Αφηρημένο

Η ετερογενής πυρηνική ribonucleoparticule A1 /A2 ( hnRNP Α1 /Α2) και τον παράγοντα ματίσματος 2 /εναλλακτικό παράγοντα ματίσματος (SF2 /ASF) είναι κομβικής σημασίας για την πρόδρομο RNA (pre-mRNA) μάτισμα. Ρυθμιστικό παράγοντα ιντερφερόνης-3 (IRF-3) παίζει κρίσιμο ρόλο στην άμυνα του ξενιστή έναντι ιικών και μικροβιακή λοίμωξη. έχουν περικομμένη IRF-3 πρωτεΐνες που προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα έχουν ταυτοποιηθεί και χαρακτηριστεί ως λειτουργικοί ανταγωνιστές για πλήρους μήκους IRF-3. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την μοριακός μηχανισμός για τη ρύθμιση του ματίσματος IRF-3 προ-mRNA και αναφέρθηκε για πρώτη φορά το ρυθμιστικό αποτέλεσμα του hnRNP Α1 /Α2 και SF2 /ASF επί IRF-3 μάτισμα και την ενεργοποίηση. Παρεμβολή RNA διαμεσολαβούμενη εξάντληση του hnRNP A1 /A2 ή SF2 /ASF σε ανθρώπινα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων (NSCLC) αυξήθηκε αποκλεισμό των εξονίων 2 και 3 του IRF-3 γονιδίου και μειωμένα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης IRF-3 και IRF- 3 καθοδικός τελεστής μόρια ιντερφερόνης-βήτα και CXCL10 /IP-10. Επιπλέον, απευθείας σύνδεση του hnRNP Α1 και SF2 /ASF σε συγκεκριμένα μοτίβα πρόσδεσης στην IRF-3 ιντρόνιο 1 επιβεβαιώθηκε από ηλεκτροφορητική ανάλυση μετατόπισης κινητικότητας RNA. Μεταγενέστερες δοκιμασία μινιγονίδιο μάτισμα έδειξε ότι IRF-3 μικρογονίδΊα με μεταλλαγμένο hnRNPA 1 /Α2 ή δεσμευτική SF2 /ASF μοτίβα αυξημένη αποκλεισμό εξώνια 2 και 3. Επιπλέον, νοκ ντάουν της hnRNP Α1 /Α2 ή SF2 /ASF σε κύτταρα NSCLC ενισχυμένο φυτοαιμαγλουτινίνη που προκαλείται από όγκο νέκρωσης απελευθέρωσης παράγοντα-α από μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC), αλλά κατέστειλε ότι ιντερλευκίνης-10 σε NSCLC /PBMC συν-καλλιέργειες. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι συγκεκριμένες νοκ ντάουν για hnRNP Α1 /Α2 ή SF2 /ASF αύξηση αποκλεισμό εξώνια 2 και 3 του IRF-3 προ-mRNA και επηρεάζουν ανοσοτροποποιητικά λειτουργίες των ανθρώπινων κυττάρων NSCLC

Παράθεση:. Guo R, Li Υ, Ning J, Sun D, ​​Lin L, Liu X (2013) hnRNP Α1 /Α2 και SF2 /ASF Ρυθμίζουν εναλλακτικό μάτισμα του ρυθμιστικού παράγοντα ιντερφερόνης-3 και επηρεάζουν ανοσορρυθμιστικά λειτουργιών του ανθρώπινου μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 8 (4): e62729. doi: 10.1371 /journal.pone.0062729

Επιμέλεια: Luwen Zhang, του Πανεπιστημίου της Νεμπράσκα – Lincoln, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Δεκεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 25 του Μαρτίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 29 του Απρίλη 2013

