Αφηρημένο

Ο αρχικός σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει διαγνωστικοί δείκτες μυθιστόρημα του ορού για τον όγκο ανθρώπινης ωοθήκης κοκκιοκυτταρικού (GCT), έναν όγκο που αντιπροσωπεύει μέχρι το 5% όλων των καρκίνων των ωοθηκών. Για να παρακαμφθεί η σπανιότητα των ανθρώπινων ιστών που διατίθενται για αναλύσεις, χρησιμοποιήσαμε το

Ctnnb1

tm1Mmt /+?

PTEN

tm1Hwu /tmiHwu?

Amhr2

ΤΜ3 (CRE) BHR /+ διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού, η οποία διαθέτει την συστατική ενεργοποίηση του CTNNB1 σηματοδότηση σε συνδυασμό με την απώλεια του

ΡΤΕΝ

σε κοκκιώδη κύτταρα και αναπτύσσει όγκων των βλαστικών κυττάρων που μιμούνται επιθετικές μορφές της ανθρώπινης ασθένειας. Πρωτεομικής προφίλ με φασματομετρία μάζας έδειξε ότι βινκουλίνης, ενολάση 1, αρκετές πρωτεΐνες θερμικού σοκ, και valosin περιέχει πρωτεΐνη (VCP) έχουν μεγαλύτερη αφθονία που εκκρίνονται από καλλιεργημένα κύτταρα ποντικού GCT σύγκριση με πρωτογενή καλλιεργημένα GC. Μεταξύ αυτών των πρωτεϊνών, μόνο VCP ήταν παρόν σε σημαντικά αυξημένα επίπεδα στην προεγχειρητική ορό ασθενών με καρκίνο GCT σε σύγκριση με τα φυσιολογικά άτομα. Για να καθοριστεί η εξειδίκευση του VCP, τα επίπεδα ορού μετρήθηκαν επίσης στο καρκίνωμα των ωοθηκών, μη-Hodgkin λέμφωμα και του μαστού, του παχέος εντέρου, του παγκρέατος, των πνευμόνων, και ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Αυξημένα επίπεδα VCP ορού παρατηρήθηκαν στην πλειονότητα των περιπτώσεων καρκίνου, με την εξαίρεση των ασθενών με πνεύμονα ή καρκίνος του προστάτη. Επιπλέον, τα επίπεδα VCP ορού αυξήθηκαν κατά κάποιο GCT, οι ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών, καρκίνο του μαστού, και του καρκίνου του παχέος εντέρου οι οποίοι δεν αλλιώς εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα ευρέως χρησιμοποιούμενα καρκινικών δεικτών ορού για τον τύπο του καρκίνου τους (π.χ. ινχιμπίνη Α, ινχιμπίνη Β, CA125, CEA, ή CA15.3). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν την πιθανή χρήση των VCP ως εξαιρετικά ευαίσθητο δείκτη ορού για GCT, καθώς και πολλές άλλες ανθρώπινων καρκίνων

Παράθεση:. Lague MN, Romieu-Mourez R, Bonneil Ε, Boyer Α, Pouletty Ν, μηνύ- Masson ΑΜ, et al. (2012) πρωτεομικής προφίλ του ένα μοντέλο ποντικού για ωοθηκών Κοκκιωδών καρκινικών κυττάρων Προσδιορίζει VCP ως ένα πολύ ευαίσθητο δείκτη όγκου ορού σε αρκετούς ανθρώπινους καρκίνους. PLoS ONE 7 (8): e42470. doi: 10.1371 /journal.pone.0042470

Επιμέλεια: DunFa Peng, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13, Απριλίου, 2012? Αποδεκτές: 9, Ιουλίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 1, Αυγούστου, 2012

Copyright: © Lague et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη λειτουργία επιχορήγηση MOP-102508 από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας και του Καναδά Έρευνας Έδρας ωοθηκών Μοριακής Βιολογίας και Λειτουργική Γονιδιωματική. Το Πανεπιστήμιο της Βιρτζίνια Κέντρο για την Έρευνα στην Δοκιμασία αναπαραγωγή ρίζας και Ανάλυσης Πυρήνα υποστηρίζεται από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας NICHD (SCCPRR) Επιχορήγηση U54-HD28934. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

