Αφηρημένο

Τα επιθηλιακά μόριο κυτταρικής προσκόλλησης (EpCAM) υπερεκφράζεται σε πολλούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών και EpCAM υπερέκφραση συσχετίζεται με μειωμένη επιβίωση των ασθενών. Ήταν ο στόχος αυτής της μελέτης για να επιτευχθεί μια στοχευμένη μεθυλίωση του γονιδιακής έκφρασης EpCAM υποκινητή και σιωπή EpCAM χρησιμοποιώντας μια κατασκευασμένη πρωτεΐνη δακτύλου ψευδαργύρου που δεσμεύεται ειδικά τον προαγωγό EpCAM συγχωνευμένο με την καταλυτική περιοχή της μεθυλτρανσφεράσης Dnmt3a DNA. Δείχνουμε ότι παροδική διαμόλυνση αυτού του κατασκευάσματος αύξησε την μεθυλίωση του υποκινητή ΕρΟΑΜ σε κύτταρα SKOV3 4-8% σε μη επεξεργασμένα κύτταρα σε 30%. Έως και 48% μεθυλίωση παρατηρήθηκε σε σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν το χιμαιρικό μεθυλοτρανσφεράσης. Πειράματα ελέγχου επιβεβαίωσαν ότι η μεθυλίωση εξαρτιόταν από τη σύντηξη του δακτύλου ψευδαργύρου και των τομέων μεθυλοτρανσφεράση και ειδικά για την περιοχή στόχο. Οι σταθερές κυτταρικές σειρές με υποκινητή μεθυλιωμένη EpCAM έδειξε μια μείωση 60-80% της έκφρασης EpCAM όπως προσδιορίστηκε σε mRNA και επίπεδο πρωτεΐνης και εμφάνισαν ένα σημαντικά μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η στοχευμένη μεθυλίωση του υποκινητή EpCAM θα ​​μπορούσε να είναι μια προσέγγιση στην θεραπεία του EpCAM καρκίνων που υπερεκφράζουν

Παράθεση:. Nunna S, Reinhardt R, Ragozin S, Jeltsch Α (2014) Targeted Μεθυλίωση του επιθηλιακού κυττάρου μόριο προσκόλλησης (EpCAM) Ανάδοχος να φιμώσουν την έκφρασή της στην ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (1): e87703. doi: 10.1371 /journal.pone.0087703

Επιμέλεια: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, Γαλλία

Ελήφθη: 29 Οκτωβρίου 2013? Αποδεκτές: 1η Ιανουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 29 του Γενάρη του 2014

Copyright: © 2014 Nunna et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει υποστηριχθεί από το Ίδρυμα Sander και την DAAD (Deutscher Akademischer Austauschdienst). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος που συμβαίνουν στην περιτοναϊκή κοιλότητα των ωοθηκών είναι η έβδομη πιο κοινός καρκίνος στις γυναίκες και δεύτερη κύρια αιτία θανάτου παγκοσμίως ανάμεσα γυναικολογικών καρκίνων [1] – [3]. Στις περισσότερες γυναίκες, ο καρκίνος των ωοθηκών είναι δύσκολο να αντιμετωπιστεί με ένα ρυθμό πενταετούς επιβίωσης της τάξης του 20% σε καρκίνους διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο [4] – [6]. Με βάση την πλατίνα ανάλογα όπως σισπλατίνη ή η καρβοπλατίνη είναι οι κύριοι παράγοντες τυπική χημειοθεραπεία για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών σε αρχικά στάδια [7]. Ωστόσο, η χρήση τους εμποδίζεται από την επίκτητο ή ενδογενή αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στο φάρμακο [8]. Παρά την αυξημένη κατανόηση στην αιτιολογία του καρκίνου των ωοθηκών έχει υπάρξει μικρή αλλαγή στην επιβίωση των ασθενών κατά τη διάρκεια των τελευταίων 30 ετών, επειδή κατά τα πρώτα στάδια του καρκίνου των ωοθηκών είναι ασυμπτωματική και δεν υπάρχουν αποτελεσματικές όγκου ειδική και ευαίσθητη δείκτες για την παρακολούθηση των επιθηλιακών καρκίνο των ωοθηκών [9]. Έτσι, υπάρχει άμεση ανάγκη για νέες στρατηγικές για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών

Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα εμφανίζουν υπερέκφραση των επιθηλιακών μόριο κυτταρικής προσκόλλησης (EpCAM), σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα των ωοθηκών [10] -. [14 ]. EpCAM (NCBI αλληλουχία αναφοράς NM_002354.2? Ονομάζεται επίσης GA733, KSA, αντιγόνο 17-1Α, ή CD326) είναι ένας 40 kDa γλυκοπρωτεΐνη επιφανείας των επιθηλιακών κυττάρων που μεσολαβεί Ca

2+ ανεξάρτητη προσκόλληση ομοφιλική κυττάρου-κυττάρου [10], [ ,,,0],15], [16]. Το επιθήλιο των υγιών ατόμων εκφράζει EpCAM, με την εξαίρεση των πλακώδες επιθήλιο και συγκεκριμένων επιθηλιακών κυττάρων των ενήλικων ηπατοκυττάρων και τα κερατινοκύτταρα [17]. EpCAM υπερεκφράζεται σε διάφορους βαθμούς σε πολυάριθμες ανθρώπινα καρκινώματα [18], [19], ο καρκίνος-κύτταρα έναρξης, και προγονικά και φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων [20]. Έχει πρόσφατα δειχθεί ότι ρυθμίζει προς τα πάνω EpCAM

c-myc, κυκλίνη Α

και

E

και επηρεάζει τον κυτταρικό κύκλο και ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [21]. Επιπλέον, συμμετέχει στο πυρηνικό μονοπάτι Wnt σηματοδότησης που επίσης προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την καρκινογένεση [20].

