Αφηρημένο

Η μετάσταση είναι μια σημαντική αιτία θνησιμότητας σε ασθενείς με καρκίνο. Invadopodia θεωρούνται κρίσιμα δομές που επιτρέπουν τα καρκινικά κύτταρα να διεισδύσουν σε ολόκληρη την εξωκυττάρια μήτρα (ECM) με τη χρήση μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs). Προηγουμένως, απομονώσαμε μια ιδιαίτερα επεμβατική υπογραμμή Α431-III από γονικά κύτταρα Α431 με τη δοκιμασία θαλάμου Boyden. Τα κύτταρα Α431-III διαθέτουν υψηλότερη επεμβατικές και μεταναστευτικές ικανότητες, αυξημένα επίπεδα ΜΜΡ-9 και μια ενισχυμένη επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) φαινότυπο. Σε αυτή τη μελέτη, ανακαλύψαμε ότι τα κύτταρα Α431-III είχαν αυξημένο δυναμικό για να σχηματιστεί invadopodia και μια βελτιωμένη ικανότητα να αποδομούν ECM σύγκριση με τα αρχικά κύτταρα Α431. Παρατηρήσαμε επίσης αυξημένα επίπεδα φωσφορυλίωσης του cortactin και Src σε κύτταρα Α431-ΙΙΙ? αυτές οι φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες έχουν αναφερθεί να είναι οι κύριοι ρυθμιστές του σχηματισμού invadopodia. Τα φλαβονοειδή, σχεδόν παντού κατανεμημένο σε βιομηχανίες τροφίμων και προϊόντα διατροφής των φυτών, έχουν τεκμηριωθεί ότι εμφανίζουν ιδιότητες κατά των όγκων. Ως εκ τούτου, ήταν πολύ ενδιαφέρον να διερευνήσει τις επιπτώσεις των φλαβονοειδών αντιοξειδωτικών στην μεταστατική δραστηριότητα των κυττάρων Α431-ΙΙΙ. Η έκθεση των κυττάρων Α431-III σε δύο ισχυρές διατροφικές φλαβονοειδή, δηλαδή luteolin (Lu) και quercetin (Qu), προκάλεσε την αναστολή του σχηματισμού invadopodia και μείωση στην αποικοδόμηση του ECM. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι Lu και Qu μετριάσει τη φωσφορυλίωση της cortactin και Src σε κύτταρα Α431-III. Κατά συνέπεια, προκύπτει υπάρχει διαταραχή της γενιάς invadopodia και την καταστολή της έκκρισης των ΜΜΡ. Οι αλλαγές αυτές, σε συνεννόηση, να επιφέρει μείωση στη μετάσταση

Παράθεση:. Λιν Υ-C, Tsai Ρ-Η, Lin C-Y, Cheng C-H, Lin Τ-Η, Lee KPH, et al. (2013) Επιπτώσεις των φλαβονοειδών στο Matrix μεταλλοπρωτεϊνάσηε έκκριση και Invadopodia Σχηματισμός σε άκρως μεταστατικών κυττάρων Α431-III Καρκίνου. PLoS ONE 8 (8): e71903. doi: 10.1371 /journal.pone.0071903

Επιμέλεια: Donald Gullberg, Πανεπιστήμιο του Μπέργκεν, Νορβηγία

Ελήφθη: 6 Απρ 2013? Αποδεκτές: 4 Ιούλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 21 του Αυγούστου, 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από την Ταϊβάν Academia Sinica θεματική του έργου (AS-96-TP-B06 σε MTL). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Chithan Γ Kandaswami απασχολείται από το Κάστρο Hills Υγείας. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

μετάσταση, η εξάπλωση του καρκίνου από τον τόπο καταγωγής στον άπω ιστούς στο σώμα , θεωρείται ότι είναι ο κύριος συνεισφέρων για θνησιμότητα στην πλειονότητα των καρκίνων [1]. Πάνω από το 90% του καρκίνου που σχετίζεται θανάτων λόγω μετάσταση και ακόμη παραμένουν να διευκρινισθούν περαιτέρω [2], οι μηχανισμοί που ελέγχουν τη μετάσταση. MMPs είναι τα καλύτερα τεκμηριωμένες κρίσιμα πρωτεολυτικά ένζυμα που σχετίζονται με μετάσταση όγκου [3]. Για να διευκολυνθεί η μετάσταση, τα καρκινικά κύτταρα εξαρτώνται από την δραστικότητα περισσότερων από ένα ΜΜΡ και άλλων γενικότερων εξευτελιστική ένζυμα, προκειμένου να τους δοθεί η δυνατότητα να διασχίσει τα εμπόδια που συναντούν ιστών κατά τη διαδικασία της εισβολής. Πιστεύεται ότι MMPs υποβαθμίζουν το ECM, και ότι η δράση αυτή επιτρέπει καρκινικά κύτταρα να μεταναστεύσουν, εισβάλλουν και να εξαπλωθεί σε διάφορες δευτερογενείς θέσεις στο σώμα όπου σχηματίζουν μεταστάσεις. MMPs ρυθμίζουν το μικροπεριβάλλον του όγκου, και η έκφραση και ενεργοποίηση τους αυξάνονται σε σχεδόν όλων των ανθρώπινων καρκίνων σε σύγκριση με εκείνες του κανονικού ιστού ισοδύναμο με το καρκίνο [4]. Ένας πλούτος πρόσφατα δεδουλευμένων πληροφορίες δείχνουν ότι οι MMPs προσλαμβάνονται σε μοναδικές δομές επιφάνειας, οι οποίες ονομάζονται invadopodia, και ότι είναι σε θέση στη συνέχεια να υποβληθούν σε έκκριση [5], [6].

