Αφηρημένο

Εκτός από τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, το ανθρώπινο γονιδίωμα μάρκες ένα μεγάλο μέρος των μη κωδικοποιητικών RNAs. έχουν μακρά μη-κωδικοποίησης RNAs (lncRNAs) έχουν περιγραφεί ως η μεγαλύτερη υποκατηγορία μη κωδικοποιητικού μεταγραφικό σε ανθρώπινα RNAs μη κωδικεύουσα. Τα τελευταία χρόνια, έχουν lncRNAs θεωρηθεί ότι είναι οι βασικοί ρυθμιστές της συμπεριφοράς του όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, με βάση την προηγούμενη έρευνα, ερευνήσαμε την έκφραση και βιολογικός ρόλος ενός πρόσφατα εντοπίστηκαν σχετίζονται με τον καρκίνο lncRNA,

lncRNA-uc002kmd

.

1

. Αναλύσαμε τη σχέση μεταξύ των

lncRNA-uc002kmd

.

1

και του παχέος εντέρου (CRC) σε σύνολο 45 CRC και ζεύγη δειγμάτων ιστού παρακείμενες, μη-όγκου. Βρήκαμε ότι

lncRNA-uc002kmd

.

1

έκφρασης συνήθως εντόνως εκφρασμένο σε καρκίνωμα σε σύγκριση με τον ιστό δίπλα στο καρκίνωμα. Μέσα από μια σειρά πειραμάτων, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το

lncRNA-uc002kmd

.

1

ρυθμίζει CD44 ως μοριακό δόλωμα για miR211-3p. ανέφερε τα δεδομένα μας είναι ότι η υπερέκφραση του

lncRNA-uc002kmd

1

πολλαπλασιασμό ενισχυμένη κύτταρο στο CRC

Παράθεση:.. Γου Χ, Ο Χ, Li S, Xu X, Chen X, Zhu η (2016) Long μη-κωδικοποίησης RNA ucoo2kmd.1 Ρυθμίζει CD44-Εξαρτάται από την κυτταρική ανάπτυξη κατά ανταγωνίζονται για miR-211-3p στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 11 (3): e0151287. doi: 10.1371 /journal.pone.0151287

Επιμέλεια: Yifeng Zhou, Ιατρικό Κολέγιο του Πανεπιστημίου Soochow, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 10 του Ιανουαρίου του 2016? Αποδεκτές: 25 Φλεβάρη του 2016? Δημοσιεύθηκε: 14 Μαρτίου 2016

Copyright: © 2016 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Zhejiang της Κίνας (LY16H160048). Επίσης, το έργο αυτό υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από Wenzhou Κοινής Ωφέλειας Επιστήμης και Τεχνολογίας του έργου (Y20140707), και υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από επώαση έργων της πρώτης συνδεδεμένες νοσοκομείο του Wenzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο (FHY2014009). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι ένα σημαντικό πρόβλημα δημόσιας υγείας σε παγκόσμιο επίπεδο και παραμένει μια σημαντική αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στον ανεπτυγμένο κόσμο, σε μεγάλο βαθμό λόγω της τάσης του να κάνουν μετάσταση [1]. Είναι η δεύτερη πιο κοινή διάγνωση του καρκίνου μεταξύ των γυναικών και η τρίτη πιο συχνή στους άνδρες [2]. Αν και τα επιτεύγματα του παχέος έρευνα για τον καρκίνο είναι αξιοσημείωτη, νέες και αποτελεσματικές θεραπευτικές στρατηγικές εξακολουθούν να χρειάζονται. Η αναζήτηση νέων βιολογικών δεικτών για τη μεταστατική εξέλιξη σε καρκίνο του παχέος εντέρου είναι επείγον.

