο, έκτοπη Bcl-2 μειώνεται κυτταρικό θάνατο μόνο εν μέρει, από 60 σε 40%. Η αναισθησία σε Bcl-2 πρότεινε τη συμμετοχή των εναλλακτικών μηχανισμών κυτταρικού θανάτου παρά την κλασική απόπτωση. Αυτή η αντίληψη υποστηρίχθηκε σθεναρά από την επόμενη παρατήρηση ότι η εξάντληση όλων των επτά πρωτεΐνες προκάλεσε κάποιο βαθμό λυσοσωμικών αποσταθεροποίησης, ένα σήμα κατατεθέν της οδού λυσοσωμικής κυτταρικό θάνατο [3], [32]. Είναι, ωστόσο, δεν είναι άμεσα προφανές πως εξάντληση των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών οδηγεί σε λυσοσωματική διάσπαση.

Από τις προσδιοριζόμενες κινεσίνες, KIF11, που ονομάζεται επίσης κινεσίνης πρωτεΐνη ατράκτου ή Eg5, έχει μελετηθεί πιο εκτεταμένα, ιδίως στο πλαίσιο του καρκίνου [33]. KIF11 σχηματίζει ένα ομοτετραμερές που είναι υπεύθυνη για το σχηματισμό ατράκτου κατά την διάρκεια της μίτωσης [18]. Κατά συνέπεια και σύμφωνα με άλλες μελέτες [28], [29], η εξάντληση KIF11 συνελήφθη κύτταρα MCF7 στον /φάση του κυτταρικού κύκλου G2 Μ. αναστολή KIF11 έχει επίσης αναφερθεί για να σκοτώσει τα ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος των ωοθηκών και λευχαιμία μέσω της εγγενούς αποπτωτικό μονοπάτι σε μια Bcl-2-ευαίσθητο τρόπο [28], [34]. Σε αντίθεση, KIF11 siRNA προκάλεσε Bcl-2-αναίσθητη μη αποπτωτικό θάνατο σε κύτταρα MCF7 που πιθανόν προέκυψε από την αποσταθεροποίηση των λυσοσωμάτων και την επακόλουθη απελευθέρωση των καθεψινών κυστεϊνης στο κυτταρόπλασμα. αναστολή KIF11 μπορεί να πυροδοτήσει την οδό λυσοσωμικής κυτταρικού θανάτου και σε άλλους τύπους κυττάρων από το λυσόσωμα σταθεροποίησης Hsp70 προστατεύει τα κύτταρα μυελώματος κατά κυτταροτοξικότητα που επάγεται από dimethylenastron, ένας αναστολέας της φαρμακολογική KIF11 [29].

Ομοίως με KIF11, εξάντληση των KIF21A προκαλούνται υπερβολικές λυσοσωμική διαπερατότητας και κυτταρικό θάνατο. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το κυτταρικό θάνατο που επάγεται από την εξάντληση KIF21A άρχισε ήδη -50 ώρες μετά την επιμόλυνση και θα μπορούσε έτσι να επηρεάσει άλλες μετρήσεις της λειτουργίας λυσοσωμικών σε αυτή τη μελέτη (Πίνακας 1). KIF21A δεσμεύεται με την γουανίνη παράγοντα νουκλεοτιδίου-ανταλλαγή BIG1 [35], το οποίο βοηθά να διατηρηθεί η οργάνωση της συσκευής Golgi [36]. Έτσι, η εξάντληση KIF21A θα μπορούσαν να επηρεάσουν την εμπορία εξαρτημάτων λυσοσωμικών από τη συσκευή Golgi στο διαμέρισμα ενδο-λυσοσωμική προκαλώντας δυσλειτουργία λυσοσωμικής. Διαφορετικά, σχεδόν τίποτα δεν είναι γνωστό για KIF21A και τα αποτελέσματά μας ενθαρρύνει σθεναρά την περαιτέρω εξέταση του ρόλου της σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα.

Το τρίτο κινεσίνης που προσδιορίζονται στην οθόνη μας, KIF20A (ονομάζεται επίσης Rabkinesin-6, RAB6KIFL ή MKlp2) έχει αναφερθεί ότι είναι απαραίτητη για την κυτοκίνηση σε κύτταρα HeLa στα οποία η αναστολή του στο σχηματισμό πολυπύρηνων [19], [37], και για την επιβίωση των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων μέσω ενός μηχανισμού που δεν περιλαμβάνει παρεμπόδιση της κυτοκίνησης [30]. Ομοίως με παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, KIF20A-εξαντλημένο κύτταρα MCF7 δεν συλλάβει σε μίτωση ή να εμφανίσει ένα πολυπύρηνα φαινότυπο υποδηλώνοντας ότι άλλοι κινεσίνες μπορεί να αναλάβει τη λειτουργία του μιτωτική σε αυτά τα κύτταρα. Αντ ‘αυτού, η εξάντληση KIF20A ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση κυττάρων MCF7 στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου και προκάλεσε λυσοσωματικής κυτταρικό θάνατο. Ο θάνατος των κυττάρων προηγήθηκε αυξημένο όγκο λυσοσωματική, κυστεΐνη δραστικότητα καθεψίνης και τη συσσώρευση δεξτράνη και αποσταθεροποίηση των λυσοσωμικών μεμβρανών. Οι παρατηρούμενες επιδράσεις στην ενδο-λυσοσωμικού διαμερίσματος μπορεί να σχετίζεται με μια άλλη προηγουμένως αναφερθεί η λειτουργία της KIF20A, δηλαδή τη συμμετοχή της στην εμπορία Golgi που σχετίζονται με κυστίδια με την πλασματική μεμβράνη μέσω της αλληλεπίδρασης με Rab6 [30], [38].