Copyright: © 2013 Guo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 30572072) σε XL και το Ίδρυμα του Πεκίνου Δημοτική Φυσικών Επιστημών (Grant Νο 5092009) και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 30871366) για να YL. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Jinying Ning, ως τρίτη συγγραφέας αυτού του χειρογράφου, ήταν υπάλληλος της η εταιρεία Crown Bioscience Inc (Πεκίνο). Συνέβαλε μερικά εργαλεία ανάλυσης και παρέχονται συμβουλευτικές υπηρεσίες σε αυτό το έργο. Δεν τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας θα μοιράζονται Crown Bioscience Inc (Πεκίνο). Δεν υπάρχουν προϊόντα στην ανάπτυξη και δεν διατίθενται στην αγορά τα προϊόντα της Crown Bioscience Inc (Πεκίνο) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το ερευνητικό έργο. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Εναλλακτικές πρόδρομο RNA (pre-mRNA) μάτισμα είναι μια σημαντική μετα-μεταγραφικό μηχανισμό με τον οποίο κύτταρα μπορεί να δημιουργήσει ένα ποικίλο ρεπερτόριο ισομορφές πρωτεΐνης από ένα πιο περιορισμένο αριθμό γονιδίων [1]. Εκτιμάται ότι η πλειοψηφία των ανθρώπινων γονιδίων με πολλαπλά εξώνια οι εναλλακτικά ματισμένες [2]. Το εναλλακτικό μάτισμα παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, τη φυσιολογία, και την ασθένεια και τη διαδικασία της αφαίρεσης ιντρόνια επιλεκτικά και σύνδεση υπολειμματικού εξώνια υπόκειται σε ακριβή ρύθμιση και συχνά διαταράσσεται σε φλεγμονώδεις διαταραχές και καρκίνους [3] – [6]. Πολυάριθμες έρευνες έχουν αποδείξει ότι ορισμένες πρωτεΐνες δέσμευσης RNA μπορεί να συμμετέχει στη ρύθμιση της φλεγμονώδους διαδικασίας και ογκογένεσης ρυθμίζοντας μάτισμα ή mRNA σταθερότητα του φλεγμονοσυσχετιζόμενων και όγκων που σχετίζονται με τα γονίδια [4], [6] – [8]. Δύο οικογένειες πυρηνικό RNA-πρωτεΐνη δέσμευσης, η οικογένεια των ετερογενών πυρηνικών ριβονουκλεοπρωτεΐνες (hnRNP) και η οικογένεια των κινασών σερίνης /πλούσια σε αργινίνη πρωτεΐνες (SR), παίζουν καθοριστικό ρόλο στην ρύθμιση του εναλλακτικού ματίσματος και της σταθερότητας του mRNA. Η οικογένεια hnRNP περιέχει τουλάχιστον είκοσι μέλη και συνδέεται κυρίως με ακολουθίες που ονομάζεται σιγαστήρες μάτισμα, που βρίσκεται στα εξώνια (ESSs, εξονικό σιγαστήρες μάτισμα) ή εσώνια (ανοσοδιεγερτικές, εσονικές σιγαστήρες splicing), για την προώθηση εξόνιο αποκλεισμού και δρουν ως καταστολείς μάτισμα [9]. Τα πιο άφθονα και καλύτερα χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες αυτής της ομάδας είναι hnRNP Α1 και Α2 hnRNP που μοιράζονται υψηλό βαθμό ομολογίας αλληλουχίας και λειτουργική ομολογία [10]. Αύξηση αποδείξεις έχουν δείξει ότι hnRNP Α1 και Α2 είναι hnRNP υπερ-εκφράζεται σε διάφορα είδη όγκων και να χρησιμεύσει ως πρώιμων βιοδεικτών όγκου [7], [11] – [13]. HnRNP U, ως ένα άλλο μέλος της οικογένειας hnRNP, έχει αναφερθεί ότι ενισχύει TLR-προκαλούμενη παραγωγή προφλεγμονωδών κυτοκινών από τη σταθεροποίηση mRNAs στα μακροφάγα [14]. Η οικογένεια πρωτεϊνών SR, μια άλλη ρυθμιστική αρχή για εναλλακτικό μάτισμα, περιλαμβάνει επίσης περισσότερες από είκοσι μέλη. Αυτές οι πρωτεΐνες δεσμεύονται σε ενισχυτές ματίσματος που εντοπίσει στα εξόνια (ESES, εξονικούς ενισχυτές splicing) ή ιντρόνια (ISEs, ιντρονικές ενισχυτές splicing), και κυρίως λειτουργούν ως ανταγωνιστές των πρωτεϊνών hnRNP [15]. Ωστόσο, ένας αριθμός από μελέτες έχουν επίσης αποκαλύψει ότι πρωτεΐνες SR ρυθμίζουν παράκαμψη εξωνίου εκδηλώσεις και διαφορετικές πρωτεΐνες SR δείχνουν απέναντι δραστηριότητες για την προώθηση έγκλεισης εξωνίου ή παρακάμπτοντας στα ίδια γονίδια [16], [17]. παράγοντας Συγκόλλησης 2 /εναλλακτικές παράγοντας ματίσματος (SF2 /ASF), ως το καλύτερα χαρακτηρισμένο μέλος της οικογένειας SR, έχει αναφερθεί ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε πολλαπλούς ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα και του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, και παίζει σημαντικό ρόλο στην εγκαθίδρυση και συντήρηση του μετασχηματισμού των κυττάρων [8], [18] – [20]. Πρόσφατη έρευνα αποκάλυψε επίσης ότι SF2 /ASF με τη μεσολάβηση της IL-17 που προκαλείται από τη σταθερότητα του mRNA των χημειοκινών CXCL1 σε ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα [21].

Η συνεχώς αυξανόμενη ρυθμιστικό παράγοντα ιντερφερόνης (IRF) οικογένεια περιλαμβάνει μεταγραφικούς ενεργοποιητές και καταστολείς που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση κρίσιμη για ανοσολογική απόκριση, αιματοποίηση, και η επιβίωση των κυττάρων [22] – [24]. IRF-3 είναι μοναδική μεταξύ των μελών της οικογένειας IRF από το ότι είναι ένα βασικό άμεση μορφοτροπέα των ιικών δίκλωνου RNA και βακτηριακού λιποπολυσακχαρίτη μεσολάβηση σηματοδότηση [25], [26]. IRF-3 χρησιμεύει ως ένα ουσιαστικό μεταγραφικός ενεργοποιητής για ιντερφερόνες τύπου Ι (ΙΡΝα /β), ένα υποσύνολο των γονιδίων ιντερφερόνης-διεγερμένα, καθώς και ορισμένα γονίδια χημειοκίνης όπως RANTES και CXCL10 /IP-10 και παίζει κρίσιμο ρόλο τόσο στην φυσική ανοσία απόκριση έναντι ιικής μόλυνσης και την επακόλουθη ενεργοποίηση της προσαρμοστικής ανοσίας [27] – [31]. Το γονίδιο IRF-3 αποτελείται από 8 εξώνια και 7 εσώνια και κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 427 αμινοξέων. IRF-3 είναι μια φωσφοπρωτεϊνη και αποτελείται από ένα Ν-τερματικό σύνδεσης ϋΝΑ πεδίο (DBD) (αμινοξέα 1 έως 110), ένα Ο-τερματικό IRF-σχετίζεται τομέα (IAD, αμινοξέα 198 να 374), και έναν τομέα διενεργοποίησης (TAD, αμινοξέα 134 έως 394) [32]. Με κρίσιμους ρόλους της στην άμυνα του ξενιστή, η δραστηριότητα του IRF-3 ελέγχεται αυστηρά. IRF-3 εκφράζεται ευρέως και βρίσκεται κατά κύριο λόγο σε μία ανενεργή κυτταροπλασματική μορφή. Μετά τη μόλυνση, ο ιός ή δίκλωνο RNA επάγει φωσφορυλίωση του C-τερματική σερίνη /θρεονίνης και οδηγεί σε μια διαμορφωτική μεταβολή σε IRF-3 με την έκθεση των δύο περιοχών DBD και IAD, η οποία περαιτέρω οδηγεί σε ομο- ή ετεροδιμερισμό, cytoplasm- to-πυρήνα μετατόπιση, σύνδεση με συνενεργοποιητές CBP /p300, και μεταγραφική ενεργοποίηση των πολλαπλών γονιδίων στόχων [33], [34].