Invadopodia ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά σε ινοβλάστες μεταμορφωθεί από το v-src ογκογονίδιο, το οποίο κωδικοποιεί μια ουσιαστικά δραστική κινάση τυροσίνης μη υποδοχέα v-src [7], και ο όρος επινοήθηκε το 1989 [8]. Invadopodia εξειδικευμένο προεξοχές μεμβράνη ακτίνη βασίζονται βρεθεί σε καρκινικά κύτταρα που υποβαθμίζουν την ECM μέσω εντοπισμός των πρωτεασών [9]. ικανότητά τους να μεσολαβούν υποβάθμιση ECM υποδηλώνει έναν κρίσιμο ρόλο για invadopodia στην εισβολή καρκίνου και μετάσταση. Invadopodia αποτελούνται από πολλά ακτίνης ρυθμιστικές πρωτεΐνες όπως cortactin, Ν-WASP, ARP2 /3 και κοφιλίνη [10]. Αν και αυτές οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες ακτίνης είναι επίσης συστατικά των άλλων προεξοχών μεμβράνης ακτίνη που βασίζεται, φθοράς μήτρας ικανότητα ξεχωρίζει ως ένα σημαντικό, ουσιαστικό και προβλέψιμο δείκτης αναγνώρισης invadopodia. Τρεις MMPs, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και ΜΤ1-ΜΜΡ [11], αναφέρεται ότι πρέπει να προσληφθεί για να invadopodia προκειμένου να φέρει σχετικά με την ικανότητα ταπεινωτική τους. Ωστόσο, οι λεπτομερείς μηχανισμοί με τους οποίους οι MMPs μεταφέρονται και στόχευση στο invadopodia, και περαιτέρω εκκρίνεται παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

Τα τελευταία χρόνια, αρκετές μοριακές παίκτες λειτουργούσας invadopodia έχουν καθοριστεί με μεταλλακτική μελέτες, έρευνες παρεμβολή RNA ή από την ανάπτυξη ανασταλτικών αντισωμάτων. Μεταξύ αυτών, ο κεντρικός ρόλος για τη μη-υποδοχέα τυροσινικής κινάσης Src στη ρύθμιση invadopodia έχει συναχθεί? μεταγενέστερες μελέτες έχουν δείξει ότι η δράση κινάσης Src είναι απαραίτητη για το σχηματισμό και τη λειτουργία invadopodia [12], [13]. Πράγματι, αυτή η δραστηριότητα του Src κινάσης στο ίδιο οδήγησε στην ανακάλυψη του invadopodia. Η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών που το απαρτίζουν είναι κρίσιμης σημασίας για τη ρύθμιση invadopodia και αυτό αφορά κυρίως τη φωσφορυλίωση τυροσίνης από Src κινάσης. Ένας αριθμός Src υποστρώματα, όπως cortactin, Tks5, dynamin2, AMAP1 /ASAP1 και Ν-WASP, έχουν εντοπιστεί στην invadopodia και απαιτούνται από αυτούς να είναι ενεργό [10], [14], [15]. Μόλις Src κινάση ενεργοποιείται από ανάντη σηματοδότηση ιντεγκρίνης ή παράγοντα διέγερσης της ανάπτυξης, οι πρωτεΐνες αυτές υφίστανται φωσφορυλίωση τυροσίνης? αυτό τότε ρυθμίζει τη λειτουργία τους ως προσαρμογείς ή τους επιτρέπει να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους κατά τη συναρμολόγηση των δικτύων ακτίνης [12], [16]. Η μετάλλαξη των θέσεων φωσφορυλίωσης τυροσίνης επί πρωτεϊνών αυτών αναστέλλει τον σχηματισμό invadopodia και λειτουργεί [15], [17], η οποία υποστηρίζει περαιτέρω τη σημασία της φωσφορυλίωσης τυροσίνης για το σχηματισμό invadopodia. Εκτός από την τυροσίνη φωσφορυλίωση από Src, της πρωτεΐνης κινάσης C έχει επίσης αναφερθεί να συνεργούν με Src και να συμμετέχουν στην ρύθμιση της invadopodia με φωσφορυλίωση σερίνης ή θρεονίνης [16].

Cortactin, ένας ακτίνης ρυθμιστική πρωτεΐνη που λειτουργεί τόσο κατά τα στάδια ενεργοποίηση και σταθεροποίηση της διακλάδωσης ακτίνης, υπήρξε κατάρτιση πρόσφατα εξέχουσα προσοχή λόγω του ρόλου της στο σχηματισμό invadopodia [18]. Cortactin αρχικά αναγνωρίστηκε ως υπόστρωμα κινάσης τυροσίνης Src [19]. Ονομάστηκε cortactin διότι εντοπίζεται σε φλοιώδη ακτίνης δομές. Ανθρώπινη cortactin κωδικοποιείται από

CTTN

(πρώην

EMS1

) στο χρωμόσωμα 11q13, η οποία συχνά ενισχύεται σε διάφορους καρκίνους, όπως του μαστού, της κεφαλής και του αυχένα [20]. Η γονιδιακή ενίσχυση που οδηγεί σε υπερέκφραση του cortactin έχει βρεθεί να σχετίζεται με υψηλότερες μετάσταση /εισβολή και κακή πρόγνωση [21]. Συνεπής με την ακτίνη του ικανότητα σύνδεσης, cortactin έχει βρεθεί να εντοπίζεται στις δομές περιφερικών κυττάρων, όπως ελασματοπόδια και invadopodia. Πρόσφατες μελέτες με στόχο τη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν τον πολυμερισμό της ακτίνης πριν από ΜΜΡ προσλήψεις έχουν προτείνει ότι cortactin φωσφορυλίωση είναι ζωτικής σημασίας για τον σχηματισμό και την ωρίμανση invadopodia [22] .Οι ευρήματα υποδεικνύουν ότι η κινάση Src τυροσίνης και cortactin υπόστρωμα του μαζί παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στον καρκίνο εισβολή και τη μετανάστευση [23].