η εξάντληση της τελευταίας εντοπίστηκαν κινεσίνη, KIF25, προκάλεσε περιφερική συνάθροιση λυσοσωμικές και αύξηση του όγκου λυσοσωμικής, ένα φαινότυπο που μοιάζει με εκείνη που προκαλείται από τα ναρκωτικά μικροσωληνίσκους διατάραξη [7]. Απορρύθμιση της εμπορίας ανθρώπων και αύξηση του όγκου λυσοσωμικών μπορεί να συνέβαλαν στη διαπερατότητας λυσοσωμική ως διευρυμένη λυσοσώματα είναι επιρρεπείς σε διάσπαση [39]. εξάντληση KIF25 προκάλεσε επίσης σχηματισμό ακτίνης ίνες στρες, η οποία μπορεί να οφείλεται σε μεταβληθεί Rho σηματοδότησης όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως με τους μικροσωληνίσκους αποσταθεροποίηση [40]. Αυτές οι πρώτες ενδείξεις για τη λειτουργία KIF25 στη διακίνηση λυσοσωμική και τη βιολογία του καρκίνου εγγυάται μια πιο προσεκτική μελέτη αυτού σε μεγάλο βαθμό άγνωστο μέλος της οικογένειας κινεσίνης.

Εκτός από τις κινεσίνες μικροσωληνίσκους αλληλεπιδρούν, εντοπίσαμε τρεις πρωτεΐνες πρόσδεσης ακτίνης, MYH1, MYO1G και TPM2, όπως τις απαραίτητες πρωτεΐνες για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. MYH1, που ονομάζεται επίσης μυοσίνης βαριά αλυσίδα 2 × (MyHC-2Χ), είναι μέρος του σαρκομερούς σε ταχέως σκελετικών μυϊκών ινών [41]. λειτουργίες του σε μη-μυϊκά κύτταρα είναι σχεδόν άγνωστη, αλλά μπορεί να σας βοηθήσει να οργανώσετε ίνες ακτίνης και έτσι να επηρεάσει ακτίνη που εξαρτώνται από την εμπορία ή οργανίδιο αγκυροβόλιο. Σύμφωνα με αυτό, MYH1-εξαντλημένο κύτταρα MCF7 έδειξαν αύξηση στην ακτίνη ίνες στρες και συσσωμάτωση περιφερική λυσοσωματικής συνοδεύεται από μια διευρυμένη λυσοσωμιακό διαμέρισμα και λυσοσωμικών διαπερατότητας. Επιπλέον, MYH1 εξάντληση προκάλεσε αναστολή της αυτοφαγικά αποικοδόμησης και συσσώρευσης των αρχικών αυτοφαγικά κενοτόπια ενδεικτική ελαττωματικών autophagosome-λυσόσωμα σύντηξης, η οποία μπορεί να οφείλεται στην κακή τοποθέτηση των λυσοσωμάτων.

Το δεύτερο προσδιορίζονται μυοσίνη, MYO1G, εμπλουτίζεται σε η μεμβράνη του πλάσματος των αιμοποιητικών κυττάρων, όπου έχει προταθεί για την ενίσχυση της κυτταρικής ελαστικότητα [42], [43]. Όπως και άλλες μυοσίνες κατηγορίας Ι [15], MYO1G μπορεί επίσης να εμπλέκονται σε διακίνηση κύστη. Ωστόσο, ούτε λυσοσωμική εντόπιση ούτε συσσώρευση δεξτράνη άλλαξε σε κύτταρα MYO1G-εξαντλημένο και οι άλλες λυσοσωματικές αποτελέσματα ήταν ηπιότερος από μετά την εξάντληση των άλλων προσδιορίζονται χτυπήματα. εξάντληση MYO1G είχε, ωστόσο, μια ισχυρή ανασταλτική επίδραση στην αυτοφαγικά ροή, η οποία θα μπορούσε να προκύψει από τις παρατηρούμενες αλλαγές στις ίνες ακτίνης. Πρόσφατα, MYH9 /NMHC-ΙΙΑ βρέθηκε να εμπλέκεται στο σχηματισμό autophagosome κατά τη διάρκεια του λιμού [44], και τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο ρόλος των πρόσθετων μυοσίνες, ειδικά MYH1 και MYO1G, στην αυτοφαγία θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω.