διαρθρωτικά ακεραιότητας είναι απαραίτητο για IRF-3 για να εκτελέσει τακτική λειτουργία του σε μυριάδες κυτταρικά μονοπάτια , όπως έχει αποδειχθεί από λειτουργικές αλλαγές που προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα του IRF-3 προ-mRNA. IRF-3a είναι το πρώτο χαρακτηρισμένο IRF-3 μάτισμα ισομορφή και πρωτότυπο εξόνιο του 2 βρέθηκαν σε IRF-3 αντικαθίσταται από το ιντρόνιο 2 [35]. πρωτεΐνη IRF-3a στερείται ένα τμήμα του Ν-τελικού DBD του IRF-3 και δεν είναι σε θέση να συνδεθεί με κλασικά στοιχεία δέσμευσης IRF, όπως ΙΡΝ-διεγερμένα στοιχεία απόκρισης (ISREs). Ωστόσο, IRF-3a με ένα ανέπαφο πεδίο IAD έχει δειχθεί ότι σχηματίζει ένα ετεροδιμερές με IRF-3 μετά ιογενή λοίμωξη και αναστέλλουν IRF-3 μεταγραφική δραστηριότητα [36]. Πρόσφατα, ταυτοποιήσαμε πέντε νέες παραλλαγές ματίσματος του IRF-3, που αναφέρεται ως IRF-3β, -3c, -3Δ, -3Ε, και -3f, και αποκάλυψε ότι αυτές οι παραλλαγές ματίσματος δημιουργείται με απαλοιφή των εξωνίων 2, 3, ή 6 ή κάποιο συνδυασμό αυτών [37]. Αυτές οι νέες ισομορφές ματίσματος είχαν αφιερωθεί να χάσει ολόκληρη την περιοχή του πεδίου DBD (IRF-3b, -3c, -3Δ και -3f) ή χάνουν τμήματα του ΣΕΔ και τομείς IAD (IRF-3b, -3Δ και -3Ε ). Επιπλέον, αποδείξαμε επίσης ότι αυτές οι νέες παραλλαγές ματίσματος εκφράστηκαν σε διάφορα είδη ανθρώπινων κυττάρων και ιστών και φαίνεται να λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστές του IRF-3 και να μειώσει την τρανσενεργοποίηση του υποκινητή ΙΡΝβ σε διαφορετικό βαθμό. Αυτά ιδρύθηκε δομικές και λειτουργικές αλλαγές λόγω εναλλακτικό μάτισμα ένταλμα περαιτέρω διερεύνηση του μοριακού μηχανισμού για τη ρύθμιση συρραφής του IRF-3 προ-mRNA.

Στην παρούσα μελέτη, RNA παρεμβολής μεσολάβηση εξάντληση των hnRNP Α1 /Α2 ή SF2 /ASF σε ανθρώπινα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων (NSCLC) αυξήθηκε αποκλεισμό των εξονίων 2 και 3 του IRF-3 προ-mRNA. Με τη χρήση της ανάλυσης και προγράμματα όπως ESE Finder ακολουθία, εντοπίσαμε το site hnRNP Α1 /Α2 δεσμευτική (UAGGGA) και θέση πρόσδεσης SF2 /ASF (GGAAGGA) στο ιντρόνιο 1. δοκιμασία Μεταγενέστερες μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας IRF-3 (EMSA) χρησιμοποιώντας άγριου τύπου ( κβ) ιχνηλάτη RNA ή RNA με μετάλλαξη σε αυτές τις θέσεις πρόσδεσης και μεταλλαγμένων δοκιμασία μινιγονίδιο μάτισμα IRF-3 επιβεβαίωσε την παρουσία του hnRNP Α1 /Α2 και SF2 /ASF μοτίβα πρόσδεσης στην IRF-3 ιντρονίου 1. Επιπλέον, η επίδραση της αλλαγής του IRF- 3 μοτίβο μάτισμα στην έκφραση των καθοδικών γονιδίων στόχων της και για την παραγωγή κυτοκίνης σε NSCLC /περιφερικά μονοπύρηνα κυττάρων (PBMC) συν-καλλιέργειες αξιολογήθηκε επίσης.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια και RNA παρεμβολές

Ανθρώπινο NSCLC κυτταρικές γραμμές Α549 και Calu-6 ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C με 5% CO

2.

επιλέχθηκαν Μικρές RNAs παρεμβολή (siRNAs) που στοχεύουν hnRNP Α1, Α2 hnRNP, SF2 /ASF, ή πολυπυριμιδίνης οδού δέσμευσης πρωτεΐνης (ΡΤΒ ή hnRNP Ι) mRNA και siRNA μορφομετατροπές διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [7] , [38]. Λόγω της λειτουργικής πλεονασμό του hnRNP Α1 και Α2 hnRNP έχει ήδη αναφερθεί, siRNAs αυτών των δύο γονιδίων διαμολύνθηκαν ταυτόχρονα. Εν συντομία, εκθετικώς αναπτυσσόμενα Α549 και Calu-6 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο). Την επόμενη μέρα, 80 pmol του hnRNP Α1 και Α2 hnRNP (κάθε 40 pmol), 40 pmol του SF2 /ASF, ή 40 pmol του PTB RNAs διπλής όψης (Πεκίνο DNA-ΣΥΝ Βιοτεχνολογία Co, Πεκίνο, Κίνα) αναμίχθηκαν με 6 μλ αντιδραστήριο Oligofectamine διαμόλυνσης (Invitrogen) συν 250 μΙ μέσου Opt-ΜΕΜ (Invitrogen) για 20 λεπτά και στη συνέχεια προστέθηκαν στα κύτταρα, αντίστοιχα. Μετά την επιμόλυνση για 48 ώρες, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με περαιτέρω 20 pmol δίκλωνου RNA-Poly (I: C) (Sigma, St. Louis, ΜΟ) για την ενεργοποίηση σηματοδότησης μέσω της οδού IRF-3. Μετά Πολυ (I: C) διέγερση για 24 ώρες, το ολικό κυτταρικό RNA και πρωτεΐνης απομονώθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Για συγκεκριμένες επιμολύνσεις siRNA, η ασυμφωνία διαμόλυνση siRNA χρησιμοποιήθηκε ως ψευδο-επιμολυσμένα ελέγχου.