Long μη-κωδικοποίησης RNAs (lncRNAs), που αποτελούνται από μη-κωδικοποίησης μεταγραφές άνω των 200 νουκλεοτιδίων, έχουν περιγραφεί ως η μεγαλύτερη υποκατηγορία των μη-κωδικοποίησης μεταγραφικό σε ανθρώπους [3]. Μια σημαντική ποσότητα του παρελθόντος έρευνα έχει επικεντρωθεί στην ρυθμιστικό και δομικό ρόλο του lncRNAs σε πολλές σημαντικές βιολογικές διεργασίες όπως η αδρανοποίηση χρωμόσωμα, κυτταρική διαφοροποίηση, γονιδιωματική αποτύπωση και την ανάπτυξη, και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [4, 5]. Τα τελευταία χρόνια, με ένα ευρύ ρόλο lncRNA στην ανάπτυξη καρκίνου, αύξηση του αριθμού των μελετών σχετικά με τη σύνδεση της με την εμφάνιση της ανάπτυξης του καρκίνου (π.χ., μελέτες αναφορικά με CRC [2, 6], οισοφαγικό καρκίνωμα πλακώδους κυττάρου (ESCC) [7], και του γαστρικού καρκίνου (GC) [8]) έχουν δημοσιευθεί. Παρά τις διαπιστώσεις αυτές, τρέχουσες γνώσεις μας σχετικά με τις μορφές έκφρασης και λειτουργικός ρόλος των lncRNAs στο CRC παραμένει περιορισμένη.

Πρόσφατα, μια μελέτη διαπίστωσε μια νέα lncRNA σε GC,

lncRNA-uc002kmd

.

1

, που ονομάζεται επίσης και

GAPLINC

. Αυτό lncRNA σχηματίζει ένα μοριακό δόλωμα για miR211-3p, η οποία στοχεύει CD44 για την υποβάθμιση και την υπερέκφραση του

lncRNA-uc002kmd

.

1

θα μπορούσε επομένως να βελτιώσει την έκφραση CD44 με τον ανταγωνισμό για το miR-211- 3p, η οποία κατασκευάζει ένα μοντέλο για

lncRNA-uc002kmd

.

1

τη μεσολάβηση της μετανάστευσης των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό του γαστρικού καρκίνου [9, 10]. Ως ένας από τους δείκτες πιο υποθετικό βλαστικών κυττάρων, CD44 παίζει ένα σημαντικό ρόλο σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση [11]. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι CD44 είναι ένας γνωστός δείκτης βλαστικών κυττάρων για CRC [12].

Με βάση αυτές τις πληροφορίες, υποθέσαμε σε αυτή τη μελέτη που

lncRNA-uc002kmd

.

1

θα μπορούσε να διαδραματίσει έναν παρόμοιο ρόλο στο CRC. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, έχουμε συναχθεί έναν τρόπο για να οριοθετηθούν το μεταγραφικό εκτροπή του

lncRNA-uc002kmd

.

1

μεταξύ CRC και ζεύγη γειτονικών, μη νεοπλασματικών ιστών.

υλικά και Μέθοδοι

τα άτομα της μελέτης

Ομογενείς Κινέζων Χαν περιελάμβανε τα άτομα που συμμετέχουν σε αυτή τη μελέτη. Σαράντα-πέντε CRC και τα αντίστοιχα γειτονικά δείγματα ιστού ελήφθησαν από ασθενείς που διατρέχουν το πρώτο νοσοκομείο θυγατρικών της Wenzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Wenzhou). Δεν υπήρχαν περιορισμοί σχετικά με την ηλικία, το στάδιο της CRC, το φύλο ή την ιστολογία. Κατά την πρόσληψη, κάθε συμμετέχων είχε προγραμματιστεί για μια συνέντευξη χρησιμοποιώντας μια επιδημιολογική ερωτηματολόγιο, μετά την παροχή γραπτή συγκατάθεση. Η Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας της Wenzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο ενέκρινε την εν λόγω μελέτη. Τα κλινικά χαρακτηριστικά όλων των ασθενών που παρατίθενται στον Πίνακα 1, όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως [13].

