Αφηρημένο

Ένας συνδυασμός απεικόνισης μοριακών στόχευση του καρκίνου και της θεραπείας είναι μια αναδυόμενη στρατηγική για τη βελτίωση της διάγνωσης του καρκίνου και την ελαχιστοποίηση των παρενεργειών των συμβατικών θεραπειών . Εδώ, έχουμε δημιουργήσει μια ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη, EC1-gluc-p53C, με σύντηξη EC1 πεπτίδιο, ένα τεχνητό συνδέτη του ErbB2, με το

Gaussia

λουσιφεράσης (gluC) και ένα πεπτίδιο ρ53-ενεργοποίηση, p53C. EC1-gluc-p53C εκφράστηκε και καθαρίστηκε από το

E. coli BL21

.

In vitro

πειράματα έδειξαν ότι EC1-gluc-p53c ήταν σταθερή σε φωταύγειας δραστηριότητα και επιλεκτικά στοχευμένες υπερεκφράζουν ErbB2 κύτταρα ΒΤ474 για την απεικόνιση βιοφωταύγεια. Επιπλέον, η εσωτερίκευση EC1-gluc-p53C στα κύτταρα ΒΤ474 που ασκείται η λειτουργία του να επανενεργοποιήσει p53 και αναστέλλει σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Σε ποντικούς που φέρουν όγκο, ο ErbB2 στόχευση βιοφωταύγεια απεικόνισης και θεραπευτικό αποτέλεσμα των EC1-gluc-p53C παρατηρήθηκαν επίσης ειδικά σε όγκους ΒΤ474 αλλά όχι σε MCF7 όγκους, η οποία δεν υπερεκφράζουν ErbB2. Έτσι, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει EC1-gluc-p53C να είναι ένα αποτελεσματικό theranostic αντιδραστήριο στόχευση ErbB2 για βιοφωταύγεια απεικόνιση και θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Χαν XJ, η Sun LF, Νισιγιάμα Υ, Feng Β, Michiue Η Seno M, et al. (2013) Theranostic Πρωτεΐνη Στόχευση ErbB2 για βιοφωτισμός απεικόνιση και θεραπεία για τον καρκίνο. PLoS ONE 8 (9): e75288. doi: 10.1371 /journal.pone.0075288

Επιμέλεια: Xiaoyuan Chen, ΝΙΗ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18, Απριλίου, 2013? Αποδεκτές: 12 Αυγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 17 του Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Han et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση-in-ενίσχυση για Νέους επιστήμονες (Β) από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστήμης, Αθλητισμού και Πολιτισμού της Ιαπωνίας (No: 21790202, http: //www.waseda.jp/rps/en/manual/kaken hi_honbun.html) και από την Grant-in-βοήθειας για την επιστημονική έρευνα από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (αριθ: 22.00119, http: //www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ErbB2 είναι μέλος του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) της οικογένειας των κινασών τυροσίνης υποδοχέα, που ονομάζεται επίσης η οικογένεια ErbB. Η οικογένεια ErbB περιλαμβάνει τέσσερα μέλη, ErbB1, ErbB2, ErbB3 και ErbB4. Υπάρχουν αρκετές ενδογενείς συνδέτες για υποδοχείς ErbB με την εξαίρεση του ErbB2 [1]. Η δραστικότητα της κινάσης της τυροσίνης του ErbBs μπορεί να ενεργοποιηθεί από ενδογενή προσδέματα και τα ομο- ή ετερο-διμερισμό των υποδοχέων ErbB, η οποία εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης των κυττάρων [1-3]. Επιπλέον, ErbB2 έχει ενοχοποιηθεί στην παθογένεση όγκων και την πρόοδο [4-6]. Κλινικά, η υπερέκφραση του ErbB2 σχετίζεται με περίπου 30% των καρκίνων του μαστού, των ωοθηκών καρκίνους [7] και άλλες κοινές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων, γαστρικό και στοματικών καρκίνων [8]. Η υπερέκφραση συνδέεται επίσης με τη μετάσταση, θεραπευτικές αντίσταση και κακή πρόγνωση του καρκίνου [9-11]. Έτσι, ErbB2 μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη μοριακός στόχος για την απεικόνιση του καρκίνου και τη θεραπεία χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα και φορείς πεπτίδιο στόχευσης [12,13]. Σε μια μελέτη έκθεσης φάγου, εντοπίσθηκαν αρκετές μικρές τεχνητές κυκλικά πεπτίδια με ειδική συγγένεια για ErbB2. EC1, μία από αυτές τις τεχνητές πεπτιδίων, δεσμεύεται με την εξωκυτταρική περιοχή του ErbB2 σε ζωντανά κύτταρα και φρέσκο ​​κατεψυγμένο ανθρώπινο δείγματα καρκίνου του μαστού [14]. Επιπλέον, η βιοτίνη-συζευγμένο EC1 και η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη EC1 ΕΟΡΡ διατηρούνται συγγένεια για ErbB2 και είχαν εσωτερικεύεται από υπερεκφράζει ErbB2 καρκινικών κυττάρων [14,15]. Πρόσφατα, δισθενή και πολυσθενείς μορφές EC1-Fc συνδετήρα σε λιποσώματα έχουν αναφερθεί για τη βελτίωση της συγγένειας για ErbB2 και να ενισχύσει την εσωτερίκευση [16]. Έτσι, EC1 πεπτίδιο μπορεί να είναι ένας πιθανός τεχνητό συνδέτη για στόχευση ErbB2.

