Abstract

Σκοπός

MAGE-Α3 είναι ένας πιθανός στόχος για ανοσοθεραπεία εξαιτίας ογκο-ειδικό χαρακτήρα και την έκφρασή του σε διάφορους τύπους όγκων. Κλινικά δεδομένα σχετικά με MAGE-A3 ανοσοθεραπεία έχουν εγείρει πολλά ερωτήματα που μπορούν να αντιμετωπιστούν μόνο με τη χρήση ζωικών μοντέλων. Στην παρούσα μελέτη, διαφορετικές πτυχές του μυϊκού αντι-καρκινικών άνοσων αποκρίσεων που επάγονται από μία ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη MAGE-Α3 (recMAGE-Α3) σε συνδυασμό με διαφορετικά ανοσοδιεγερτικά (AS01, AS02, AS15 CpG7909 ή) ερευνήθηκαν.

πειραματικός Σχεδιασμός και Αποτελέσματα

με βάση το προφίλ κυτοκίνης αναλύσεις και την προστασία έναντι της πρόκλησης με MAGE-Α3-όγκου που εκφράζει, επιλέχθηκε ο συνδυασμός recMAGE-A3 + AS15 για περαιτέρω πειραματική εργασία, ιδίως για τη μελέτη των μηχανισμών της αντι -tumor απαντήσεις. Με τη χρήση του MHC τάξης Ι, MHC τάξης ΙΙ, perforin-, Β-κύτταρο και την IFN-γ-knock-out ποντίκια και CD4

+ T σε κύτταρα, CD8

+ T σε κύτταρα και ΝΚ σε κύτταρα απεμπλουτισμένο ποντίκια, αποδείξαμε ότι CD4

+ Τ κυττάρων και ΝΚ κυττάρων είναι τα κύρια τελεστές κατά του όγκου, και ότι η ΙΡΝ-γ είναι ένα σημαντικό μόριο τελεστή. Αυτό το μοντέλο όγκου ποντικού ιδρύθηκε, επίσης, την ανάγκη να επαναλάβει τις ενέσεις AS15 recMAGE-A3 + για να διατηρήσει αποτελεσματικές απαντήσεις αντι-όγκου. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η αποτελεσματικότητα της απόρριψης όγκου από τις προκάλεσε αντι-ΜΑΟΕ-Α3 αποκρίσεις εξαρτάται από την αναλογία των κυττάρων όγκου που εκφράζουν MAGE-A3.

Συμπεράσματα

Ο recMAGE-A3 + AS15 ανοσοθεραπεία καρκίνου που προκαλείται αποτελεσματικά ένα αντιγόνο-ειδικό, λειτουργικά και μακράς διαρκείας ανοσολογική απόκριση σε θέση να αναγνωρίσει και να εξαλειφθούν MAGE-A3-καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν έως και αρκετούς μήνες μετά την τελευταία ανοσοποίηση σε ποντικούς. Τα στοιχεία που υπογράμμισε τη σημασία της ανοσοδιεγερτικό να επάγει μια τύπου Th1 ανοσολογική απόκριση, καθώς και το βασικό ρόλο που διαδραματίζει η IFN-γ, CD4

+ Τ κύτταρα και ΝΚ κυττάρων στην αντικαρκινική δράση.

Παράθεση: Gérard C, Baudson Ν, Ory Τ, Louahed J (2014) Tumor Mouse Μοντέλο επιβεβαιώνει MAGE-A3 Καρκίνος Ανοσοθεραπευτικός ως ένα αποτελεσματικό επαγωγέας του Long-Lasting αντι-καρκινικές απαντήσεις. PLoS ONE 9 (5): e94883. doi: 10.1371 /journal.pone.0094883

Επιμέλεια: Ramon Arens, Πανεπιστήμιο Leiden Ιατρικό Κέντρο, Κάτω Χώρες

Ελήφθη: 21 Ιανουαρίου του 2014? Αποδεκτές: 20, Μαρ 2014? Δημοσιεύθηκε: May 15, 2014

Copyright: © 2014 Gérard et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι χρηματοδότες είχε ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. GlaxoSmithKline Biologicals SA ήταν η πηγή χρηματοδότησης και συμμετείχε σε όλες τις φάσεις της διεξαγωγής της μελέτης και ανάλυσης. GlaxoSmithKline Biologicals SA χρηματοδότησε επίσης όλα τα έξοδα που συνδέονται με την ανάπτυξη και τη δημοσίευση του παρόντος χειρογράφου. JL είχε εμπλακεί στην εποπτεία της μελέτης σε όλα τα στάδια. Όλοι οι συγγραφείς συμμετείχαν στο σχεδιασμό της μελέτης, την επανεξέταση των εκθέσεων μελέτη, την ανάλυση δεδομένων και την ερμηνεία. ΝΒ και ΝΑ πραγματοποίησε τη μελέτη και συμμετείχαν στην παραγωγή δεδομένων. Όλοι οι συγγραφείς συμμετείχαν στην εκπόνηση και την έγκριση του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Έχω διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: CG, NB, ΝΑ, JL είναι υπάλληλοι της GlaxoSmithKline εμβόλια. CG και JL δηλώνουν την ιδιοκτησία μετοχών στον όμιλο εταιριών GlaxoSmithKline. CG και JL είναι επίσης εφευρέτης για τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας ανήκει στον όμιλο εταιριών GlaxoSmithKline (WO /2013/096430). Αυτό δεν αλλάζει προσήλωση μας στην PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Από τις παρατηρήσεις του William Coley στον 19ο αιώνα ότι ο καρκίνος μπορεί να αντιμετωπιστεί με την κινητοποίηση το ίδιο το ανοσοποιητικό σύστημα του ασθενούς , ο απώτερος στόχος για immunologists καρκίνο ήταν να επιτευχθεί επαναλήψιμα αυτό σε ασθενείς. Οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες παρεκκλίνουσα, ενεργοποιείται εκ νέου ή υπερ-εκφράζεται σε κύτταρα όγκου, αντιπροσωπεύουν εν δυνάμει «καρκινικά αντιγόνα» που μπορεί να στοχεύονται από το ανοσοποιητικό σύστημα [1] – [3].

απομεθυλίωση υποκινητής Aberrant γονίδιο είναι ένα σημαντικός μηχανισμός με τον οποίο η έκφραση του κανονικά σιωπηλών γονιδίων ενεργοποιεί ξανά σε κύτταρα όγκου. Αυτή είναι η περίπτωση για την MAGEA

οικογένεια γονιδίων που εκφράζονται κανονικά κατά την εμβρυϊκή ζωή [4] και στον πλακούντα [5], [6], αλλά είναι σιωπηλοί σε φυσιολογικούς ενήλικες ιστούς, με εξαίρεση την βλαστικής σειράς κύτταρα του όρχεως [5].