δείκτες ορού έχουν μεγάλη αξία για την κλινική εξέταση, διάγνωση και παρακολούθηση των καρκίνων. Ένα ιδανικό δείκτης θα πρέπει να έχει υψηλή ευαισθησία και /ή υψηλή ειδικότητα, ώστε να διακρίνει τους ασθενείς με καρκίνο από υγιή άτομα, καθώς και από ασθενείς με καλοήθεις όγκους ή άσχετες συνθήκες. Οι περισσότεροι σήμερα χρησιμοποιούνται δείκτες ορού είναι ορμόνες, γλυκοπρωτεΐνες, ή άλλες πρωτεΐνες υπερεκφράζονται από τα καρκινικά κύτταρα. Οι δείκτες αυτοί συνήθως δεν είναι ειδικά για ένα μοναδικό είδος καρκίνου και μερικές φορές η έλλειψη ευαισθησίας [1]. Αρκετές στρατηγικές έχουν πρόσφατα πρότεινε για τον εντοπισμό νέων καρκινικών δεικτών στον ορό [2]. Διαφορική πρωτεομική ανάλυση δειγμάτων ορού από ασθενείς με καρκίνο και σε υγιή άτομα είναι προσεγγίσεις της επιλογής, αλλά παρεμποδίζονται από τη σπανιότητα του υλικού σε σπάνιες μορφές καρκίνου, καθώς και από τη δυσκολία στην ανίχνευση πρωτεϊνών που εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα σε σύγκριση με άφθονες φυσιολογικές πρωτεΐνες ορού. Μια εναλλακτική προσέγγιση σε δύο στάδια περιλαμβάνει την αρχική αναγνώριση των πρωτεϊνών που εκφράζονται διαφορικά και /ή εκκρίνονται μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων, ακολουθούμενη από την ταυτοποίηση αυτών των πρωτεϊνών στον ορό των ασθενών με καρκίνο. Αυτή η προσέγγιση απαιτεί ιδανικά την απομόνωση των πρωτογενών κυττάρων όγκου και αντίστοιχα φυσιολογικά κύτταρα. Σε αυτό το πλαίσιο, η χρήση των σχετικών ζωικά μοντέλα ανάπτυξης όγκου μπορεί να παρέχει απαραίτητα υλικά έναρξης για πρωτεομική ή γονιδιωματική ανάλυση, και να οδηγήσει στην ταυτοποίηση ογκο-ειδικά υποψήφιος πρωτεΐνες ή γονίδια των οποίων η έκφραση μπορεί να κατόπιν να διερευνηθεί σε ανθρώπινα δείγματα, όπως αποδεικνύεται στον καρκίνο των ωοθηκών [3], [4], [5].

η κοκκιωδών κυττάρων των ωοθηκών όγκου (GCT) είναι η πιο διαδεδομένη του καλωδίου φύλο /στρωματικών υποομάδα των όγκων των ωοθηκών σε γυναίκες, και πιστεύεται ότι αντιπροσωπεύει έως το 5% όλων των καρκίνων των ωοθηκών. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, η ομάδα μας έχει επικεντρωθεί στην διασαφήνιση της μοριακής αιτιολογίας της ανθρώπινης GCT, καθώς και για τη δημιουργία σχετικών μοντέλων GCT ζώο. Βρήκαμε στοιχεία ότι απορρύθμιση τόσο της WNT /CTNNB1 (β-κατενίνης) και PI3K /AKT σηματοδότησης οδών συμβαίνουν στο ανθρώπινο GCT [6], [7]. Διαγονιδιακά ποντίκια με συστατική ενεργοποίηση των CTNNB1 στα κοκκιώδη κύτταρα (GC,

Ctnnb1

tm1Mmt /+?

