Abstract

Εκτός από γενετικές αλλαγές, η εμφάνιση των επιγενετικών αλλαγών σχετίζεται με τη συσσώρευση των δύο γενετικών και επιγενετικών εκδηλώσεις που προάγουν την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου του ανθρώπου. Προηγουμένως, είχαμε αναφερθεί ένα σύνολο υποψήφιων γονιδίων που αποτελούν μέρος της αναδυόμενης «methylome του καρκίνου». Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε πρώτα 23 υποψήφια γονίδια για μεθυλίωση προαγωγού σε ένα μικρό αριθμό ιστών όγκου πρωτογενών κόλου και τους ελέγχους. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, στη συνέχεια, εξετάστηκε η συχνότητα μεθυλίωση του

Ογκοστατίνης Μ υποδοχέα-β

(

OSMR

) σε ένα μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων ιστού και κοπράνων DNA που συλλέγονται από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και των ελέγχων. Βρήκαμε ότι

OSMR

ήταν συχνά μεθυλιώθηκε σε πρωτογενείς κόλον καρκινικούς ιστούς (80%, 80/100), αλλά όχι σε φυσιολογικούς ιστούς (4%, 4/100). Η μεθυλίωση του

OSMR

επίσης ανιχνεύθηκε στα κόπρανα DNA από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (38%, 26/69) (cut-off στην TaqMan-MSP, 4). Ανίχνευση άλλων μετουσιωμένο δεικτών στα κόπρανα DNA βελτιωμένη ευαισθησία με μικρή επίδραση στην ειδικότητα. Ο υποστηρικτής μεθυλίωση μεσολάβηση αποσιώπηση του

OSMR

σε κυτταρικές γραμμές, και τα κύτταρα CRC με χαμηλή

OSMR

έκφραση ήταν ανθεκτικά στην αναστολή της ανάπτυξης με ογκοστατίνη Μ Τα δεδομένα μας παρέχει μια βιολογική λογική για σίγηση του

OSMR

στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου και επισημάνετε ένα νέο θεραπευτικό στόχο σε αυτή τη νόσο. Επιπλέον, η ανίχνευση και η ποσοτικοποίηση των

OSMR

μεθυλίωση προαγωγού σε κοπράνων DNA είναι ένα εξαιρετικά ειδικό διαγνωστικό βιοδείκτη για CRC

Παράθεση:. Kim MS, Louwagie J, Carvalho Β, Terhaar τικά Droste JS, Πάρκο HL, Chae YK, et al. (2009) Ανάδοχος μεθυλίωσης του DNA των

Ογκοστατίνης Μ υποδοχέα-β

ως Novel Διαγνωστικό και Θεραπευτικό Marker στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 4 (8): e6555. doi: 10.1371 /journal.pone.0006555

Επιμέλεια: Jonathan Weitzman, Université Paris-Diderot, Paris 7, Γαλλία

Ελήφθη: 6η Φεβρουαρίου του 2009? Αποδεκτές: 30 Ιουνίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 7 Αυγούστου 2009

Copyright: © 2009 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (U01-CA84986) και OncoMethylome Επιστημών, SA, και η ολλανδική Αντικαρκινικής Εταιρείας (αριθμός έργου RUG 2004 έως 3161). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Στο πλαίσιο συμφωνίας παραχώρησης άδειας εκμετάλλευσης μεταξύ OncoMethylome Επιστημών, SA και το Πανεπιστήμιο Johns Hopkins, Dr. Sidransky δικαιούται μερίδιο των δικαιωμάτων που έλαβε από το Πανεπιστήμιο για τις πωλήσεις των προϊόντων που περιγράφονται σε αυτό το άρθρο. Ο Δρ Sidransky κατέχει OncoMethylome Sciences, SA απόθεμα, το οποίο υπόκειται σε ορισμένους περιορισμούς στο πλαίσιο της πολιτικής του Πανεπιστημίου. Ο Δρ Sidransky είναι αμειβόμενη σύμβουλος OncoMethylome Επιστημών, SA και είναι αμειβόμενη μέλος της Επιστημονικής Συμβουλευτικής Επιτροπής της εταιρείας. Ο όρος της ρύθμισης αυτής είναι να διαχειρίζεται το Πανεπιστήμιο Johns Hopkins, σύμφωνα με τη σύγκρουση των πολιτικών συμφερόντων.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους μεταξύ των ανδρών και των γυναίκες και ευθύνεται για το 10% όλων των νέων περιπτώσεων καρκίνου και θανάτων από καρκίνο κάθε χρόνο [1]. Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών από καρκίνο του παχέος εντέρου έχει αυξηθεί κατά τα τελευταία 20 χρόνια, λόγω της έγκαιρης ανίχνευσης από την αυξημένη προβολή. Παρά την μεγάλη πρόοδο, πιο προηγμένη γνώση της μοριακής παθογένεσης της CRC ή βασικών περιβαλλοντικών /διαιτητικών παραγόντων στην ανάπτυξη CRC εξακολουθεί να είναι απαραίτητη. Επιπλέον, η εξεύρεση δυνητικών διαγνωστικοί δείκτες και θεραπευτικών στόχων για CRC θα βοηθήσει στην έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Οι περισσότεροι CRCs προκύπτουν από αδενωματώδη προδρόμους, και συσσώρευση μεταλλάξεων κέρδος-of-λειτουργίας σε πρωτο-ογκογονίδια και απώλειας λειτουργίας μεταλλάξεων σε ογκοκατασταλτικά γονίδια (ΟΚΓ) οδηγεί σε εξέλιξη της αδενωματώδεις βλαβών σε καρκίνωμα [2], [3], [4].