Αν και ο ακριβής ρόλος του EpCAM είναι αόριστη στην πρόοδο του καρκίνου των ωοθηκών, η EpCAM έκφραση πάνω συσχετίζεται σημαντικά με την μειώθηκε το ποσοστό επιβίωσης σε ασθενείς με σταδίου III /IV της νόσου και υπερέκφραση του EpCAM στον καρκίνο του μαστού και της χοληδόχου κύστης έχει μια ισχυρή συσχέτιση με κακή πρόγνωση [22] – [24]. Τα αντισώματα αντι-ΕρΟΑΜ χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο αίμα των ασθενών με καρκίνο, και για την παροχή προγνωστικές πληροφορίες που να επιτρέπει τη θεραπεία των ασθενών [25]. Επιπλέον, η άμεση σύνδεση της EpCAM με την εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών προτείνεται ότι μπορεί να χρησιμεύσει ως δυνητικός θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών και διαφορετικές προσεγγίσεις έχουν τεκμηριωθεί για στόχευση EpCAM [26], [27]. αντισώματα EpCAM όπως MT201 εξαλείψει αποτελεσματικά τα καρκινικά κύτταρα από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών [28]. Για παράδειγμα, Το catumaxomab έχει εγκριθεί για τη θεραπεία του κακοήθους ασκίτη και έχει χρησιμοποιηθεί για επιθηλιακούς καρκίνους ωοθηκών και μη ωοθηκών [29] – [31]. Παρά το γεγονός ότι, αντι-ΕρΟΑΜ μονοκλωνικά αντισώματα παρέχουν προστασία έναντι του καρκίνου [32], [33], η εξαρτώμενη από αντίσωμα κυτταροτοξικότητα στηρίζεται στην CH2 τομέα του αντισώματος που διαφέρει σημαντικά από παρτίδα σε παρτίδα κατά τη διάρκεια της παραγωγής αντισωμάτων [34]. Επιπλέον, τα αντισώματα αντι-ΕρΟΑΜ απέτυχαν να παρέχουν οποιαδήποτε κλινική προστασία έναντι ορθοκολικού καρκίνου του προστάτη και λόγω του μεγάλου μεγέθους του αντισώματος το οποίο περιορίζει τη διανομή και την παράδοση [34] – [36]. Ως εκ τούτου, είναι καλύτερα και πιο γενικές στρατηγικές για την στοχευμένη καταστολή του EpCAM απαιτείται.

Ως εναλλακτική προσέγγιση, το ογκογόνο λειτουργία της EpCAM ανεστάλη με τη μείωση της έκφρασης του γονιδίου της. Μία μέθοδος για να επιτευχθεί αυτό ήταν η εφαρμογή του αντινοηματικού RNA το οποίο έχει οδηγήσει σε μια ισχυρή μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και του μεταβολισμού σε ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος [21]. Σε μια παρόμοια προσέγγιση, siRNA μεσολαβεί αποσιώπηση της έκφρασης EpCAM μειώνεται έντονα την κυτταρική μετανάστευση και επεμβατική δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του μαστού [23]. EpCAM έκφραση ήταν επίσης σιγήσει από την έκφραση μιας πρωτεΐνης δακτύλου ψευδαργύρου το οποίο συνδέεται με τον υποκινητή EpCAM [37] και μια σύντηξη ενός EpCAM στόχευσης ψευδαργύρου πεδίο δακτύλου με έναν τομέα καταστολέα [38]. Ωστόσο, όλες αυτές οι προσεγγίσεις δεν οδήγησαν σε μια επίμονη κάτω ρύθμιση η οποία ενίσχυσε τις προσπάθειες να συνδεθεί το γονίδιο καταστολής με επιγενετικές σημάτων, όπως μεθυλίωση του DNA. Μεθυλίωσης του DNA διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στην επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης [39] – [42]. Στα θηλαστικά, η μεθυλίωση του DNA λαμβάνει χώρα σε θέση C5 της κυτοσίνης κυρίως στο πλαίσιο των CpG δινουκλεοτιδίων. Οι πλούσιες περιοχές CpG ονομάζονται νησίδες CpG και συχνά εμφανίζονται σε περιοχές του γονιδίου υποκινητή [43]. Ο υποκινητής EpCAM περιέχει ένα νησί CpG, η μεθυλίωση των οποίων συσχετίζεται αντιστρόφως με EpCAM έκφραση, προσβολή όγκου και της προόδου σε διάφορους τύπους καρκίνου [13], [44]. Προς στήριξη αυτής της έννοιας, θα μπορούσε να αποδειχθεί ότι η μεθυλίωση του DNA εισάγεται στην υποκινητή σε ένα μη-κατευθυνόμενο τρόπο οδήγησε προς τα κάτω ρύθμιση του γονιδίου EpCAM [45].