για να προσδιοριστεί το πώς τα κύτταρα ελέγχουν το σχηματισμό invadopodia, αρκετοί ερευνητές έχουν προβληθεί μια συλλογή των φαρμακολογικά δραστικών ενώσεων με σκοπό τον προσδιορισμό των χημικών ουσιών που είναι ικανές να αναστείλουν τη διαδικασία. Οι φλαβονοειδή φυτών έχουν αναγνωριστεί εδώ και καιρό ότι διαθέτουν αντι-καρκινική και αντι-διαφοροποίηση επιδράσεις [24] – [27]. Προηγουμένως, έχουμε εντοπίσει δύο διαιτητικές φλαβονοειδών συστατικών, Lu, μια φλαβόνη, και Qu, ένα flavonol, καθώς μερικά από τα πιο ισχυρά φυτικά φλαβονοειδή από πλευράς τους

in vitro

βιολογικές δραστηριότητες. Παρουσιάζουν μια ποικιλία αντικαρκινικών επιδράσεων, όπως η εξασθένηση των δραστηριοτήτων της κυτταρικής ανάπτυξης και της κινάσης, η επαγωγή της απόπτωσης, της απομείωσης της διαφοροποίησης, την καταστολή της έκκρισης των ΜΜΡ, η μείωση στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων, την αναστολή της μετάστασης και της μείωσης των αγγειογένεση [28] – [31]. Παρά το γεγονός ότι αυτές οι δύο φλαβονοειδή είναι δυνητικά αποτελεσματικές ως αντι-επεμβατική ενώσεις, μέχρι σήμερα καμία μελέτη αξιολόγησε την επίδραση των Lu και Qu στο σχηματισμό και τη λειτουργία invadopodia. Σε προηγούμενες μελέτες, έχουμε τεκμηριώσει ότι τόσο Lu και Qu είναι σε θέση να αμβλύνει δραστηριότητες κινάσης τυροσίνης και σε μεγάλο βαθμό καταστέλλουν την έκκριση των ΜΜΡ σε κύτταρα όγκου [26]. Ανατίμηση του ενδιαφέρον και τη σημασία της αναστολής των δραστηριοτήτων της κινάσης και της MMP έκκριση από αυτά τα φλαβονοειδή μας ώθησε να αξιολογήσει τις επιπτώσεις τους στα γεγονότα που περιβάλλουν τον σχηματισμό invadopodia και λειτουργεί.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά

Α431 ανθρώπινου επιδερμικού καρκινική κυτταρική σειρά αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Οι εξαιρετικά μεταστατικών κυττάρων Α431-ΙΙΙ απομονώθηκαν στο εργαστήριο μας από τα γονικά κύτταρα Α431 όγκων (Α431-Ρ) [32]. Ο ορός εμβρύου μόσχου (FBS) και RPMI-1640 ελήφθησαν από την GIBCO (Grand Island, ΝΥ). ΜΜΡ-9 siRNA αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Εκκινητές PCR αγοράστηκαν από την εικόνα της κνίδωσης Biotech (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Quercetin αγοράστηκε από Nacalai Tesque (Kyoto, Japan). Luteolin ελήφθη από EXTRASYNTHESE (Genay, France). Αντι-cortactin αντίσωμα που ελήφθη από Epitomic (Burlingame, CA). αντίσωμα αντι-φωσφο-cortactin (Y421) αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Αντι-Src αντίσωμα αποκτήθηκε από την Upstate Biotechnology (Lake Placid, ΝΥ). Αντι-φωσφο-Src αντίσωμα (Y418) αγοράστηκε από Abcam (Cambridge, ΜΑ). Αντι-Tks5 αντίσωμα και GM6001 ελήφθησαν από την Millipore (Billarica, ΜΑ). Αντι-ΜΤ1-ΜΜΡ, TIMP1, αντισώματα Timp2 αγοράστηκαν από Genetex (Irvine, CA).

Παρασκευή κυτταρικά λύματα

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή και μετά πλύθηκαν με PBS. Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης χρυσό όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Το αδιάλυτο υλικό συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στα 14.000 χ

g

για 20 λεπτά στους 4 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης ποσοτικοποιείται χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό πρωτεΐνης Bio-Rad (Hercules, CA). Τα δείγματα στη συνέχεια διαιρούνται σε κλάσματα 50 μί και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για περαιτέρω μελέτη.

Η επιμόλυνση των μικρών RNA παρέμβαση

Α431 κύτταρα-III (2.5 × 10

5) απλώθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας 60 mm και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. 6 μΐ Lipofectamine 2000 (Invitrogen) προστέθηκε σε 300 μΙ μέσου χωρίς ορό, αναμειγνύονται καλά και επωάστηκαν για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Παράλληλα, 12 μΙ αποθέματος siRNA (10 μΜ) προστέθηκε για το διαχωρισμό 300 μΙ μέσου χωρίς ορό, αναμιγνύεται καλά. Το αραιωμένο siRNA και Lipofectamine 2000 στη συνέχεια συνδυάστηκαν και επωάστηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, το σύμπλοκο siRNA /Lipofectamine προστέθηκε στο τρυβλίο 60 mm που περιείχαν μέσο ελεύθερο ορού 2,4 ml δίνοντας μια τελική συγκέντρωση 40 ηΜ. Μετά από 24 ώρες το μέσο που περιέχει το σύμπλοκο διαμόλυνση αλλάχθηκε και φρέσκο ​​μέσο που περιέχει FBS προστέθηκε 10%? τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για άλλες 24 ώρες. Ολες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε με τη χρήση υψηλής καθαρότητας Απομόνωση RNA Kit (Roche, Βασιλεία, Ελβετία), και αντίστροφη μεταγραφή με τη χρήση του MMLV υψηλής απόδοσης ανάστροφης μεταγραφάσης kit (Epicentre, Madison, WI). Ποσοτικοποίηση των επιπέδων μεταγραφής των γονιδίων στόχων πραγματοποιήθηκε στο σύστημα LightCycler (Roche) χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό SYBR Πρόμιγμα Εχ Taq (Takara Bio, Shiga, Japan) και τα ειδικά σύνολα εκκινητών.