Εκτός από τις γενετικές μεταβολές που αφορούν μεταλλάξεις των ογκογονιδίων και ΕΠΠΕ, καρκινογόνες εξέλιξη από καλόηθες νεόπλασμα σε αδενοκαρκίνωμα μπορεί να συμβεί μέσω επιγενετικών αλλαγών στο υποκινητές γονιδίων [5]. Η ανώμαλη έκφραση του γονιδίου είναι ένα χαρακτηριστικό των ανθρώπινων καρκίνων, και οι αλλαγές στην κατάσταση μεθυλίωσης του DNA μπορεί να έχει σοβαρές επιπτώσεις στην έκφραση των γονιδίων. ΕΠΠΕ οθόνη τόσο γενετικοί όσο και επιγενετικών απενεργοποίηση σε ανθρώπινους όγκους, και η μεταγραφική σίγηση του ΟΚΓ απέδειξε υπερμεθυλίωση ως ενός κοινού μηχανισμού για απώλεια της λειτουργίας TSG σε ανθρώπινους καρκίνους [6], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου [7], [8]. Έτσι, η γνώση των προτύπων μεθυλίωσης σε όλο το γονιδίωμα μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό βασικών ΕΠΠΕ απενεργοποιούνται κατά τη διάρκεια του σχηματισμού όγκων [9], [10], [11].

Στο παρελθόν, έχουμε αναφερθεί ένα σύνολο υποψήφιων γονιδίων που αποτελούν μέρος της η αναδυόμενη «methylome του καρκίνου», χρησιμοποιώντας μια νέα δεδομένα αλγόριθμο δομή υποκινητή και μικροσυστοιχιών που παράγεται από κυτταρικές σειρές καρκίνου του 22 προήλθαν από 5 βασικοί τύποι καρκίνου [12]. Σε αυτή την προηγούμενη μελέτη, εξετάσαμε πρόσφατα εντοπίστηκαν ειδική για τον καρκίνο μεθυλιωμένα γονίδια σε ένα πάνελ των 300 πρωτοπαθείς όγκους που αντιπροσωπεύουν 13 τύπους καρκίνου. Με βάση τα στοιχεία, ο αριθμός των γνωστών μεθυλιωμένων γονιδίων ειδική για τον καρκίνο αυξήθηκε κατά περίπου 40%.

Στην παρούσα μελέτη, επανεξέτασε την κατάσταση μεθυλίωσης του καρκίνου ειδικής μεθυλιωμένων γονιδίων σε ένα μεγαλύτερο αριθμό ιστού και κόπρανα DNA από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς και τους ασθενείς χωρίς καρκίνο. Βρήκαμε ότι

Ογκοστατίνης Μ υποδοχέα-β

(

OSMR

) και

β-1,4-γαλακτοζυλοτρανσφεράση-1

(

B4GALT

) ήταν ιδιαίτερα μεθυλιωμένο σε πρωτογενείς ιστούς CRC αλλά σπάνια σε αντίστοιχο φυσιολογικό γειτονικό βλεννογόνο ούτε σε μη-κακοήθη φυσιολογικούς ιστούς κόλου. Η μεθυλίωση των γονιδίων αυτών ανιχνεύθηκε επίσης στα κόπρανα DNA από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά γενικά απουσιάζουν από ασθενείς μη καρκινικά. Επιπλέον,

OSMR

και

B4GALT

έκφραση mRNA σε καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Λειτουργικές μελέτες αποκάλυψαν μια κατασταλτική ρόλο για

OSMR

στο παχύ έντερο εξέλιξης του καρκίνου. Ως εκ τούτου,

OSMR

μεθυλίωση είναι βιολογικά σχετικές και μπορούν να ανιχνευθούν συχνά σε πρωτογενείς όγκους CRC και συμφωνημένα σκαμνί DNA.

Αποτελέσματα

ανάλυση μικροσυστοιχιών σε τρεις καρκίνου του παχέος εντέρου ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ( HCT116, ΗΤ-29 και DLD1) προσδιόρισε 52 δυνητικοί στόχοι γονίδιο με βάση την επανενεργοποίηση μετά την αγωγή με 5-αζα-άΟ [12]. Από αυτά τα 52 γονίδια,

sirtuin 2

(

SIRT2

) μετρήθηκε δύο φορές στη λίστα υποψήφιο γονίδιο μας, διότι έχει δύο διαφορετικούς αριθμούς ταυτοποίησης γονιδίων (NM_012237 και NM_030593) στη βάση δεδομένων NCBI. Επιπλέον,

μεθυλοτρανσφεράσης Ο6-μεθυλγουανίνη-DNA

(

MGMT

) είχε προηγουμένως αναφερθεί ότι φιλοξενούν ειδική για τον καρκίνο μεθυλίωση προαγωγού σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του παχέος εντέρου [9], έτσι ώστε να αποκλείονται

MGMT

από την περαιτέρω ανάλυσή μας (52 -2 = 50).