MAGE-A3, ένα μέλος αυτού του MAGE-μια οικογένεια, είναι ένα ελκυστικό αντιγόνο όγκου, όπως i) εκφράζεται σχεδόν αποκλειστικά σε όγκους, εξαλείφοντας τον κίνδυνο της τοποθέτησης ενός δραστική ανοσοαπόκριση έναντι φυσιολογικών ιστών (γεννητικά κύτταρα των όρχεων είναι τα μόνα φυσιολογικά κύτταρα που εκφράζουν MAGE-A3, αλλά στερούνται των μορίων Ι-ΙΙ κλασική HLA τάξης και ως εκ τούτου δεν έχουν δυνατότητες παρουσίασης αντιγόνου, η οποία αποκλείει την ανάπτυξη των ανοσο-συναφείς τοξικότητα κατά MAGE-A3 ανοσοθεραπεία), ii) εκφράζεται σε πολλούς διαφορετικούς τύπους καρκίνου, και iii) είναι φυσικά ανοσογόνο, όπως διαπιστώθηκε CD8

+ Τ λεμφοκύτταρα ειδικά για ΜΑΟΕ-Α3 για να διεισδύσει θέσεις όγκου σε ασθενείς με μελάνωμα [ ,,,0],. 7]

Κλινικά δεδομένα που παράγονται κατά την τελευταία δεκαετία, χρησιμοποιώντας διαφορετικές ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις έδειξαν ότι χορήγηση MAGE-A3 ως καθαρισμένη ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη διαμορφωθούν με ένα ανοσοδιεγερτικό μπορεί να είναι μία πολλά υποσχόμενη προσέγγιση [8] – [11]. Παρ ‘όλα αυτά, παρά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα, πολλά ζητήματα πρέπει να επιλυθούν για να βελτιωθεί περαιτέρω ΜΑΟΕ-Α3-ειδική ανοσοθεραπεία. Συγκεκριμένα, η βελτίωση της MAGE-Α3-ανοσοδιεγερτικό συνδυασμό για την επαγωγή μακράς διαρκείας αντι-καρκινική ανοσοαποκρίσεις παραμένει ουσιαστική. Επιπλέον, οι ακριβείς μηχανισμοί και τα βασικά του ανοσοποιητικού τελεστές που οδηγεί στην απόρριψη του όγκου δεν είναι γνωστό, και δεν υπάρχει σαφής συσχέτιση του ανοσοποιητικού για κλινική αποτελεσματικότητα έχει ακόμα προσδιοριστεί. Ούτε είναι γνωστό σε ποιο βαθμό το εστιακό μοτίβο της έκφρασης MAGE-Α3 εντός ενός όγκου μπορεί να περιορίσει την κλινική αποτελεσματικότητα. Τέτοια ερωτήματα και τις υποθέσεις δεν μπορεί λογικά να αντιμετωπιστεί σε κλινικές δοκιμές, λόγω της μακράς διάρκειας και περιορισμένο αριθμό ασθενών. Ως εκ τούτου, προ-κλινικές μελέτες παραμένουν ουσιαστικής σημασίας για την καθοδήγηση της κλινικής ανάπτυξης της MAGE-Α3-ειδική ανοσοθεραπεία.

Εμείς απευθύνεται κάποια από αυτά τα ερωτήματα στην παρούσα μελέτη. Σε μία πρώτη σειρά πειραμάτων, τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με ανασυνδυασμένη MAGE-Α3 (recMAGE-Α3) διαμορφώνονται με διαφορετικά ανοσοδιεγερτικά: AS01, AS02, AS15 ή CpG7909. AS15 επιλέχθηκε από αυτόν τον πίνακα για περαιτέρω έρευνα, λόγω της ικανότητάς του να οδηγεί το ανοσοποιητικό σύστημα προς μια τύπου Th 1 άνοση απόκριση και η προκύπτουσα δραστικότητα κατά του όγκου έναντι MAGE-Α3-που εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, ποντικοί ανοσοποιήθηκαν με το επιλεγμένο σκεύασμα AS15 recMAGE-A3 + σε μία άλλη σειρά πειραμάτων για να αξιολογήσει i) τα βασικά τελεστές που συμμετέχουν στην δραστικότητα κατά του όγκου, ii) την επίδραση των ενισχυτικές ενέσεις και iii) την επίπτωση της ετερογένειας των όγκων -i.e. η αναλογία των κυττάρων όγκου που εκφράζουν MAGE-Α3- αυτή την δραστικότητα κατά των όγκων.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Τα πειράματα διεξήχθησαν σε εργαστήρια GlaxoSmithKline εμβόλια ή με το προσωπικό της GlaxoSmithKline σε Armand Frappier Ινστιτούτο (IAF – Καναδάς). Οι μελέτες σε ζώα αποκαλύπτονται σε αυτό το χειρόγραφο ήταν ηθικά ελεγχθεί και εγκριθεί από το βελγικό ηθικές Επιτροπή τα εμβόλια της GlaxoSmithKline για τα πειράματα σε ζώα ή από την επιτροπή δεοντολογίας της IAF. Αυτά έγιναν σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή Οδηγία 2010/63 /ΕΕ, τα πρότυπα CCAC (Καναδικό Συμβούλιο για τη Φροντίδα των Ζώων), και της GlaxoSmithKline εμβόλια Πολιτικής σχετικά με την περίθαλψη, την ευημερία και την μεταχείριση των ζώων. Τόσο η εγκατάσταση GlaxoSmithKline Εμβόλιο και IAF είναι AAALAC (Ένωση για την Αξιολόγηση και διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδας Ζώων) είναι διαπιστευμένοι. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία: όγκοι που υπερβαίνει το μέγιστο επιτρεπόμενο μέγεθος 17 mm × 17 χιλιοστά, έλκος, νέκρωση όγκου, σπασμοί, τη νοσηρότητα και κυκλώνοντας συμπεριφορά ήταν οι συνθήκες που απαιτούν ευθανασία από ενδο-περιτοναϊκή ένεση με παράγωγο βαρβιτουρικού οξέος (υπερδοσολογία)

αντιγόνου Περιγραφή, Παραγωγή και καθαρισμός

Η πρωτεΐνη σύντηξης ProtD-MAGE-Α3-His, επίσης, σύντμηση recMAGE-Α3, περιέχει τα πρώτα 127 υπολείμματα της πρωτεΐνης D που προέρχεται από το

Haemophilus influenzae

στο Ν-τελικό άκρο της για τη βελτίωση της έκφρασης της πρωτεΐνης σε ένα βακτηριακό σύστημα, και μια αλληλουχία υπολειμμάτων ιστιδίνης στο C-άκρο της για να διευκολύνει τον καθαρισμό της πρωτεΐνης σύντηξης.