Είναι σαφές ότι, για να μειώσει τις παρενέργειες μιας επιγενετικής γονιδιακής αποσιώπησης θεραπείας, μια στοχευμένη παράδοση φίμωση επιγενετικών σημάτων, όπως απαιτείται μεθυλίωσης του DNA. Αυτό απαιτεί την σύζευξη ενός καταλυτικού χαρακτηριστική ομάδα η οποία παρέχει το σήμα αποσιώπηση με ένα τμήμα στόχευσης, το οποίο εξασφαλίζει την ειδική σύνδεση του καταλυτικού φορέα σε ένα καθορισμένο γενωμικού στόχου [46] – [48] (Σχ. 1). Διαφορετικές μοριακές οντότητες είναι σε χρήση για την λειτουργία στόχευσης ειδική αλληλουχία, συμπεριλαμβανομένης της σύντηξης του τμήματος ϋΝΑ μεθυλτρανσφεράση σε ολιγονουκλεοτίδιο triplex σχηματισμού [49], σύντηξη με γενετική μηχανική πρωτεϊνών δακτύλου ψευδαργύρου (βλέπε παρακάτω), TAL τελεστές [50], [51] και στα μελλοντικά συστήματα δυνητικά μηχανικής CRISPR /CAS [52]. Από δακτύλους ψευδαργύρου ήταν τα πρώτα δομοστοιχεία πρωτεΐνη για την οποία έγινε δυνατή σχεδιασμό ειδικής αλληλουχίας δέσμευσης του DNA [53] – [58], οι αρχικές μελέτες στοχευμένες μεθυλίωσης επικαλείται τεχνητή πρωτεΐνες ψευδαργύρου-δακτύλου με τη συσκευή [59] στόχευσης. Ακολουθώντας την προσέγγιση αυτή, η καταστολή των ιικών γονιδίων [60], τα κάτω ρύθμιση Maspin και SOX2 [61] και την καταστολή του γονιδίου VEGFA [62] έχει επιτευχθεί σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Στην παρούσα εργασία, έχουμε συντήκονται μία πρωτεΐνη δακτύλου ψευδαργύρου που στοχεύει τον υποκινητή EpCAM [37] με την μεθυλτρανσφεράση DNA 3α (Dnmt3a) καταλυτική περιοχή, προκειμένου να μεθυλίωση του υποκινητή EpCAM, η οποία στη συνέχεια θα πρέπει να οδηγήσει σε EpCAM σίγηση. Χρησιμοποιήσαμε κύτταρα SKOV3 τα οποία προέρχονται από ανθρώπινα θηλυκά κύτταρα αδενοκαρκινώματος και έχουν χρησιμοποιηθεί ως μοντέλο για τον καρκίνο των ωοθηκών [45]. Δείχνουμε ότι η στοχευμένη μεθυλίωση του υποκινητή οδηγεί σε μείωση της γονιδιακής έκφρασης EpCAM, υποστηρίζοντας περαιτέρω την άποψη ότι η στοχευμένη μεθυλίωση του DNA είναι μια γενική προσέγγιση για τη γονιδιακή αποσιώπηση. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η φίμωση του EpCAM οδηγεί σε μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων SKOV3.

Η μπλε γραμμή αντιπροσωπεύει την θέση πρόσδεσης ZF, κενές γλειφιτζούρια αντιπροσωπεύουν μη μεθυλιωμένα CpGs και συμπληρώθηκε γλειφιτζούρια αντιπροσωπεύουν μεθυλιωμένο CpGs.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας, τη διαμόλυνση και τον εμπλουτισμό των διαμόλυνσης

SKOV3 ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών ελήφθησαν από την ATCC (Αμερικανική συλλογή Τύπων καλλιέργειας). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ΡΑΑ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 2 mM L-γλουταμίνη (ΡΑΑ). Για παροδική επιμόλυνση, 3.5 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε φιάλες Τ25 και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν μετά από μία ημέρα με 12 μΙ αντιδραστηρίου διαμόλυνσης FuGENE HD (Promega) και 6 μg τριών πλασμιδικών DNA τα οποία εκφράζουν ένα το άλλο δάκτυλο ψευδαργύρου κατασκευάσματα σύντηξης που χρησιμοποιούνται σε αυτή την εργασία, το δείκτη LNGFR, και GFP σε αναλογία 10:2.5:1 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [62]. Τα επιμολυσμένα κύτταρα εμπλουτίστηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα MACSelect ™ LNGFR (Miltenyi Biotec) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, όταν τα κύτταρα συν-επιμολύνονται με το μόριο LNGFR, εκφράζεται στην κυτταρική επιφάνεια. Μετά από τέσσερις ημέρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με μαγνητικά σφαιρίδια συζευγμένα με αντίσωμα αντι-LNGFR επί 15 λεπτά στους 4 ° C. Τα επιμολυσμένα κύτταρα πέρασαν μέσω στήλης διαχωρισμού MACS τοποθετούνται σε ένα διαχωριστή MACS και πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό ΡΒΕ (φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα με 0.5% αλβουμίνη βόειου ορού και 5 mM EDTA) για να πλύνει τα μη επιμολυσμένα κύτταρα. Μετά την έκπλυση, μόνο τα επιμολυσμένα κύτταρα που δεσμεύονται από μαγνητικά σφαιρίδια συγκρατείται στη στήλη και τα εμπλουτισμένα κύτταρα εκλούσθηκαν σε ΡΒΕ και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση μεθυλίωσης.

Για σταθερή παραγωγή κυτταρικής γραμμής, 2 × 10

5 κυττάρων σπάρθηκαν ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων, και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 6 μΙ αντιδραστηρίου διαμόλυνσης FuGENE HD και 2 μg του EpCAM ZF-Dnmt3aCD πλασμιδιακό DNA. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο που περιείχε 800 ng /ml G418 για έξι εβδομάδες. Τα μονοκλωνικά αποικίες ελήφθησαν και περαιτέρω στην παρουσία του G418 περιέχει μέσο και δύο από τις σταθερές κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα.