Η

Κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινο ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, HCT116 και SW480, ήταν που αγοράστηκαν από την Τράπεζα κυττάρων του Type Culture Collection από την κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Σαγκάη Ινστιτούτο Κυτταρικής Βιολογίας, και διαβιβάστηκαν για λιγότερο από 6 μήνες. Οι διαδικασίες κυτταρικής καλλιέργειας έχουν δημοσιευτεί αλλού [13]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 σε μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη σε μια 10-ml δίσκο καλλιέργειας.

εκχύλιση RNA και σε πραγματικό χρόνος αλυσιδωτής αντίδρασης ποσοτικής πολυμεράσης

ΤΚΙζοΙ

® αντιδραστήριο (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για να απομονωθεί ολικό RNA από τα κύτταρα και τους ιστούς, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η σχετική έκφραση γονιδίου του

GAPLINC

προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ΑΒΙ Prism 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο ελέγχου, και όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν [14, 15]. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για qPCR ενίσχυση περιελάμβανε την προς τα εμπρός GTTTCCTGGAAGGGCATTTT και το αντίστροφο CAATCAGGGCTCTTGGACTC.

Κατασκευή των πλασμιδίων δημοσιογράφος

Η μέθοδος για την κατασκευή των πλασμιδίων δημοσιογράφος έχει δημοσιευτεί αλλού [9]. Ο φορέας pGL3 υποκινητή (GENECHEM) χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή των πλασμιδίων pGL3-

lncRNA-uc002kmd

.

1

-3’UTR (το πλασμίδιο που περιέχει

lncRNA-uc002kmd

.

1

3’UTR) και pGL3- CD44-3’UTR. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA.

παροδικές επιμολύνσεις και προσδιορισμούς λουσιφεράσης

HCT116 και SW480 επιμολύνθηκαν με τα πλασμίδια αναφοράς χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, CA, USA), σύμφωνα με τον κατασκευαστή του οδηγίες. Η χρήση του συστήματος Dual-Luciferase Reporter δοκιμασία (Promega, Madison, WI, USA) για να μετρηθεί η δραστικότητα της λουσιφεράσης έχει δημοσιευθεί αλλού [16]. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν και κάθε ομάδα περιλάμβανε 6 επαναλήψεις.

ακτινομυκίνη D δοκιμασία

HCT116 και SW480 επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) και συν-επιμολύνθηκαν με miR-211-3p, όπως υποδεικνύεται, για 24 ώρες? τα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε ακτινομυκίνη D (Sigma, St Louis, ΜΟ). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τη σταθερότητα του

lncRNA- uc002kmd

.

1

mRNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφάσης (qRT-PCR), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13].

ανάλυση Western blot

Western στύπωμα διεξήχθη για να αξιολογηθεί CD44 και έκφραση β-δράση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Η ανάλυση Western blotting επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Το σύστημα Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratory, Kumamoto, Japan) μέτρησης κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση βιωσιμότητα των κυττάρων, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή [16]. Υπήρχαν 6 επαναλήψεων για κάθε ομάδα, και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές.

Στατιστικές αναλύσεις

Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του

lncRNA-uc002kmd

.

1

και το

CD44

γονίδιο στο CRC ιστό αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης και μοντέλα γραμμικής παλινδρόμησης. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας t-test ζεύγη, 2-tailed Student. Ένα

P

-τιμή του & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Κινητά χαρακτηρισμό

LncRNA-uc002kmd

1

Για να προσδιοριστεί η κυτταρική εντόπιση του

lincRNA-uc002kmd

.

1

, τα επίπεδα της μεταγραφής πυρηνικής ελέγχου (

U6

) και κυτταροπλασματική απομαγνητοφώνηση ελέγχου (

GAPDH

mRNA) ανιχνεύθηκαν με RT-qPCR στα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα, αντίστοιχα. Για την κυτταρική σειρά HCT116, ανάλυση qRT-PCR αποκάλυψε ότι (μέση ± SEM) 89,8%

lincRNA-uc002kmd

.