Η εκκρινόμενη κατσαρωμένα σχετίζονται πρωτεΐνη 4

(

SFRP4

) είχε προηγουμένως αναφερθεί να είναι μεθυλιωμένα στον καρκίνο του παχέος εντέρου [16], [17] και συμπεριλήφθηκε ως θετικός έλεγχος για γονιδιακή μεθυλίωση στη μελέτη μας.

νευροτροφίνης τύπου υποδοχέα τυροσινικής κινάσης 2

(

NTRK2

) και

τύπου ουροκινάσης ενεργοποιητή πλασμινογόνου

(

Plau

) συμπεριλήφθηκαν επίσης, επειδή δεν εκθέσεις σχετικά με μεθυλίωση της τα δύο γονίδια σε καρκίνο του παχέος εντέρου έχουν δημοσιευθεί ακόμα. Εξετάσαμε έτσι την κατάσταση μεθυλίωσης του ένα σύνολο 50 γονιδίων με διθειώδες-αλληλούχιση ή C-MSP σε καρκινικές κυτταρικές σειρές κόλου (HCT116, DLD1, RKO, και SW480) (Σχήμα S1). Ως αποτέλεσμα, βρήκαμε 23 γονίδια που πρέπει να μεθυλιωθεί σε περισσότερες από μία κυτταρική γραμμή (Πίνακας 1). Η μεθυλίωση στις άλλες 27 γονίδια δεν ανιχνεύθηκε σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν.

Η

Για την ταυτοποίηση των γονιδίων που φέρουν ειδική για τον καρκίνο μεθυλίωση προαγωγού, εξετάσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης των 23 γονιδίων σε πέντε με δέκα ζεύγη συνταιριασμένων πρωτοπαθών CRC (ΡΤ) και αντίστοιχο φυσιολογικό κόλον (PN) ιστούς. Φυσιολογικούς ιστούς βλεννογόνου του κόλου από ασθενείς μη καρκινικά (ΝΝ) συμπεριλήφθηκαν επίσης να συγκρίνουν εξειδίκευση μεθυλίωσης μεταξύ του καρκίνου και μη καρκινοπαθείς. Αποκλείσαμε γονίδια που έτρεφε μεθυλίωση σε ΝΝ με συχνότητες υψηλότερες από 30%. Ως αποτέλεσμα, βρήκαμε ότι

3′-5′-phosphoadenosine phosphosulfate συνθάσης 2

(

PAPSS2

),

γονίδιο γ-τουμπουλίνης 2

(

TUBG2

),

NTRK2

,

B4GALT1

, και

OSMR

καθώς και

SFRP4

έτρεφε ειδική για τον καρκίνο μεθυλίωση με υψηλές συχνότητες (& gt? 30 %) (Πίνακας 2). Όλα τα 6 από αυτά τα γονίδια δεν τρέφουν μεθυλίωση σε όλα τα ΝΝ δοκιμαστεί, και οι διαφορές στην NN

vs.

PT και μεθυλίωση

vs.

Περιπτώσεις unmethylation ήταν στατιστικά σημαντικές. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα του C-MSP, διθειώδες-αλληλουχίας, και COBRA σε κυτταρικές σειρές και ιστούς δείχνεται στο Σχήμα 1Α και το Σχήμα S2.

Α, κατάσταση μεθυλίωσης του κάθε γονιδίου εξετάσθηκε σε κυτταρικές σειρές και ιστούς CRC με C -MSP μετά PCR με μεθυλίωση ειδικούς εκκινητές. Τα προϊόντα PCR διέτρεξαν επί πηκτωμάτων αγαρόζης 4% προ-βάφτηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο.

In vitro

μεθυλιωμένα, κατεργασμένου με όξινο θειώδες ανθρώπινη φυσιολογική του DNA των λεμφοκυττάρων (NL) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για PCR, και απεσταγμένο νερό (DW) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος PCR.

β-ακτίνης

χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την ακεραιότητα του DNA.