Amhr2

TM3 (CRE) BHR /+) αναπτύσσουν προκαρκινικές αλλοιώσεις των ωοθηκών συχνά εξελίσσονται σε GCT αργότερα στη ζωή τους [6]. Η απώλεια της PI3K /AKT σηματοδότησης γονίδιο ανταγωνιστή

PTEN

στο GC σπάνια προκαλεί GCT, αλλά η ταυτόχρονη ενεργοποίηση των CTNNB1 και την απώλεια του

PTEN

στο

Ctnnb1

tm1Mmt /+?

PTEN

tm1Hwu /tm1Hwu?

Amhr2

TM3 (CRE) BHR /+ (CPA) μοντέλο έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη των επιθετικών, μεταστατικό GCT με 100 % διεισδυτικότητα [7]. Έχουμε προτείνει ότι η CPA ποντίκι είναι το καλύτερο μοντέλο που διατίθενται σήμερα για την ανάλυση των GCT βιολογίας, καθώς και για προκλινικές μελέτες σε ζώα με στόχο την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παρεμβάσεων ή /και διαγνωστικών εργαλείων.

Υποθέσαμε ότι η CPA ποντίκι μοντέλο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση των διαφορικά εκφρασμένων, GCT-συνδεόμενες πρωτεΐνες, και ότι αυτά θα μεταφραστεί σε κλινικά χρήσιμες διαγνωστικών δεικτών της ανθρώπινης ασθένειας νέα ορό. Εδώ παρουσιάζουμε μια ανάλυση διαφορικής secretome σύγκριση πρωτογενή καλλιεργημένα GC από τα φυσιολογικά ποντίκια στα κύτταρα GCT από ποντίκια CPA. Αυτή η προσέγγιση οδήγησε στην ταυτοποίηση της πρωτεΐνης που περιέχει vasolin (VCP) ως δυνητικά κλινικά σχετικό δείκτη ορού για ανθρώπινη GCT, καθώς και για άλλες μορφές καρκίνου.

Αποτελέσματα

Ταυτοποίηση των πρωτεϊνών που εκκρίνονται επιλεκτικά σε ποντίκι GCT

πρωτεομικής προφίλ χρησιμοποιήθηκε με στόχο τον εντοπισμό εκκρίνεται πρωτεΐνες που θα μπορούσαν να αποτελέσουν διαγνωστικούς δείκτες νέο ορό ειδικό για GCT. Πέρασε μέσα καλλιέργειας ελήφθησαν από καλλιεργημένα κύτταρα GCT από ποντίκια CPA ή από την κανονική GC από ECG-διεγείρονται οι ωοθήκες. Πρωτεΐνες από τα μέσα μαζικής ενημέρωσης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και δεκατέσσερις ζώνες πρωτεΐνης παρατηρήθηκαν σε GCT αλλά όχι σε μέσο GC υποβλήθηκαν σε ανάλυση φασματομετρία μάζας (Σχήμα 1). Αυτή η διαδικασία εντόπισε μια σειρά από πρωτεΐνες που ήταν πιο άφθονα εκκρίνεται ή αποβάλλεται από τα κύτταρα GCT σχέση με το φυσιολογικό GC (Πίνακας 1). VCL, ΕΝΟ1, αρκετές πρωτεΐνες θερμικού σοκ (HSPA8 /HSC70, οι συστατικών και επαγώγιμων ισομορφών HSP90 άλφα HSP90ab1 και HSP90aa1, και HSPA4), και VCP ήταν οι πιο σταθερά προσδιορίζονται πρωτεΐνες από το secretome GCT.

Τα δείγματα χωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE ακολουθούμενη από χρώση με άργυρο. Τα βέλη δείχνουν τα παραδείγματα των πρωτεϊνών που εκφράζονται εκλεκτικά στα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας GCT, μαζί με κατά προσέγγιση μοριακά βάρη. Ένα σύνολο 3 γελών με διαφορετικές περιεκτικότητες ακρυλαμιδίου μελετήθηκαν και 14 ζώνες (με πρωτεΐνες από 12 έως 116 kDa) υποβλήθηκαν σε ανάλυση φασματομετρία μάζας. Μόνο ένας από τους 3 γελών εμφανίζεται στην εικόνα.