1

ανιχνεύθηκε στο πυρηνικό κλάσμα, και 13,1% βρισκόταν στο κυτταροπλασματικό κλάσμα. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με την κυτταρική γραμμή SW480, συγκεκριμένα, 89,2% και 11,8%

lincRNA-uc002kmd

.

1

ανιχνεύθηκε στο πυρηνικό κλάσμα και τα κυτταροπλασματικά κλάσματα, αντίστοιχα (Σχ 1Α) .

(Α) Τα επίπεδα της μεταγραφής πυρηνικής ελέγχου (U6), κυτταροπλασματική μεταγραφή ελέγχου (GAPDH mRNA) και

lincRNA-uc002kmd

.

1

αξιολογήθηκαν από qRT- PCR σε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM. (Β) Ανάλυση κηλίδος Northern

lincRNA-uc002kmd

.

1

έκφραση στα κύτταρα CRC. (C) Μέγιστη βαθμολογία ΚΠΣ του

lincRNA-uc002kmd

.

1

με ανάλυση με PhyloCSF. Το σκορ -178.6075. (Δ) Η

lincRNA-uc002kmd

.

1

εκφράστηκε σε υψηλότερο επίπεδο σε ιστούς CRC σε σύγκριση με ταιριάζει CRC παρακείμενους ιστούς. Το επίπεδο έκφρασης του

lincRNA-uc002kmd

.

1

αναλύθηκε με qRT-PCR κανονικοποιημένη στο

GAPDH

. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Ε) Οι γραμμικές συσχετίσεις μεταξύ του

lincRNA-uc002kmd

.

1

επίπεδα έκφρασης και CD44 mRNA ελέγχθηκαν. Η σχετική αξία έκφραση ομαλοποιήθηκε με

GAPDH

επίπεδο έκφρασης. (F, G)

lincRNA-uc002kmd

.

1

έκφραση επηρεάζεται σημαντικά έκφραση CD44 mRNA. Νοκ ντάουν του

lincRNA-uc002kmd

.

1

μειωμένη έκφραση CD44, ενώ έκτοπη έκφραση της GAPLINC αυξημένο επίπεδο CD44 mRNA. (Η) Τα επίπεδα πρωτεΐνης CD44 αξιολογήθηκε σε κύτταρα CRC (κύτταρα HCT116 και τα κύτταρα SW480) με κηλίδα Western.

Η

LincRNA-uc002kmd

.

1

θα μπορούσαν να ανιχνευθούν ως μία μεταγραφή του αναμενόμενου μεγέθους με κηλίδωση Northern (Σχήμα 1 Β) στα κύτταρα CRC. Ταυτόχρονα, εξετάσαμε την κωδικοποίηση δυναμικό του

lincRNA-uc002kmd

.

1

χρησιμοποιώντας PhyloCSF, το σκορ PhyloSCF είναι -178.6075, το αποτέλεσμα αυτό έδειξε το χαμηλό δυναμικό κωδικοποίησης του

lincRNA -uc002kmd

.

1

(Σχήμα 1C).

LncRNA-uc002kmd

.

1

είναι up-ρυθμίζεται στους ιστούς CRC

Το επίπεδο έκφρασης του

lncRNA-uc002kmd

.

1

εξετάστηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου σε 45 ζεύγη CRC ιστού και συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Λεπτομερείς κλινικά χαρακτηριστικά που παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Η

lncRNA-uc002kmd

.

1

μεταγραφές εκφράστηκαν σε υψηλότερα επίπεδα στον ιστό του όγκου σε σύγκριση με το παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (Εικόνα 1ϋ).

Σύλλογος

lncRNA-uc002kmd

.

1

και

CD44

στο CRC

Δοκιμάσαμε τη συσχέτιση μεταξύ

lncRNA-uc002kmd

.