παθογένεση όγκων, αρκετές ανώμαλη μεταλλάξεις βρίσκονται στα γονίδια καταστολής όγκων. Ένα από τα πιο γνωστά γονίδια καταστολής όγκων είναι

p53

, η οποία είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της απόπτωσης και η πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο στον καρκίνο [17,18]. Αποκατάσταση της δραστηριότητας ρ53 έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα αποτελεσματικό μέσο για την αντιμετώπιση καρκινικών κυττάρων με ρ53 μεταλλάξεις [19,20]. Σε προηγούμενες μελέτες μας [21-23], ένα πλήρους μήκους ανασυνδυασμένο ρ53 παραδόθηκε με επιτυχία σε ανθρώπινα κακοήθη κύτταρα γλοιώματος, του στόματος και του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα με σύντηξη με πολυ-αργινίνη, ένα πεπτίδιο διείσδυσης σε κύτταρα (CPP). Διαπιστώθηκε ότι η πλήρους μήκους ανασυνδυασμένη ρ53 είχε σημαντική ανασταλτική δράση επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, το μεγάλο μοριακό μέγεθος και την ταχεία αποικοδόμηση από το μονοπάτι ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος επηρέασε σημαντικά την αποτελεσματικότητα της μεταγωγής πρωτεΐνης και επίδραση της μετάγονται ρ53 σε καρκινικά κύτταρα [24]. Το C-τελικό άκρο της ρ53 είναι μια λυσίνη περιοχή πλούσια υπόκειται σε μια ποικιλία από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις [25,26]. Ένα πεπτίδιο που προέρχεται από το C-τελικό άκρο ενεργοποιεί ειδική σύνδεση με ρ53

in vitro

μέσω ενός άγνωστου μηχανισμού [27] DNA. Έχει αναφερθεί ότι το C-τερματικό πεπτίδιο ρ53 που προέρχεται από (p53C) προκάλεσε ταχεία απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του μαστού που φέρουν ενδογενή μεταλλάξεις ρ53 ή υπερεκφράζονται άγριου τύπου (wt) ρ53, αλλά δεν ήταν τοξικό για μη κακοήθη ανθρώπινες κυτταρικές σειρές που περιέχουν wt ρ53 [28 ]. Επιπλέον, το πεπτίδιο p53C συντήκονται με CPP αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων από την επανενεργοποίηση ενδογενή ρ53, και αυξάνει σημαντικά τη διάρκεια ζωής σε ζωικά μοντέλα του τερματικού περιτοναϊκή καρκινωμάτωσης και καρκίνου της ουροδόχου κύστης

in vivo

[29-31]. Οι μελέτες αυτές αποδεικνύουν την επανενεργοποίηση της πρωτεΐνης p53 από το πεπτίδιο p53C να είναι ένα πολλά υποσχόμενο μέσο για τη θεραπεία του καρκίνου.

απεικόνισης βιοφωταύγεια αναδύεται ως μια σχετικά απλή, αποδοτική και εξαιρετικά ευαίσθητο τρόπο για την παρακολούθηση της δυναμικής βιολογικές διεργασίες σε άθικτο κύτταρα και τα ζώντα ζώα [32]. Τα τελευταία χρόνια, η τεχνολογία έχει αναπτυχθεί ραγδαία με βελτιώσεις στην λουσιφεράσης δημοσιογράφους και όργανα [33]. Οι πιο κοινές λουσιφεράσεις για την απεικόνιση βιοφωταύγειας περιλαμβάνουν

Firefly

λουσιφεράσης (διακύμανση των),

Renilla

λουσιφεράσης (RLuc) και

Gaussia

λουσιφεράσης (gluC). Κάθε λουσιφεράσης έχει ξεχωριστές ιδιότητες όσον αφορά την εφαρμογή της απεικόνισης βιοφωταύγεια. Διακύμανση των (62 kDa) καταλύει την οξείδωση της λουσιφερίνης για απόδοση βιοφωταύγειας παρουσία O

2, μαγνήσιο και ΑΤΡ [34]. RLuc (36 kDa) και gluc (19,9 kDa) καταλύουν την οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση της συνελεντεραζίνης να εκπέμπουν φως ανεξάρτητα από ΑΤΡ. Ωστόσο, RLuc έχει χαμηλότερη κβαντική απόδοση από ό, τι διακύμανση των, και επίσης λιγότερο ενζυματική απόδοση [35,36]. Gluc αποδίδει περίπου 200- (

in vivo

) έως 1000 φορές (

in vitro

) επιπλέον βιοφωταύγειας σε κύτταρα θηλαστικών από διακύμανση των και RLuc [37]. Ως εκ τούτου, μικρό μοριακό μέγεθος του (19.9kDa), ανεξαρτησία από ΑΤΡ και την ισχυρή εκπομπή κάνει gluC πολύ πιο κατάλληλα για την απεικόνιση βιοφωταύγεια

in vitro

και

in vivo

[38,39].

Η έννοια της «Theranostic» είχε δρομολογηθεί από Funkhouser το 2002 από μία από τις αξιολογήσεις του [40]. Theranostics ορίζεται ως ένα υλικό το οποίο συνδυάζει τις λεπτομέρειες της θεραπείας και διαγνωστικής απεικόνισης ταυτόχρονα μέσα στην ίδια δόση. Ο στόχος της theranostic είναι να δωρίσουν τα υλικά με την ικανότητα παρακολούθησης της κατεργασμένου ιστού και αποτελεσματικότητα στη μακροχρόνια περίοδο [41]. έχουν Theranostic αντιδραστήρια έχουν αναπτυχθεί ταχέως κατά την προηγούμενη δεκαετία, ιδιαίτερα μετά την εμφάνιση ορισμένων νέων οπτικών ανιχνευτών και ισχυρή βιομόρια για τη στόχευση και τη θεραπεία. Στην παρούσα μελέτη, μία νέα ErbB2-στόχευση πρωτεΐνη βιοφωταύγεια δομήθηκε με σύντηξη EC1 με gluc και πεπτίδιο p53C. Δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκινώματος του μαστού, MCF7 χωρίς έκφραση της ErbB2 και ΒΤ474 που υπερεκφράζουν ErbB2, χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί ο ρόλος του EC1-gluc-p53C σε συγκεκριμένες απεικόνιση βιοφωταύγειας και τη θεραπεία του καρκίνου. Παρατηρήσαμε ότι EC1-gluc-p53C όχι μόνο στοχευμένες ErbB2 για την απεικόνιση βιοφωταύγεια, αλλά και επιλεκτικά αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου των ΒΤ474

in vitro

και

in vivo

. Τα παρόντα αποτελέσματα δείχνουν ότι EC1-gluc-p53C μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη theranostic αντιδραστήριο που στοχεύουν ErbB2 για βιοφωταύγεια απεικόνιση και θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και ανίχνευση της έκφρασης ErbB2

