Αφηρημένο

Τα microRNAs είναι μικρά μη-κωδικοποίησης μόρια RNA που ρυθμίζουν mRNA μετάφραση και τη σταθερότητα με τη δέσμευση να συμπληρωματικές ακολουθίες συνήθως μέσα un-μεταφρασμένη περιοχή 3 ‘(UTR). Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η ηπατική τοξικότητα που προκαλείται από τον αδενοϊό άγριου τύπου 5 (Ad5WT) σε ποντικούς μπορεί να προληφθεί με την ενσωμάτωση 4 θέσεις σύνδεσης για το συκώτι-ειδική microRNA, mir122, μέσα στο 3 ‘UTR του Ε1Α mRNA. Αυτός ο ιός, που ονομάζεται Ad5mir122, είναι μια πολλά υποσχόμενη υποψήφια ιοθεραπείας και δεν προκαλεί εμφανή ήπατος παθολογία. Στο παρόν δείχνουμε ότι Ad5mir122 διατηρεί λυτική δραστηριότητα άγριου τύπου στα καρκινικά κύτταρα δεν εκφράζουν mir122 και να αξιολογήσει τις επιπτώσεις από την ενδεχόμενη εξάντληση mir122 σε κύτταρα-ξενιστές. Επαναλάβετε χορήγηση 2 × 10

10 ιικά σωματίδια του Admir122 να HepG2 ποντίκια που φέρουν όγκο εμφάνισαν σημαντική αποτελεσματικότητα κατά του καρκίνου. RT-QPCR έδειξε ότι Ε1Α mRNA ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω 29-φορές στο ήπαρ, σε σύγκριση με Ad5WT. κηλίδα Western για Ε1Α επιβεβαίωσε ότι όλες οι παραλλαγές των πρωτεϊνών γκρέμισε. RT-QPCR για τις ώριμες mir122 σε μολυσμένα συκώτια έδειξε ότι ποσότητα mir122 παρέμεινε ανεπηρέαστη. Γονιδίωμα ευρύ mRNA μικροσυστοιχιών χαρακτηριστικών των μολυσμένων συκώτια έδειξε ότι αν και το επίπεδο μεταγραφής του acc = GSE23854).

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα πειράματα σε ζώα έγινε σύμφωνα με τους όρους των κατευθυντήριων γραμμών του Ηνωμένου Βασιλείου Home Office και τις κατευθυντήριες γραμμές UKCCCR για την καλή διαβίωση των ζώων στην Πειραματική νεοπλασία. Ο αριθμός της άδειας του έργου γραφείο στο σπίτι κάτω από τις οποίες διεξήχθησαν τα πειράματα αυτά είναι PPL 30/2333. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν με την έγκριση της Επιτροπής Δεοντολογίας Ιατρικών Επιστημών των Ζώων, Πανεπιστήμιο της Οξφόρδης.

Αποτελέσματα

Ad5mir122 δείχνει μειωμένη έκφραση Ε1Α σε πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η συμπερίληψη των θέσεων σύνδεσης microRNA εντός της 3’UTR του αδενοϊού Ε1Α mRNA οδηγεί σε χαμηλότερη Ε1Α πρωτεΐνη τόσο σε ήπαρ ποντικού

in vivo

και στις mir122 θετική κυτταρική γραμμή ανθρώπινου ηπατώματος Huh7

in vitro

. Ωστόσο, τα κύτταρα Huh7 εκφράζουν μόνο το 8% των επιπέδων mir122 πρωτογενών ανθρώπινων ηπατοκυττάρων [27]. Συνεπώς, θέλαμε να μετρηθεί το επίπεδο ελέγχου της έκφρασης ιικών διαγονιδίου που θα μπορούσε να επιτευχθεί σε πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα ως υποκατάστατο του ανθρώπινου ήπατος. Πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα (1 × 10

4 /φρεάτιο) επωάστηκαν είτε με Ad5WT κωδικοποιεί λουσιφεράση C-τερματικώς συντηγμένη με την πρωτεΐνη Ε1Α (Ad5WTLuc) ή το ισοδύναμο ιό που περιέχει τέσσερα mir122 περιοχές στην Ε1Α-λουσιφεράσης 3’UTR σύνδεσης ( Ad5mir122luc). Μετά από 72 ώρες τα επίπεδα λουσιφεράσης ήταν & gt? 30 φορές χαμηλότερη σε κύτταρα μολυσμένα με Ad5mir122luc (9.5 × 10

2 RLU /mg), σε σύγκριση με Ad5WTluc (2.7 × 10

4 RLU /mg) (Σχήμα 1) . Αυτή είναι η πρώτη επίδειξη του ελέγχου της ρυθμιζόμενης ιού microRNA στην πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα και αναδεικνύει την πιθανή κλινική χρησιμότητα της αξιοποίησης ρύθμισης microRNA στη θεραπευτική ιούς.

Πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα μολύνθηκαν είτε με Ad5mir122luc ή Ad5WTluc σε 1 VP /κύτταρο. Τα επίπεδα λουσιφεράσης δείχνεται 3 ημέρες μετά τη μόλυνση (η = 3) ως σχετικές μονάδες φωτός ανά mg συνολικής πρωτεΐνης. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση.

Η

Ad5mir122 σκοτώνει mir122 αρνητικά κύτταρα με Ad5WT ισχύ

Η ικανότητα της Ad5mir122 για να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα δεν εκφράζουν mir122 συγκρίθηκε με Ad5WT. Πολλαπλές κυτταρικές γραμμές επωάστηκαν σε 10 και 100 νρ /κύτταρο και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε μετά από 3 ή 6 ημέρες με δοκιμασία MTS. Ίσες θανάτωση των κυττάρων παρατηρήθηκε με τους δύο ιούς και στα δύο ΜΟΙ από 3 ημέρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σχεδόν πλήρης θανάτωση κυττάρου σε μερικές κυτταρικές γραμμές παρατηρήθηκε στην υψηλότερη ΜΟΙ από την ημέρα 6 (Σχήμα 2). Είναι ενδιαφέρον ότι η κυτταρική γραμμή πιο ευπαθή σε θανάτωση από τους δύο ιούς ήταν HepG2 ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος που φέρεται να είναι αρνητικός mir122 [27]. Δεδομένου ότι μειώνει τα επίπεδα mir122 στην πρωτοβάθμια ηπατώματα είναι ένας δείκτης της κακής πρόγνωσης [28], τα κύτταρα HepG2 αντιπροσώπευε ένα πολλά υποσχόμενο μοντέλο όγκου η οποία θα πρέπει να μεγιστοποιηθεί το θεραπευτικό δείκτη επιτυγχάνεται με Ad5mir122 μεταξύ ιστό του όγκου και της πρωτογενούς του ήπατος.

Σύγκριση Ad5mir122 και Ad5WT σε κυτταρικές σειρές καρκίνου επωάζεται σε μία πολλαπλότητα μόλυνσης 100 ιικά σωματίδια ανά κύτταρο. Η επιβίωση των κυττάρων ποσοστό δείχνεται 6 ημέρες μετά τη μόλυνση (Ν = 5) χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία κυτταρικής επιβίωσης MTS. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA. (* = P & lt? 0,05, NS = όχι σημαντική)

Η

Φαρμακοδυναμική ηγεσία προσδιορισμό της βέλτιστης δόσεων ιού

Οι βέλτιστες δόσεις των Ad5mir122 και Ad5WT προσδιορίστηκαν προκειμένου να καθορίσει ένα πρωτόκολλο που θα επιτρέψει επανάληψη παράδοση σε ένα μοντέλο αποτελεσματικότητας του καρκίνου. Παρά το γεγονός ότι έχουμε ορίσει προηγουμένως τη μέγιστη εφάπαξ ένεση ανεκτή δόση σε φυσιολογικά ποντίκια του Admir122 (6 × 10

10 vp), η θεραπεία της ξενομόσχευμα φέρουν άτριχων ποντικών μπορεί να απαιτήσει ένα διαφορετικό πρωτόκολλο, και ως εκ τούτου μια μελέτη κλιμάκωσης φαρμακοδυναμική ηγεσία της δόσης διεξήχθη .

Ad5WT και Ad5mir122 χορηγήθηκαν ενδοφλεβίως σε CD1 γυμνών ποντικών που φέρουν ξενομοσχεύματα HepG2, με ALT ορού μετρήθηκε μετά από κάθε δόση (Σχήμα 3α). Η δόση έναρξης για τους δύο ιούς ήταν 6 × 10

9 VP /ποντίκι, που αντιστοιχούν σε 8,8 × 10

8 pfu για Ad5WT, ελαφρώς χαμηλότερη από τη δημοσιευμένη μέγιστη ανεκτή δόση (MTD, 1 × 10

9 pfu ) [17]. Για να ενεργοποιήσετε την απεικόνιση της δραστηριότητας του ιού κάθε δόση περιείχε 10% Ad5mir122luc.