Ολικό RNA Απομόνωση και Ημι-ποσοτική RT-PCR

Το συνολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Περίπου 3 μg ολικού RNA από κάθε κυτταρική γραμμή υποβλήθηκε σε πέψη με RNase-free DNase Ι (Promega, Madison, WI) για να απομακρυνθεί η μόλυνση ϋΝΑ και αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA χρησιμοποιώντας το σύστημα Superscript III (Invitrogen). Για να εξεταστούν τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των γονιδίων στόχων σε κύτταρα, σύνολα εκκινητών ειδικά για τον τύπο σχεδιάστηκαν και τα αντίστοιχα προϊόντα της PCR υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας για να επιβεβαιωθεί η ακρίβεια της μεταγραφής. Τα σετ εκκινητή, θερμοκρασία ανόπτησης για ενίσχυση, και το μήκος των PCR προϊόντων που παρατίθενται στον Πίνακα 1. Το μίγμα PCR αποτελούνταν από 10 mM Tris-HCl ρΗ 8.0, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl

2, 200 pmol για κάθε εκκινητή, 2 υ Taq DNA πολυμεράση (Promega), και ένα 1-2 μΐ cDNA δείγματος. Τα προκύπτοντα θραύσματα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1.2 έως 2.5% και οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. Όλες οι αντιδράσεις PCR επαναλήφθηκε με επαναλήψιμα αποτελέσματα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος και το συνολικό RNA που εκχυλίζεται από τα ίδια κύτταρα χωρίς αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιήθηκε σαν αρνητικός έλεγχος. Για να εξασφαλιστεί ότι οι αντιδράσεις PCR εμπίπτουν εντός της γραμμικής περιοχής του πολλαπλασιασμού, εξετάστηκαν οι αριθμοί σωστή της ποδηλασίας για ενίσχυση του κάθε γονιδίου ελέγχου ή στόχου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Ανάλυση Western Blot

τα κύτταρα λύθηκαν για 30 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (15 mM Tris-HCl ρΗ 7.5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20, και 1 mM DTT) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης και το διάλυμα καθαρίζεται με φυγοκέντρηση στα 12.000 rpm για 15 λεπτά. Η συνολική πρωτεΐνη (25 μg) σε 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος νατρίου δωδεκυλοθειικό (SDS) διαχωρίστηκε με 10% SDS-PAGE και ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Pharmacia Biotech, Chicago, IL). Οι μεμβράνες στη συνέχεια αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα και ανιχνεύθηκαν με ειδικά πρωτογενή αντισώματα: αντι-hnRNP Α1 (Proteintech Group, Inc., Chicago, IL), αντι-hnRNP A2B1 (Proteintech), αντι-SF2 /ASF (Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA), αντι-ΡΤΒ (Proteintech), αντι-ακτίνης (Ι-19) (Santa Cruz), ή αντι-IRF-3 (Proteintech) (1:1000 να 1:3000 αραίωση), αντιστοίχως. Μετά από πλύση με 0.2% Tween ρυθμιστικό 20 /PBS τρεις φορές, οι μεμβράνες επωάστηκαν με χρένο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση και οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας, ECL (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).

ηλεκτροφορητική κινητικότητα Shift Δοκιμασία (EMSA)

η αλληλουχία του ιντρονίου 1 του IRF-3 προ-mRNA, ανοδικά του εξονίου 2 5 ‘θέση ματίσματος, περιλαμβάνει αλληλουχία UAGGGA η οποία είναι η ίδια με την συναίνεση hnRNP A1 /A2 υψηλής συγγένειας πρόσδεσης τόπου που έχει χαρακτηριστεί από SELEX, UAGGG (A /U) [39]. Με τη χρήση του προγράμματος ESE Finder, άλλες δύο θέσεις πρόσδεσης (GGAAGGA) του SF2 /ASF εντοπίστηκαν αμέσως ανάντη της θέσης ματίσματος εξόνιο 2 5 ‘. Να διερευνήσει τη δυνατότητα να hnRNP Α1 /Α2 και SF2 /ASF συνδέονται με αυτά τα μοτίβα πρόσδεσης, πρωτεΐνες σύντηξης GST-hnRNP Α1 και GST-SF2 /ASF εκφράστηκαν από την επαγωγή IPTG και καθαρίζονται με γλουταθειόνη Sepharose 4Β. Συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια RNA που περιέχουν μοτίβα πρόσδεσης άγριου τύπου για hnRNP A1 /A2 ή SF2 /ASF (wt-Α1 ή WT-SF2), η σύνδεση G3C μεταλλαγμένο μοτίβο για hnRNP A1 /A2 (μι-Α1), ή το μοτίβο πρόσδεσης G2C μεταλλαγμένο για SF2 /ASF (μι-SF2) βιοτινυλιώθηκαν χρησιμοποιώντας το Pierce RNA 3 ‘Kit End Βιοτινυλίωση (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αντιδράσεις μετατόπισης πηκτής διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το LightShift χημιφωταύγειας EMSA Kit (Pierce) σύμφωνα με την περιγραφή του κατασκευαστή. Εν συντομία, 20 fmol βιοτινυλιωμένης άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο RNA ανιχνευτές επωάστηκαν με 50 ng καθαρισμένου πρωτεϊνών σύντηξης GST για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε ένα 20-μΙ αντίδραση σύνδεσης που περιέχει 2 μg tRNA. Οι αντιδράσεις EMSA υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 6% αυτοφυή PAGE, μεταφέρθηκαν σε ένα θετικά φορτισμένο μεμβράνη νάιλον (Amersham), και στη συνέχεια διασυνδέονται χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο GS εις συνδετήρες γονιδίων UV (BioRad, Hercules, CA). Ανίχνευση βιοτινυλιωμένου RNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση σταθεροποιημένου συζυγούς υπεροξειδάσης στρεπταβιδίνης /αρμορακίας (Pierce) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να αποδειχθεί η ειδικότητα του σχηματισμού συμπλόκου πρωτεΐνης-ΚΝΑ, καθαρισμένη πρωτεΐνη GST χρησιμοποιήθηκε για αντίδραση EMSA και λειτούργησε ως αρνητικός μάρτυρας.