Οι κυτταρικές σειρές MCF7 και ΒΤ474 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). κύτταρα ΒΤ474 φέρουν παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη (E285K) στο γονίδιο p53 [42], ενώ MCF7 κυττάρων με υπερέκφραση του wt ρ53 [28]. κύτταρα ΒΤ474 αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 100 μg /ml πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (P /S). κύτταρα MCF7 καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMED συμπληρωμένο με 10% FBS και 100 μg /ml P /S. Τα μέντιουμ, FBS και P /S ήταν από την Invitrogen. Όλες οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με μια ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2.

Η έκφραση του ErbB2 σε κύτταρα MCF7 και ΒΤ474 εξετάστηκε με ανοσοκηλίδωση Western. Εν συντομία, MCF7 και ΒΤ474 κύτταρα επί 35 χιλιοστά πιάτα πλύθηκαν μία φορά με PBS, και αποξέστηκαν σε 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε 6% SDS-PAGE, και ανοσοστυπώθηκαν με αντίσωμα αντι-ΕΛΒ2 κουνελιού (1: 1000? Cell Signaling) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. HRP-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1: 2000. σήματα Ανοσοκηλίδωση ανιχνεύθηκαν με το Versa Doc 5000 σύστημα απεικόνισης (Bio-Rad) με ένα ενισχυμένο κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Amersham Biosciences, Pittsburgh, ΡΑ).

κατασκευή πλασμιδίου

Το πλασμίδιο pGLuc αγοράστηκε από LUX βιοτεχνολογίας Ltd (Σκωτία, Ηνωμένο Βασίλειο). Το γονίδιο gluc ενισχύθηκε από το πλασμίδιο χρησιμοποιώντας ένα νοηματικό εκκινητή (5′-GGATCCGAAACCAACTGAAAACAATGAAG-3 ‘) και αντινόημα εναρκτήρα (5′-GTCGACATCACCACCGGCACCCTTTAT-3′). Το PCR προϊόν συνδέθηκε εντός του φορέα pCR2.1 ΤΟΡΟ (Invitrogen) για ενίσχυση, και επανακλωνοποιήθηκε στο φορέα pET52b (Invitrogen) για να κατασκευαστεί gluc-pET52b. Τα ακόλουθα νοηματικά και αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια (Hokkaido System Science, Ιαπωνία) με κατάλληλες θέσεις ενζύμου αντίσταση για EC1 ή p53C πεπτιδίου παρασκευάστηκαν? για EC1? 5’-GGGTGGACTGGCTGGTGCCTGAATCCAGAAGAATCTACTTGGGGATTCTGTACTGGATCTTTCGGTGGAGGTAGTTCAG-3 ‘(έννοια, υπογράμμιση υποδεικνύει

Σαμ

Ι και

Bam HI

sites) και 5′-GATCCTGAACTACCTCCACCGAAAGATCCAGTACAGAATCCCCAAGTAGATTCTTCTGGATTCAGGCACCAGCCAGTCCACCC-3′ (αντιπληροφοριακό, υπογράμμιση υποδεικνύει

Μπαμ

HI και

Σαμ

sites Ι), και για p53C? 5′-TCGACGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAAGGCGC-3 ‘(έννοια, υπογράμμιση υποδεικνύει

Sal

Ⅰand

Δεν

Ⅰsites), και 5′-GGCCGCGCCTTTTTTATGGCGGGAHHTAGACTGACCCTTTTTGGACTTCAGGTGGCTGGAGTGAGCCCTGCTCCCG-3′ (έννοια, υπογράμμιση υποδεικνύει

Δεν

ⅰand

Sal

ⅰsites). Τα ολιγονουκλεοτίδια για EC1 και p53C τροποποιήθηκαν με φωσφορυλίωση στο 5 ‘. Τα ολιγονουκλεοτίδια με νόημα και αντινόημα (10 pmol έκαστο) συν-επωάστηκαν στους 95 ° C για 10 λεπτά, και ανόπτηση σε θερμοκρασία δωματίου για να σχηματίσει δίκλωνο ΟΝΑ. Το δίκλωνο DNA για EC1 ή p53C συνδέθηκε προς gluc-pET52b σε επεξεργασία με τα κατάλληλα ένζυμα για να κατασκευάσει αντοχή EC1-gluc-pET52b ή EC1-gluc-p53C-pET52b. Η τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση εισήχθη στο BamHI σε EC1-gluc και EC1-gluc-p53C χρησιμοποιώντας ένα κιτ QuikChange (Stratagene) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές για μεταλλαξογένεση ήταν 5’-GTGGAGGTAGTTCAGGAACCAAACCAACTG-3 ‘(έννοια, υπογράμμιση δηλώνει το μεταλλαγμένο νουκλεοτίδιο), 5′-CAGTTGGTTTGGTTCCTGAACTACCTCCAC-3’ (antisense). GluC, EC1-gluc και EC1-gluc-p53C στη συνέχεια υποκλωνοποιήθηκαν σε pGEX-6P-1 μεταξύ του

Bam HI

και

Eco

τοποθεσίες RI για τον καθαρισμό πρωτεϊνών. Οι αλληλουχίες των κατασκευασμένων πλασμιδίων επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα sequencer ΑΒΙ 3100.