το μόνο πρωτεΐνη μη κινητικά προσδιορίζονται στην οθόνη μας ήταν TPM2, η οποία σχηματίζει νημάτια μαζί ίνες ακτίνης και ελέγχει τη σύσπαση των μυών αναστέλλοντας την αλληλεπίδρασή ακτίνης-μυοσίνης. Σε μη-μυϊκά κύτταρα, TPM2 και άλλα τροπομυοσίνες πιστεύεται ότι σταθεροποιούν νημάτια ακτίνης και ρυθμίζουν τις λειτουργίες της ακτίνης, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων κινητικότητα και οργανιδίων και κυστιδίων μεταφοράς [16]. εξάντληση TPM2 προκάλεσε περιφερική συνάθροιση λυσοσωμικής υποδεικνύοντας ότι TPM2 μπορεί, πράγματι, να λειτουργήσει στην ακτίνη που εξαρτώνται από την εμπορία λυσοσωμικής. Αυτό είναι συνεπές με τα δεδομένα που δείχνουν ότι μικροέγχυση TPM1 και TPM2 αντισωμάτων αναστέλλει την μεταφορά της ενδοκυτταρικής κόκκων [45].

επιβλαβείς αλλαγές λυσοσωματικής παρατηρείται κατά εξάντληση του KIF25, TPM2 και MYH1 μπορεί να συνδέεται με προφανή λειτουργία τους στην λυσοσωμική διακίνησης αλλά παραμένει λιγότερο σαφές πώς κάτω ρύθμιση των άλλων πρωτεϊνών διαταραχθεί λυσοσώματα. Είναι πιθανό ότι η εξάντληση τους είχαν ανεπαίσθητες επιπτώσεις στην διακίνηση λυσοσωμικό, όπως αλλαγές στη διακίνηση μικρής εμβέλειας των λυσοσώματα ή διακίνησης υποπληθυσμό λυσόσωμα, η οποία δεν ήταν ανιχνεύσιμες με τις χρησιμοποιούμενες μεθόδους. Εναλλακτικά, η μεταφορά των λιπιδίων ή πρωτεϊνών που προάγουν την ακεραιότητα λυσοσωμική, όπως πρωτεΐνες της λυσοσωμικής μεμβράνης, Hsp70 και σφιγγομυελινάσης οξύ [5], [23], μπορεί να έχουν μεταβληθεί. Πιο έμμεσα, η εξάντληση τους μπορεί να προκαλέσει κυτταροσκελετού αλλαγές που βλάπτουν άλλα κυτταρικά οργανίδια και με τον τρόπο αυτό ενεργοποιούν καταρράκτες σηματοδότησης που προκαλούν λυσοσωμικής διαπερατότητας.

Οι προσδιορίζονται πρωτεΐνες μπορεί να είναι κατάλληλοι στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου, όπως τα καρκινικά κύτταρα ευαισθητοποιούνται σε λυσοσωμική κυτταρικό θάνατο [ ,,,0],4], [5]. Αρκετοί αναστολείς της KIF11, η οποία ρυθμίζεται προς τα πάνω σε ένα ευρύ φάσμα καρκίνων (Oncomine, https://www.oncomine.org), βρίσκονται ήδη σε κλινικές δοκιμές ως αντικαρκινικά φάρμακα [9], και ένας αναστολέας KIF20A έχει πρόσφατα ταυτοποιηθεί [46]. Αυτοί οι αναστολείς αναπτύχθηκαν ως μιτωτικοί αναστολείς αλλά τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αντικαρκινική δράση τους μπορεί επίσης να προκύψει από διάσπαση λυσοσωματικής. Βρήκαμε επίσης ότι η εξάντληση των επτά χτυπήματα ενισχυθεί η τοξικότητα της φωτο-οξείδωσης και των φαρμάκων λυσοσώματος-διαταράσσοντας siramesine, ετοποσίδη και σισπλατίνη. Ισχυρή συνέργεια με όλα τα φάρμακα παρατηρήθηκε μετά την εξάντληση των KIF11, KIF21A και TPM2 ενώ προς τα κάτω ρύθμιση των άλλων πρωτεϊνών ήταν συνεργιστική μόνο με μερικά από τα φάρμακα, πιθανώς εξαιτίας των διαφορών στο μηχανισμό της διαταραχής λυσοσωμικής ή πρόσληψη φαρμάκου. Συνεπώς, συνδυάζοντας αναστολή πρωτεΐνη μοτέρ με άλλες θεραπείες λυσόσωμα διαταραχής φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου. Αυτό θα πρέπει ιδιαίτερα να ελέγχονται για τις ήδη διαθέσιμες αναστολείς KIF11, που έχουν μόνο μέτρια αντικαρκινική δράση ως ενιαίο παράγοντες [9].

Εκτός από τις συνδέσεις του καρκίνου που μελετήθηκαν εδώ, τα αποτελέσματά μας παρέχουν ενδείξεις για την αιτιολογία της σπάνιες γενετικές διαταραχές που προκαλούνται από μεταλλάξεις στο KIF21A και TPM2.