IRF-3 Μινιγονίδιο Κατασκευή και Μορφομετατροπή

Ένα άγριου τύπου μικρογονίδιο που περιέχει το σχετική IRF-3 γονιδιωματική περιοχή από το εξώνιο 1 με το εξώνιο 4 και πλευρικές περιοχές κλωνοποιήθηκε σε φορέα pcDNA3.0 (Invitrogen) χρησιμοποιώντας τα

Κρη

της Ι και

θέσεις Eco RI

κοπής. Το ιντρόνιο 1 του wt-IRF-3 μινιγονίδιο περιέχει τις υποθετικές θέσεις πρόσδεσης για hnRNP A1 /A2 (wt-Α1) και SF2 /ASF (wt-SF2). Μινιγονίδια με τη θέση σύνδεσης G3C μεταλλαγμένο για hnRNP A1 /A2 (μι-Α1) ή της θέσης σύνδεσης G2C μεταλλαγμένο για SF2 /ASF (μι-SF2) δημιουργήθηκαν μέσω μιας δύο σταδίων PCR προέκτασης επικαλύψεων [40] χρησιμοποιώντας το wt-IRF -3 μινιγονίδιο κατασκεύασμα ως πρότυπο. Όλες οι κασέτες έκφρασης είναι υπό τον έλεγχο του υποκινητή CMV και ενός σήματος πολυΑ. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση. Άγριου τύπου και μεταλλαγμένα φορείς μινιγονίδιο επιμολύνθηκαν σε κύτταρα Α549. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των IRF-3 ισομορφές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας RT-PCR.

απομόνωση και καλλιέργεια περιφερικού αίματος μονοπύρηνα κύτταρα (PBMC) και συν-καλλιέργεια με Α549 κύτταρα

το πρωτόκολλο της μελέτης και τα έγγραφα συναίνεσης εγκρίθηκαν από την Ηθική και τις Ακαδημαϊκές επιτροπές Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Πρώτη Νοσοκομείο. δείγματα αίματος περιφερική φλέβα ελήφθησαν από υγιείς δότες με ενημερωμένη συγκατάθεση. Απομόνωση και καλλιέργεια των PBMC εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [41]. Εν συντομία, τα PBMC απομονώθηκαν από περιφερικό αίμα χρησιμοποιώντας Histopaque®-1077 (Sigma) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την καλλιέργεια των PBMC, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 5% θερμο-απενεργοποιημένο FBS (Invitrogen), 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 5 μg /ml φυτοαιμαγλουτινίνη (ΡΗΑ) (Sigma) και 10 mM HEPES και σπάρθηκαν σε 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων.

Για τις επόμενες συν-καλλιέργεια με PBMC, Α549 κύτταρα σε 60-80% συρροή επιμολύνθηκαν με ειδικές siRNAs, όπως περιγράφεται παραπάνω. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με περαιτέρω Πολυ (I: C). Τέσσερις ώρες αργότερα, το μέσο αλλάχθηκε σε PBMC μέσο συν-καλλιέργειας [RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS, 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 1 μg /ml ΡΗΑ, και 10 mM HEPES]. PBMC (5 × 10

6 κύτταρα) σπάρθηκαν σε Transwell-Clear ένθετα (μεγέθους 0,4 μm πόρων, Costar Ομίλου, Washington, DC) και τοποθετείται στην κορυφή των πολιτισμών Α549. Συν-καλλιέργεια διεξήχθη για 72 ώρες και το μέσο καλλιέργειας στη συνέχεια συλλέχθηκε για περαιτέρω ανάλυση.

Ανίχνευση της ΙΡΝβ, CXCL10 /IP-10, TNF-α, και IL-10 με Δοκιμασία ενζυματικής ανοσοαπορρόφησης (ELISA )

Συγκεντρώσεις της ΙΡΝβ (Pierce), CXCL10 /IP-10 (SABiosciences, Frederick, MD), παράγοντα νέκρωσης όγκων-άλφα (TNF-α) (SABiosciences), και η ιντερλευκίνη-10 (IL-10) (SABiosciences) σε υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας προσδιορίστηκαν με ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Τα δεδομένα μετρήθηκαν στα 450 nm με αναγνώστη μικροπλακός BioRad.

ανοσοϊστοχημική χρώση

Για την ανάλυση ανοσοϊστοχημείας της έκφρασης του hnRNP Α1, Α2 hnRNP, SF2 /ASF, και IRF-3, 63 παραφίνη-ενσωματωμένες ανθρώπινους ιστούς NSCLC όγκου, 39 παρακείμενους ιστούς ελέγχου μη-όγκου, και 26 ιστοί βρογχεκτασίες ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Πρώτη Νοσοκομείο, Πεκίνο, Κίνα. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε τόσο από την Ηθική και τις Ακαδημαϊκές επιτροπές του Πανεπιστημίου του Πεκίνου Πρώτη Νοσοκομείο, και ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε θέμα.