Έκφραση και καθαρισμός των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

Η έκφραση και ο καθαρισμός των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία,

Ε. coli

BL21 (DE3) μετασχηματισμένο με το πλασμίδιο για gluc, EC1-gluc ή EC1-gluc-p53C αναπτύχθηκε σε μέσο LB το οποίο περιέχει 100 μg /mL αμπικιλλίνη σε 37 ° C. Οταν η OD600 έφθασε 0,6, η έκφραση των GST-συντηγμένων πρωτεϊνών προκλήθηκε με προσθήκη 0,2 mM ισοπροπυλ 1-θειο-β-D-γαλακτοπυρανοσίδη σε 25 ° C όλη τη νύκτα. Οι πρωτεΐνες σύντηξης καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας μια στήλη γλουταθειόνης Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare). Για τη διάσπαση GST από τις πρωτεΐνες σύντηξης, οι καθαρισμένες πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε περαιτέρω επεξεργασία με PreScission πρωτεάση (GE Healthcare) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε 15% SDS-PAGE, και επιβεβαιώθηκε με Coomassie brilliant blue χρώση και ανοσοστύπωση με κουνέλι αντι-

Gaussia

ορού λουσιφεράσης (1: 1000, Nanolight). Οι πρωτεΐνες τελικά σε διαπίδυση έναντι PBS, και οι συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Bio-Rad Laboratories). Κλάσματα πρωτεΐνης φυλάχθηκαν στους -80 ° C πριν από τη χρήση.

Παρασκευή συνελεντεραζίνης (CTZ)

Το υπόστρωμα για gluc παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Εν συντομία, CTZ (Nanolight) διαλύθηκε σε οξυνισμένη μεθανόλη (1 σταγόνα πυκνού HCl (12,4 Ν) σε 10 mL μεθανόλης) σε συγκέντρωση 5 mg /ml. Κλάσματα των 100 μΐ αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Για την απεικόνιση της φωταύγειας, οι κλάσματα CTZ (5 mg /ml) αραιώθηκαν με PBS (που περιέχει 5 mM NaCl, ρΗ 7,2) για μεγαλύτερη απόδοση φωτός και περισσότερη σταθερότητα.

Αναλύσεις της δραστηριότητας φωταύγειας και τη σταθερότητα των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

για να προσδιοριστεί η δραστικότητα φωταύγειας των καθαρισμένων πρωτεϊνών, 2 μg του κάθε πρωτεΐνη μεταφέρθηκε σε μία πλάκα 96 φρεατίων. Η βιοφωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο πλάκας (Microlumat συν LB 96V, τεχνολογίες Berthold) μετά την προσθήκη 10 μΙ CTZ (20 μΜ). Bioluminescent δραστηριότητα αναφέρθηκε σε σχετικές μονάδες φωτός (RLU) μετριέται με χρόνο ολοκλήρωσης 10 sec και υπολογίζεται ως RLU ανά micromole για κάθε πρωτεΐνη. Οι τιμές για EC1-gluc και EC1-gluc-p53C ομαλοποιήθηκαν με gluc.

Η σταθερότητα των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών αξιολογήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38]. Κλάσματα πρωτεΐνης επωάστηκαν με ίσο όγκο ορού ποντικού (Sigma) στους 37 ° C. Σε κάθε χρονικό σημείο, τα δείγματα αποσύρθηκαν για βιοφωταύγεια απεικόνιση και κηλίδωση Western. Στην ανάλυση της σταθερότητας βιοφωταύγειας, το ποσοστό της αρχικής ποσότητας του RLU σε κάθε χρονικό σημείο απεικονίστηκε γραφικά για κάθε πρωτεΐνη. Για την ανίχνευση της αποδόμησης των πρωτεϊνών μετά την επώαση με ορό, τα δείγματα αποσύρθηκαν σε κάθε χρονικό σημείο υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 15% πήκτωμα ακρυλαμιδίου SDS-PAGE, και ανοσοστυπώθηκαν με κουνέλι αντι-

Gaussia

ορού λουσιφεράσης σε αραίωση 1: 1000. Συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα (Rabbit? Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1: 2000

απεικόνισης βιοφωταύγεια

in vitro

, εσωτερίκευση από τα κύτταρα που υπερεκφράζουν ErbB2 και

WST-1 προσδιορισμό.

για την απεικόνιση βιοφωταύγειας

in vitro

, MCF7 και ΒΤ474 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε δίσκους υάλου πυθμένα 35-mm. Για να βελτιωθεί η προσκόλληση των κυττάρων MCF7 και ΒΤ474, όλα τα πιάτα γυαλιού πυθμένα είχαν προ-επικαλυφθεί με λαμινίνη (Roche). MCF7 και ΒΤ474 κύτταρα επωάστηκαν με 1 μΜ του κάθε πρωτεΐνη για 24 ώρες. Μετά από τρεις πλύσεις με DMEM, βιοφωταύγεια ανιχνεύθηκε με την Olympus Luminoview LV 200 (Bio-φωταύγεια μικροσκόπιο) αμέσως μετά την προσθήκη 1 μg /mL CTZ σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό. Οι εικόνες ελήφθησαν και αναλύθηκαν με λογισμικό Metamorph (Molecular Devices).

Για να εξεταστεί η εσωτερίκευση του EC1-συντηγμένων πρωτεϊνών σε ErbB2 που υπερεκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα, τα κύτταρα ΒΤ474 επωάστηκαν με 1 μΜ gluc, EC1-gluc ή EC1- gluC-p53C. Στη μελέτη αποκλεισμού, τα κύτταρα ΒΤ474 υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντι-ΕτοΒ2 έναντι εξωκυτταρική περιοχή του ErbB2 (Κοτόπουλο, 1,0 μg /mL, Abcam) 1 ώρα πριν από την επώαση με EC1-gluc ή EC1-gluc-p53C. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και επεξεργασία με θρυψίνη. Κυτταρόλυμα προετοιμάστηκε και υποβλήθηκε σε 15% SDS-PAGE. Η εσωτερίκευση της πρωτεΐνης σύντηξης ανοσοαποτύπωση με κουνέλι αντι

Gaussia

λουσιφεράσης ορό. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας ενδογενής έλεγχος.