Η παραγωγή recMAGE-A3 διεξήχθη σε η

Escherichia coli

στέλεχος AR58, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Μία άλλη ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη MAGE-Α3, η οποία αποτελείται από τα πρώτα 314 αμινοξέα της MAGE-A3 που ακολουθείται από 6 υπολείμματα ιστιδίνης, παρήχθη με βακιλλοϊό [11]. Αυτή η πρωτεΐνη, που αναφέρεται ως bacMAGE-A3, χρησιμοποιήθηκε στην παρακολούθηση των ανοσολογικών αποκρίσεων.

Περιγραφή της Ανοσοδιεγέρτες

AS02 αποτελείται από ένα γαλάκτωμα ελαίου-σε-νερό το οποίο περιέχει 3-

O

-desacyl-4′-μονοφωσφορυλο λιπίδιο α (MPL, GlaxoSmithKline εμβόλια, Rixensart, Βέλγιο), ένα ΤοΙΙ (TLR) -4 αγωνιστή, και QS-21 (

Quillaja saponaria

κλάσμα Molina 21, Antigenics Inc, θυγατρική της Agenus Inc., Lexington, ΜΑ, USA), το οποίο είναι ένα μόριο της οικογένειας σαπωνίνη [12]. AS01 είναι ένα ανοσοενισχυτικό σύστημα περιέχει MPL, QS-21 και λιποσωμάτων. AS15 περιέχει MPL, QS-21, λιπόσωμα, και το TLR-9 συνδέτη CpG7909 (συνθετικά ολιγοδεοξυριβονουκλεοτίδια [ΟϋΝ] που περιέχει μη μεθυλιωμένα μοτίβα CpG? Αναφέρεται εδώ ως CpG).

Ποντίκι Στελέχη και Ανοσοποιήσεις

C57BL /6 ή CB6F1 (υβρίδιο μεταξύ C57BL /6 και BALB /c) θηλυκά ποντίκια (ηλικίας 6-8 εβδομάδων) αγοράστηκαν από την Harlan (Horst, The Netherlands) και διατηρήθηκαν σε συγκεκριμένες συνθήκες χωρίς παθογόνα.

οι ποντικοί συνήθως ενίεται 2 ή 4 φορές ενδομυϊκά σε διαστήματα 2 εβδομάδων με 1 ή 10 μg recMAGE-A3 σε 50 μΙ ανοσοδιεγερτικού.

Για να μελετηθεί η μακροπρόθεσμη προστασία, ποντικοί έλαβαν 2 ενέσεις είτε recMAGE-A3 + AS15 ή φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) σε διαστήματα 2 εβδομάδων. Οκτώ εβδομάδες μετά τη δεύτερη ανοσοποίηση, τα ζώα προκλήθηκαν με έναν όγκο TC1-MAGE-Α3 (βλέπε περιγραφή των καρκινικών κυττάρων κάτω?

μοντέλα όγκων και προκλήσεις

). Την Ημέρα 150, 80 ημέρες μετά την πρόκληση όγκου, χωρίς όγκο ζώα από την ομάδα recMAGE-A3 + AS15 τυχαιοποιήθηκαν και κατανέμονται σε δύο ομάδες. Μία ομάδα έλαβε τέσσερις αναμνηστικές ενέσεις recMAGE-A3 + AS15 σε διάστημα 4 εβδομάδων και η άλλη ομάδα έλαβε ενέσεις PBS ακολουθώντας το ίδιο χρονοδιάγραμμα. Τριάντα ημέρες μετά την τελευταία ένεση, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε πρόκληση όγκου στην ίδια πλευρά, και η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε κατά την διάρκεια 46 ημερών (μέχρι την ημέρα 319). Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα ενέθηκαν σε μία ομάδα δέκα PBS-ανοσοποιημένα ποντίκια, ως θετικός μάρτυρας για την ανάπτυξη του όγκου.

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος της ΙΡΝ-γ, περφορίνη και MHC τάξης Ι ή II μορίων σε προστασία των όγκων ακόλουθες MAGE-A3 ανοσοθεραπεία, ανοσοανεπάρκεια ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν με τα ίδια σχήματα εμβολιασμού, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα ακόλουθα στελέχη αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Jackson: ΙΡΝγ-νοκ άουτ (ΚΟ) ποντικοί (B6.129S7-Ifngtm1Ts /J), MHC κατηγορίας Ι-ΚΟ (B6.129P2-b2mtm1Unc), MHC κατηγορίας II-ΚΟ (B6.129S2 -H2-dIAb1-Ea00451), Β κυττάρων-KO (B6.129S2.IgHmTm1Cgn) και τα ποντίκια περφορίνης-ΚΟ (C57BL /6-PRF1 tm1Sdz /J).

Για να εκτιμηθεί ο δυνητικός ρόλος των Τ κυττάρων, recMAGE-A3-ανοσοποιημένων C57BL /6 ποντικοί εξαντλούνται από CD4

+ ή CD8

+ Τ κυττάρων με την έγχυση αντισώματα αντι-ποντικού αρουραίου 0,5 mg (GK1.5 [ΤΙΒ-207 από ATCC] και 2,43 [TIB- 210 από ATCC], αντίστοιχα) μία εβδομάδα πριν από την πρόκληση όγκου και στη συνέχεια εβδομαδιαίως κατά τη διάρκεια του πειράματος. εξάντληση των κυττάρων ΝΚ επιτεύχθηκε με την έγχυση του αντισώματος αντι-ασιαλο GM1 (Cedarlane) δύο φορές την εβδομάδα ξεκινώντας την ημέρα 49 (δηλ 7 ημέρες πριν από την πρόκληση όγκου) και μέχρι το τέλος του πειράματος (0.1 ml ανά ένεση). Depletions επιβεβαιώθηκαν με κυτταρομετρία ροής (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). αντισώματα ελέγχου με παρόμοια ισοτύπους με τα καταστρέφουν τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι.