1

και

CD44

σε άλλα 15 ζεύγη CRC επικουρική μη καρκινικούς ιστούς. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ασθενείς με υψηλότερα

lncRNA-uc002kmd

.

1

επίπεδα έκφρασης σε ιστό CRC εμφανίζεται σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του CD44 (

R

2

= 0.24,

P

& lt? 0,05? Σχ. 1Ε)

Χρησιμοποιώντας ειδικές siRNAs, νοκ ντάουν του

lncRNA-uc002kmd

1

μειώθηκε σημαντικά έκφραση CD44, ενώ η υπερέκφραση του

lncRNA-uc002kmd

.

1

αυξημένα επίπεδα CD44 mRNA (Σχήμα 1F και 1G). Western Blot αποτελέσματα με συνέπεια έδειξε ότι νοκ ντάουν του

lncRNA-uc002kmd

.

1

μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης CD44 στην κυτταρική σειρά HCT116, ενώ η υπερέκφραση του lncRNA-uc002kmd.1 αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης CD44. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν στην SW480 κυτταρική γραμμή (Σχήμα 1).

LncRNA-uc002kmd

.

1

ρυθμίζει

CD44

έκφρασης με τον ανταγωνισμό για το miR -211-3p

Συμπτωματικά, το miRNA είναι γνωστή ως miR-211-3p ήταν ο προβλεπόμενος στόχος τόσο για

lncRNA-uc002kmd

.

1

και CD44. Για να επαληθεύσετε το ρόλο του miR-211-3p στα κύτταρα CRC, θα κλωνοποιηθεί το 3 ‘UTR του CD44 και

lncRNA-uc002kmd

.

1

κατάντη ενός γονιδίου λουσιφεράσης και συν-επιμολυσμένα αυτές οι δημοσιογράφοι με miR-211-3p μιμείται στα κύτταρα CRC. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, miR-211-3p μείωσε σημαντικά την λουσιφεράσης σήματα των δύο ρεπόρτερ. Επιπλέον, μετρήθηκε το CD44 και

lncRNA-uc002kmd

.

1

επίπεδα στα κύτταρα CRC μετά από τη θεραπεία με τα miR-211-3p μιμείται. Όπως ήταν αναμενόμενο, το CD44 και

lncRNA-uc002kmd

.

1

επίπεδα μειώθηκαν σημαντικά (Σχήμα 2Β). Εκτός από αυτό, έχουμε δοκιμάσει το επίπεδο έκφρασης των CD44 και miR-211-3p σε 15 ιστούς ζεύγη CRC, τα αποτελέσματα δείχνουν μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ miR211-3p και τα επίπεδα έκφρασης CD44 (

R

2

= 0.24,

P

& lt? 0,05?. Σχ. 2Γ)

(Α) Τόσο

lincRNA-uc002kmd

1

και CD44 είναι στοχευμένες με miR-211-3p. MiR-211-3p μειώθηκε σημαντικά τα λουσιφεράσης σήματα και των δύο

lincRNA-uc002kmd

.

1

και CD44. (Β) Η CD44 και

lncRNA-uc002kmd

.

1

επίπεδα μειώθηκαν σημαντικά. Τα δεδομένα είναι μέση τιμή ± SEM, κανονικοποιημένη στο

GAPDH

. (Γ) Οι αρνητικές συσχετίσεις μεταξύ του

lincRNA-uc002kmd

.

1

επίπεδα έκφρασης και CD44 mRNA ελέγχθηκαν.

Η

Μετά την εξουδετέρωση του

lncRNA- uc002kmd

.

1

από siRNA, θα κλωνοποιηθεί η περιοχή 3’UTR του CD44 σε ρεπόρτερ λουσιφεράσης και συν-επιμολυσμένα την κατασκευή με το

lncRNA-uc002kmd

.

1

siRNA ή ελέγχου siRNA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τότε knockdown του

lncRNA-uc002kmd

.

1

μείωσε σημαντικά την ένταση της λουσιφεράσης. Όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-211-3p θα μπορούσε να στοχεύσει

lncRNA-uc002kmd

.