ανάλυση μεθυλίωσης του γονιδίου μεθυλίωσης EpCAM υποκινητή και μη στοχευόμενων

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας QIAamp® DNA μίνι κιτ (Qiagen) και διθειώδους μετατροπή διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [63]. Εν συντομία 400 ng γονιδιωματικού DNA υποβλήθηκε σε πέψη με το περιοριστικό ένζυμο SphI όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Μετατροπή διθειώδους διεξήχθη υπό την παρουσία ΝαΟΗ και όξινο θειώδες νάτριο χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συνθήκες: 15 λεπτά επώαση στους 99 ° C, 30 λεπτά στους 50 ° C, 5 λεπτά στους 99 ° C, 1,5 ώρες στους 50 ° C, 5 min στους 99 ° C και 1,5 ώρα στους 50 ° C. Κατά τη διάρκεια της επώασης με όξινο θειώδες, μη μεθυλιωμένη κυτοσίνη μετατρέπεται σε ουρακίλη, αλλά μεθυλιωμένα κυτοσίνες παραμένουν αμετάβλητες. Στη συνέχεια, το DNA συμπυκνώθηκε και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας Amicon ultra φυγοκεντρικές φίλτρα (Millipore) και ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές διθειώδους. Η ουρακίλη ενισχύεται η θυμίνη σε αυτήν την αντίδραση. Το PCR προϊόν υποκλωνοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ κλωνοποίησης StrataClone PCR και μεμονωμένοι κλώνοι αλληλουχήθηκαν. Για την ανάλυση κατάσταση μεθυλίωσης του, 220 bp του υποκινητή EpCAM περιέχει 16 CpGs ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές (Για: 5′-CTT ΤΤΤ AAG GTT ΤΤΑ GAG TAG-3 ‘και Rev: 5’-ΑΑΑ ΑΑΑ ΤΑΑ ΑΤΑ AAC TCC CCT CCC -3 ‘). Για γονίδιο μεθυλίωσης-μη στόχους, τέσσερα αμπλικόνια από γονίδια (KIAA0179, DSCR3, Sumo3 και WRB, αντίστοιχα) αναλύθηκαν? οι αλληλουχίες όλων των αμπλικονίων και μια λίστα των εκκινητών που χρησιμοποιούνται παρέχονται στο Συμπληρωματικές πληροφορίες S1. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Bisma [64].

RT qPCR ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε από σταθερές κυτταρικές σειρές και τα κύτταρα ελέγχου SKOV3, χρησιμοποιώντας Purelink ™ RNA μίνι κιτ (Ambion). Ένα σύνολο 1,0 μg RNA μετατράπηκε σε συμπληρωματικό DNA χρησιμοποιώντας Μ-ΜυΙ_ν ανάστροφης μεταγραφάσης (ΝΕΒ) με ολίγο dT εναρκτήρες. Q-RT PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ™ σύστημα Real-Time CFXConnect (Bio-Rad). επίπεδα έκφρασης EpCAM μεταγραφής ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας SsoFast ™ EvaGreen® Supermix (Bio-Rad) και ειδικούς εκκινητές EpCAM (για: 5′-GAACAATGATGGGCTTTATG-3 ‘, rev: 5′-TGAGAATTCAGGTGCTTTTT-3′) με τη χρήση βήτα ακτίνης ως εσωτερικός έλεγχος (για : 5’-TCACCAACTGGGACGACATG-3 ‘, rev: 5′-ACCGGAGTCCATCACGATG-3’). Η σχετική ποσότητα μεταγραφής μετρήθηκε με ενίσχυση κύκλος κατωφλίου (C

T), η οποία συσχετίζεται αντίστροφα με την ποσότητα του RNA παρούσα. Η φορές αλλαγή στην EpCAM RNA υπολογίστηκε με τη μέθοδο της ΔΔCt. Οι τιμές Ct προσδιορίζονται ως μέσος όρος των τριπλών και το πείραμα διεξήχθη σε δύο τεχνικές επαναλήψεις.

κηλίδωση Western

Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από σταθερές κυτταρικές σειρές και τα κύτταρα ελέγχου SKOV3 χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ40 και 1 mM PMSF), και η συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε ποσοτικά με BCA ™ κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Thermo Scientific). Τέσσερα μα συνολικής πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη αποκλείστηκε επί μία νύκτα με επώαση με 4% λευκωματίνη βόειου ορού σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, και ανιχνεύθηκαν με αντι-ανθρώπινη IgG κουνελιού EpCAM σε 1:4000 αραίωσης (Abcam Ab71916), ακολουθούμενη από ραφανιδική υπεροξειδάση συζευγμένη κατσίκας αντι-κουνελιού IgG σε 1: 4000 αραίωση (GE Healthcare). Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια western αποτύπωση λύση (Thermo Scientific), και οι εικόνες συλλήφθηκαν στις ταινίες X-ray, σαρώνονται και ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού J Image.

δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού (δοκιμασία CCK8)

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του κιτ-8 (CCK8) δοκιμασία καταμέτρησης κυττάρων (Dojindo) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, κύτταρα SKOV3 ή σταθερές κυτταρικές σειρές CD1 και CD2 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1,5 × 10

4 κύτταρα σε 200 μΙ μέσου σε μια πλάκα καλλιέργειας 96 φρεατίων κυττάρων και αναπτύχθηκαν για τρεις ημέρες σε ϋΜΕΜ με 10% FCS στους 37 ° C με 5% CO

2. Μετά από τρεις ημέρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΙ του αντιδραστηρίου CCK8 ανά φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες στο CO

2 θερμοκοιτίδα. Στη συνέχεια, 100 μΙ υπερκειμένου από κάθε φρεάτιο μεταφέρθηκαν σε φρέσκες πλάκες των 96 φρεατίων και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο. Το αντιδραστήριο περιέχει CCK8 WST-8 [2- (2-μεθοξυ-4-νιτροφαινυλ) -3- (4-νιτροφαινυλ) -5- (2,4-δισουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο, μονονάτριο άλας] διαλύεται σε νερό και κυτταρική μέσο καλλιέργειας, το οποίο μπορεί να εισέλθει στο κύτταρο, όπου μειώνεται κατά αφυδρογονάσες να δώσει ένα πορτοκαλί χρωματισμένο προϊόν φορμαζάνης. Η ποσότητα φορμαζάνης που σχηματίζεται είναι ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων.