Μοντέλα Όγκου και Προκλήσεις

κύτταρα

TC1-MAGE-Α3 είναι καρκινικά κύτταρα ποντικού γενετικώς τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν ανθρώπινο MAGE-Α3. κύτταρα TC1 όγκου (που λαμβάνεται από τον Δρ Τ Wu, ο John Hopkins University) είναι ενδιαφέροντα, καθώς ανακεφαλαιώνουν τα διάφορα στάδια που οδηγούν σε ένα ογκογόνο κυτταρική σειρά. Αρχικά, η κυτταρική σειρά όγκου TC1 δημιουργήθηκε από επιθηλιακά κύτταρα /6 πρωτογενή πνεύμονα C57BL αθανατοποιημένα με επιμόλυνση του

HPV-16 Ε6

και

e7

γονίδια, και μετασχηματίζονται με ένα ενεργοποιημένο

ras ογκογονιδίου

[13]. Αυτά τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο pcDNA3 που περιέχει

MAGEA3

cDNA και η

ζεοκίνη

γονίδιο επιλογής. Κλώνοι ανθεκτικοί σε ζεοκίνη θεραπεία ελέγχθηκαν για

MAGEA3

έκφρασης με RT-PCR και για το MHC τάξης Ι έκφραση με κυτταρομετρία ροής (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ο καλύτερος κλώνος που δείχνει αναπαραγώγιμες ογκογονικότητα σε ποντικούς επιλέχθηκε.

Για κάθε πρόκληση, τα ζώα έλαβαν μια υποδόρια ένεση των 2 × 10

6 κύτταρα TC1-MAGE-A3 (200 μΙ στο πλευρό). Μεμονωμένα ανάπτυξη του όγκου καταγράφηκε δύο φορές την εβδομάδα, με μέτρηση του προϊόντος από τα 2 κύρια διάμετροι του όγκου κατά τη φάση της παρακολούθησης, ξεκινώντας 7 ημέρες μετά την ημέρα της πρόκλησης. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν κατά τη διάρκεια της μελέτης, όταν το μέγεθος του όγκου έφθασε 289 χιλιοστά

2. Στην περίπτωση αυτή, η τιμή της τελευταίας μέτρησης που λαμβάνονται πριν να θυσιάσει μεταφέρθηκε στο σημείο (α) την επόμενη φορά.

Για να προσδιοριστεί εάν ένα ποσοστιαίο όριο της MAGE-Α3-καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν είναι απαραίτητη για να εκμαιεύσει απόρριψη όγκου από το ανοσοποιητικό σύστημα, τα ποντίκια PBS-ψευδο-ανοσοποιημένους ποντικούς που έχουν ανοσοποιηθεί και με recMAGE-A3 + AS15 προκλήθηκαν με γονικά κύτταρα TC1 (100% MAGE-A3-αρνητικά κύτταρα), κύτταρα TC1-MAGE-A3 (100% MAGE- Α3 εκφράζοντα κύτταρα), ή διαφορετικές αναλογίες TC1 /TC1-MAGE-A3: δηλ. 10/90, 50/50 ή 90/10%, αντίστοιχα

κυτοκίνης

Παραγωγή

Απομονωμένα σπληνοκύτταρα ποντικού καλλιεργήθηκαν παρουσία 1 μg /ml bacMAGE-A3. Μετά από 72 ώρες, οι συγκεντρώσεις της IL-2, IL-4, IL-5, ΙΡΝ-γ και ΤΝΡ-α στα υπερκείμενα μετρήθηκαν με συστοιχία κυτταρομετρική χάντρα (CBA, Pharmingen κατ n ° 551287), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή .

Η ενδοκυτταρική κυτοκίνη χρώσης και κυτταρομετρία ροής

Περιφερειακά μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος που απομονώνονται από ανοσοποιημένα ζώα διεγέρθηκαν

in vitro

στο 96-στρογγυλό πυθμένα φρεατίων είτε με μέσο (χωρίς διέγερση ) ή μια δεξαμενή πενήντα επτά 15 πεπτίδια mer επικαλυπτόμενες από 10 αμινοξέα, που καλύπτει ολόκληρη την αλληλουχία του MAGE-A3 (1 μg /ml για κάθε πεπτίδιο), σε τελικό όγκο 200 μΙ RPMI, 5% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) που περιέχει αντι-ποντικού κουνελιού αντι-CD49d και αντι-CD28 (Becton Dickinson, BD n ° 553154 και n ° 553295, αντίστοιχα? τελική συγκέντρωση: 1 μg /ml το καθένα). Μετά από 2 ώρες επώασης στους 37 ° C, η έκκριση κυτοκινών παρεμποδίστηκε με την προσθήκη 50 μΙ Brefeldin (Golgi Plug, BD n ° 555029: 1/1000 σε RPMI 5% FCS). Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε ένα 96-κωνικό πλάκα καλά πυθμένα, φυγοκεντρείται και πλένεται με 250 μΙ PBS που περιέχει 1% FCS (FACS ρυθμιστικό διάλυμα). Τα σφαιρίδια του κυττάρου επωάστηκαν για 10 λεπτά στους 4 ° C παρουσία του αρουραίου αντι-ποντικού CD16 /CD32 (2.4G2, BD n ° 553142? 0,5 ​​mg /ml) για να εμποδίσει Ρογ υποδοχείς. CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα χρωματίστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C με την προσθήκη αντι-ποντικού CD4 μονοκλωνικό αντίσωμα 50 μΐ φυκοερυθρίνη σημασμένο αρουραίου (BD n ° 556616) ή peridinin χλωροφύλλης πρωτεΐνη-επισημασμένο αντι αρουραίου μονοκλωνικό αντίσωμα -mouse CD8 (BD n ° 553036). Μετά από ένα στάδιο πλύσης, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 200 μΙ διαλύματος Cytofix-Cytoperm (BD n ° 554722) για 20 λεπτά στους 4 ° C και διαπερατά με προσθήκη διαλύματος permWASH (BD n ° 554723). Μετά τη φυγοκέντρηση, τα κύτταρα επωάστηκαν 2 ώρες στους 4 ° C με 50 μΙ ενός μίγματος του αλλοφυκοκυανίνη-επισημασμένο αντι-ΙΡΝ-γ (BD n ° 554413). Τα κύτταρα πλύθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS, πριν την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (LSR2 από BD). Gating έγινε σε Τ κύτταρα, και συνολικά περίπου 20.000 CD4

+ Τ κυττάρων αποκτήθηκαν. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως ποσοστά του ΜΑΟΕ-Α3-ειδική ΙΡΝ-γ παραγωγή CD4

+ ή CD8

+ Τ κύτταρα μεταξύ του συνολικού πληθυσμού των CD4

+ ή CD8

+ Τ κύτταρα, αντίστοιχα , μετά την αφαίρεση του ελέγχου μέσου αξίας.