Όλοι οι ιστοί ενσωματωμένες σε παραφίνη και βάφτηκαν χρησιμοποιώντας S-P ανοσοϊστοχημική μέθοδο. Εν συντομία, τα πλακίδια αφαιρείται η παραφίνη σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αιθανόλη, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PBS που περιέχει 3% διοξείδιο του υδρογόνου για να εμποδίσει ενδογενούς υπεροξειδάσης. Μετά προεπώαση σε 10% ορό κατσίκας για μη-ειδική μπλοκ πρόσδεσης, τα πλακίδια επωάστηκαν στη συνέχεια με ειδικά πρωτογενή αντισώματα: αντι-hnRNP Α1 (Proteintech), αντι-hnRNP A2B1 (Proteintech), αντι-SF2 /ASF (Santa Cruz), ή αντι-IRF-3 (Proteintech) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την έκπλυση, οι τομές επωάστηκαν στην συνέχεια με βιοτινυλιωμένο ανοσοσφαιρίνες για 15 λεπτά και στη συνέχεια με στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση προϊόν σύζευξης για 15 λεπτά. Τα σήματα αναπτύχθηκαν με DAB H-

2 διάλυμα

2O. Τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν με 5% αιματοξυλίνη, και στη συνέχεια εξετάστηκαν με μικροσκοπία φωτός. Τμήματα χωρίς πρωτοβάθμια επεξεργασία αντίσωμα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Η χρώση βαθμολογήθηκε σε μία κλίμακα από 0 έως IV ως ακολούθως: 0, λιγότερο από 5% των κυττάρων βάφτηκαν? Ι, 5-25% κύτταρα βάφτηκαν? II, 25-50% των κυττάρων βάφτηκαν? III, 50-75% των κυττάρων βάφτηκαν? και IV, περισσότερο από το 75% των κυττάρων χρωματίστηκαν. Παρτιτούρες II-IV ταξινομήθηκαν ως θετικά, ενώ οι βαθμολογίες 0 και εγώ ήταν αρνητικές.

Στατιστική Ανάλυση

SPSS 15.0 (SPSS Inc, Chicago, IL) χρησιμοποιήθηκε για τον καθορισμό στατιστική σημαντικότητα. Οι συνεχείς μεταβλητές από διαφορετικές ομάδες παρουσιάζονται ως μέσο ± S.D. και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

τεστ. Chi-square test χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν σημασία για hnRNP Α1, Α2 hnRNP, SF2 /ASF, και IRF-3 έκφραση μεταξύ καλοηθών και κακοηθών ομάδες πνευμονικό ιστό που μελετήθηκαν. Οι τιμές των

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Νοκ ντάουν της hnRNP Α1 /Α2 ή SF2 /ASF στο Ανθρώπινο NSCLC κύτταρα Αυξάνει Αποκλεισμός εξώνια 2 και 3 του IRF-3 Gene

για να εξεταστεί η πιθανή επίδραση της hnRNP Α1 /Α2 και SF2 /ASF σχετικά με τη ρύθμιση μάτισμα του IRF-3 γονίδιο, πραγματοποιήσαμε εξάντληση siRNA με τη μεσολάβηση της hnRNP Α1 /Α2 ή SF2 /ASF σε κύτταρα Α549 NSCLC και Calu-6. Μετά siRNA επιμόλυνση και επακόλουθη Πολυ (I: C) διέγερση του IRF-3 σηματοδοτικό μονοπάτι, το ολικό κυτταρικό RNA και πρωτεΐνης απομονώθηκαν και η αφθονία των hnRNP Α1 /Α2 και SF2 /ASF mRNAs και πρωτεϊνών εκτιμήθηκε με ημι-ποσοτική RT-PCR και ανάλυση Western blot, αντίστοιχα. Σε σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα εκχυλίσματα ελέγχου, τα εκχυλίσματα από τα δύο Α549 και Calu-6 κυττάρων επιμολυσμένων με ειδικές siRNAs έδειξε αξιοσημείωτη μείωση στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων στόχων (Σχ. 1Β και 1Γ). Όπως ήταν αναμενόμενο, το SF2 /ASF siRNA επιμόλυνση δεν επηρέασε τα επίπεδα των hnRNP Α1 /Α2, και το αντίστροφο.

(Α) Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει τα τρία μάτισμα παραλλαγές FL-IRF-3 (full-length IRF -3), τύπου Ι (μόνο Ε2 αποκλεισμού) και τύπου ΙΙ (αποκλεισμού) ισομορφές τόσο Ε2 και Ε3. Ε, εξόνιο. Οι IRF-3 εξώνια από 1 έως 4 αριθμημένα. Η μαύρη συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει εσώνια. Τα βέλη πάνω από τις μεταγραφές δείχνουν τη θέση των συγκεκριμένων συνόλων εκκινητή σχεδιασμένο για την ανάλυση RT-PCR των παραλλαγών IRF-3 μάτισμα. (Β) Συγκόλληση παράγοντες hnRNP Α1 /Α2 ή SF2 /ASF είχαν εξαντληθεί από συγκεκριμένες επιμόλυνση siRNA σε ανθρώπινο NSCLC κύτταρα Α549 και Calu-6, αντίστοιχα. Α1, hnRNP Α1? Α2, hnRNP Α2. Η εσφαλμένης σύμπτωσης siRNA ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν για ψευδο-επιμολυσμένα ελέγχου. Μετά siRNA επιμόλυνση και επακόλουθη Πολυ (I: C) διέγερση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ημι-ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η επίδραση της παρεμβολής RNA για την έκφραση των γονιδίων στόχων και IRF-3 παραλλαγές ματίσματος. Τα προϊόντα που αντιστοιχούν σε FL-IRF-3 και δύο είδη της παραλλαγής ματίσματος (Τύπου Ι και Τύπου II) υποδεικνύονται με βέλη. Για όλες τις αντιδράσεις, ολικό RNA εξάγεται από κύτταρα Α549 χωρίς αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιήθηκε σαν αρνητικός έλεγχος. Τα προϊόντα PCR του FL-IRF-3, τύπου Ι και ισομορφές Τύπου II ποσοτικοποιήθηκαν με σάρωση TotalLab Quant. Το γράφημα δείχνει την αναλογία ισομορφή FL /(FL + I + II) και οι τιμές είναι μέσες ± SD για n = 3 πειράματα. ανάλυση (C) κηλίδα Western πραγματοποιήθηκε με αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον των πρωτεϊνών υποδεικνύονται στα δεξιά. Πρωτεΐνη ζώνες IRF-3 επίσης ποσοτικοποιείται και κανονικοποιήθηκε ως προς τον εσωτερικό έλεγχο ακτίνης. Το γράφημα δείχνει την αναλογία IRF-3 /ακτίνης και οι τιμές είναι μέσες ± SD για n = 3 πειράματα.