Α) στον ορό τρανσαμινάση της αλανίνης (ALT) τα επίπεδα, από τα ποντίκια που έλαβαν Ad5mir122, Ad5WT ή PBS. Οι τιμές ALT για κάθε ομάδα φαίνεται στο ημέρες 2, 5 και 8 (n = 3) μετά την πρώτη ένεση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μονάδες ανά λίτρο ALT χρησιμοποιώντας την εξίσωση στα υλικά και μεθόδους. Β) λουσιφεράσης απεικόνισης 2 ημέρες μετά την πρώτη ένεση του Ad5mir122 (αριστερός πίνακας) ή Ad5WT (δεξί πάνελ). Γ) λουσιφεράσης απεικόνισης οκτώ ημέρες μετά την πρώτη ένεση. Τα ποντίκια που έλαβαν μια μόνο ένεση του Ad5WT φαίνονται στο δεξί πλαίσιο και οι ποντικοί που λαμβάνουν τρεις ενέσεις Ad5mir122 φαίνεται στο αριστερό πλαίσιο. Οι εικόνες που όλα παρουσιάζονται στην ίδια κλίμακα. Δ) Η δοσολογία και το θεραπευτικό σχήμα για Ad5mir122 και Ad5WT. Οι Viral δόσεις που υποδεικνύονται παραπάνω κάθε γραμμή και περιλαμβάνουν 10% ενός ιού ρεπόρτερ λουσιφεράσης (Ad5mir122luc). Όλα τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με δισφωσφονικό λιποσώματα σε ημέρες -1

Η

Δύο ημέρες μετά τη χορήγηση του 6 × 10

9 νρ Ad5WT, ποντικοί έδειξαν δραματικά αυξημένα επίπεδα ALT. (& Gt? 1.000 Μονάδες /L) υποδηλώνοντας σημαντική ηπατική τοξικότητα (Σχήμα 3α). Imaging έδειξαν υψηλά επίπεδα ηπατικών έκφρασης λουσιφεράσης, επιβεβαιώνοντας δραστηριότητα του ιού στο ήπαρ με λίγο ή καθόλου σήμα όγκου (Σχήμα 3b). Παρά το γεγονός ότι οι τιμές της ALT μειώθηκαν σταθερά κατά ημέρες 2-8 (Σχήμα 3α), διάφορα ζώα (6 στους 10) έδειξε σημαντική απώλεια βάρους (& gt? 5%) και το ένα τέθηκε κάτω (απώλεια βάρους & gt? 15%). Κατά συνέπεια αυτή η δόση των Ad5WT λήφθηκε ως MTD, και η θεραπεία δεν είχε κλιμακωθεί.

Αντίθετα, δύο ημέρες μετά τη χορήγηση της ίδιας δόσης (6 × 10

9 VP) της Ad5mir122, ποντίκια έδειξαν ALT αναγνώσεις παρόμοια με PBS μάρτυρες (Σχήμα 3α). δεδομένων απεικόνισης επιβεβαίωσε αυτό το αποτέλεσμα χωρίς ανιχνεύσιμη ηπατική λουσιφεράσης (Σχήμα 3β). Μικρή έως καθόλου μόλυνση του όγκου παρατηρήθηκε με αυτή τη δόση.

Η δόση του Ad5mir122 επομένως αυξήθηκε κατά το ήμισυ log έως 2 × 10

10 νρ, τρεις ημέρες μετά την πρώτη ένεση. Απεικόνιση κατά την ημέρα πέντε έδειξαν κάποια ενεργότητα λουσιφεράσης (υποδεικνύοντας έκφραση του Ε1Α) τόσο του όγκου και του ήπατος, αν και οι απόλυτες τιμές κυμάνθηκαν μεταξύ ποντικών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μέσες τιμές ALT παρουσίασαν αύξηση σε 222 μονάδες ALT /L σε σύγκριση με 42 μονάδες ALT /L από τους ελέγχους (Σχήμα 3α). Την ημέρα έξι η δόση αυξήθηκε περαιτέρω κατά το ήμισυ καταγραφής έως 6 × 10

10 VP. Απεικόνιση κατά την ημέρα οκτώ έδειξαν σημαντική δραστικότητα λουσιφεράσης στους όγκους, ωστόσο αυτό συζεύχθηκε με μετρήσιμη δραστικότητα λουσιφεράσης επίσης στο ήπαρ (Σχήμα 3c). αναγνώσεις ALT έδειξε μόνο μια μικρή αύξηση από την προηγούμενη δόση (Σχήμα 3α). Αυτή η μελέτη επιβεβαίωσε ότι οι 6 × 10

10 VP της Ad5mir122 ήταν κοντά στο MTD για Admir122, σε συμφωνία με προηγούμενα δεδομένα μας σε φυσιολογικά ποντίκια.

Η επανάληψη της χορήγησης του αδενοϊό μπορεί να προκαλέσει αθροιστική τοξικότητα [10]. Για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας ήταν επιθυμητή η χορήγηση του ιού σε πολλές περιπτώσεις, ως εκ τούτου, για επαναλαμβανόμενες χορηγήσεις επιλέξαμε επίπεδα δόσης που ήταν μισό log χαμηλότερες από τις εκτιμώμενες MTDs του Ad5mir122 (2 × 10

10 νρ /ποντίκι) και Ad5WT (2 × 10

9 vp /ποντίκι).