SLC39A4

και

SLC9A3R1

υπέστησαν μεθυλίωση τόσο σε κυτταρικές σειρές και ιστούς, αλλά

GANAB

,

Plau

και

UBE3A

δεν ήταν . Οι άλλες 5 γονίδια μεθυλιωμένα σε μία από τις τρεις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν, και μόνο μεθυλιωμένο σε ιστούς CRC (PT). PN, αντιστοιχισμένο φυσιολογικούς ιστούς κόλου από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου? PT, σε συνδυασμό CRC? NN, φυσιολογικό επιθήλιο κόλου από ασθενείς μη καρκινικά. Αποτελέσματα C-MSP του

OSMR

σε κυτταρικές σειρές και ιστούς CRC παρουσιάστηκαν σε προηγούμενη έκθεση [12]. Β, οικόπεδα διασπορά των τιμών μεθυλίωσης έξι υποψήφια γονίδια σε ιστούς και κυτταρικές γραμμές (CL). Οι συνολικές τιμές μεθυλίωσης (τιμές μεθυλίωση TaqMan, TaqMeth V) και η βέλτιστη εξειδίκευση /ευαισθησία στη βέλτιστη cut-offs που υπολογίζεται από την ανάλυση ROC φαίνονται στον Πίνακα 3. Τα βέλη δείχνουν τις βέλτιστες τιμές αποκοπής για κάθε γονίδιο. Δεν έχουν αναφερθεί περιπτώσεις NN εμφανίζεται TaqMeth V πάνω από τις βέλτιστες cut-offs για

B4GALT1

και

OSMR

. ΗΕΚ293, ένα μη-ογκογόνα γραμμή κυττάρων, στέγαζε ένα υψηλό επίπεδο

B4GALT1

μεθυλίωσης (TaqMeth V, 101,12), αλλά

OSMR

μεθυλίωση δεν ανιχνεύθηκε στην κυτταρική σειρά (TaqMeth V, 0,00 ). *, Δείγματα με μια αναλογία ίση με μηδέν δεν θα μπορούσε να καταγράφεται σωστά σε λογαριθμική κλίμακα, έτσι παρουσιάζονται εδώ ως 0,1. Ολες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις διπλούν μορφή, και τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές. Τα δεδομένα έδειξαν ότι αναπαραγώγιμα και συγκλίνουσες αποτελέσματα εις τριπλούν. TaqMeth V περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. C, ποσοτικά επίπεδα μεθυλίωσης του

B4GALT1

και

OSMR

στην πρωτοβάθμια ιστούς του παχέος εντέρου. Διάγραμμα διασποράς του

B4GALT1

και

OSMR

μεθυλίωση του υποκινητή. Τα βέλη δείχνουν βέλτιστες τιμές αποκοπής για κάθε γονίδιο (3.877 για το

B4GALT1

και 22.01 για

OSMR

).

Η

Για τη μελέτη της μεθυλίωσης υποστηρικτής αυτών 6 γονίδια από TaqMan-MSP ανάλυση σε πραγματικό χρόνο, σχεδιάσαμε εκκινητών και ανιχνευτών που στοχεύουν ειδικά τα νησιά CpG του κάθε γονιδίου (Σχήμα S3). Αυξήσαμε τους αριθμούς του δείγματος σε πάνω από 25 ζεύγη των πρωτογενών CRC (ΡΤ) και αντίστοιχο φυσιολογικό κόλον (PN) ιστούς, και σε 13 φυσιολογικούς ιστούς βλεννογόνου του κόλου από ασθενείς μη-καρκίνου (ΝΝ). Η κατανομή των τιμών μεθυλίωσης για κάθε γονίδιο φαίνεται στο Σχήμα 1Β. Λόγω της ετερογενούς κλωνική μπαλώματα είναι γνωστό για την επέκταση πέρα ​​από τα σύνορα του όγκου, επίσης παρατηρείται συνήθως ένα χαμηλό επίπεδο μεθυλίωσης στο PN. Οι συνολικές τιμές μεθυλίωσης (τιμές μεθυλίωση TaqMan, TaqMeth V) παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.

B4GALT1

και

OSMR

έτρεφε υψηλότερα επίπεδα συνολικής μεθυλίωσης σε ΡΤ από εκείνες στις ΡΝ και ΝΝ, και ο οι διαφορές ήταν σημαντικές και για τις δύο γονιδίων μεταξύ του PT και PN (

P & lt? 0.001

) και μεταξύ του PT και ΝΝ (

P & lt? 0.001

). Όταν οι τιμές μεθυλίωση συγκρίθηκαν στο πλαίσιο των επιμέρους ζεύγη δειγμάτων PN και PT, σημαντικά υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης του

PAPSS2 TUBG2

,

NTRK2

, και

SFRP4

βρέθηκαν στο 60% ( 18/30), 50% (15/30), 30% (9/30) και 36% (11/30), αντίστοιχα, σε σχέση με το PN αντίστοιχα δείγματα όγκου (PT). Υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης του

B4GALT1

σε δείγματα PN βρέθηκε μόνο σε 4 περιπτώσεις (13,3%, 4/30), και μεθυλίωση του

OSMR

δεν βρέθηκε σε κανένα από τα ζεύγη φυσιολογικά (0 %, 0/25).