Στατιστικές αναλύσεις

Cytokine αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός ANOVA με την ομάδα ως παράγοντας μετά log-μετασχηματισμό των δεδομένων. Για άλλες αναλύσεις, το στατιστικό μοντέλο ήταν μια επαναλαμβανόμενη ANOVA με την ομάδα, το χρόνο και την ομάδα-από-χρόνο αλληλεπίδρασης ως παράγοντες? η συσχέτιση μεταξύ δύο μετρήσεων από τους ίδιους ποντικούς θεωρείται ότι είναι αυτοπαλινδρόμησης, δηλαδή συσχετίσεις μειώνονται εκθετικά με το χρόνο. Διακυμάνσεις ήταν υποτίθεται ότι είναι διαφορετική μεταξύ των ομάδων αλλά πανομοιότυπα σε όλη χρονικά σημεία. Συγκρίσεις των μέσων μεγεθών όγκων έγιναν κατά το τελευταίο χρονικό σημείο.

Αποτελέσματα

ανοσοποιητικού και αντι-όγκου Απαντήσεις σε ποντίκια ανοσοποιημένα με recMAGE-Α3 σε συνδυασμό με διαφορετικούς Ανοσοδιεγέρτες

Μετά από τέσσερις ανοσοποιήσεις C57BL /6 ποντίκια με recMAGE-A3, μόνος ή διαμορφωθούν με ένα ανοσοδιεγερτικό (AS01, AS02, AS15 CpG ή), αξιολογήθηκαν δύο χυμική και κυτταρική ανοσολογική απόκριση. Η απόκριση αντισωμάτων ήταν χαμηλή μετά την ανοσοποίηση με μόνη recMAGE-A3, σε σύγκριση με την ανοσοποίηση με recMAGE-A3 διαμορφωθούν με ένα ανοσοδιεγερτικό (Σχήμα S1). Οι χυμικές αποκρίσεις που προκαλούνται από recMAGE-A3 τυποποιούνται με διαφορετικές ανοσοδιεγερτικά θεωρήθηκαν ισοδύναμες, ανεξάρτητα από το ανοσοδιεγερτικού. Παρομοίως, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ανοσοδιεγερτικά στην ικανότητά τους να επάγουν αποκρίσεις Τ-κυττάρων, όπως αξιολογήθηκε με πειράματα λεμφο-πολλαπλασιασμός (εικόνα S2).

Σε αντίθεση, δεν παρατηρήθηκαν όταν η σχετική διαφορά μεταξύ των ανοσοδιεγερτικών

in vitro

παραγωγή κυτοκίνης από σπληνοκύτταρα που απομονώνονται από ανοσοποιημένα ζώα μετρήθηκε με CBA στα υπερκείμενα καλλιέργειας (Σχήμα 1). Παρά τον μικρό αριθμό των ποντικών (η = 2 ή 3) σε κάθε ομάδα, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι AS15 επάγει μία σαφή τάση προς ένα προφίλ Th1, χαρακτηρίζεται από υψηλότερη IFN-γ /IL-5 και TNF-α IL-5 αναλογίες /, συγκριτικά με AS01, AS02 και CpG. Αυτή η παρατήρηση συσχετίστηκε με υψηλότερη παραγωγή της IL-2 που επάγεται από AS15 συγκριτικά με τα άλλα ανοσοδιεγερτικά.

Οι ποντικοί ανοσοποιήθηκαν τις ημέρες 0, 14, 28 και 42 με recMAGE-A3 (10 μg αντιγόνου) μόνα τους ή recMAGE-Α3 διαμορφώνονται με διαφορετικά ανοσοδιεγερτικά, και την εκ νέου διεγείρονται

in vitro από

bacMAGE-Α3. Η παραγωγή κυτοκίνης μετρήθηκε με κυτταρομετρική συστοιχίας σφαιριδίων (CBA) μετά από 72 ώρες καλλιέργειας. Κάθε κουκίδα αντιπροσωπεύει ένα ποντίκι, και τα μπαρ είναι geomeans. Ν, δεν έγινε.

Η

Μετά από 4 ανοσοποιήσεις με PBS ή recMAGE-A3 τυποποιούνται με διαφορετικές ανοσοδιεγερτικά, οι ποντικοί προκλήθηκαν υποδορίως με καρκινικά κύτταρα TC1-MAGE-Α3 και

in vivo

ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε κατά τη διάρκεια 4 εβδομάδων. Σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με PBS, μια προοδευτική αύξηση των όγκων παρατηρήθηκε (Σχήμα 2). Διαφορετικά αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για τους ποντικούς που ανοσοποιήθηκαν με recMAGE-A3, ανάλογα με τη σχετική ανοσοδιεγερτικό. Τα ποντίκια δεν προστατεύονται από την ανάπτυξη του όγκου όταν AS02 χρησιμοποιήθηκε και ήταν κακώς προστατεύονται με AS01 ή CpG. Ωστόσο, η ανάπτυξη του όγκου ελέγχθηκε στα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν με recMAGE-A3 + AS15. Δεν ήταν μόνο το μέγεθος του όγκου μειώνεται σε αυτή την ομάδα, αλλά 3/5 ποντικοί ήταν χωρίς όγκο όταν οι όγκοι αξιολογήθηκαν τέσσερις εβδομάδες μετά την πρόκληση όγκου.

Τα ποντίκια (η = 5) ανοσοποιήθηκαν με recMAGE-A3 ( 10 μg του αντιγόνου) διαμορφώνονται με διαφορετικά ανοσοδιεγερτικά και προκλήθηκαν με κύτταρα TC1-MAGE-A3. Την ημέρα 84, τα πρότυπα σφάλματα του μέσου φαίνεται και ο αριθμός των ποντικών που παραμένουν άνευ όγκου ενδείκνυται για κάθε ομάδα. Την Ημέρα 84, η ομάδα AS15 recMAGE-Α3 + βρέθηκε διαφορετική από οποιαδήποτε άλλη ομάδα (p & lt? 0,01). Επίσης, ο ρυθμός ανάπτυξης των όγκων μειώθηκε στην ομάδα recMAGE-A3 + AS15, σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες (p & lt? 0,01).