Γονιδιακής Έκφρασης Microarray Analysis

Η διαδικασία της ανάλυσης μικροσυστοιχιών γονιδιακής έκφρασης που παρέχονται από τον κατασκευαστή Welgene Biotech (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Εν συντομία, οι δύο Α431-Ρ και τα κύτταρα Α431-III (1 × 10

6) απλώθηκαν σε πιάτα 100 mm και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε πλήρες θρεπτικό μέσο. Μετά από 24 ώρες, το σύνολα του RNA και των δύο κυττάρων εκχυλίστηκαν με 3 ml αντιδραστηρίου ΤπζοΙ. Η ανάλυση μικροσυστοιχιών γονιδιακής έκφρασης του Α431-Ρ και τα κύτταρα Α431-III έγιναν από Welgene Biotech. Τα στοιχεία που συζητήθηκαν στην παρούσα έκδοση έχουν κατατεθεί στη γονιδιακή έκφραση Omnibus NCBI και είναι προσβάσιμη μέσω του αριθμού ένταξη GEO Σειρά GSE47996 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE47996) .

ζυμογραφία ζελατίνης

Το προσαρμοσμένο μέσο συλλέχθηκε και διαχωρίστηκε με 8% SDS-PAGE που περιείχε 0,1% ζελατίνη. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή πλύθηκε σε 2.5% Triton Χ-100 για 20 λεπτά, δύο φορές, για να μετουσιώνεται οι ζελατινάσες και στη συνέχεια επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0, που περιέχει 5 mM ΟαΟ

2, 0,02 % NaN

3) στους 37 ° C για 24 έως 48 ώρες. Η πηκτή στη συνέχεια βάφτηκε με Coomassie Blue και αποχρωματίζονται με ρυθμιστικό αποχρωματισμού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Η δραστηριότητα ζελατινάσης ήταν ορατή ως διαυγείς ζώνες εντός του πηκτώματος.

Western Blotting

Τα δείγματα κυτταρολύματος αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα 5 χ δείγμα και έβρασαν για 5 λεπτά, διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές (PAGE), και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Millipore). Οι κηλίδες μεμβράνης μπλοκαρίστηκαν σε PBS που περιείχε 5% BSA για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα επί μία νύκτα στους 4 ° C. Μετά από έκπλυση με TBST που περιείχε 20 mM Tris-HCl (ρΗ 7,6), 0,8% (β /ο) ΝαΟΙ και 0.25% Tween-20, τα στυπώματα επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Millipore). Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλένονται με TBST, και ανοσοαντέδρασαν ζώνες ανιχνεύθηκαν με αντιδραστήρια ECL και εκτίθεται στο Fujifilm.

Δοκιμασία in vitro εισβολή

Το φίλτρο μιας 24 φρεατίων μονάδα Transwell επικαλύφθηκε με 0,1 mL 0,6 mg /mL EHS Matrigel. Το κατώτερο διαμέρισμα περιείχε RPMI-1640 με 10% FCS ως χημειοελκτικό. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν στο άνω διαμέρισμα (10

5 κύτταρα /0,5 mL RPMI-1640 που περιέχει 0.1% BSA) για 24 ώρες. Μετά την επώαση, τα φίλτρα σταθεροποιήθηκαν με 3% γλουταραλδεΰδη σε PBS και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Τα κύτταρα στην ανώτερη επιφάνεια του φίλτρου απαλά ξύνεται, και εκείνοι που διείσδυσε μέσω του Matrigel στην κατώτερη επιφάνεια του φίλτρου μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο (20 Χ).

ανοσοφθορισμού

τα κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων που περιέχουν καλυπτρίδες επικαλυμμένες με ζελατίνη 18 mm για 18-24 ώρες με σκοπό να προσκολληθούν. Το μέσο στη συνέχεια απορρίφθηκε και τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, πλύθηκαν με PBS, και κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 για 10 λεπτά. Μετά από πλύση με PBS, οι καλυπτρίδες μπλοκαρίστηκαν με 1% BSA σε PBS για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-cortactin ή αντι-Tks5 αντισώματα, τα οποία αραιώθηκαν σε 1% ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος για 1 ώρα BSA. Αυτό ακολουθήθηκε από επώαση με το κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με Alexa Fluro 555 (Invitrogen) για 1,5 h. Τα ίδια κύτταρα επίσης χρωματίστηκαν με Alexa φθορο 488 συζευγμένο με φαλλοϊδίνη και DAPI για την ανίχνευση F-ακτίνης και οι πυρήνες των κυττάρων, αντίστοιχα. Οι καλυπτρίδες στη συνέχεια τοποθετούνται σε 50% γλυκερόλη σε PBS και αναλύθηκε με μικροσκοπία confocol εικόνα.

Matrix Αποδόμηση Δοκιμασία

Η δοκιμασία αποικοδόμηση μήτρας διεξήχθη σύμφωνα με μια διαδικασία που περιγράφηκε προηγουμένως [34], και η όλη διαδικασία για την δοκιμασία αποικοδόμηση μήτρας εκτελέστηκε στο σκοτάδι. Εν συντομία, 18 καλυπτρίδες mm επικαλύφθηκαν αρχικά με 0,2 mg /mL Όρεγκον Green® 488 συζευγμένο με ζελατίνη (Molecular Probe). Οι καλυπτρίδες είχαν 200 μι 0,5% παγωμένου γλουταραλδεϋδη σε PBS προστέθηκαν σε αυτά και τα μίγματα στη συνέχεια επωάστηκε για 15 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από πλύση με PBS, οι καλυπτρίδες επωάστηκαν με φρέσκο ​​5 mg /ml NaBH

4 σε PBS για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, οι καλυπτρίδες πλύθηκαν με PBS και αποστειρώνονται σε 70% αιθανόλη. Μετά από απόσβεση με μέσο χωρίς ορό για 1 ώρα, 1 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες επί 5 ώρες, και διαφάνειες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας phalloidin για την ανίχνευση F-ακτίνη και DAPI για την ανίχνευση των κυτταρικών πυρήνων. Οι εικόνες οπτικοποιήθηκαν με συνεστιακή μικροσκόπηση. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό σχηματισμού invadopodia και λειτουργία, οι invadopodia με το χέρι ποσοτικοποιείται μετρώντας το συνολικό αριθμό των κυττάρων που παράγουν invadopodia σε τουλάχιστον πέντε μεμονωμένα πεδία (& gt? 300 κύτταρα). Η περιοχή της μήτρας γύρω από τα κύτταρα που είχαν υποβαθμιστεί μετρήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας ένα πανομοιότυπο κατώφλι σήματος για την Όρεγκον Green® φθορισμού 488-ζελατίνης για κάθε εικόνα. Η υποβαθμισμένη περιοχή που μετρήθηκε ήταν η περιοχή όπου το σήμα φθορισμού ήταν κάτω από το όριο, όπως μετράται από το ImageJ. Η ποσοτικοποιημένη περιοχή ήταν τότε ομαλοποιημένη σχέση με τον αριθμό των κυττάρων.