1

και CD44 και ότι

lncRNA-uc002kmd

.

1

απαιτείται για την άφθονη έκφραση του CD44 (Σχήμα 3Α).

(Α) Ο φορέας αναφοράς συν-επιμολύνθηκε σε κύτταρα CRC, τα οποία υποβλήθηκαν σε θεραπεία με

lncRNA-uc002kmd

.

1

siRNA ή τον έλεγχο siRNA. Το σήμα της λουσιφεράσης μειώθηκε σημαντικά. (Β) Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η σταθερότητα του

lncRNA-uc002kmd

1

mRNA αναλύθηκε με qRT-PCR σε σχέση με το χρόνο 0 μετά το κλείδωμα νέα σύνθεση RNA με ακτινομυκίνη D.? δεδομένα είναι μέση τιμή ± SEM, κανονικοποιημένη στο

GAPDH

. (Γ) HCT116 και SW480 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων μετά επιμολυνθεί, και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων εκτελέστηκε ημερησίως για 3 ημέρες χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό CCK-8. Έξι αντίγραφα για κάθε ομάδα και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Δεδομένα aremean ± SEM. *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. (D) Τα δεδομένα έδειξαν όγκοι του όγκου των ξενομοσχευμάτων σε κάθε ομάδα 4 εβδομάδες μετά την υποδόρια εμφυτευμένων σταθερά κύτταρα CRC. Οι μέσοι όγκοι του όγκου από τα έξι γυμνούς ποντικούς από κάθε ομάδα δείχνονται σε διαφορετικά χρονικά σημεία. *

P

& lt?.. 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

LncRNA-uc002kmd

1

ρυθμίζει την ανάπτυξη των κυττάρων

ερευνήσαμε περαιτέρω την επίδραση του

lncRNA-uc002kmd

.

1

στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στο

vitro

. κύτταρα CRC επιμολύνθηκαν με miR-211-3p μιμείται ή με έναν αναστολέα miR-211-3p, και τα επίπεδα μεταγραφής του

lncRNA-uc002kmd ήταν

κάτω-ρυθμίζονται μετά τη σύνθεση του RNA ανεστάλη με ακτινομυκίνη D στο παρουσία του miR-211-3p (ρυθμισμένα προς τα κάτω από 100% σε 54% ± 3,2% με την παρουσία 1 pmol miR-211-3p? και ρυθμισμένα προς τα κάτω από 100% σε 28% ± 3,2% με την παρουσία 40 pmol miR-211-3p).

Πραγματοποιήσαμε CCK-8 προσδιορισμούς για να δοκιμαστούν τα αποτελέσματα των

LincRNA-uc002kmd

.

1

στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα CRC. Παρατηρήσαμε μια συνεπή αύξηση στην κυτταρική πολλαπλασιασμού του HCT116 (αύξηση 38%) και SW480 (αύξηση 31%) κυτταρικές σειρές όταν

LncRNA-uc002kmd

.

1

υπερεκφράστηκε σε φυσιολογικά επίπεδα μέσω CCK -8 προσδιορισμούς, σε σύγκριση με τον έλεγχο. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η

lncRNA-uc002kmd

.

1

κάτω-ρυθμίζονται τα κύτταρα, ο πολλαπλασιασμός των HCT116 (μείωση 50%) και SW480 κυτταρικών σειρών (27% μείωση) μειώθηκε σταθερά (Σχ 3C) .

LncRNA-uc002kmd

.

1

επιταχύνει την ανάπτυξη του όγκου σε ξενομόσχευμα

Για να εξεταστεί η βιολογική σημασία του

LncRNA-uc002kmd

.