Η

Η ιδιαιτερότητα αυτής της απάντησης αντι-όγκου ιδρύθηκε δείχνοντας ότι τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με recMAGE + AS15 δεν ήταν σε θέση να εξαλείψουν κύτταρα TC1 επιμολυσμένα με ένα άσχετο αντιγόνο (TC1-Her2 /neu) εγχύεται υπό τις ίδιες συνθήκες όπως τα κύτταρα TC1-MAGE-A3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Παρατηρήσαμε επίσης ότι AS15 έπρεπε να είναι παρούσα σε κάθε ένεση να διεγείρουν αποτελεσματικά αντι-ΜΑΟΕ-Α3 ανοσία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Με βάση το πλήρες σύνολο των δεδομένων τη σύγκριση των διαφόρων ανοσοδιεγερτικά, επιλέξαμε AS15 για όλους μεταγενέστερα πειράματα με recMAGE-A3, καθώς προκάλεσε μία Th1-προκατειλημμένη ανοσοαπόκριση και ήταν η πιο αποτελεσματική έναντι της ανάπτυξης του MAGE-Α3-που εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα.

Ανοσοποίηση με recMAGE-A3 + AS15 Διεγείρει Μακροχρόνια

προστασία

μια σημαντική πτυχή στην παραγωγή ενός αντι-όγκου ανοσοαπόκριση είναι η επαγωγή μακροχρόνιας ανοσολογικής μνήμης που είναι ικανό να παρέχει μακροχρόνια προστασία έναντι υποτροπές όγκου. Σε προκαταρκτικά πειράματα σε ποντίκια, παρατηρήσαμε ότι η αύξηση του αριθμού των recMAGE-A3 ενέσεις AS15 + ήταν απαραίτητη για την καλύτερη προστασία ποντικών έναντι πρόκλησης όγκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η διατήρηση της ανοσολογικής απόκρισης με επανειλημμένες ενέσεις μπορούν να χρειαστούν για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας (δεδομένα δεν παρουσιάζονται) .

Έχουμε δημιουργήσει ένα πείραμα για να αξιολογηθεί κατά πόσον ανοσοποίηση με recMAGE-A3 + AS15 ήταν σε θέση να προκαλέσει τέτοια μακροπρόθεσμη ανοσολογική μνήμη και αν ενισχυτές ήταν απαραίτητο (Εικόνα 3Α). Για το σκοπό αυτό, τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν τις ημέρες 0 και 14 με PBS ή recMAGE-A3 + AS15. Ανοσοποίηση με recMAGE-A3 + AS15 που προκαλείται ΙΡΝ-γ που παράγουν αντιγονο-ειδικά CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα (Σχήμα 4). Μετά την πρόκληση με κύτταρα όγκου TC1-MAGE-Α3, όλοι PBS-ανοσοποιημένα ποντίκια ανέπτυξαν έναν όγκο και θυσιάστηκαν, ενώ 52 από 60 recMAGE-A3 + AS15-ανοσοποιημένα ποντίκια απέρριψαν τον όγκο και παρέμεινε χωρίς όγκο για τουλάχιστον δύο μήνες ( Σχήμα 3Α).

Α. σχεδιασμός της μελέτης και το μέγεθος του δείγματος (CB6F1 ποντίκια) στα διάφορα στάδια φαίνονται. Οι ανοσοποιήσεις έγιναν με 1 μg του αντιγόνου. B. Μετά τη δεύτερη πρόκληση όγκου, ανάπτυξη όγκου παρακολουθήθηκε για 46 ημέρες. Στο τέλος του πειράματος (Ημέρα 319), τα τυπικά σφάλματα του μέσου φαίνεται και ο αριθμός των χωρίς-όγκο ποντικών ενδείκνυται για κάθε ομάδα.

Η

ποντίκια CB6F1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως φαίνεται στο σχήμα 3Α . Εν συντομία, οι ποντικοί με όγκους προκλήθηκαν μετά από δύο ανοσοποιήσεις με recMAGE-A3 + AS15 ή PBS (έλεγχος 1). Τα ποντίκια της ομάδας MAGE-A3 + AS15 υπόλοιπο του όγκου χωρίς έλαβαν είτε ενισχυτών PBS ή recMAGE-A3 + AS15 ενισχυτές. Μια νέα ομάδα ελέγχου έλαβε PBS (έλεγχος 2). Ελήφθησαν δείγματα αίματος την Ημέρα 21 (7 ημέρες μετά τη δεύτερη ανοσοποίηση) και την ημέρα 166 (7 ημέρες μετά την πρώτη ένεση αναμνηστική). Τα δείγματα αίματος συγκεντρώθηκαν και οι ποσότητες των ΜΑΟΕ-Α3-ειδική ΙΡΝ-γ παραγωγή CD4

+ και CD8

+ Τ κυττάρων προσδιορίστηκε με χρώση ενδοκυτταρικά και κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το ποσοστό του συνολικού CD4

+ και το συνολικό CD8

+ Τ κυττάρων μετά από αφαίρεση των τιμών μέσου ελέγχου, το οποίο αντιπροσώπευε περίπου 0,02% κατά τη μέτρηση CD4

+ Τ κύτταρα και 0,1% κατά τη μέτρηση CD8

+ Τ κύτταρα, αντίστοιχα? κάθε κουκίδα είναι μια ομάδα 3 δείγματα κατά την Ημέρα 21 και κάθε κουκίδα είναι μια πισίνα 5 δείγματα για την Ημέρα 166. *** = ρ & lt?. 0.001

Η

Σε αυτό το στάδιο, 50 του 52 του όγκου -δωρεάν ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες. Μία ομάδα έλαβε PBS και η άλλη ομάδα recMAGE-A3 + AS15. Οι ανοσοαποκρίσεις αξιολογήθηκαν την Ημέρα 166, 7 ημέρες μετά την πρώτη αναμνηστική. Στην ομάδα που έλαβε μια αναμνηστική PBS, το CD4

+ και CD8 απαντήσεις

Τ-κυττάρων + την Ημέρα 166 (5 μήνες μετά τα δύο πρώτα εμβόλια με recMAGE-Α3 + AS15) ήταν χαμηλότερες από τις απαντήσεις κατά την Ημέρα 21 (μία εβδομάδα μετά τις δύο πρώτες ανοσοποιήσεις με recMAGE-A3 + AS15) (Σχήμα 4). Αυτό απεικονίζει την μείωση στην ανοσοαποκρίσεις πάροδο του χρόνου. Σε αντίθεση, ένα ενιαίο recMAGE-A3 + AS15 ενισχυτική ένεση ήταν επαρκής για να αυξήσει τα επίπεδα της κυτοκίνης που παράγουν CD4

+ Τ κύτταρα μέχρι τουλάχιστον τα μετρούμενα επίπεδα την Ημέρα 21. Επιπλέον, τα επίπεδα των CD8

+ Τ κύτταρα αυξήθηκαν έως και 5 φορές σε σύγκριση με τα επίπεδα που μετρώνται μία εβδομάδα μετά τις δύο πρώτες ανοσοποιήσεις (Σχήμα 4) και τα ΜΑΟΕ-Α3-ειδικά CD8

+ Τ κύτταρα που παράγουν ΙΡΝ-γ σε ποσοστό μέχρι 20% του το CD8

+ πισίνα κυττάρων Τ.