#

P

και

##

P

& lt?. 0.05 σε σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα Α549 και Calu-6 κυττάρων, αντίστοιχα

Η

των παραλλαγών ματίσματος IRF-3, IRF-3b, -3c, -3Δ, και -3f χάνουν εξόνιο 2 ή και τα δύο εξόνιο 2 και εξόνιο 3 [37]. Για την ανάλυση της αλλαγής εναλλακτικό μάτισμα του IRF-3 σε siRNA επιμολυσμένα κύτταρα, ενίσχυση RT-PCR του IRF-3 διεξήχθη χρησιμοποιώντας ειδικές ομάδες εναρκτήρα με πρόσθιο εκκινητή που βρίσκεται στο εξόνιο 1 και αντίστροφο εκκινητή στο εξόνιο 4. Όπως φαίνεται στα Σχ. 1Α και 1Β, πλήρους μήκους IRF-3 (FL-IRF-3) και δύο είδη της παραλλαγής ματίσματος (Τύπου Ι: μόνο εξόνιο 2 του αποκλεισμού και Τύπου II: και οι δύο εξόνιο 2 και εξόνιο 3 αποκλεισμού) που δημιουργούνται τρεις ζώνες: 500 bp (Ε1 + 2 + 3 + 4), 327 bp (Ε1 + 3 + 4), και 155 bp (Ε1 + 4) σε μήκος, αντίστοιχα. Όσο για τα κύτταρα Α549, σε συνδυασμό εξάντληση των hnRNP Α1 και hnRNP Α2 και ενιαία εξάντληση του SF2 /ASF τόσο σαν αποτέλεσμα προφανής μείωση της FL IRF 3–mRNA, από 67% σε 9% ή 11%, και ταυτόχρονη αύξηση των mRNAs του Τύπου I και II ισομορφές (Εικ. 1Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας Calu-6 κυττάρων, με knockdown του hnRNP A1 /A2 ή SF2 /ASF καταλήγοντας σε μείωση από 91% σε 13% ή 15% FL-IRF-3 mRNA (σχ. 1Β). Ενιαία εξάντληση hnRNP Α1 ή Α2 hnRNP εκτελέστηκε επίσης σε κύτταρα NSCLC και έδειξε καμία επίδραση στην IRF-3 πρότυπο ματίσματος (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα RT-PCR, hnRNP A1 /A2 ή εξάντληση SF2 /ASF οδήγησε σε εμφανή μείωση στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης IRF-3 τόσο σε Α549 και Calu-6 κυττάρων (Εικ. 1 C).

Για να διερευνηθεί πιο άμεσα η ιδιαιτερότητα της hnRNP A1 /2 ή SF2 /ASF εξάντληση και εξόνιο παράκαμψη του IRF-3 προ-mRNA, χρησιμοποιήσαμε siRNA να καταστρέφουν PTB, ένα άλλο άφθονο αρνητικός ρυθμιστής του εναλλακτικού ματίσματος. εξάντληση ΡΤΒ δεν έδειξε καμία επίδραση επί του τρόπου διεξαγωγής μάτισμα IRF-3 (Σχ. 2Α και 2Β).

παράγοντας Συγκόλληση ΡΤΒ εξαντλήθηκε από συγκεκριμένες διαμόλυνση siRNA σε ανθρώπινα Α549 κύτταρα NSCLC και Calu-6. Η εσφαλμένης σύμπτωσης siRNA ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ως ψευδο-επιμολυσμένα ελέγχου. Μετά siRNA επιμόλυνση και επακόλουθη Πολυ (I: C) διέγερση, ολικό κυτταρικό RNA και πρωτεΐνης συλλέχθηκαν και δοκιμάστηκαν με ημι-ποσοτική RT-PCR (Α) και ανάλυση κηλίδας Western (Β) για να εξεταστούν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων στόχων και IRF- 3 παραλλαγές ματίσματος αναγράφεται στα δεξιά. Για τις αντιδράσεις RT-PCR, ολικό RNA εξάγεται από κύτταρα Α549 χωρίς αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιήθηκε σαν αρνητικός έλεγχος. Για όλες τις RT-PCR και ανάλυση στυπώματος Western, ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

hnRNP A1 /A2 και SF2 /ASF δεσμεύονται ειδικά με αλληλουχίες σε IRF-3 Intron 1

Λόγω της αναγνώρισης του hnRNP Α1 /Α2 και SF2 /ASF μοτίβα πρόσδεσης αμέσως ανάντη του IRF-3 εξόνιο 2 5 ‘θέση ματίσματος (Εικ. 3Α), διερευνήσαμε περαιτέρω την πιθανότητα ότι hnRNP Α1 /Α2 και SF2 /ASF δεσμεύονται ειδικά σε αυτά τα μοτίβα πρόσδεσης. Οι πρωτεΐνες σύντηξης GST-hnRNP Α1 και GST-SF2 /ASF εκφράστηκαν από την επαγωγή IPTG και καθαρίστηκαν με γλουταθειόνη Sepharose 4Β (Σχ. 3Β). Οι πρωτεΐνες σύντηξης GST επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο RNA ανιχνευτές που περιέχει τις αλληλουχίες UAGGGA ή GGAAGGA του IRF-3 ιντρονίου 1 και ανάλυση EMSA διεξήχθη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3C, σαφείς ζώνες μετατόπιση βρέθηκαν με GST-hnRNP Α1 και πρωτεΐνες GST-SF2 /ASF. Περαιτέρω G3C μετάλλαξη του UAGGGA μοτίβο και G2C μετάλλαξη του μοτίβου GGAAGGA οδήγησε σε μεγάλη μείωση στην hnRNP Α1 και SF2 /ASF δεσμευτική. Αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν την παρουσία hnRNP Α1 /Α2 και SF2 /ASF θέσεις ανοδικά του εξονίου 2 5 ‘θέση ματίσματος του IRF-3 προ-mRNA δέσμευσης.