Η

Η μεθυλίωση των 6 γονιδίων σε ιστό έδειξε εξαιρετικά διακριτική δέκτη-χειριστή χαρακτηριστικό (ROC) καμπύλη προφίλ, διακρίνοντας σαφώς CRC (PT) από την κανονική βλεννογόνο του παχέος εντέρου (ΝΝ) (

P & lt? 0.001

) (Σχήμα S4A). AUROC (περιοχή κάτω από ROC) ήταν πάνω από 0.76 σε όλα τα γονίδια που εξετάστηκαν. Για να μεγιστοποιηθεί η ευαισθησία και η εξειδίκευση, οι βέλτιστες cut-off για τα 6 γονίδια υπολογίστηκαν από την ανάλυση ROC (PT

vs

. ΝΝ) και φαίνονται στον Πίνακα 3. Κατά cut-off οριστεί για βέλτιστη εξειδίκευση 90% ή περισσότερο, η ευαισθησία του κάθε γονιδίου σε ΡΤ ήταν πάνω από 70%. Δεν έχουν αναφερθεί περιπτώσεις NN εμφανίζεται TaqMeth V πάνω από τις βέλτιστες cut-offs για

B4GALT1

και

OSMR

(100% ειδικότητα). Οι ευαισθησίες του

B4GALT1

και

OSMR

ήταν 83% (25/30) και 80% (20/25), αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

B4GALT1

και

OSMR

λιμάνι ειδική για τον καρκίνο μεθυλίωσης στο CRC με υψηλή συχνότητα. Ως εκ τούτου, εστιάσαμε στο

B4GALT1

και

OSMR

για περαιτέρω μελέτη.

Εξετάσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης του

B4GALT1

και

OSMR

σε 100 νέα ζεύγη CRC (ΡΤ) και αντίστοιχο φυσιολογικό (PN) ιστούς με ανάλυση TaqMan-MSP (Σχ. 1 C). Η TaqMeth V στο PT κυμαίνονταν μηδέν έως 370,70 (μέση τιμή 3,70) για

B4GALT1

και μηδέν έως 749,27 (μέση τιμή 59,24) για

OSMR

. Η αξία PN κυμαίνονταν από 0 έως 9,70 (μέση τιμή 0,26) για

B4GALT1

και 190.68 (μέση τιμή 1,54) για

OSMR

. Τα επίπεδα συνολικής μεθυλίωσης του

B4GALT1

και

OSMR

ανιχνευθεί σε PT (22.33 ± 48.69 για

B4GALT1

και 116,83 ± 151,52 για

OSMR

, μέση τιμή ± SD, n = 100) ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερες από εκείνες στο PN (0,90 ± 1,37 για

B4GALT1

και 6,49 ± 21,52 για

OSMR

, μέσος όρος ± SD, n = 100) (

P & lt? 0.001

). Στα βέλτιστη cut-offs (τιμές, 3,87 για

B4GALT1

και 22.01 για

OSMR

) υπολογίζεται από την ανάλυση ROC (PT

vs

. PN) (Σχήμα S4B) , η ειδικότητα των δύο γονιδίων ήταν πάνω από 96%. Οι ευαισθησίες του

B4GALT1

και

OSMR

ήταν 49% (49/100) και 80% (80/100), αντίστοιχα. Στο σύνολό τους,

B4GALT1

και

OSMR

ήταν συχνά μεθυλιώνονται στην πρωτοβάθμια ιστούς CRC, αλλά εμφανίζεται απουσιάζει ή χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης σε αντίστοιχες φυσιολογικούς ιστούς.

Στη συνέχεια, θα πραγματοποιηθεί μια τύφλωσε ανάλυση της ανάλυσης γονιδίου μεθυλίωσης στα κόπρανα DNA που συλλέγονται από ασθενείς με ή χωρίς καρκίνο του παχέος εντέρου. Η κλινική κατάσταση των ασθενών δεν αποκαλύφθηκε μέχρι την ολοκλήρωση της ανάλυσης. Εξετάσαμε επίσης υπερμεθυλίωση

SFRP1

ως θετικός έλεγχος για ανίχνευση γονιδίου μεθυλίωσης στα κόπρανα του DNA [18]. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης ROC στο DNA σκαμνί που φαίνεται στο Σχήμα 2. Ο Πίνακας 4 δείχνει την ευαισθησία /ειδικότητα του κάθε γονιδίου για τον καρκίνο του παχέος εντέρου που ανιχνεύονται σε δείγματα κοπράνων DNA.

SFRP1

μεθυλίωση δεν ανιχνεύθηκε σε ασθενείς με ενδοσκοπικά φυσιολογικό κόλον (0%, 0/15), και βρέθηκε σε 55% (11/20) των ασθενών CRC, στην βέλτιστη τιμή αποκοπής υπολογίστηκε από η ανάλυση ROC. Η μεθυλίωση του

B4GALT1

και

OSMR

ανιχνεύθηκε στο 64% (9/14) και 80% (16/20) των δειγμάτων DNA κοπράνων από ασθενείς CRC, αντίστοιχα. Όταν μεθυλίωση του

SFRP1

και

OSMR

συνδυάστηκε, η ευαισθησία ήταν 60% (12/20), και η ειδικότητα ήταν 100% (0/15). Διακρίσεις μεταξύ των ασθενών χωρίς καρκίνο και σε ασθενείς CRC από

SFRP1

ή

OSMR

μεθυλίωση ήταν στατιστικά σημαντική (

P & lt? 0,01

).

Ένα τύφλωσε δοκιμή ήταν πραγματοποιήθηκε για ανάλυση μεθυλίωσης του γονιδίου στα κόπρανα DNA που συλλέγονται από ασθενείς με ή χωρίς καρκίνο του παχέος εντέρου.