Μετά από τέσσερα μηνιαία ενισχυτές, τα 50 ποντίκια που είχαν όγκους αμφισβητηθεί. Σε αυτό το στάδιο, μια τρίτη ομάδα 10 ποντικών που έλαβαν μόνο PBS εισήχθη ως μάρτυρας για την ανάπτυξη του όγκου. Αριθ ΙΡΝ-γ που παράγουν αντιγονο-ειδικά CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα ανιχνεύθηκαν σε αυτήν την ομάδα ελέγχου.

Στην ομάδα που έλαβε ενισχυτικά του PBS, μόνο χαμηλά επίπεδα της ΙΡΝ-β γ-παραγωγή ειδικών για το αντιγόνο CD4

παρατηρήθηκαν + Τ κύτταρα (υπόλοιπο από τις δύο πρώτες εγχύσεις ΜΑΟΕ-Α3 + AS15 που έλαβαν 9 μήνες νωρίτερα). Ωστόσο, 19 από αυτά τα 25 ποντίκια παρέμειναν άνευ όγκου μετά την πρόκληση, που δείχνει ότι μια μακροπρόθεσμη ανοσολογική μνήμη είχε αυξηθεί, και ότι τα ποντίκια που εξακολουθούν να προστατεύονται σχεδόν ένα χρόνο μετά την τελευταία ανοσοποίηση. Στην ομάδα των ποντικών ενισχύθηκε σε μηνιαία βάση recMAGE-A3 + AS15 και τα 25 ποντίκια παρέμειναν άνευ όγκου (Σχήμα 3Β). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι υπήρχε όφελος του δίνοντας αναμνηστικές ενέσεις με recMAGE-Α3 + AS15, ακόμη και αν μια μακρόχρονη και αποτελεσματική ανοσολογική απάντηση προκλήθηκε από την πρώτη ανοσοποίηση.

Σε ένα επόμενο μακροπρόθεσμο πείραμα, διαπιστώσαμε ότι AS15 ήταν αναγκαία σε κάθε αναμνηστική για την προστασία βέλτιστο τρόπο τα ζώα από την ανάπτυξη του όγκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

CD4

+ Τ κύτταρα, ΝΚ κύτταρα, ΙΡΝ-γ και MHC τάξης II οι κυτταρικές υποπληθυσμών και Μοριακής τελεστές συμμετέχει στο recMAGE-A3 + AS15 που προκαλείται

προστασίας του όγκου

σε μια προσπάθεια να εντοπίσει τα κύτταρα ή τους μηχανισμούς τελεστή που μπορεί να είναι υπεύθυνη για την προστασία κατά του όγκου, μια σειρά πειραμάτων διεξήχθη σε ποντίκια είτε ΚΟ ή εξαντλημένο ειδικών τύπων κυττάρων. Οι διάφορες ομάδες ανεπαρκή ποντίκια έλαβαν δύο ή τέσσερις ανοσοποιήσεις recMAGE-A3 + AS15 σε ένα διάστημα δύο εβδομάδων πριν να προκληθούν με κύτταρα TC1-MAGE-A3. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 5, Β κυττάρων-KO, MHC Τάξης Ι-ΚΟ και περφορίνης-ΚΟ παρέμειναν προστατεύεται από recMAGE-A3 + AS15 ανοσοποιήσεις. Σε αντίθεση, η προστασία του όγκου επηρεαστεί με ΝΚ και CD4

ποντίκια + κυττάρων Τ-εξαντλημένα, και IFN-γ-ΚΟ και MHC κατηγορίας II ποντίκια-ΚΟ. Αυτά τα αποτελέσματα προσδιόρισε το CD4

+ Τ κυττάρων και ΝΚ κυττάρων ως κλειδί κυτταρικοί πληθυσμοί στο μηχανισμό απόρριψης όγκων. IFN-γ αναγνωρίστηκε επίσης ως ένα κρίσιμο μοριακό τελεστή. Αν και η ακριβής πηγή της ΙΡΝ-γ δεν είναι γνωστή, τονίζει περαιτέρω τη σημασία της επαγωγής μιας Th1-προκατειλημμένη κατά του όγκου ανοσοαπόκριση.

Σε πειράματα εξάντληση των κυττάρων, isoptypes ελέγχου (Ig) που είναι παρόμοια με το αντίσωμα που χρησιμοποιείται να καταστρέφουν χρησιμοποιήθηκαν κυττάρων Τ ή ΝΚ κυττάρων. Ο αριθμός των ζώων ανά ομάδα υποδεικνύεται σε κάθε τίτλο γράφημα. Το κόκκινο βέλος δείχνει την ώρα της πρόκλησης του όγκου. Κατά την τελευταία χρονικό σημείο, τα πρότυπα σφάλματα του μέσου φαίνεται και ο αριθμός των χωρίς-όγκο ποντικών ενδείκνυται για κάθε ομάδα. Το μέσο μέγεθος του όγκου σε κάθε ομάδα ήταν στατιστικώς σε σύγκριση με εκείνη του recMAGE-A3 ομάδα AS15 + στο τελευταίο χρονικό σημείο (* = ρ & lt? 0,01? ** = Ρ & lt? 0,001? NS = μη σημαντική).