Για να αξιολογηθεί το θεραπευτικό αποτέλεσμα της EC1-gluc-p53C

in vitro

, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία WST-1 όπως περιγράφεται προηγουμένως [ ,,,0],21]. Μετά 3,0 × 10

3 MCF7 και 1,0 × 10

4 ΒΤ474 κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων επίπεδου πυθμένα πλάκες, αυτά καλλιεργήθηκαν σε DMEM ή μέσο RPMI1640 που περιείχε 10% εμβρυϊκό βόειο ορό για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συμπληρώθηκαν με 1 μΜ της πρωτεΐνης ή PBS (ημέρα 0) και καλλιεργήθηκαν περαιτέρω 96 h (Day4). Η βιωσιμότητα των κυττάρων από την ημέρα 0 έως την ημέρα 4 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία WST-1 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Roche Applied Science). Για να προσδιοριστεί η εξαρτώμενη από την δόση επίδραση του EC1-gluc-p53C επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΒΤ474, η πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε σε 0,1 ~ 2,0 μΜ, και η δοκιμασία WST-1 διεξήχθη την ημέρα 4.

Reporter Assay για ρ53 γνώμονα Μετενεργοποίησης

Η δοκιμασία ρεπόρτερ διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [22]. Εν συντομία, η λουσιφεράση φορέα ρεπόρτερ pGL2-βασικό (Promega) που περιέχει ένα θραύσμα 2,4 kbp του ανθρώπινου ρ21

WAF1

υποκινητή ήταν ένα δώρο από Drs. Τ Akiyama (Πανεπιστήμιο του Τόκιο) και Κ Yoshikawa (Πανεπιστήμιο Οσάκα). κύτταρα ΒΤ474 καλλιεργούνται μέχρι 80% συρροή σε δίσκους mm διαμέτρου 35 επιμολύνθηκαν με το φορέα αναφοράς λουσιφεράσης με Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 μΜ του gluc, EC1-gluc, EC1-gluc-p53C ή τον ίδιο όγκο PBS για 24 ώρες, και περαιτέρω καλλιεργήθηκαν σε νέο μέσο 2 ώρες πριν από την κυτταρική συγκομιδή. Το κυτταρόλυμα χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της δραστικότητας της λουσιφεράσης με φωτόμετρο και σύστημα προσδιορισμού λουσιφεράσης (Promega). Η δραστικότητα λουσιφεράσης υποβάθρου αφαιρέθηκε σε όλα τα πειράματα. Πέντε ανεξάρτητα πειράματα για κάθε κατάσταση.

Παρασκευή φέρουν όγκο ποντικών

Γυμνά ποντίκια (Balb /c Slc-ηυ /ηυ, θηλυκά, 6 ~ 8 εβδομάδων) αγοράστηκαν από Charlesriver , Ιαπωνία. Το σχέδιο των πειραμάτων σε ζώα εξετάστηκε και εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας για πειράματα σε ζώα στο Πανεπιστήμιο Okayama υπό την αναγνωριστικά OKU-2010378, OKU-2011400. σφαιρίδια 17β-οιστραδιόλης (0,72 mg? Innovative Research of America) εμφυτεύθηκαν 4 ημέρες πριν από την μεταμόσχευση των καρκινικών κυττάρων και παρέμεινε στη θέση του μέχρι το τέλος της μελέτης. Τα καλλιεργημένα κύτταρα MCF7 και ΒΤ474 πλύθηκαν δύο φορές με PBS, typsinized, και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση. Τα κύτταρα (5.0 × 10

6 κύτταρο) αιωρήθηκε σε Matrigel (BD Bioscience) μεταμοσχεύθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές των αναισθητοποιημένων ποντικών με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 5 mg /100g πεντοβαρβιτάλη διάλυμα υπό ασηπτικές συνθήκες. Τα ποντίκια με όγκους που αναπτύχθηκαν για 10 ~ 14 ημέρες χρησιμοποιήθηκαν για

in vivo

πειράματα. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου, την αναπνοή και συμπεριφορικές δραστηριότητα παρακολουθούνταν δύο φορές κάθε μέρα για να αξιολογήσει τον πόνο στα ποντίκια. Τα πειράματα αμέσως σταμάτησε αν ποντίκια φάνηκε σημαντικό σύμπτωμα του πόνου. Όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 15mg 100g πεντοβαρβιτάλης διάλυμα /μετά τα πειράματα.

Η έκφραση του ErbB2 σε MCF7 και ΒΤ474 ξενομοσχεύματα επιβεβαιώθηκε με ανοσοφθορισμό (IF) χρώση. Εγκλεισμένα σε παραφίνη τομές όγκων παρασκευάσθηκαν σε πάχος 5 μm. Πρώτον, ιστολογικές παρατηρήσεις ξενομοσχευμένου όγκων έγιναν χρησιμοποιώντας Η &? Χρώση Ε. IF χρώση συνέχεια διεξήχθη με αντι-ΕΛΒ2 (1:50? Cell Signaling). Το δευτερογενές αντίσωμα ήταν Cy3-συζευγμένο IgG αντι-κουνελιού (1: 100? Invitrogen, Molecular Probes). Ο πυρήνας ήταν αντι-βάφτηκαν με 0,1 μg /ml του Hoechst 33248 (Sigma) για 5 λεπτά. σήματα φθορισμού παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ (FV300, Όλυμπος).