Μέτρηση των κυττάρων

δοκιμασία

κύτταρα SKOV3 ή σταθερές κυτταρικές σειρές CD1 και CD2 σπάρθηκαν σε ένα πιάτο έξι κυτταρικής καλλιέργειας σε ένα καλά πυκνότητα 2 × 10

5cells ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για τέσσερις ημέρες σε ϋΜΕΜ με 10% FCS στους 37 ° C με 5% CO

2. Μετά από τέσσερις ημέρες, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, σε επεξεργασία με θρυψίνη και συλλέχθηκαν ξεχωριστά και ένα ενιαίο εναιώρημα κυττάρων παρασκευάστηκε. Τα κύτταρα αραιώθηκαν σε Trypan μπλε κηλίδα 0,4% (Gibco) σε αναλογία 1:01 και το συνολικό αριθμό των βιώσιμων κυττάρων σε κάθε φρεάτιο απαριθμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο καταμέτρησης Neubauer ή αιμοκυτταρόμετρο. Ζωντανά κύτταρα μπορούν να διαφοροποιηθούν από τα νεκρά κύτταρα, γιατί τα νεκρά κύτταρα καταλαμβάνουν τη βαφή και λεκέ σκούρο μπλε, ενώ οι μεμβράνες των ζωντανών κυττάρων είναι άθικτα και να αποτρέψει την πρόσληψη της χρωστικής.

Αποτελέσματα

Στοχευμένες DNA μεθυλίωση του υποκινητή ΕρΟΑΜ στον καρκίνο των ωοθηκών SKOV3 κύτταρα

ήταν ο στόχος αυτής της μελέτης για να επιτευχθεί μια στοχευμένη μεθυλίωση του EpCAM έκφραση προαγωγό και γονίδιο EpCAM σιωπή. Έχουμε χρησιμοποιήσει μια πρωτεΐνη δακτύλου μηχανικής ψευδαργύρου που δεσμεύεται ειδικά τον προαγωγό EpCAM [37] και συντήκονται με την καταλυτική περιοχή της μεθυλτρανσφεράσης Dnmt3a DNA (Dnmt3aCD), η οποία έχει προηγουμένως χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για να εισαγάγει στοχευμένη DNA μεθυλίωση [60], [62 ]. Για την ειδική μεθυλίωση στόχο, SKOV3 καρκινικά κύτταρα, τα οποία έχουν ένα μη-μεθυλιωμένο υποκινητή EpCAM έκφραση και δραστική EpCAM [11], επιμολύνθηκαν παροδικά με το χιμαιρικό δάκτυλο ψευδαργύρου – Dnmt3a καταλυτική περιοχή (ZF-Dnmt3aCD) κατασκευάσματα. Μετά από τέσσερις ημέρες τα επιμολυσμένα κύτταρα εμπλουτίζονται με επιλογή MACS και την κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή EpCAM (Εικ. 2) αναλύθηκε με διθειώδες μετατροπή και αλληλούχιση των μεμονωμένων κλώνων. Σε δύο ανεξάρτητα πειράματα, μη επιμολυσμένα κύτταρα SKOV3 έδειξε ένα βασικό επίπεδο 4-8% μεθυλίωσης του DNA. Ωστόσο, η μεθυλίωση αυξήθηκε σε 29% (± 4%) σε ZF-Dnmt3aCD επιμολυσμένα κύτταρα σε δύο ανεξάρτητα πειράματα (Σχ. 3). Σημαντικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι τα επίπεδα μεθυλίωσης του & gt? 80% θα μπορούσε να επιτευχθεί σε κάποιες συγκεκριμένες θέσεις CpG της περιοχής στόχου, όπως και οι θέσεις 14-16. Ο υποκινητής EpCAM έδειξε βασικό επίπεδο μεθυλίωσης σε κύτταρα SKOV3 που διαμολύνθηκαν με φορείς ελέγχου, είτε τον έλεγχο φορέα μόνο, δακτύλου ψευδαργύρου χωρίς Dnmt3aCD ή Dnmt3aCD χωρίς δακτύλου ψευδαργύρου, αντίστοιχα (Εικ. 3). Το εύρημα ότι η έκφραση της άστοχα καταλυτικής περιοχής Dnmt3a δεν οδήγησε σε μεγάλη αύξηση της μεθυλίωσης του DNA στο υποστηρικτής EpCAM είναι σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις σε άλλο τόπο του στόχου [62].

Το γονίδιο εμφανίζεται με μπλε χρώμα , το νησί της CpG σε πράσινο και το αμπλικόνιο σε μαύρο χρώμα. Η ακολουθία αμπλικόνιο δίνεται παρακάτω, η αλληλουχία δέσμευσης ιστοσελίδα ZF είναι σκιασμένη με κόκκινο χρώμα. Αυτή η εικόνα δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας Σάντα Κρουζ πρόγραμμα περιήγησης στο γονιδίωμα (https://genome.ucsc.edu/) [66]

Η

Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες συντομογραφίες:. SKOV3 κυττάρων, τα μη επεξεργασμένα κύτταρα? ZF, κύτταρα SKOV3 επιμολυσμένα με το κατασκεύασμα δακτύλου ψευδαργύρου, ZF-Dnmt3aCD, κύτταρα επιμολυσμένα με το δάκτυλο ψευδαργύρου Dnmt3a κατασκεύασμα καταλυτική περιοχή? VEC cntrl, κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα? Dnmt3aCD, κύτταρα επιμολυσμένα με ένα κατασκεύασμα Dnmt3aCD χωρίς δάκτυλο ψευδαργύρου? CD1, σταθερή κυτταρική γραμμή που εκφράζει ZF-Dnmt3aCD 1? CD2, σταθερή κυτταρική γραμμή που εκφράζει ZF-Dnmt3aCD 2. Οι οριζόντιες γραμμές δείχνουν τις CpGs στην amplicon αναλύονται και οι κάθετες γραμμές αντιπροσωπεύουν μεμονωμένους κλώνους που αναλύθηκαν κατά την αλληλουχία. Οι μπλε και κόκκινα χρώματα αντιπροσωπεύουν μη μεθυλιωμένα CpG και μεθυλιωμένα CpG, αντίστοιχα, για την λευκού χρώματος περιοχές, η κατάσταση μεθυλίωσης είναι άγνωστη για τεχνικούς λόγους.