Ομοεστιακή Μικροσκοπίας

φθορισμού εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM 510 ομοεστιακό μικροσκόπιο με ένα φακό βύθισης 63 × πετρελαίου, μια NA 1,25 στόχος και το pin τρύπα της μονάδας 0.1 ευάερα. Η ανάλυση εικόνας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού ImageJ.

Στατιστική Ανάλυση

Τα ποσοτικά στοιχεία από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσα (± SEM). t-tests Αζευγάρωτη Student χρησιμοποιήθηκαν για να συγκριθούν οι διαφορές μεταξύ των ομάδων. Ένα

σ

της & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Τα κύτταρα Α431-ΙΙΙ αποτελούν περισσότερο Invadopodia και υποβαθμίζουν την ECM Αποτελεσματικά

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι τα κύτταρα Α431-ΙΙΙ παρουσιάζουν μεγαλύτερη διεισδυτική και μεταναστευτική ικανότητες μαζί με αυξημένα επίπεδα της ΜΜΡ-9 [32]. Αυτό μας παρέχει ένα αξιόπιστο μοντέλο για τη μελέτη του μηχανισμού της μετάστασης /εισβολής δια συγκρίσεως κύτταρα Α431-ΙΙΙ με των γονικών κυττάρων (Α431-P). Για να καθοριστεί εάν Α431-P και Α431-ΙΙΙ κύτταρα είναι ικανά να σχηματίσουν invadopodia, εκτελέσαμε πρώτα ανοσοφθορισμό για την ανίχνευση και τη σύγκριση του σχηματισμού invadopodia με Α431-Ρ και τα κύτταρα Α431-III. Α431-P και Α431-ΙΙΙ κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων επικαλυμμένες με ζελατίνη για 4 ώρες. Invadopodia μπορούσε να παρατηρηθεί ως cortactin και τελείες ακτίνης θετική βρίσκεται στην κοιλιακή περιοχή των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1Α, invadopodia ήταν εύκολα να βρεθεί σε κύτταρα Α431-III. Υπήρχαν λίγα ή καθόλου ανιχνεύσιμη invadopodia ορατό στο Α431-Ρ κύτταρα. Στη συνέχεια, δοκιμασία αποικοδόμηση μήτρας διεξήχθη για να αξιολογηθεί η ικανότητα αποικοδόμησης ECM του invadopodia σε Α431-Ρ και τα κύτταρα III. Τα κύτταρα Α431-III βρέθηκαν να έχουν υψηλότερη ικανότητα ζελατίνης ταπεινωτική σύγκριση με Α431-Ρ κύτταρα (Σχ. 1Α). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η μεγαλύτερη ικανότητα ζελατίνη ταπεινωτική βρέθηκε να σχετίζεται με κύτταρα Α431-ΙΙΙ παραλληλίζεται μεγαλύτερη ικανότητα τους να σχηματίζουν invadopodia

Α, Άνω πάνελ:. Α431-P και Α431-ΙΙΙ κύτταρα χρωματίστηκαν με cortactin ( κόκκινο), F-ακτίνη (πράσινο), και DAPI (μπλε). Αιχμές βελών, παραδείγματα invadopodia που χαρακτηρίζονται ως cortactin και ακτίνη-θετική τελείες. Εκπρόσωπος εικόνες που λαμβάνονται και των δύο κυττάρων. Κάτω πίνακας: Και οι δύο κύτταρα απλώθηκαν σε Oregon Green® 488 συζευγμένο με ζελατίνη. Υποβαθμισμένη ECM αναγνωρίστηκε ως μια σκοτεινή περιοχή στο ζελατίνη. Β, Άνω πάνελ: Ποσοτικοποίηση των κυττάρων που σχετίζονται με αποικοδόμηση μήτρας. Κάτω πίνακας: Ποσοτικοποίηση της περιοχής αποικοδόμησης ομαλοποιηθεί έναντι του αριθμού των κυττάρων. C, εκτελέστηκαν προσδιορισμοί εισβολή. *

σ

& lt? 0,05. Οι ράβδοι σφάλματος παρουσιάζουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. μπαρ κλίμακας είναι 22 μm. P (Α431-P)? ΙΙΙ (Α431-III).

Η

Για την ποσοτικοποίηση του σχηματισμού invadopodia και την ικανότητά τους για την υποβάθμιση της ECM, υπολογίσαμε το ποσοστό των κυττάρων με invadopodia puncta που σχετίζονται με υποβαθμισμένες μπαλώματα ζελατίνη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, πάνω από το 35% των κυττάρων Α431-ΙΙΙ βρέθηκαν να σχηματίσουν invadopodia και να υποβαθμίσει ζελατίνη. Αυτό διαφέρει με τα αποτελέσματα για Α431-P, όπου μόνο το 5% των Α431-Ρ κύτταρα βρέθηκαν να σχηματίσουν invadopodia. Εμείς ποσοτικά, επίσης, την περιοχή των υποβαθμισμένων μπαλώματα και ομαλοποιηθεί αυτή εναντίον των αριθμών των κυττάρων. Α431 κύτταρα-III παρουσίασαν 10 φορές μεγαλύτερη ικανότητα να αποικοδομεί ζελατίνη από ό, τι Α431-Ρ κύτταρα. Αυτή η μεγαλύτερη ικανότητα σχηματισμού invadopodia και εξευτελιστικής λειτουργία αντιστοιχούσε με την ικανότητα εισβολής των κυττάρων αυτών (Εικ. 1 C). Συνοπτικά, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι, σε σύγκριση με Α431-Ρ κύτταρα, ιδιαίτερα επεμβατική κύτταρα Α431-ΙΙΙ παρουσιάζουν μία πολύ μεγαλύτερη ικανότητα να σχηματίζουν invadopodia και ότι αυτό οδηγεί σε περισσότερο αποικοδόμηση του ECM και αυξημένη διεισδυτική ικανότητα.