κατακράτηση θέση του όγκου της ΕΚ 1-gluc-p53C σε ξενομοσχεύματα όγκου

Στη συνέχεια, 30 μL της ΕΚ 1-gluc-p53C πρωτεΐνη (0.5 μg /μL) εγχύθηκε εντός του όγκου σε MCF7 και ΒΤ474 ξενομοσχεύματα σε γυμνά ποντίκια. Σε 1, 3, 6, 12 και 24 ώρες μετά την ένεση, οι ποντικοί θανατώθηκαν. Οι όγκοι αποκόπηκαν και αμέσως σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη. Παραφίνη-embedded φέτες MCF7 και ΒΤ474 όγκοι παρασκευάστηκαν σε 10 μm. χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη για να αναλυθεί η κατανομή των EC1-gluc-p53C σε όγκους. Η χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες που συνόδευαν το κουνέλι αντι

Gaussia

λουσιφεράσης ορό. Το δευτερογενές αντίσωμα ήταν συζευγμένο με FITC IgG κουνελιού (1: 100, Invitrogen, Molecular Probes). σήματα φθορισμού παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο συνεστιακό λέιζερ (FluoView, Όλυμπος, Ιαπωνία).

απεικόνισης βιοφωταύγεια

in vivo

Η

Για την απεικόνιση βιοφωταύγεια

in vivo

, 30 μΙ πρωτεΐνης EC1-gluc-p53C (0,5 μg /μΙ) εντός του όγκου ένεση στα ξενομοσχεύματα MCF7 και ΒΤ474 εγκατεστημένοι σε γυμνούς ποντικούς. Στις 6, 8, 12 και 24 ώρες μετά την ένεση, οι ποντικοί απεικονίστηκαν με ένεση μέσω μιας φλέβας της ουράς με 100 μΙ διαλύματος CTZ (3 mg /kg) υπό αναισθησία χρησιμοποιώντας ένα ψυχόμενο CCD κάμερα (IVIS Lumina-ΙΙ, δαγκάνα Επιστήμες Ζωής ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39]. Η bioluminescent ένταση της επιλεγμένης περιοχής πάνω του όγκου καταγράφηκε ως μέγιστη φωτόνια s

-1 εκατοστά

-2 στερακτίνιο

-1.

Επίδραση της ΕΚ 1-gluc-p53C στην ανάπτυξη του όγκου

MCF7 και ΒΤ474 ξενομοσχευμάτων και στις δύο πλευρές των γυμνών ποντικών αφέθηκαν να αναπτυχθούν μέχρι ένα μέσο όγκο ~ 100 χιλιοστά

3 ± 10 χιλιοστά

3 ελήφθησαν πριν από την ένεση της πρωτεΐνης. Στη συνέχεια, 30 μλ καθαρισμένης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης (0,5 μg /μL) ή 30 μΙ PBS ήταν εντός του όγκου ένεση σε MCF7 και ΒΤ474 ξενομοσχεύματα καθημερινά για 5 ημέρες. Οι ποντικοί παρακολουθούνται καθημερινά και ο όγκος του όγκου τους μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ψηφιακό παχύμετρο δύο φορές την εβδομάδα. Καθ ‘όλη την διάρκεια της θεραπείας στο πείραμα φορτίο όγκου πέθανε κανένας ποντικός. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο: όγκος όγκου = L × W

2 χ 0,5 (L είναι η μακρύτερη διάμετρος, το W είναι η συντομότερη διάμετρος)

Στατιστική ανάλυση

Δεδομένα. εμφανίζονται ως η μέση τιμή ± SD ή μέση ± SEM Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση είτε t-test του Student να συγκρίνετε δύο προϋποθέσεις ή ANOVA που ακολουθείται από τις προγραμματισμένες συγκρίσεις πολλές συνθήκες, και η P & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική

Αποτελέσματα

Καθαρισμός και βιοχημικός χαρακτηρισμός του. οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες

οι τρεις GST συντηγμένη πρωτεΐνη κατασκευάσματα εκφράστηκαν σε

E. coli BL21

και καθαρίζεται χρησιμοποιώντας μια στήλη γλουταθειόνης Sepharose 4 Fast Flow. Μετά τον καθαρισμό, η ετικέτα GST διασπάστηκε από την πρωτεάση PreScission να συγκομιδή gluc, EC1-gluc και EC1-gluc-p53C όπως φαίνεται στο Σχήμα 1α. Gluc και EC1-gluc χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτεΐνες ελέγχου. Coomassie Brilliant Blue χρώση αποκάλυψε την καθαρότητα όλων των τριών πρωτεϊνών να είναι & gt? 80%. Τα μοριακά μεγέθη των gluc, EC1-gluc και EC1-gluc-p53C ήταν περίπου 20, 23, και 25 kDa, αντίστοιχα (Σχήμα 1β). Στη Δυτική κηλίδωση, οι κύριες ζώνες του gluc, EC1-gluc και EC1-gluc-p53C και επιπλέον δευτερεύουσες ζώνες που αντιστοιχούν στα ΟδΤ-συντηγμένων πρωτεϊνών παρατηρήθηκαν (Σχήμα 1γ). Επιπλέον, μια απώλεια σε δραστικότητα βιοφωταύγειας προκλήθηκε με τη σύντηξη EC1 και πεπτιδίου p53C με gluc. Ένα περίπου 30% και 50% μείωση ανιχνεύθηκε στο βιοφωταύγειας δραστικότητα του EC1-gluc και EC1-gluc-p53C σύγκριση με gluc, αντίστοιχα (Σχήμα 1δ).