Η

Από τη στιγμή που διεξήγαγε τις πειράματα μεθυλίωσης σε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα μετά από MACS επιλογής, ένα φόντο από μη επιμολυσμένα κύτταρα ήταν ακόμη παρούσα, η οποία εκτιμάται να είναι στην περιοχή του 20% με βάση την μικροσκοπική παρατήρηση. Για να ληφθεί ένα δείγμα ομογενές κύτταρο, στο οποίο όλα τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το χιμαιρικό μεθυλτρανσφεράση, δημιουργήσαμε δύο ανεξάρτητες σταθερές κυτταρικές σειρές (που ονομάζεται CD1 και CD2), τα οποία εκφράζουν το δάκτυλο ψευδαργύρου Dnmt3aCD χιμαιρικό μεθυλοτρανσφεράσης. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από δύο κυτταρικές σειρές και η κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή EpCAM αναλύθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα επίπεδα μεθυλίωσης του υποκινητή EpCAM αυξήθηκαν σε 46% στη σταθερή κυτταρική σειρά CD1 και 48% σε CD2 (Εικ. 3).

Off-στόχο γονίδιο μεθυλίωσης

Για να αναλύσει μεθυλίωση σε άλλα loci που μπορεί να συνοδεύει στοχευμένες μεθυλίωση μας, διερευνήσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης του τέσσερα επιπλέον γονίδια που δεν αποτελούν στόχο (KIAA0179, DSCR3, Sumo3 και WRB) όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Τα κύτταρα SKOV3 παρουσίασαν μεθυλίωση του 1%, 1%, 17% και 2% αντίστοιχα, στις τέσσερις αμπλικόνια (Σχ. 4 και [62]). κύτταρα SKOV3 παροδικά επιμολυσμένα με ZF-Dnmt3aCD έδειξε επίπεδα μεθυλίωσης του 1%, 1%, 22%, και 1%, το οποίο είναι σχεδόν πανομοιότυπα με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα SKOV3 (Εικ. 4). Οι σταθερές κυτταρικές σειρές CD1 και CD2 έδειξε επίσης προτύπων μεθυλίωσης πολύ παρόμοια με τα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 4). Αν και τα αποτελέσματα αυτά δεν αποκλείουν συμπληρωματικές μεθυλίωσης που συμβαίνουν σε κάποια επιμέρους τόπους, δείχνουν ότι η μεθυλίωση του υποκινητή EpCAM δεν συνοδεύεται από μια μαζική, απροσδιόριστα και γονιδιώματος σε επίπεδο μεθυλίωσης του DNA, που δείχνει ότι η στόχευση ήταν τουλάχιστον εν μέρει επιτυχής.

η μεθυλίωση των τεσσάρων γονιδίων-μη στόχους αναλύθηκε (KIAA0179, DSCR3, Sumo3 και WRB). παρουσίαση των δεδομένων είναι όπως στο Σχ. 3. Οι αλληλουχίες των περιοχών που αναλύθηκαν εδώ δίνεται στην Συμπληρωματικές πληροφορίες S1.

Η

EpCAM έκφραση καταστέλλεται από στοχευμένες DNA μεθυλίωση του γονιδίου EpCAM υποστηρικτής

Για να προσδιορίσετε εάν η μεθυλίωση προαγωγού οδήγησε σε μεταγραφική σίγηση της γονιδιακής έκφρασης EpCAM, ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα SKOV3 και τις σταθερές κυτταρικές σειρές CD1 και CD2 και προσδιορίσθηκαν με ποσοτική RT-PCR τα επίπεδα EpCAM mRNA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α και Β, παρατηρήσαμε μια μείωση του EpCAM έκφραση του 80% σε σταθερή κυτταρική σειρά CD1 και 60% σε σταθερή κυτταρική γραμμή CD2. Η καταστολή EpCAM από στοχευμένες μεθυλίωση του DNA επιβεβαιώθηκε στο επίπεδο πρωτεΐνης με κηλίδωση Western, όπου παρατηρείται αντίστοιχη μείωση της έκφρασης EpCAM στις σταθερές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τα κύτταρα SKOV3 (Εικ. 5C και D).

) Παράδειγμα της ανάλυσης RT qPCR του EpCAM (αριστερά) και βήτα ακτίνης (δεξιά) mRNA ανέρχεται σε κύτταρα SKOV3 και σε δύο ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές οι οποίες εκφράζουν σταθερά το ZF-Dnmt3a κατασκεύασμα (CD1 και CD2). Β) Ποσοτικοποίηση της ανάλυσης RT qPCR έκφρασης EpCAM όπως φαίνεται στον πίνακα Α Πραγματοποιήσαμε δύο ανεξάρτητων παρασκευασμάτων RNA κάθε αναλύεται σε τρεις τεχνικές επαναλήψεις. Η εικόνα δείχνει ο μέσος όρος των δύο αποτελεσμάτων, οι ράβδοι σφάλματος υποδεικνύουν το τυπικό σφάλμα. C) Παράδειγμα ανάλυσης στυπώματος Western της έκφρασης EpCAM στα κύτταρα SKOV3 και τις σταθερές κυτταρικές σειρές CD1 και CD2 (άνω πάνελ). Βήτα ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης (κάτω πάνελ). Οι ζώνες ακτίνης EpCAM και βήτα σημειώνονται με βέλη. Δ) Ποσοτικοποίηση της ανάλυσης Western Blot της έκφρασης EpCAM όπως φαίνεται στο πίνακα C. Η εικόνα δείχνει κατά μέσο όρο δύο ανεξάρτητων πειραμάτων, οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση των δεδομένων.