Cortactin φωσφορυλίωση Προωθεί invadopodia σχηματισμός και Matrix Υποβάθμιση

Πρόσφατα, αρκετές αναφορές έχουν εγκριθεί ότι η υπερέκφραση των ρυθμιστικών αρχών invadopodia ή πρωτεΐνες συστατικό invadopodia είναι σε θέση να ενισχύσει τον σχηματισμό invadopodia. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αν αυτές οι ρυθμιστικές αρχές είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα Α431-III, πραγματοποιήσαμε μικροσυστοιχιών και qPCR αναλύσεις να διευκρινιστεί αυτό το γεγονός. Προς έκπληξή μας, δεν υπήρξε σημαντική αύξηση του οποιουδήποτε γνωστού ρυθμιστή invadopodia ή πρωτεΐνη συστατικό (σχήμα 2Α & amp?. 2Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η διαφορά μεταξύ του Α431-P και Α431-ΙΙΙ, από την άποψη της invadopodia, είναι πιθανό να είναι στο επίπεδο της μεταγωγής σήματος και όχι σε επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης.

Α, έκφραση των ρυθμιστικών αρχών invadopodia, συστατικά του πυρήνα και ΜΜΡ /TIMPs σε Α431-P και Α431-III αναλύθηκαν με μικροσυστοιχίας. Β, έκφραση των ρυθμιστικών αρχών invadopodia, εξαρτήματα και ΜΜΡ /TIMPs επικυρώθηκαν από qPCR. C, Total κυτταρολύματα υποβλήθηκαν για ανάλυση ανοσοκηλίδωσης. Η ενεργή κατάσταση της Src κινάσης και η φωσφορυλίωση της cortactin προσδιορίστηκαν.

Η

Src κινάσης διαδραματίζει θεμελιώδη ρόλο στη ρύθμιση του σχηματισμού invadopodia [12], [13]. Αρκετές πρωτεΐνες συστατικό είναι γνωστό ότι υφίστανται φωσφορυλίωση τυροσίνης κατά τη διάρκεια invadopodia αιτιολογίας, περιλαμβανομένης cortactin [9], [35]. Η φωσφορυλίωση των cortactin από Src κινάση είναι ένας βασικός διακόπτης που επιτρέπει την αναδιαμόρφωση των νημάτων ακτίνης και την ενεργοποίηση του σχηματισμού invadopodia και λειτουργία [17], [22]. Για να ελεγχθεί ο ρόλος των Src στο σχηματισμό και τη λειτουργία invadopodia, εξετάσαμε δράση κινάσης Src με αντι-φωσφορυλιωμένης αντίσωμα Src σε Α431-Ρ και τα κύτταρα III. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Γ, βρήκαμε ότι Src κινάση ενεργοποιήθηκε σημαντικά σε κύτταρα Α431-ΙΙΙ, και ακολουθείται από μια αύξηση στη φωσφορυλίωση του κατάντη στόχου, cortactin. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η δράση κινάσης Src, παρά η μεταγραφική επαγωγή των Src ή οποιουδήποτε άλλου ρυθμιστή invadopodia /συστατικό, είναι πιθανό να είναι υπεύθυνο για αυξημένο σχηματισμό invadopodia από κύτταρα Α431-ΙΙΙ, σε συμφωνία με συμπέρασμα μας σχετικά με τα δεδομένα μικροσυστοιχίας.

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το ρόλο της Src κινάσης και cortactin φωσφορυλίωση σε σχηματισμό invadopodia σε κύτταρα Α431-III, μπορούμε στη συνέχεια κατεργάζεται τα κύτταρα με SU6656, έναν εκλεκτικό αναστολέα της κινάσης Src. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι σχηματισμός invadopodia κατεστάλη δραματικά από την αγωγή με SU6656 (Εικ. 3Α), όπως και οι εισβάλλοντες ικανότητες ανιχνεύονται με προσδιορισμούς εισβολής (Σχ. 3D). Ποσοτικοποίηση του ποσοστού των invadopodia-θετικών κυττάρων και η σχετική έκταση αποικοδόμησης παρουσιάζονται στο σχήμα 3Β. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η μείωση στη φωσφορυλίωση του Src προκύπτει από την αναστολή της δράσης της κινάσης Src με SU6656, ενώ συνοδεύεται επίσης από ένα χαμηλότερο επίπεδο του cortactin φωσφορυλίωσης (Εικ. 3C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η δραστικότητα της κινάσης Src είναι απαραίτητο για τον σχηματισμό invadopodia και το διεισδυτικό δυναμικό.

Α, κύτταρα Α431-ΙΙΙ απλώθηκαν σε ζελατίνη ή Oregon Green® 488 συζευγμένο με ζελατίνη και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή 5 μΜ SU6656 για 5 ώρες για να διερευνήσει τον σχηματισμό invadopodia και αποικοδόμηση μήτρας. Β, Ποσοτικοποίηση των κυττάρων που σχετίζονται με αποικοδόμηση μήτρας (άνω πάνελ). Ποσοτικοποίηση της περιοχής αποικοδόμησης ομαλοποιηθεί έναντι του αριθμού των κυττάρων (κάτω πίνακας). C, Total κυτταρολύματα προετοιμάστηκαν για ανάλυση ανοσοκηλίδωσης. Active Src και κατάντη cortactin στόχου (Y421) αναλύθηκαν. Α, διεξήχθησαν δοκιμασίες εισβολή. *

σ

& lt? 0,05. Οι τιμές P σε σύγκριση με τον έλεγχο Α431-III. Οι ράβδοι σφάλματος παρουσιάζουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. μπαρ κλίμακας είναι 22 μm.