Η

VCP είναι ένας δείκτης ορού για GCT και άλλων τύπων καρκίνου

επόμενο διερευνηθεί αν οι πρωτεΐνες που εκκρίνονται από GCT κύτταρα από ποντίκια CPA θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως δείκτες ορού σε ανθρώπους ασθενείς με GCT. Ανθρώπινα ομόλογα εννέα πρωτεΐνες που προσδιορίζονται στις secretome αναλύσεις (Β2Μ, CTSB, HSPA4 /HSP70, HSP90, SPARC, ΤΙΜΡ-2, VCP, VCL, και WIF-1) επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη με βάση γνωστές λειτουργίες των γονιδίων και τη διαθεσιμότητα αντισώματος. Ελήφθησαν δείγματα ορού από υγιείς εθελοντές και από ασθενείς με GCT πριν από τη θεραπεία. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα του Β2Μ, CTSB, HSP90, SPARC, ΤΙΜΡ-2, VCL ή WIF-1 παρατηρήθηκαν με ανοσοστύπωμα αναλύσεις στον ορό των ασθενών GCT σε σύγκριση με υγιή άτομα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οριακά αυξημένα επίπεδα HSP4A παρατηρήθηκαν στον ορό μερικών ασθενών GCT σε σύγκριση με φυσιολογικά άτομα, ωστόσο οι διαφορές δεν ήταν στατικά σημαντικές, και θεωρείται απίθανο να είναι κλινικά χρήσιμες (Σχήμα 2Α). επίπεδα VCP ήταν χαμηλά σε αναλύσεις ανοσοστυπώματος των δειγμάτων ορού από υγιή άτομα, αλλά ήταν σημαντικά αυξημένες στην πλειονότητα των δειγμάτων ορού από ασθενείς GCT (

P

Pten

tm1Hwu/tm1Hwu;

Amhr2

tm3(cre)Bhr/+ (CPA) διαγονιδιακά ποντίκια δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7] και διατηρήθηκαν σε C57BL /6 γενετικό υπόβαθρο. Σε αυτά τα ποντίκια, συστατική ενεργοποίηση του CTNNB1 σηματοδότηση οφείλεται στην διαγραφή του τρίτου εξονίου του

Ctnnb1

, με αποτέλεσμα την παραγωγή μιας μεταλλαγμένης πρωτεΐνης κυρίαρχη σταθερή CTNNB1 που στερείται τις θέσεις φωσφορυλίωσης που απαιτούνται για την αποδόμηση του proteosomal [ ,,,0],6]. CPA ποντίκια αναπτύσσουν GCT τοκετό και πεθαίνουν πριν από τις 8 εβδομάδων [7]. Όλες οι διαδικασίες ζώων είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Θεσμικών Ζωικά και ήταν σύμφωνη με τη πολιτική USPHS στην ανθρώπινη φροντίδα και χρήση των πειραματόζωων.

Κυτταρική καλλιέργεια

Κανονική GC απομονώθηκαν με τη χρήση της μεθόδου περιγράφεται από Ζελέζνικ Βελιγραδίου et al. [26]. Εν συντομία, ανώριμα (23-26 ημερών ηλικίας) C57BL /6 ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με 5 IU ιπποειδών χοριακή γοναδοτροπίνη (ΗΚΓ, Folligon, Intervet, Schering-Plough) για να προκαλέσει την ανάπτυξη των ωοθυλακίων. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, τα ζώα θυσιάστηκαν και οι ωοθήκες τρυπηθεί με βελόνα 25-gauge να απελευθερώσει GCs εντός του μέσου (0,9% NaCl). Το κυτταρικό εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στα 1000

g

για 5 λεπτά και επαναιωρήθηκαν GC απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε 70% συρροή σε ϋΜΕΜ /μέσου F12 (Sigma Aldrich) συμπληρωμένου με 5% FBS (Invitrogen), πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (P /S). GCT από 21 έως 25 ημερών ποντικοί CPA αποκόπηκαν, κιμάς με μια λεπίδα νυστεριού μέγεθος 10 και πέψη για 2 ώρες με 0.1% κολλαγενάση από

Clostridium histolyticum

(Sigma) σε DMEM χωρίς ορό με P /S . Τα κύτταρα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 1000

g

για 10 λεπτά και επαναιωρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS και P /S πριν από την επίστρωση σε τρυβλία κυτταρικής καλλιέργειας 100 mm (25 × 10

6 κύτταρα /δίσκο) .