η αποτελεσματικότητα των Ad5mir122 και Ad5WT σε ένα μοντέλο ηπάτωμα ξενομοσχεύματος

Για να προσδιοριστεί η αντικαρκινική δράση της Ad5mir122, γυμνών ποντικών που φέρουν ξενομοσχεύματα ιδρύθηκε HepG2 ήταν χορηγείται 2 × 10

10 VP ενδοφλεβίως κατά τις ημέρες 0, 3, 19 και 22, ενώ τα ζώα ελέγχου έλαβαν είτε 2 × 10

9 VP της Ad5WT ή PBS. Η θεραπεία ξεκίνησε με όγκους μεταξύ 10-20 mm

3 σε μέγεθος. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε για την αποτελεσματικότητα και ένα τελικό σημείο επιβίωσης (για το γράφημα Kaplan Meier) εισήχθη όταν μεμονωμένες όγκος του όγκου έφθασε 400 χιλιοστά

3. Τα ζώα που εμφανίζουν την ταχύτερη ανάπτυξη του όγκου επετράπη να συνεχίσουν πέρα ​​από αυτό το σημείο (έως 1000 mm

3) να επιτρέψει στην ομάδα μέσο μέγεθος του όγκου να φθάσει τα 400 mm

3. Τα ποντίκια χορηγούνται Ad5mir122 έδειξαν μειωμένη σημαντικά τον όγκο του όγκου από την ημέρα 20 συγκριτικά με ελέγχους PBS (Σχήμα 4α). Ωστόσο, τα ποντίκια που έλαβαν Ad5WT έδειξαν επίσης σημαντική αποτελεσματικότητα αντι-καρκίνου. Αυτό είναι ίσως αναμενόμενο, δεδομένου ότι Ad5WT έχει δειχθεί ότι έχει ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα [29]. Είναι σημαντικό να τονιστεί ότι οι δόσεις των Ad5mir122 και Ad5WT δεν ισοτοξική. Μετά από 4 ημέρες σε αγωγή με Ad5WT ένας ποντικός τέθηκε κάτω λόγω της απώλειας βάρους (& gt? 15%) και ηπατική τοξικότητα (4β Σχήμα). Δεν υπάρχουν τέτοιου είδους αρνητικά γεγονότα συνέβησαν στην ομάδα που έλαβε Ad5mir122 σε μια 10 φορές υψηλότερη δόση.

Η επανάληψη της χορήγησης του Ad5mir122 (n = 10 ποντίκια) στη δόση της θεραπείας καθορίζεται από το σχήμα 2 (2 × 10

10vp ) τις ημέρες 0, 3, 19 και 22 με ενδοφλέβια ένεση. Τα ζώα ελέγχου έλαβαν επαναλαμβανόμενη χορήγηση του 2 × 10

9 νρ Ad5WT ή PBS με ενδοφλέβια ένεση (η = 10 ποντικοί). Α) Ο όγκος του όγκου των ποντικών που έλαβαν PBS ή Ad5mir122 ή ​​Ad5WT υπολογίστηκε ως ο όγκος του ελλειψοειδούς [24]. Διεξήχθη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA με Bonferroni μετά τη δοκιμή (ns = όχι σημαντική, * = Ρ & lt? 0,05, ** = Ρ & lt? 0,01) σε κάθε χρονικό σημείο. Οι μπάρες σφάλματος που εμφανίζονται ως τυπικό σφάλμα. Β) Ανάλυση Kaplan Meier επιβίωσης δείχνει αυξημένη επιβίωση των ποντικών που έλαβαν Ad5mir122 και Ad5WT σύγκριση με τους μάρτυρες ποντικούς που λαμβάνουν PBS. Μετά από 4 ημέρες σε αγωγή με Ad5WT ένα ποντίκι τέθηκε κάτω λόγω τοξικότητας. Δεν τοξικότητες που σχετίζονται με τη θεραπεία παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της θεραπείας Ad5mir122 ή ​​θεραπεία με PBS. Ημέρες φαίνεται τόσο του οριζόντιου άξονα αντιπροσωπεύουν τις ημέρες αριθμό από την πρώτη ένεση του ιού.