Η

ΜΜΡ δραστηριότητα είναι απαραίτητη για Invadopodia Σχηματισμός και Matrix Υποβάθμιση

Για να μεταστάσεις, τα καρκινικά κύτταρα βασίζονται σε σχηματισμό invadopodia και MMPs να ολοκληρώσει την πέψη της ECM, το οποίο διευκολύνει τη διείσδυση των κυττάρων κατά μήκος του φράγματος ECM. Η συμμετοχή των MMPs σε δραστηριότητα invadopodia είναι απαραίτητη εάν πρωτεόλυση επρόκειτο να συμβεί. Για να προσδιοριστεί η συσχέτιση των MMPs και του σχηματισμού invadopodia σε Α431-ΙΙΙ, μετρήσαμε πρώτα την ικανότητα των κυττάρων Α431-III για να σχηματίσει invadopodia και υποβαθμίζουν την ECM παρουσία GM6001, ένα ευρύ φάσμα ΜΜΡ αναστολέα. Η μελέτη μας χρησιμοποιούνται Tks5 ως δείκτης για την ανίχνευση του σχηματισμού invadopodia και τη λειτουργία. Κατάρριψη κύτταρα Α431-ΙΙΙ με 25 μΜ GM6001 καταργηθεί εντελώς η υποβάθμιση ζελατίνη (Σχ. 4Α). Δεν ανιχνεύσιμη invadepodia dot-όπως δομές σε κύτταρα Α431-ΙΙΙ παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία με GM6001. Η επίδραση αυτή μπορεί να οφείλεται σε αποτυχία invadopodia να σχηματίσουν μια σταθερή δομή όταν δραστικότητα ΜΜΡ αναστέλλεται. Ποσοτικοποίηση του ποσοστού των invadopodia-θετικών κυττάρων και των σχετικών περιοχών αποικοδόμησης παρουσιάζονται στο σχήμα 4Β. Τα αποτελέσματα των GM6001 σχετικά με τις δραστηριότητες και TIMPs MMPs «μετρήθηκαν με κηλίδα western και zymography (Εικ. 4C). Μαζί, τα ευρήματά μας δείχνουν την κρίσιμη σημασία της δραστηριότητας ΜΜΡ στην εξευτελιστική ικανότητα των κυττάρων Α431-III, και πώς ΜΜΡ δραστηριότητα επηρεάζει τον σχηματισμό της δομής invadopodia.

Α, κύτταρα Α431-III απλώθηκαν σε ζελατίνη ή Όρεγκον Green® 488 συζευγμένο με ζελατίνη και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή 25 μΜ GM6001 για 5 ώρες για να παρατηρούμε το σχηματισμό invadopodia και τη μήτρα αποικοδόμησης ικανότητα. Tks5, πρωτεϊνικό συστατικό invadopodia, χρησιμοποιήθηκε ως ένας δείκτης. Β, Ποσοτικοποίηση των κυττάρων που σχετίζονται με αποικοδόμηση μήτρας (αριστερό πάνελ). Ποσοτικοποίηση της περιοχής υποβάθμισης ομαλοποιηθεί έναντι του αριθμού των κυττάρων (δεξί πάνελ). C, Επίδραση του GM6001 με θέμα «δραστηριότητες και TIMPs« ΜΜΡ έκφραση μετρήθηκαν με ζυμογραφία και στύπωμα western. D, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 40 ηΜ ΜΜΡ-9 siRNA ή ελέγχουν siRNA. Knockdown αποτελεσματικότητα μετρήθηκε με qPCR (αριστερά) ή ζυμογραφία ζελατίνης (δεξιά). Ε, τα κύτταρα Α431-III (που εκφράζουν τον έλεγχο ή ΜΜΡ-9 knockdown siRNA) απλώθηκαν σε ζελατίνη ή Oregon Green® 488 συζευγμένο με ζελατίνη για να ερευνήσει το σχηματισμό invadopodia και τη μήτρα αποικοδόμησης ικανότητα. . F, Ποσοτικοποίηση των κυττάρων που σχετίζονται με την υποβάθμιση της μήτρας (αριστερό πάνελ) και την περιοχή της υποβάθμισης ομαλοποιηθεί έναντι του αριθμού των κυττάρων (δεξιά πλευρά) *

σ

& lt? 0,05. Οι ράβδοι σφάλματος παρουσιάζουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. Ράβδος κλίμακας είναι 22 μm.