Η

Μειωμένη έκφραση EpCAM συνεργάτες με μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

Για να διερευνηθεί αν η μειωμένη έκφραση EpCAM επηρεάζεται ο πολλαπλασιασμός των SKOV3 κυττάρων, ένας ίσος αριθμός μη επεξεργασμένα κύτταρα καθώς και κύτταρα CD1 και CD2 σπάρθηκαν και μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρου διεξήχθη μετά τρεις μέρες. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το αντιδραστήριο CCK8 διαλύθηκε σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας και επωάστηκαν για 4 ώρες στον επωαστήρα. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, το αντιδραστήριο μπορεί να διαχυθεί μέσα στα κύτταρα, όπου μειώνεται κατά την κυτταρική αφυδρογονάσες για να παραχθεί ένα πορτοκαλί χρωματισμένο προϊόν φορμαζάνης, η οποία μπορεί να ανιχνευθεί με απορρόφηση στα 450 nm. Δεδομένου ότι το ποσό της φορμαζάνης είναι ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων, η δοκιμασία αυτή επιτρέπει την εύκολη εκτίμηση του αριθμού των ζωντανών κυττάρων στο δείγμα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, υπήρξε 60% μείωση των ζωντανών κυττάρων σε CD1 και 40% σε CD2 σε σύγκριση με τον έλεγχο SKOV3 κυττάρων, η οποία είναι σε πολύ καλή συσχέτιση με την μείωση της έκφρασης EpCAM σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Για την επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων, πραγματοποιήσαμε επίσης βιώσιμων κυττάρων μετρώντας χρησιμοποιώντας Trypan blue, όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Για το σκοπό αυτό σπάρθηκαν ένας ίσος αριθμός κυττάρων και επωάζονται για τέσσερις ημέρες. Στη συνέχεια, μετρήθηκαν ο συνολικός αριθμός των βιώσιμων κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Β, τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν την δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων, επειδή δεν υπήρχε μια μείωση περίπου 50% στον αριθμό των ζωντανών κυττάρων σε CD1 και περίπου 40% σε CD2. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του EpCAM οδηγεί σε σημαντική μείωση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού των SKOV3 κυττάρων in vitro.

Α) Αποτελέσματα από προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων CCK8 που ακολουθείται με τις σταθερές κυτταρικές σειρές CD1 και CD2 και τα κύτταρα SKOV3 ως αναφορά. Τα αποτελέσματα που απεικονίζονται είναι από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα και οι ράβδοι σφάλματος υποδεικνύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. Β) βιώσιμων κυττάρων καταμέτρηση πραγματοποιείται από κυανή χρώση Trypan. Το γράφημα αντιπροσωπεύει τα δεδομένα από δύο ανεξάρτητα πειράματα και οι ράβδοι σφάλματος υποδεικνύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

Συζήτηση

Στοχευμένες μεθυλίωσης του DNA με σύντηξη ενός τομέα μεθυλτρανσφεράσης DNA (εδώ η καταλυτική περιοχή Dnmt3a) και μια συσκευή στόχευσης (εδώ ένα σχεδιασμένο δάκτυλο ψευδαργύρου) είναι μια ελκυστική προσέγγιση για τη γονιδιακή σίγηση [46] – [48]. Υπάρχουν ορισμένα προηγούμενα παραδείγματα της επιτυχούς εφαρμογής αυτής της μεθόδου για την επίτευξη γονιδιακής σίγησης σε ανθρώπινα κύτταρα [60] – [62]. Εδώ, έχουμε αποδείξει την στοχευμένη μεθυλίωση και γονιδιακή σίγηση του γονιδίου EpCAM, το οποίο είναι ένα πολλά υποσχόμενο στόχο στη θεραπεία όγκου. Δείχνουμε απουσία αποτελεσμάτων off-στόχο σε όλες τις θέσεις που επιθεωρήθηκαν για αυτό, το οποίο δείχνει ότι η στόχευση ήταν (τουλάχιστον εν μέρει) με επιτυχία. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την ιδέα, που στοχεύουν μεθυλίωση και γονιδιακή αποσιώπηση είναι μια καθολική προσέγγιση με ευρεία εφαρμογή. Επιπλέον, έχουμε αποδείξει ότι η αποσιώπηση της έκφρασης EpCAM οδηγεί σε μείωση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυττάρων SKOV3.