Διαφορικές secretome αναλύσεις

Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επίστρωση, καλλιεργημένα κύτταρα και GC GCT πλύθηκαν με HBSS (Invitrogen) και επωάστηκαν για 24 ώρες σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και συμπυκνώθηκαν 80 φορές χρησιμοποιώντας Amicon Ultra-4 φυγοκεντρικές μονάδες ηθμού (Millipore) με ένα 3 kDa μοριακού βάρους αποκοπής. Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις ποσοτικοποιήθηκαν με τη χρήση της μεθόδου του Bradford (δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad) και 4-6 μg δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE. Μετά κηλίδωση αργύρου, πρωτεΐνες ζώνες βρέθηκαν σε GCT αλλά όχι σε δείγματα GC (n = 14) αποκόπηκαν από το πήκτωμα. Οι φέτες της πηκτής αποχρωματίζονται με 50% μεθανόλη, στη συνέχεια, μειώνεται σε 10 mM DTT επί 1 ώρα στους 56 ° C και αλκυλιώθηκε σε 55 mM χλωροακεταμίδιο για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από έκπλυση σε 50 mM διττανθρακικού αμμωνίου, τα κομμάτια του πηκτώματος συρρικνωθεί σε 100% ακετονιτρίλιο (ACN). Η πέψη διεξήχθη χρησιμοποιώντας θρυψίνη σε 50 mM διττανθρακικού αμμωνίου για 8 ώρες στους 37 ° C. Τα πεπτίδια τελικά εξάγεται σε 90% ACN /0,5 Μ ουρίας και ξηραίνεται σε κενό ταχύτητας. Τα δείγματα επαναδιαλυτοποιήθηκε σε 5% ACN με 2% μυρμηκικό οξύ (FA) και διαχωρίστηκαν σε ένα σπιτικό

18 στήλη C (150 μm χ 10 cm) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Eksigent nanoLC-2D. Μια 56-λεπτη βαθμίδα από 5-60% ACN (0,2% FA) για την έκλουση των πεπτιδίων από μία στήλη σπιτικό ανάστροφης φάσης (150 μm i.d. χ 100 mm) μ ‘ένα ρυθμό ροής ορίζεται σε 600 νανολίτρου /min. Η στήλη ήταν άμεσα συνδεδεμένο με ένα nanoprobe διασυνδεθεί με ένα φασματόμετρο μάζας LTQ-Orbitrap Βέλος (Thermo-Fisher). Κάθε πλήρες φάσμα MS ακολουθήθηκε από δώδεκα MS /MS φάσματα (δεκατρία συμβάντα σάρωσης), όπου επιλέχθηκαν οι δώδεκα πιο άφθονα ιόντα πολλαπλώς φορτισμένο για αλληλούχιση MS /MS. Πειράματα Tandem MS διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας προκαλούμενη από σύγκρουση διάσπαση στην παγίδα γραμμική ιόντων. Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας τη μηχανή αναζήτησης 2.1 μασκότ (Matrix Science) με τις παραμέτρους ανοχής ορίζεται σε 15 ppm και 0,5 Da για τον πρόδρομο και τα ιόντα κομμάτι αντίστοιχα. Τα επιλεγμένα μεταβλητά τροποποιήσεις ήταν carbamidomethyl (C), απαμίδωση (NQ), οξείδωση (Μ) και φωσφορυλίωση (STY). Η επιλεγμένη βάση δεδομένων ήταν ανθρώπινο ΙΡΙ v.3.54 βάση δεδομένων με 150.858 αλληλουχίες.