Αναστολή Ανάπτυξης όγκου εξαρτάται από την αναλογία του MAGE-Α3-που εκφράζουν κύτταρα στον όγκο

η έκφραση των αντιγόνων MAGE δεν είναι απαραίτητα ομοιογενής σε έναν όγκο, που δείχνει εστιακή χρώση σε ανοσοϊστοχημεία [14], πιθανώς επειδή δεν είναι όλα τα κύτταρα εκφράζουν MAGE-A3 συγχρόνως και στο ίδιο επίπεδο. Καθώς το φαινόμενο αυτό αναμένεται να έχει επιπτώσεις στην αποτελεσματικότητα του AS15 ανοσοποίησης recMAGE-A3 +, θα αξιολογηθεί κατά πόσο recMAGE-A3 + AS15 ήταν σε θέση να προστατεύσει τα ποντίκια εναντίον ενός όγκου που δεν αποτελείται από 100% MAGE-Α3-κύτταρα που εκφράζουν.

Μετά την ανοσοποίηση με PBS ή recMAGE-A3 + AS15, οι ποντικοί προκλήθηκαν με διαφορετικές αναλογίες TC1 γονικών όγκων και TC1-MAGE-A3-κύτταρα που εκφράζουν (0-10-50-90 και 100%) (Σχήμα 6). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα τα μίγματα όγκου αυξήθηκε ομοιόμορφα σε ψευδο-ανοσοποιημένους ποντικούς με PBS. Ομοίως, η ανάπτυξη μιας MAGE-Α3-αρνητικών όγκου δεν επηρεάστηκε από AS15 ανοσοποίηση recMAGE-A3 +. Σε αντίθεση, recMAGE-A3 + AS15 ανοσοποίηση προστατεύονται έναντι της ανάπτυξης του όγκου κατά τη διάρκεια των 25 ημερών μετά την πρόκληση του όγκου ακόμη και όταν μόνο το 10% των κυττάρων εξέφρασαν TC1 MAGE-A3. Το ίδιο ισχύει όταν το 50% των κυττάρων, και πέρα, εκφρασμένη MAGE-Α3. Ωστόσο, ενώ όλα τα ποντίκια προκλήθηκαν με 100% MAGE-Α3-που εκφράζουν τα κύτταρα παρέμειναν άνευ όγκου έως και 57 ημέρες μετά την πρόκληση, υποτροπές παρατηρήθηκαν στα ποντίκια που προκλήθηκαν με όγκους που περιείχαν MAGE-A3-αρνητικά κύτταρα. Η ένταση του φαινομένου ήταν εξαρτώμενη από το ποσοστό του MAGE-A3-αρνητικά κύτταρα στο δύσκολο όγκου. Στην ομάδα προκλήθηκαν με 90% MAGE-A3-εκφράζοντα κύτταρα, 2/9 ποντίκια εμφάνισαν υποτροπή. Το μέσο μέγεθος όγκου στην ομάδα αυτή δεν ήταν στατιστικά διαφορετική από εκείνη της ομάδας που λαμβάνει 100% MAGE-A3-κύτταρα που εκφράζουν TC1. Σε αντίθεση, στην ομάδα προκλήθηκαν με 50% της MAGE-A3-εκφράζοντα κύτταρα, 6/9 ποντίκια παρουσίασαν υποτροπή την Ημέρα 112, και στην ομάδα προκλήθηκαν με 10% του MAGE-A3-εκφράζοντα κύτταρα, υποτροπές παρατηρήθηκαν σε 7 /9 ποντικών την ημέρα 112. το μέσο μέγεθος του όγκου σε αυτές τις ομάδες ήταν στατιστικά διαφορετική από εκείνη της ομάδας που λαμβάνει 100% του MAGE-A3-κύτταρα που εκφράζουν TC1, με το υψηλότερο μέσο μέγεθος όγκου μεταξύ όλων υποτροπιάσει ζώα παρατηρούνται σε ποντικούς που προκλήθηκαν με 10% MAGE-A3-εκφράζοντα κύτταρα.

Οι ποντικοί ανοσοποιήθηκαν με recMAGE-A3 + AS15 (1 μg αντιγόνου) παρακολουθήθηκαν μέχρι την ημέρα 112. Τις ημέρες 77 και 112, τα πρότυπα σφάλματα του μέσου όρου εμφανίζονται και η αριθμός χωρίς-όγκο ποντικών ενδείκνυται για κάθε ομάδα. Οι στατιστικές συγκρίσεις του μέσου μεγέθους του όγκου της κάθε ομάδας με την εν λόγω ομάδα η TC1-MAGE-A3 (100%) τις ημέρες 77 και 112 εμφανίζονται (* = ρ & lt? 0,01? ** = ρ & lt? 0,001? NS = μη σημαντική). Κόκκινο βέλος:. Την ημέρα της πρόκλησης

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τη δυνατότητα της recMAGE-Α3 διαμορφώνονται με διαφορετικά ανοσοδιεγερτικά. Τόσο οι επάγονται ανοσολογικές αποκρίσεις και την ικανότητά τους να αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου αναλύθηκαν. Για τις λειτουργικές πειράματα, το δυναμικό κατά των όγκων MAGE-Α3 ανοσοποιήσεις αξιολογήθηκε σε μία προφυλακτική περιβάλλον με τα ποντίκια που δεν φέρουν όγκο και όχι ένα θεραπευτικό πλαίσιο, ώστε να μιμούνται περισσότερο στενά την κλινική κατάσταση του επικουρική θεραπεία για ασθενείς με καρκίνο. Πράγματι, στο πλαίσιο της επικουρικής θεραπείας, οι ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση πρώτα, και θεωρούνται χωρίς όγκου όταν λαμβάνουν το σχήμα εμβολιασμού. Μολονότι μοντέλα ποντικού μπορεί να μην αντικατοπτρίζει πλήρως την ανθρώπινη κατάσταση, εν μέρει λόγω των εγγενών διαφορών μεταξύ των δύο ανοσοποιητικά συστήματα [15] και επειδή οι ποντικοί δεν έχουν ασταρωθεί με μία πρωτογενή όγκο, έγχυση των κυττάρων TC1-MAGE-A3 επιλέχθηκε ως ένα μοντέλο όγκου για τον χαρακτηρισμό της επίπτωσης των ανοσοαποκρίσεων που έχουν επάγεται από recMAGE-A3-based ανοσοποίηση. Με αυτό το μοντέλο, οι διάφορες ανοσοδιεγερτικά μπορούσαν να αξιολογηθούν και τουλάχιστον ένα μέρος των μηχανισμών απόρριψης όγκου μπορεί να κατέρρευσε.

πρώτο και επαναλήψιμη παρατήρηση μας ήταν ότι η ένεση του recMAGE-A3 μόνη δεν επάγει προστατευτικές ανοσοαποκρίσεις , recMAGE-Α3 είναι ασθενώς ανοσογονική από μόνη της.