α) Schema του καθαρισμού του EC1-gluc -p53C με το σύστημα έκφρασης GST. Η ετικέτα GST διασπάστηκε από την πρωτεάση PreScission μετά τον καθαρισμό. β) Coomassie brilliant blue χρώση των καθαρισμένων πρωτεϊνών μετά από 15% SDS-PAGE. Λωρίδα 1 ~ 4 είναι δείκτης, gluC, EC1-gluc και EC1-gluc-p53C, αντίστοιχα. γ) Οι καθαρισμένες πρωτεΐνες μετά από 15% SDS-PAGE ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western με αντι-κουνέλι

Gaussia

λουσιφεράσης ορού. Λωρίδες 1 ~ 3 είναι gluC, EC1-gluc και EC1-gluc-p53C, αντίστοιχα. δ) βιο-φωσφορισμού δραστηριότητες των καθαρισμένων πρωτεϊνών. Κάθε πρωτεΐνη (2 μg) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο πλάκας. Οι bioluminescent τιμές της ΕΚ 1-gluc και EC1-gluc-p53C ομαλοποιήθηκαν με gluC. n = 6 καθένα, * ρ & lt?. 0.01

Η

Η σταθερότητα των gluc, EC1-gluc και EC1-gluc-p53C αξιολογήθηκε με επώαση σε ορό ποντικού στους 37 ° C. Η σταθερότητα των gluc βελτιώθηκε με την σύντηξη EC1 και p53C. Ο χρόνος ημίσειας ζωής της δραστηριότητας φωταύγειας του gluc προσδιορίστηκε ως 18,6 ώρες, ενώ εκείνη του EC1-gluc και EC1-gluc-p53C ήταν 189,5 και 216 ώρες, αντίστοιχα (Σχήμα 2α). Ως αποτέλεσμα, η δραστικότητα της βιοφωταύγειας EC1-gluc-p53C έφθασε το 92% εκείνο του gluc σε 3 ώρες μετά την επώαση σε ορό (Σχήμα 2β). Επιπλέον, η αποικοδόμηση των τριών πρωτεϊνών στον ορό εξετάστηκε επίσης με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-gluc αντίσωμα. Και οι τρεις πρωτεΐνες ήταν σταθερές έναντι αποικοδόμησης όταν επωάζεται σε ορό στους 37 ° C (Σχήμα 2c). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν την bioluminescent δραστικότητα και τη σταθερότητα του EC1-gluc-p53C να είναι κατάλληλη για εφαρμογή τόσο

in vitro

και

in vivo

.

Οι πρωτεΐνες επωάστηκαν με ίσο όγκο ορού ποντικού σε 37 ° C αποσύρθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία για την αξιολόγηση bioluminescent δραστηριότητα (α) και κηλίδωση Western (γ). β) Η βιοφωταύγειας δραστικότητα του EC1-gluc-p53C και gluc εξετάστηκε 3 ώρες μετά από επώαση σε ορό. Οι bioluminescent τιμές της ΕΚ 1-gluc-p53C ομαλοποιήθηκαν με gluC. n = 6 το καθένα.

Η

EC1-gluc-p53C οι στόχοι που ErbB2 για την απεικόνιση βιοφωταύγεια

in vitro

Η

Δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκινώματος του μαστού, MCF7 και ΒΤ474, ήταν που χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της ErbB2 στόχευση απεικόνισης

in vitro

. Η υπερέκφραση του ErbB2 σε ΒΤ474 επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western, ενώ η έκφραση του ErbB2 σε κύτταρα MCF7 ήταν μη ανιχνεύσιμη (Εικόνα 3α). Για την ανίχνευση της ErbB2 στόχευση βιοφωταύγεια, MCF7 και ΒΤ474 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μΜ των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Ένα ισχυρό σήμα ανιχνεύτηκε σε υπερεκφράζουν ErbB2 κύτταρα ΒΤ474 επωάζονται με EC1-gluc και EC1-gluc-p53C (Σχήμα 3b, Εικόνα S1). Αντιθέτως, καμία σημαντική βιοφωταύγειας παρατηρήθηκε σε κύτταρα MCF7 επωάστηκαν με κάθε πρωτεΐνη (Σχήμα 3Β, Σχήμα S1). Επιπλέον, η εσωτερικοποίηση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα ΒΤ474 επωάστηκαν με EC1-gluc και EC1-gluc-p53C, και την εσωτερίκευση του EC1-συντηγμένων πρωτεϊνών ήταν ως επί το πλείστον μη ανιχνεύσιμη, όταν ο εξω-κυτταρικός τομέας της ErbB2 έχει αποκλειστεί από αντι αντίσωμα ErbB2 (Εικόνα 3c). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι EC1-gluc και EC1-gluc-p53C διατηρούν συγγένεια για ErbB2, και εσωτερικεύονται σε κύτταρα που υπερεκφράζουν ErbB2

in vitro

.

α) Η έκφραση της ErbB2 σε MCF7 και ΒΤ474 κύτταρα. Κυτταρόλυμα από τις δύο κυτταρικές σειρές υποβλήθηκε σε 6% SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με αντίσωμα αντι-ΕrbΒ2. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένα ενδογενές ελέγχου. β) απεικόνιση βιοφωταύγεια

στο

vitro

. Τα κύτταρα επωάζονται με 1 μΜ του ΕΚ-gluc-p53C πλύθηκαν με μέσο καλλιέργειας χωρίς ορό. Οι εικόνες ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο βιοφωταύγεια αμέσως μετά την προσθήκη του 1 μg /mL CTZ. Ι και ΙΙΙ, εικόνες βιοφωτισμός? II και IV, εικόνες αντίθεσης φάσης. Bar = 100 μm. γ) Η εσωτερίκευση της ΕΚ 1-συγχωνευμένων πρωτεϊνών σε υπερεκφράζουν ErbB2 κύτταρα ΒΤ474. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 μΜ πρωτεΐνης για 24 ώρες, λωρίδα 1: gluc? λωρίδα 2: ΕΚ-gluc-p53C? λωρίδα 3: ΕΚ-gluc? λωρίδα 4: αντι-ErbB2 + EC1-gluc-p53C? λωρίδα 5: αντι-ErbB2 + ΕΚ-gluc. Η εσωτερίκευση της πρωτεΐνης σύντηξης ανοσοαποτύπωση με κουνέλι αντι

Gaussia

λουσιφεράσης ορό. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας ενδογενής έλεγχος.