1

στην ανάπτυξη του όγκου, ξενομόσχευμα έλαβαν υποδόρια ένεση με κύτταρα CRC. Όπως φαίνεται στο Σχ 3D, η ανάπτυξη όγκων από πάνω ρυθμισμένα

LncRNA-uc002kmd

1

ξενομοσχεύματα ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με εκείνη των ξενομοσχευμάτων ελέγχου:. 423,3 ± 71,6 mm

3 έναντι 600 ± 17,6 χιλιοστά

3 για τα κύτταρα HCT116 (

P

& lt? 0,05)? και 420 ± 70,8 χιλιοστά

3 έναντι 616,7 ± 21,7 χιλιοστά

3 για SW480 κύτταρα (

P

& lt? 0,05)., αντίστοιχα

Συζήτηση

η μελέτη αυτή, εντοπίσαμε το

lncRNA-uc002kmd

.

1

στο CRC και διαπίστωσε ότι ήταν δραματικά up-ρυθμίζεται CRC ιστό χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό μεταγραφάσης αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης αντίστροφη, υποδηλώνοντας την πιθανή λειτουργία του

lncRNA-uc002kmd

.

1

στο CRC. Μια σειρά από πειράματα έχουν καταδείξει τη συσχέτιση μεταξύ

lncRNA-uc002kmd

.

1

, miR-211-3p και CD44, καταλήγοντας στο συμπέρασμα ότι

lncRNA-uc002kmd

.

1

ρυθμίζει CD44-εξαρτώμενη κυτταρική ανάπτυξη με τον ανταγωνισμό για το miR-211-3p σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν τον σημαντικό ρόλο του

lncRNA-uc002kmd

.

1

κατά τη διάρκεια της CRC ογκογένεσης.

Οι LncRNAs εμφανίζονται ως βασικοί παράγοντες σε διάφορες βασικές βιολογικές διεργασίες και μια αυξανόμενη ποσότητα η έρευνα έχει προτείνει ότι lncRNAs αποτελούν σημαντικούς παράγοντες για την ανάπτυξη καρκίνου του [17-19]. Το πιο γνωστό lncRNA, Hotair, ρυθμίζεται προς τα πάνω σε καρκίνο της χοληδόχου κύστης (GBC), που οδηγεί σε μεταστάσεις του όγκου μέσω μεταβληθεί μεθυλίωση της ιστόνης Η3 λυσίνης 27 (H3K27) και γονιδιακή έκφραση [20, 21].

Linc-POU3F3

αυξάνεται σε δείγματα ESCC, η οποία, μέσω αλληλεπιδράσεων με

ΕΖΗ2

για την προώθηση της μεθυλίωσης του

POU3F3

, στη συνέχεια, την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου [22]. Άλλα από αυτά σχολιασμένα-lncRNA, μη σχολιασμένα lncRNA έχει που έχει την επιθυμητή επίδραση στην ανάπτυξη πολλών κακοήθων όγκων, όπως του ορθοκολικού καρκίνου που σχετίζεται lncRNA (CCAL) προώθηση της CRC εξέλιξη από την οδό ενεργοποιημένης Wnt /β-κατενίνης [23] . Μια πρόσφατη έκθεση διαπίστωσε ότι

lncRNA-uc002kmd

.

1

, επίσης γνωστή ως GAPLINC, ήταν ρυθμισμένη σε GC και εμφανίζεται επίσης σημαντική προγνωστική επιπτώσεις στη διάγνωση και την πρόγνωση του καρκίνου του στομάχου, ενώ , στη μελέτη μας,

lncRNA-uc002kmd

.

1

συμμετείχε επίσης στην προώθηση της ανάπτυξης CRC.

στη συνέχεια, μελετήσαμε τους μηχανισμούς με τους οποίους

lncRNA -uc002kmd

.

1

ασκεί τη λειτουργία της στην κακοήθη φαινότυπο CRC. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ξεκάθαρα ότι όταν φίμωση

lncRNA-uc002kmd

.

1

έκφρασης, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC ανεστάλη. Τα δεδομένα μας επίσης επιβεβαίωσε ότι

lncRNA-uc002kmd

.