Σε μια πρόσφατη εργασία, der Gun et al. (2013) ανέφεραν ένα περίπου διπλάσιο αποσιώπηση της EpCAM μετά την έκφραση ενός δακτύλου ψευδαργύρου λιωμένο καταστολέας Kruppel που σχετίζονται με το πλαίσιο (SKD) τομέα, το οποίο παραδόθηκε με ένα φορέα ρετροϊού [38]. Είναι ενδιαφέρον, αυτό οδήγησε σε μείωση του πολλαπλασιασμού σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, αλλά όχι σε κύτταρα SKOV3. Παρομοίως, ένα RNAi βασισμένη αποσιώπηση του EpCAM στα κύτταρα SKOV3 δεν μειώνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αυτό το έργο. Αυτά τα αποτελέσματα με τα κύτταρα SKOV3 δεν είναι σε συμφωνία με τα δεδομένα μας, αλλά υπάρχουν σημαντικές διαφορές στη ρύθμιση και των δύο μελετών. Πρώτα απ ‘όλα, van der Gun et al. (2013) χρησιμοποίησαν ένα πεδίο καταστολής, ενώ απασχολούσε μεθυλίωσης του DNA με τη μεσολάβηση επιγενετικές μηχανισμό αποσιώπηση. Στην πραγματικότητα, EpCAM αποσιώπηση ήταν ελαφρώς ισχυρότερη στο setup μας, 60-80% σε κυτταρικές σειρές που μας έναντι του 50% που παρατηρήθηκε από τον van der Gun et al. (2013), η οποία μπορεί να επηρεάσει τα αποτελέσματα. Δεύτερον, van der Gun et al. (2013) παραδόθηκε σίγηση τους κατασκευάζουν με φορείς ρετροϊών και να χρησιμοποιήσετε κενούς φορείς ως έλεγχο. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε 4-6 ημέρες μετά την μεταγωγή. Η μελέτη μας χρησιμοποιούνται κυτταρικές γραμμές οι οποίες εκφράζουν τα κατασκευάσματα σίγηση σε ένα σταθερό τρόπο μετά από μια αρχική παροδική επιμόλυνση. Και οι δύο μέθοδοι έχουν τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά τους. Στην ρετροϊική παράδοση, οι κυτταρικές επιδράσεις μετρούνται μερικές ημέρες μετά από μια ρετροϊική μόλυνση, η οποία μπορεί να επηρεάσει έντονα τις κυτταρικές αποκρίσεις. Επιπλέον, στη σταθερή κυτταρική σειρά, EpCAM σίγησε για αρκετές εβδομάδες πριν διεξήχθη η ανάλυση πολλαπλασιασμού των κυττάρων, η οποία έδωσε το μεγάλο χρονικό διάστημα κύτταρο να ανταποκριθεί στην μείωση της έκφρασης EpCAM. Σε αντίθεση, οι δοκιμές πολλαπλασιασμού van der Gun et al. (2013) διεξήχθησαν 4 έως 6 ημέρες μετά τη μεταγωγή και στα πειράματα RNAi η ανάγνωση έγινε 1 έως 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση siRNA, τα οποία μπορεί να είναι ένας άλλος λόγος για την διαφορά στα αποτελέσματα. Είναι ένα μειονέκτημα του σταθερού προσέγγιση γραμμή κυττάρων που είναι ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές που μελετήθηκαν τα οποία μπορεί να έχουν συσσωρευτεί ειδικές προσαρμογές. Ωστόσο, το γεγονός ότι και οι δύο σταθερές γραμμές που μελετήθηκαν εδώ έδειξε παρόμοια αποτελέσματα, αντιμετωπίζει εν μέρει την ανησυχία αυτή. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι περαιτέρω πειράματα θα χρειαστούν για την επίλυση αυτού του ζητήματος, αλλά η μείωση της πολλαπλασιαστικής δυναμικού μιας κυτταρικής γραμμής όγκου που παρατηρείται εδώ μετά επιγενετικές αποσιώπηση του υποκινητή EpCAM είναι μία πολλά υποσχόμενη αποτέλεσμα για πιθανές θεραπευτικές εφαρμογές του EpCAM σίγηση στη θεραπεία των καρκίνων με EpCAM υπερέκφραση

Για τις μελλοντικές εφαρμογές των στοχευμένων γονιδίων, πρέπει να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα της παράδοσης του στοχευόμενου κατασκευάσματος μεθυλοτρανσφεράση.? διάφορες στρατηγικές παράδοσης ιογενή είναι διαθέσιμα για το σκοπό αυτό και επί του παρόντος αναπτύσσονται στο εργαστήριο μας και σε άλλα μέρη [61], [65]. Μετά την ανάπτυξη αρκετών ενεργή και λειτουργική χιμαιρική μεθυλτρανσφεράσες που λειτουργούν σε μοντέλα κυτταροκαλλιέργειας, θα είναι το ένα δίπλα κρίσιμο ορόσημο των μελλοντικών εργασιών για την ενσωμάτωση αυτών των ενζύμων σε ένα αποτελεσματικό σύστημα παροχής που επιτρέπει τη μόλυνση των κυττάρων όγκου στο ζώο (ή άνθρωπο) σώμα, και οδηγεί σε αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε ζωικά μοντέλα. Εάν αυτό μπορεί να επιτευχθεί, θα είναι επίσης απαραίτητο να καθοριστεί το δυναμικό μεθυλίωση εκτός στόχου σε ευρεία κλίμακα γονιδιώματος και με ποσοτικό τρόπο σε διαφορετικούς ιστούς. Για το λόγο αυτό, αρκετές γονιδιώματος μεθόδους ευρεία ανάλυση της μεθυλίωσης του DNA είναι διαθέσιμες. Ανάλογα με την ποσότητα της μεθυλίωσης off-στόχο και την πληγείσα τόπους, πραγματοποιείται ανάλυση κινδύνου θα επιτρέψει να αξιολογηθεί εάν τα αντιδραστήρια αυτά θα μπορούσαν να είναι ασφαλής για κλινικές δοκιμές. Εάν χρειάζεται η ειδικότητα της στόχευσης θα μπορούσε να βελτιωθεί με τη χρήση ψευδαργύρου δάκτυλα ενότητες οι οποίες αναγνωρίζουν μακρύτερες αλληλουχίες από εκείνο που χρησιμοποιείται εδώ. Τελικά άλλες μεθόδους στόχευσης, όπως TAL περιοχές τελεστή ή μεθόδων που απορρέουν CRISPR μπορούν να χρησιμοποιηθούν, αν και για τους ιδιαιτερότητα είναι ένα θέμα, καθώς και.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πληροφορίες S1.

Primer και αμπλικονίου ακολουθίες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0087703.s001

(PDF)

Ευχαριστίες

Με ιδιαίτερη χαρά ανακοινώνουμε τη συμβολή και βοήθεια από τον Δρ . Kirsten Liebert και ο Δρ Γινγκτζίνγκ Zhang στην πρώιμη φάση του έργου.