SFRP1

συμπεριλήφθηκε να συγκρίνουν τη συχνότητα της μεθυλίωσης ενός γνωστού μετουσιωμένο γονίδιο ειδική για τον καρκίνο. Ευαισθησία /ειδικότητα με βάση τη βέλτιστη cut-offs που υπολογίζεται από την ανάλυση ROC παρουσιάζεται στον Πίνακα 4.

Η

OSMR

μεθυλίωση ελέγχθηκε με τυφλό τρόπο σε ένα πιο ανεξάρτητο σύνολο των κοπράνων δείγματα (καμία επικάλυψη με τα δείγματα στον πίνακα 4). Σκαμνί DNA από υγιή άτομα της ομάδας ελέγχου που δεν είχαν οπτική τις ανωμαλίες σε κολονοσκόπηση συμπεριλήφθηκαν για αυτή τη μελέτη. Η ευαισθησία του

OSMR

μεθυλίωση σε ασθενείς CRC ήταν 38% (26/69) και η ειδικότητα ήταν 95% (77/81) (Πίνακας 5). Η διαφορά μεταξύ των ασθενών CRC και υγιών μαρτύρων ήταν στατιστικά πολύ σημαντική (

P & lt? 0.001

). Επιπλέον,

OSMR

μεθυλίωση ανιχνεύθηκε στο 56% (15/27) και 44% δείγματα (8/18) σκαμνί DNA από CRC στάδιο ασθενείς II και III, αντιστοίχως. Επιπλέον, 34 από 41 περιπτώσεις (83%) των κοπράνων DNA από διαψεύδοντας τους ασθενείς ελέγχου χωρίς CRC ήταν τελείως αρνητικοί για

OSMR

μεθυλίωσης. Άλλες κλινικές παράμετροι σε σύγχυση ελέγχων, όπως εκκολπωμάτωση, αιμορροΐδες, και πολύποδες δεν σχετίστηκαν σημαντικά με

OSMR

κατάσταση μεθυλίωσης στα κόπρανα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Για να εξετάσει τα μεταγραφικά επίπεδα του

B4GALT1

και

OSMR

, εκτελέσαμε RT-PCR ή ανάλυση σε πραγματικό χρόνο RT-PCR (Εικ. 3) χρησιμοποιώντας cDNA που παρασκευάσθηκε από κυτταρικές σειρές CRC (HCT116, ΗΤ29, DLD-1 , RKO, και SW480) και ένα μη-ογκογονική κυτταρική σειρά, ΗΕΚ293.

OSMR

έκφραση παρατηρήθηκε μόνο στα κύτταρα όπου η μεθυλίωση του

OSMR

δεν βρέθηκε (HCT116 και ΗΕΚ293). Αύξηση του

OSMR

έκφραση με επεξεργασία 5-αζα-άΟ είχε αναφερθεί στο παρελθόν [12], υποδηλώνοντας ότι η έκφραση του

OSMR

συσχετίζεται στενά με μεθυλίωση προαγωγού. Βασική έκφραση του

B4GALT1

ανιχνεύθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν, και όλες αυτές οι κυτταρικές σειρές έτρεφε επίσης μεθυλίωση του

B4GALT1

. Ωστόσο,

B4GALT1

αυξήθηκε περαιτέρω κατά 5-Αζα-dC (Σχήμα S5A), υποδεικνύοντας ότι η έκφραση της ήταν τουλάχιστον εν μέρει καταστέλλεται με μεθυλίωση προαγωγού.

Α, Έκφραση

B4GALT1

και

OSMR

σε κυτταρικές σειρές εξετάστηκε με ανάλυση RT-PCR. Η μεθυλίωση του

B4GALT1

στις κυτταρικές σειρές εξετάστηκε από C-MSP ή TaqMan-MSP. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Μ, μεθυλίωση? U, unmethylation. Β και C, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε πέντε ζεύγη (α – ε) της κανονικής (ΡΝ) και cDNA όγκων που παρασκευάστηκε από CRC ασθενείς (PT) (

αριστερά

). Η έκφραση του

B4GALT1

(Β) και

OSMR

(C) συγκρίθηκαν επίσης μεταξύ των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου (Τ) ή χωρίς καρκίνο (ΝΝ) (

δεξιά

). Σχετική έκφραση (Πάσο) υπολογίστηκε συγκρίνοντας τις αναλογίες της έκφρασης του mRNA της

B4GALT1

και

OSMR

σε ένα γονίδιο εσωτερικού ελέγχου, GAPDH. Τα πειράματα γίνονται εις διπλούν, και οι τιμές υποδεικνύουν μέσα ± SD. *,

P & lt? 0,05

. Τα πειράματα γίνονται εις διπλούν, και οι τιμές υποδεικνύουν μέσα ± SD. *,

P & lt?. 0.05

Η

Στη συνέχεια εκτελείται σε πραγματικό χρόνο RT-PCR σε cDNA που παρασκευάζεται από όγκο (PT) και των αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών (PN) πέντε επιμέρους καρκίνου του παχέος εντέρου ασθενείς (συμφωνημένα cDNA). Σε 3 από 5 περιπτώσεις όγκων,