Η

Kaplan Meier ανάλυση των ποντικών χορηγείται Ad5mir122 έδειξαν αυξημένη επιβίωση με όλα τα ποντίκια επιβιώνουν περισσότερο από όλους τους ελέγχους (Σχήμα 4β). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η χορήγηση επανάληψη της Ad5mir122 σε δόσεις πάνω από το MTD του Ad5WT μπορεί να έχει σημαντική αποτελεσματικότητα κατά του καρκίνου χωρίς τοξικότητα.

Η αξιολόγηση των ενδο-ηπατική δραστηριότητα Ad5mir122 Ε1Α

Για την ποσοτικοποίηση τόσο η Ε1Α mRNA και πρωτεΐνης που παράγεται από Admir122 στη βέλτιστη δόση της θεραπείας σε σύγκριση με Ad5WT, Balb /C ποντικοί εγχύθηκαν με 2 × 10

10 νρ και τα ήπατα συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες. Ως περαιτέρω έλεγχοι ποντικούς χορηγήθηκε PBS ή ένα Ε1Α διαγραφεί μη αντιγραφικό αδενοϊού τύπου 5 που κωδικοποιεί λουσιφεράση (AdLuc) στην ίδια δόση. RNA εκχυλίστηκε και η κύρια Ε1Α 13S μεταγράφημα μετρήθηκε με RT-QPCR. Ad5mir122 έδειξε μια 29-πλάσια μείωση στο επίπεδο του 13S Ε1Α αντιγράφων μεταγραφής σε σύγκριση με Ad5WT. Ε1Α mRNA αντίγραφα ανά νανογραμμαρίων συνολικού RNA ήταν 4,57 × 10

6 και 1,54 × 10

5, αντίστοιχα. Αυτό επιβεβαίωσε ότι η σταθερότητα του mRNA είναι η ίδια που πλήττονται άμεσα από τον κανονισμό microRNA, όπως θα αναμενόταν (Σχήμα 5α).

Α) RT QPCR για την μεταγραφή 13S Ε1Α mRNA στο συκώτι των ποντικών 48 ώρες μετά την ενδοφλέβια ένεση με 2 × 10

10 VP of Ad5mir122, Ad5WT, Ad5Luc ή PBS. Ad5mir122 δείχνει μείωσε σημαντικά Ε1Α mRNA κατά τη διάρκεια της μόλυνσης του ήπατος σε σύγκριση με Ad5WT (Ν = 3). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση δύο ουρά Student t-test (* Ρ = & lt? 0,05). Β) κηλίδα Western για να επιβεβαιωθεί ότι όλες οι πρωτεΐνες Ε1Α παραλλαγές γκρέμισε. Κάθε λωρίδα αντιπροσωπεύει πρωτεΐνη που εξάγεται από ένα άτομο το ποντίκι. λωρίδες ελέγχου που περιέχουν συκώτι από ποντίκια που έλαβαν θεραπεία είτε με Ε1Α διαγραφεί φορέα Ad5Luc ή PBS δεν παρουσιάζουν κανένα σήμα Ε1Α. θεραπεία Ad5WT δείχνει 3 σαφώς καθορισμένες ζώνες που αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες που παράγονται από τα 13S (36 kDa), 12S (26 kDa) και μια μικρότερη ασθενέστερη λωρίδα η οποία μπορεί να αντιπροσωπεύουν τις 11S ή το προϊόν μεταγραφής 10S Ε1Α. Η θεραπεία με Admir122 δείχνει σημαντική knockdown σε επίπεδα πρωτεΐνης Ε1Α για όλες τις παραλλαγές ματίσματος. Το στύπωμα εκτέθηκε για 1, 5 και 10 λεπτά με την έκθεση 5 λεπτών παρουσιάζονται εδώ. Τα μοριακά βάρη υπολογίστηκαν έναντι ενός διπλού χρώματος σκάλα μοριακού βάρους (Bio-Rad).

Η

Για να επιβεβαιώσετε ότι το μειωμένο επίπεδο Ε1Α mRNA οδήγησε σε μειωμένη παραγωγή πρωτεϊνών Ε1Α, και να επιβεβαιώσει ότι το αποτέλεσμα δεν ήταν Ε1Α 13S ειδικών, το ήπαρ πρωτεϊνικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με κηλίδα western για Ε1Α πρωτεΐνη.