(Α) Αλληλουχίες ιντρονίου 1 (439-462) και ιντρόνιο 1 (558-600) του IRF-3. Οι πιθανές θέσεις πρόσδεσης για hnRNP Α1 /Α2 (wt-Α1) ή SF2 /ASF (wt-SF2) σημειώνονται με έντονους πλάγιους χαρακτήρες. Η θέση σύνδεσης G3C μεταλλαγμένο για hnRNP A1 /A2 (μι-Α1) και την θέση πρόσδεσης G2C μεταλλαγμένο για SF2 /ASF (μι-SF2) είναι υπογραμμισμένες. (Β) Οι πρωτεΐνες σύντηξης GST-hnRNP Α1 (GST-Α1) και GST-SF2 /ASF (GST-SF2) εκφράστηκαν από την επαγωγή IPTG και καθαρίζονται με γλουταθειόνη Sepharose 4Β. (Γ) Είκοσι νανογραμμάρια εκάστου GST, GST-Α1, και πρωτεΐνη GST-SF2 χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασία ηλεκτροφορητικής μετατόπισης κινητικότητας με βιοτινυλιωμένο RNA ανιχνευτές WT-Α1 ή WT-SF2 και μεταλλαγμένων παραγώγων τους.

Η

IRF-3 Μινιγονίδια με μεταλλαγμένα hnRNP Α1 /Α2 ή SF2 /ASF μοτίβα πρόσδεσης σε αύξηση του αποκλεισμού των εξώνια 2 και 3

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τους ρόλους των hnRNP Α1 /Α2 ή SF2 /ASF δεσμευτική μοτίβα στη ρύθμιση μάτισμα του IRF -3 γονίδιο, IRF-3 μικρογονίδια που περιέχουν άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο μοτίβα πρόσδεσης hnRNP A1 /A2 ή SF2 /ASF κατασκευάστηκαν και διαμολύνθηκε σε κύτταρα Α549 (Σχ. 4Α και 4Β). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των IRF-3 ισομορφές μετρήθηκαν με ανάλυση RT-PCR. Σε σύγκριση με την άγριου διαμόλυνση τύπου μικρογονίδιο, η μετάλλαξη του hnRNP A1 /A2 ή SF2 /ASF θέσεις σύνδεσης οδήγησε σε εμφανή μείωση στην αναλογία ισομορφή FL /(FL + I + II), από 79% σε 23% ή 28% (και τα δύο

P

& lt? 0,05), αντίστοιχα, όπως φαίνεται στα Σχ. Οι 4Β και 4C.

(Α) Το άγριου τύπου (wt) και μεταλλαγμένων (mu) εκδόσεις του IRF-3 μικρογονίδιο απεικονίζεται. PCMV, υποκινητή του φορέα pcDNA3.0. pA, πόλυΑ σήμα. Οι IRF-3 εξώνια από 1 έως 4 αριθμημένα. Η μαύρη συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει εσώνια. (Β) Παροδική διαμόλυνση των WT-IRF-3 ή μ-IRF-3 μικρογονίδια διεξήχθη σε κύτταρα Α549 και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των IRF-3 ισομορφές μετρήθηκαν με ανάλυση RT-PCR. (Γ) Η γραφική παράσταση δείχνει την αναλογία ισομορφή FL /(FL + I + II) και οι τιμές είναι μέσες ± SD για n = 3 πειράματα.

#

P

και

##

P

& lt?. 0.05 σε σύγκριση με το WT-IRF-3 επιμόλυνση μικρογονίδιο

Η

siRNA που διαμεσολαβείται από εξάντληση της hnRNP Α1 /Α2 ή SF2 /ASF μειώνει την έκφραση της IRF-3 καθοδικός τελεστής Μόρια ΙΡΝβ και IP-10

Για να διερευνήσουν την επίδραση του IRF-3 εναλλακτικό μάτισμα ρυθμίζονται από νοκ ντάουν της hnRNP Α1 /Α2 ή SF2 /ASF επί της έκφρασης του IRF-3-επαγώγιμων γονιδίων, απομονώσαμε το ολικό RNA από Α549 και Calu-6 κυττάρων μετά από συγκεκριμένες διαμόλυνση siRNA και επακόλουθη Πολυ (I: C) διέγερση και εκτελείται ημι-ποσοτική RT-PCR για την ανάλυση των επιπέδων έκφρασης της ΙΡΝβ και IP-10 γονίδια. Επιπλέον, το υπερκείμενο της κυτταρικής καλλιέργειας συλλέχθηκε επίσης και ΙΡΝβ και ΙΡ-10 πρωτεΐνες εξετάστηκαν με προσδιορισμό ELISA χρησιμοποιώντας αντι-ΙΡΝβ ή αντι-ΙΡ-10 αντισώματα, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α και 5Β, Α549 και Calu-6 κυττάρων χωρίς Πολυ (I: C) διέγερση έδειξαν πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης της ΙΡΝβ και ΙΡ-10, σε σύγκριση με κύτταρα με πολυ (I: C) διέγερση. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κάτω ρύθμιση της ΙΡΝβ και ΙΡ-10 γονιδίων σε δύο επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης συνοδεύτηκε από σημαντικά μειωμένα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης IRF-3 τόσο σε Α549 και Calu-6 κύτταρα επιμολυσμένα με hnRNP A1 /A2 ή SF2 /siRNA ASF (Εικ. 1Γ, 5Α και 5Β).

Α549 και Calu-6 κύτταρα έγιναν συγκεκριμένες siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν της hnRNP Α1 /Α2 ή SF2 /ASF. Mock, κύτταρα επιμολυσμένα με το ταιριάζουν ελέγχου siRNA. Ελέγχου, κύτταρα χωρίς ειδική ή εικονικές επιμόλυνση siRNA και Πολυ (I: C) διέγερση. (Α) Μετά siRNA επιμόλυνση και επακόλουθη Πολυ (I: C) διέγερση, η έκφραση του mRNA της ΙΡΝβ και ΙΡ-10 γονίδια αναλύθηκε με ημι-ποσοτική RT-PCR. Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα Α549 χωρίς αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιήθηκε σαν αρνητικός έλεγχος. (Β) Η έκκριση της ΙΡΝβ (επάνω) και ΙΡ-10 (κάτω) πρωτεΐνες εξετάστηκε με δοκιμασία ELISA. Όπως φαίνεται στο Σχ.