OSMR

ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται (Σχ. 3C,

αριστερά

). Η έκφραση του

B4GALT1

και

OSMR

σε όγκο ήταν τρεις και τέσσερις φορές μικρότερη από ό, τι στο φυσιολογικό ιστό (ΝΝ), αντίστοιχα (Σχ. 3Β και C,

δεξιά

) . Με ανοσοϊστοχημική χρώση μιας μικροσυστοιχίας κόλον φυσιολογικών και καρκινικών ιστών με ένα αντίσωμα αντι-OSMR, ανιχνεύσαμε ισχυρή έκφραση του

OSMR

σε όλα τα μη-κακοήθεις φυσιολογικούς ιστούς (ΝΝ) και των παρακείμενων βλεννογόνο φυσιολογικό κόλον (PN) από άνω και κάτω τελεία ασθενείς με καρκίνο (Εικ. 4 και Πίνακας 6). Ωστόσο,

OSMR

ήταν μόλις και μετά βίας ανιχνεύθηκε σε σχεδόν όλων των πρωτοπαθών όγκων (PT) (ασθενής έκφραση σε 4 από τα 10 περιπτώσεις). Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ειδικής ελάττωσης του

OSMR

mRNA και της πρωτεΐνης στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Ισχυρή έκφραση του

OSMR

ανιχνεύθηκε σε όλα τα μη-κακοήθη φυσιολογικούς ιστούς (ΝΝ) και γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου (ΡΝ). Σε αντίθεση,

OSMR

σπάνια ανιχνεύεται στα νεοπλασματικά κύτταρα από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Οι βαθμοί του όγκου που υποδεικνύεται.

Η

Για να διερευνήσουν το ρόλο της μεθυλίωσης του DNA στη ρύθμιση του

OSMR

έκφρασης, έχουμε επιμολυσμένα μια pGL3-

OSMR

-Pro2 -Luciferase κατασκευή σε τρεις κυτταρικές σειρές? ένα

OSMR

-αρνητικοί κυτταρική γραμμή, SW480, και δύο

OSMR

-θετικό κυτταρικές σειρές, HCT116 και ΗΕΚ293. Το κατασκεύασμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς

Sss

Ι μεθυλάση πριν από την επιμόλυνση. Δραστηριότητα του

OSMR

υποκινητή δεν ανιχνεύθηκε σε SW480, αλλά ένα υψηλό επίπεδο δραστηριότητας προαγωγού ανιχνεύθηκε σε HCT116 και κύτταρα ΗΕΚ293 (Εικ. 5Α). Επαγωγή της CpG μεθυλίωσης με

Sss

Ι μεθυλάση μείωσε τη δραστηριότητα σε ελάχιστα επίπεδα.

Α, ανάλυση των

OSMR

δράση προαγωγού με τη δοκιμασία λουσιφεράσης σε OSMR-θετικό (HCT116 και ΗΕΚ293) και – αρνητικό (SW480) κύτταρα. Το κατασκεύασμα υποκινητή προ-επεξεργασία με ή χωρίς

Sss

Ι μεθυλάση για 8 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Η υψηλότερη δραστικότητα ανιχνεύθηκε σε ΗΕΚ293 κύτταρα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως φορές αύξηση πάνω από pGL3-βασικό δραστηριότητα. Τα πειράματα γίνονται εις τριπλούν, και οι τιμές υποδεικνύουν μέσα ± SD. Οι μέσες τιμές παρουσιάζονται. Β, siRNA πισίνα στόχευσης

OSMR

και μη στόχευση ελέγχου επιμολύνθηκαν παροδικά σε HCT116, και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με rhOSM (50 ng /ml) (

αριστερά

). κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ή χωρίς Stat3 αναστολέα πεπτίδιο (Stat3 Inh, 100 μΜ) ενεργεί ως μια εξαιρετικά επιλεκτική, ισχυρός αναστολέας της ενεργοποίησης Stat3 (

δεξιά

). Η κυτταρική ανάπτυξη προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Τα δεδομένα εκφράζονται ως απορρόφηση σε 570 nm. Τα πειράματα γίνονται εις τριπλούν, και οι τιμές υποδεικνύουν μέσα ± SD.