1

σχηματίζει ένα μοριακό δόλωμα για miR211-3p. Είναι κοινή γνώση ότι miRNAs είναι σύντομες ακολουθίες RNA, αν και αλληλουχίες στόχο των 3’UTRs των mRNAs τότε χειριστούν αρνητικά την έκφραση του γονιδίου. Τα miRNAs εμπλέκονται σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες, όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και τον μεταβολισμό. Σε γενικές γραμμές, miRNAs διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση των γονιδίων, κυρίως στοχεύοντας άφθονα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Όλο και περισσότερο, όμως, περισσότερη έρευνα διαπίστωσε ότι miRNAs μπορεί επίσης να εκτελέσει τη λειτουργία τους από lncRNAs στόχευση [24]. Η θεωρία του ανταγωνιστικού ενδογενούς RNA έδειξαν ότι κωδικοποιούν τα γονίδια και lncRNAs μπορεί να ρυθμίσει ο ένας τον άλλο μέσα από τον ανταγωνισμό τους για miRNA δεσμευτική [25]. Σύμφωνα με αυτή τη θεωρία, lncRNAs μπορούν να ασκήσουν την επιρροή τους σε στόχους με την εξυπηρέτηση των ως κράχτες για miRNAs.

Στην εργασία αυτή, εντοπίσαμε την πρωτεΐνη CD44 ως ένα σημαντικό μέρος του

lncRNA-uc002kmd

.

1

– miRNA ρυθμιστικό δίκτυο. Χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία λουσιφεράσης, βρήκαμε ότι CD44 καταστέλλεται από miR-211-3p, και αυτή η λειτουργία μετριάζει

lncRNA-uc002kmd

.

1

υπερέκφραση. Βρήκαμε επίσης ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης CD44 αυξάνεται σταδιακά με την αύξηση των επιπέδων του

lncRNA-uc002kmd

.

1

.

CD44 είναι μια επιφάνεια του κυττάρου διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που παίζει ένα σημαντικό ρόλο σε ένα αριθμό βιολογικών λειτουργιών [26]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι CD44 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη AML και οι παραλλαγές της CD44 θα μπορούσε να επηρεάσει την έκφραση του, που οδηγεί σε ποικίλες κινδύνους AML [15]. Επιπλέον, CD44 είναι ένας σημαντικός δείκτης βλαστικών κυττάρων για πολλαπλούς συμπαγείς όγκους, η οποία οδηγεί στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου [27]. CD44 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως νέος δείκτης για τα χαρακτηριστικά και τη διαχείριση πολλών όγκων όπως GC [28] ή CRC [11]. Πρόσφατα, πολλές μελέτες έχουν δείξει σημαντική συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου των

CD44

ογκογενετικότητας έκφρασης και του καρκίνου του μαστού, η οποία υπογραμμίζει τον σημαντικό ρόλο του

CD44

στην πρόοδο του όγκου και των μεταστάσεων [11, 29, 30 ]. Στη μελέτη μας, δείξαμε ότι miR211-3p δεσμεύεται με την περιοχή 3’UTR του CD44, στοχεύουν CD44 για την αποικοδόμηση. Μέσα από το δόλωμα miR211-3p, η

lincRNA-uc002kmd

.

1

αυξάνει την έκφραση CD44.

Συνολικά, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι

lincRNA-uc002kmd

.

1

μπορεί να βελτιώσει την έκφραση CD44 με τον ανταγωνισμό για το miR-211-3p, στη συνέχεια, μεσολαβώντας στη μετανάστευση των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό στο CRC.

Ευχαριστίες

Το έργο υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση από Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Zhejiang της Κίνας (LY16H160048). Επίσης, το έργο αυτό υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από Wenzhou Κοινής Ωφέλειας Επιστήμης και Τεχνολογίας του έργου (Y20140707), και υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από επώαση έργων της πρώτης συνδεδεμένες νοσοκομείο του Wenzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο (FHY2014009).