Δείγματα ορού

Τα δείγματα ορού από ασθενείς με καρκίνο του μαστού, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, του παγκρέατος ή του καρκίνου του προστάτη, ή μη-Hodgkin λέμφωμα ( n = 12 για κάθε τύπο καρκίνου) ελήφθησαν από το Οντάριο όγκου Bank. Τα δείγματα ορού από υγιείς εθελοντές (n = 7) και σε ασθενείς με GCT (n = 9) ή καρκίνωμα ωοθηκών (n = 8? 2 διαφανείς κύτταρο, 2 ορώδες, 2 βλεννώδες και 2 ενδομητριοειδές ωοθηκών) ελήφθησαν από το Réseau de Recherche du καρκίνο du Fonds de recherche Κεμπέκ – Santé. Διαδικασίες αυτές εγκρίθηκαν από την επιτροπή FRQS-RRCancer Έρευνας και το Διοικητικό Συμβούλιο του Οντάριο Cancer Research Δεοντολογίας, καθώς και την Comité d’éthique de la recherche sur les sujets humains της νοσοκομειακό κέντρο de l’Université de Montréal. ινχιμπίνης τα επίπεδα Β Inhibin Α και προσδιορίστηκαν με ELISA στο Πανεπιστήμιο της Βιρτζίνια Κέντρο για την Έρευνα στην Δοκιμασία Αναπαραγωγής Ligand και Ανάλυση Core. Οι τιμές για αναστολίνη Α και Β κάτω από το όριο ανίχνευσης (13 ng /l και 20 ng /l, αντιστοίχως) ορίστηκαν ως συνήθως. επίπεδα CA15.3 και CEA καθορίστηκαν από Les Laboratoires du Centre νοσοκομειακό de l’Université de Montréal. Τιμές κάτω του 7 μg /l και 29 kU /l για CEA και CA 15.3, αντίστοιχα, θεωρήθηκαν φυσιολογικά. επίπεδα CA125 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ δοκιμασίας ELISA και τα επίπεδα θεωρήθηκαν κανονική όταν κάτω από 35 U /ml (Abnova).

αναλύσεις ανοσοστυπώματος

Δείγματα ορού (4 μικρολίτρα δηλαδή περίπου 200 μg ) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε πηκτώματα ακρυλαμιδίου 10%. Τα πηκτώματα μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο (GE Amersham /VWR). Ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε με HSPA4- ή VCP-ειδικά αντισώματα (κλώνοι ab75977 ή ab11433 αντίστοιχα, Abcam) και συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερογενή αντισώματα (GE Amersham /VWR) και αποκάλυψε τη χρήση ECL Detection Αντιδραστήρια (GE Amersham /VWR). Ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών ζωνών διεξήχθη με πυκνομετρία αναλύσεις χρησιμοποιώντας Kodak Image Station 440CF και λογισμικό v.3.6.5 Kodak 1D (Eastman Kodak, Rochester, ΝΥ). Προκειμένου να ομαλοποιήσει τα επίπεδα VCP ή πρωτεΐνη HSPA4 μεταξύ ανοσοστυπώματα, κάθε γέλη περιείχε δύο ή τρία κοινά δείγματα ορού ως αναφορές. Η τιμή αναφοράς για VCP ορίστηκε ως ο μέσος όρος των εντάσεων ζώνης υγιή ελέγχου αναλύσεις ανοσοστυπώματος + 2SD.

Στατιστικές αναλύσεις

Η μονόδρομη ANOVA με post-test του Dunnett χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των επιπέδων VCP σε υγιείς γυναίκες και ασθενείς με καρκίνο.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Meggie Girard, Kathleen Theroux, η Jennifer Kendall-Dupont, και Manon de Ladurantaye για τεχνική βοήθεια και το Οντάριο του όγκου Τράπεζα (Jeanette Joanes ) και η Réseau de recherche du καρκίνο du Fonds de la Recherche en Santé du Québec για την παροχή οροί από ασθενείς με καρκίνο και φυσιολογικά άτομα.