Η

Τρεις MMPs, ΜΤ1-ΜΜΡ (ΜΜΡ14), ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, έχουν αναφερθεί ότι συνδέονται με invadopodia λειτουργούν σε διάφορες κυτταρικές σειρές [13], [36], [37]. Έχουμε δείξει ότι η δραστηριότητα των ΜΜΡ-9 είναι το κλειδί ΜΜΡ που αυξάνει σημαντικά σε κύτταρα Α431-ΙΙΙ (Σχ 2Α & amp?. 2Β) [32], και ότι αυτή η πρωτεΐνη παίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση, εισβολή και την ΕΜΤ [33]. Λόγω του γεγονότος ότι ΜΤ1-ΜΜΡ και ΜΜΡ-2 υφίστανται λίγα ή και καθόλου αλλαγές στα κύτταρα Α431-III, είναι πιθανό η αύξηση στο επίπεδο ΜΜΡ-9 είναι ο σημαντικότερος παράγοντας για την αύξηση της invadopodia πρωτεολυτική δραστικότητα. Για να επιβεβαιωθεί αν η ΜΜΡ-9 συμβάλλει στη διαδικασία διαμόρφωσης invadopodia, ένας αποκλεισμός της ενδογενούς δραστικότητας ΜΜΡ-9 σε κύτταρα Α431-III διεξήχθη με siRNA knockdown. Knockdown ΜΜΡ-9 σε κύτταρα Α431-ΙΙΙ επιβεβαιώθηκαν με qPCR και αναλύσεις ζυμογραφία (Εικ. 4D). Η απώλεια της ΜΜΡ-9 οδήγησε σε αποτυχία για ανίχνευση invadopodia puncta σε κύτταρα Α431-ΙΙΙ (Σχ. 4Ε). Knockdown ΜΜΡ-9 σε κύτταρα Α431-III ήταν επαρκής για να εμποδίσουν το σχηματισμό invadopodia κατά περίπου 60% και να προκαλέσει μια μείωση 70% της συνολικής έκτασης αποικοδομείται από τα κύτταρα αυτά, όπως φαίνεται στο σχήμα 4F. Σε γενικές γραμμές, knockdown του ΜΜΡ-9 σε κύτταρα Α431-III είχε ένα παρόμοιο αποτέλεσμα με εκείνο της έκθεσης σε GM6001. Και στις δύο περιπτώσεις υπήρχε είτε μια αποτυχία να ανιχνεύσει invadopodia ή μία σημαντική μείωση του αριθμού των invadopodia δομών dot-όπως. Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ΜΜΡ-9 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην πρόκληση της γενιάς invadopodia και την επακόλουθη αποδόμηση της ECM.

Luteolin και Κερσετίνη Σαθεροποιημένο Src κινάσης Δραστηριότητα και επηρέασε την προς τα κάτω στόχος Cortactin

Σε προηγούμενες μελέτες μας, εντοπίσαμε δύο από τα πιο ισχυρά γνωστά φλαβονοειδή, δηλαδή Lu και Qu. Αυτά τα φλαβονοειδή επιδεικνύουν μία ποικιλία αντικαρκινικές επιδράσεις, όπως η αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και δραστικότητα κινάσης, η καταστολή των MMPs έκφραση και την έκκριση, μείωση της μετανάστευσης /εισβολής, και αναστροφή της ΕΜΤ [26], [29], [38], [39]. Παρά το γεγονός ότι αυτές οι δύο φλαβονοειδή είναι δυνητικά αποτελεσματικές ως αντι-επεμβατική ενώσεις, μέχρι σήμερα καμία μελέτη αξιολόγησε την επίδραση των Lu και Qu στο σχηματισμό και τη λειτουργία invadopodia. Με βάση τις επιπτώσεις τους στη δραστηριότητα της κινάσης και MMPs [26], θα υποτεθεί ότι Lu και Qu μπορεί να έχει τη δυνατότητα να διακόψει το σχηματισμό και τη λειτουργία των invadopodia. Έχουν γίνει προτάσεις ότι η Src, όταν ενεργοποιηθεί, είναι σε θέση να την μεταγωγή σημάτων στους μεταγενέστερους στόχους που στη συνέχεια ρυθμίζει την κυτταρική ανάπτυξη, την επιβίωση, τη μετανάστευση και την εισβολή [40]. Τα ευρήματα αυτά μας ώθησε να διερευνήσει εάν η θεραπεία είτε με Lu ή Qu θα έχουν άμεση ανασταλτική επίδραση στην δραστικότητα τυροσινικής κινάσης Src, και την απομείωση των cortactin φωσφορυλίωσης ως συνέπεια.

Η θεραπεία είτε με Lu ή Qu βρέθηκε να μειώνει φωσφορυλίωση src και φωσφορυλίωση cortactin (Εικ. 5Α). Εκτός από την ανασταλτική επίδραση στην Src και cortactin φωσφορυλίωση, ερευνήσαμε επίσης τα αποτελέσματα αυτών των δύο φλαβονοειδών επί ΜΜΡ δραστικότητα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β, Lu ή Qu κατέστειλε την έκκριση της MMP-2 και δραστικότητα ΜΜΡ-9, αλλά δεν είχε σημαντικές επιπτώσεις στο ΜΤ1-ΜΜΡ, TIMP1 και Timp2.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 20 μΜ Lu ή Qu σε ελεύθερο ορού μέσο για 24 ώρες. Α, τον συνολικό κυτταρολύματα υποβλήθηκαν για ανάλυση ανοσοκηλίδωσης. Ενεργό Src και κατάντη cortactin στόχου (Y421) προσδιορίστηκαν. Β, ρυθμισμένα μέσα και προϊόν λύσης κυττάρου αναλύθηκαν για δραστηριότητες και TIMPs «MMPs έκφρασης χρησιμοποιώντας ζυμογραφία ζελατίνης και στύπωμα western. C, Εκπρόσωπος εικόνες της Α431-III που έλαβαν θεραπεία με Lu ή Qu. Αριστερός πίνακας: Τα κύτταρα βάφτηκαν με cortactin (κόκκινο) και F-ακτίνης (πράσινο). Δεξιό πλαίσιο: κύτταρα Α431-ΙΙΙ απλώθηκαν σε Oregon Green® 488 συζευγμένο με ζελατίνη τη διερεύνηση της ικανότητας εξευτελιστική μήτρας. Α, Ποσοτικοποίηση των κυττάρων που σχετίζονται με αποικοδόμηση μήτρας (αριστερό πάνελ). Ποσοτικοποίηση της περιοχής υποβάθμισης ομαλοποιηθεί έναντι του αριθμού των κυττάρων (δεξί πάνελ). Ε, εκτελέστηκαν προσδιορισμοί εισβολή. *

σ

& lt? 0,05. Οι τιμές P σε σύγκριση με τον έλεγχο Α431-III. Οι ράβδοι σφάλματος παρουσιάζουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. μπαρ κλίμακα είναι 22 μm.

Η

Για την περαιτέρω διερεύνηση των επιπτώσεων της Lu και Qu θεραπεία για τη διαδικασία σχηματισμού invadopodia, αξιολογήσαμε την ικανότητα των κυττάρων Α431-III για να σχηματίσουν invadopodia και να υποβαθμίζει ζελατίνη με την παρουσία του Lu ή Qu.