Η

EC1-gluc-p53C αναστέλλει επιλεκτικά τον πολλαπλασιασμό του υπερεκφράζουν ErbB2 κύτταρα ΒΤ474

δοκιμασία WST-1 χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τα αποτελέσματά της ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων MCF7 και ΒΤ474. EC1-gluc-p53C ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των ΒΤ474 αλλά όχι κύτταρα MCF7 την ημέρα 3 και 4 (Σχήμα 4α). Οι πρωτεΐνες ελέγχου, gluc και EC1-gluc, δεν είχε σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων είτε γραμμής (Σχήμα 4α). Επιπλέον, το αποτέλεσμα του EC1-gluc-p53C επί του πολλαπλασιασμού ΒΤ474 ήταν δοσοεξαρτώμενη (Εικόνα 4Β). Επιπλέον, τα αποτελέσματα της λουσιφεράσης Δοκιμασία ρεπόρτερ για ρ53 γνώμονα Μετενεργοποίησης έδειξε ότι το πεπτίδιο ήταν ενεργό p53C και ενεργοποιηθεί ενδογενές ρ53 όταν εσωτερικεύεται σε κύτταρα ΒΤ474 (Σχήμα 4γ). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ανασταλτική δράση του EC1-gluc-p53C επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων έχει μια ιδιότητα ErbB2-στόχευση και οφείλεται στην αποτελεσματικότητα του πεπτιδίου p53C στην πρωτεΐνη σύντηξης.

α) Χρόνος -εξαρτώμενη μεταβολές στον πολλαπλασιασμό των MCF7 (άνω πίνακας) και κύτταρα ΒΤ474 (κάτω πίνακας). Τα κύτταρα συμπληρωμένο με 1 μΜ από κάθε ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ή PBS (έλεγχος) την ημέρα 0 και περαιτέρω καλλιεργήθηκαν 96 ώρες (ημέρα 4). Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκε με την δοκιμασία WST-1 κάθε 24 ώρες. ♦, PBS (έλεγχος)? ■, gluC? ▲, EC1-gluc? ×, EC1-gluc-p53C. n = 6 καθένα. * P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0.01 vs ελέγχου. β) δοσο-εξαρτώμενο αποτέλεσμα του EC1-gluc-p53C επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΒΤ474. κύτταρα ΒΤ474 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EC1-gluc-p53C σε διάφορες συγκεντρώσεις ή PBS (Cont.), και WST-1 δοκιμασία πραγματοποιήθηκε την ημέρα 4. n = 6 για κάθε προϊόν. *, P & lt? 0,05? **, P & lt? 0.01. γ) p53 με γνώμονα την μεταγραφική δραστηριότητα με την ρ21

WAF1

δοκιμασία luciferace δημοσιογράφος. ΒΤ474 επιμολυσμένα με τον φορέα αναφοράς λουσιφεράσης επωάσθηκαν με 1 μΜ του gluc, EC1-gluc, EC1-gluc-p53C ή PBS για 24 ώρες. p21

WAF1

λουσιφεράσης δραστηριότητες ρεπόρτερ στα κύτταρα μετρήθηκαν με το σύστημα προσδιορισμού λουσιφεράσης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.E.M.

n

= 5 σε κάθε ομάδα? ** P & lt? 0.01.

Η

EC1-gluc-p53C στοχεύει ErbB2 για την απεικόνιση βιοφωταύγεια

in vivo

Η

Για τα πειράματα

in vivo

, ετοιμάσαμε τα ποντίκια με MCF7 και ΒΤ474 ξενομόσχευμα όγκων και στις δύο πλευρές. Ιστολογικές παρατηρήσεις των όγκων έγιναν χρησιμοποιώντας Η &? Χρώση Ε (Σχήμα S2a). Υψηλή έκφραση του ErbB2 σε όγκους ΒΤ474 επιβεβαιώθηκε επίσης από IF χρώση (Σχήμα S2B). Για την αξιολόγηση της ErbB2-στόχευση ιδιότητα του EC1-gluc-p53C

in vivo

, η διατήρηση του EC1-gluc-p53C σε όγκους μετά την ένεση εντός του όγκου εξετάστηκε με χρώση IF με αντι-gluc αντίσωμα. EC1-gluc-p53C ήταν ανιχνεύσιμη σε όγκους ΒΤ474 για έως και 24 ώρες μετά την ένεση. Σε αντίθεση, EC1-gluc-p53C ήταν μόνο ασθενώς ανιχνεύθηκε σε MCF7 όγκους έως και 6 ώρες μετά την ένεση (Εικόνα 5). Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει το χρόνο κατακράτησης του EC1-gluc-p53C να είναι πολύ μεγαλύτερη σε ΒΤ474 από όγκους MCF7. Με βάση το χρόνο κατακράτησης EC1-gluc-p53C σε όγκους, βιοφωταυγή εικόνες αποκτήθηκαν 6, 8, 12 και 24 ώρες μετά την ένεση της πρωτεΐνης. Ανιχνεύθηκε σήμα σε όγκους ΒΤ474 για μέχρι 24 ώρες, ενώ δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε καρκινικές θέσεις MCF7 8 ώρες μετά την ένεση της πρωτεΐνης (Σχήμα 6). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το ακίνητο ErbB2 στόχευση της ΕΚ 1-gluc-p53C διευκολύνει τη διατήρηση του σε όγκους ΒΤ474 και απεικόνισης βιοφωταύγεια

in vivo

.

Στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά την ένεση εντός του όγκου EC1-gluc -p53C, τα ποντίκια θανατώθηκαν και οι όγκοι αποκόπηκαν. Οι όγκοι στη συνέχεια αμέσως σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA. Εγκλεισμένα σε παραφίνη τομές όγκων παρασκευάσθηκαν σε πάχος 10 μm.