*, P & lt? 0,05

. C, 5-Αζα-dC (5 μΜ) προ-θεραπεία για 48 ώρες σε SW480 και κύτταρα DLD-1, και στη συνέχεια συν-θεραπεία με rhOSM για 48 ώρες. Η κυτταρική ανάπτυξη προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. *, 5-Αζα-άΟ-κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα (

P & lt? 0,05

)? #, 5-Αζα-DC /rhOSM- κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με τη θεραπεία 5-Αζα-dC μόνο (

P & lt? 0,05

). Α, Η φωσφορυλίωση του

Stat3

και

Erk

σε απόκριση σε rhOSM (50 ng /ml) αναλύθηκε με κηλίδωση Western σε HCT116 και κυτταρικές σειρές SW480. rhOSM αυξημένη φωσφορυλιωμένη

Stat3

και

Erk

σε κύτταρα HCT116 αλλά όχι σε κύτταρα SW480 (τα οποία στερούνται LIFR-βλέπε Ε παρακάτω). Ίση φόρτωση πρωτεΐνης παρακολουθήθηκε με συνολικό

Stat3

,

Erk

και

β-ακτίνης

αξιολόγηση στα δείγματα. Επαναδραστηριοποίηση

OSMR

με επεξεργασία 5-Αζα-άΟ προσδιορίστηκε σε SW480 και DLD-1 κύτταρα με κυτταρομετρία ροής (σχήμα S6). Ε Έκφραση

LIFR

και

gp130

εξετάστηκε σε κυτταρικές σειρές CRC με RT-PCR.

LIFR

εκφράστηκε σε κύτταρα HCT116 αλλά σιγήσει στις περισσότερες άλλες κυτταρικές γραμμές CRC δοκιμάστηκαν.

gp130

, η

OSMR

ετεροδιμερές, είχε εκφράζεται παντού σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. δεν εξετάστηκε κατάσταση Promoter μεθυλίωσης αυτών των δύο τελευταίων γονιδίων.

Η

ογκοστατίνη Μ (OSM) είναι μία ιντερλευκίνη-6 (IL-6) -τύπου κυτοκίνης, αλλά πιο δραστική από IL-6 στην αναστολή της πολλαπλασιασμός πολλών κυτταρικών σειρών συμπαγών όγκων [19], [20]. Πρόσφατα, μια συσχέτιση της αντίστασης στην αναστολή της ανάπτυξης από OSM με ειδική απώλεια του

OSMR

και σηματοδότηση Stat3 αναφέρθηκε [15]. Για να εξεταστεί η αντίσταση των κυττάρων CRC στην αναστολή της ανάπτυξης από OSM, έχουμε παροδικά επιμολυσμένα πισίνα siRNA που στοχεύει OSMR και ένα μη-στόχευσης siRNA ελέγχου σε

OSMR

εκφράζοντα κύτταρα HCT116, και εκτελείται μία τυπική δοκιμασία κυτταρικής ανάπτυξης μετά την αγωγή των κυττάρων με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη OSM (rhOSM). Παρατηρήσαμε σημαντική αναστολή αύξησης με rhOSM σε κύτταρα HCT116, και η αναστολή αντιστράφηκε με knock-down του

OSMR

(Σχ. 5Β, αριστερά). Ένα πεπτίδιο αναστολέα Stat3 (Stat3 Inh) που καταργείται Stat3 ενεργοποίηση (Σχ. 5D) μπλοκάρει την rhOSM επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης σε κύτταρα HCT116 (Εικ. 5Β, δεξιά). Σταθερά, η καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων από rhOSM δεν παρατηρήθηκε σε SW480 και DLD-1 κύτταρα με

OSMR

μεθυλίωση προαγωγού (Εικ. 5C). Είναι ενδιαφέρον ότι η αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης με επεξεργασία 5-Αζα-dC σε κύτταρα SW480 και DLD-1 (*,

P & lt? 0,05

) ήταν σημαντικά αυξημένη με τη θεραπευτική αγωγή rhOSM (#,

P & lt? 0.05

). Τέλος παρατηρήσαμε ότι rhOSM ενεργοποιείται φωσφορυλίωση Stat3 σε κύτταρα HCT116, ανεξάρτητα OSMR επίπεδα έκφρασης (Σχ. 5D, αριστερά). Η έκφραση του

gp130

και

LIFR

mRNA παρατηρήθηκε σε κύτταρα HCT116 (Εικ. 5Ε), υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση των Stat3 σε κύτταρα HCT116 με πολύ χαμηλή έκφραση OSMR που προκαλείται από siRNA μορφομετατροπή μπορεί να είναι μέσω gp130 /LIFR (τύπου υποδοχέα Ι OSM) μεσολάβηση σηματοδότησης. φωσφορυλίωση Erk αυξημένη σε κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με στόχευση siRNA

OSMR

, και το βασικό επίπεδο φωσφο-ΕΚΚ σε SW480 κύτταρα με

OSMR

μεθυλίωσης ήταν υψηλότερη από ό, τι στα κύτταρα HCT116 (Εικ. 5D). 5-Αζα-άΟ μειώθηκε μερικώς ενεργοποιημένο Erk σε κύτταρα SW480, και rhOSM ανακτηθεί βασική phopshorylation Erk παρουσία 5-αζα-DC. Έτσι, μεθυλιωμένο

OSMR

αισθητά μειωμένο όγκο αναστολής σήματα από rhOSM και σημαντικά γεγονότα κατάντη σηματοδότησης.

Συζήτηση

Ανάδοχος μεθυλίωση των βασικών ρυθμιστικών γονιδίων οδηγεί τη διαδικασία του καρκίνου και η σωστό πλαίσιο μπορεί να χρησιμεύσει ως ένας διαγνωστικός δείκτης και θεραπευτικός στόχος. Καρκίνος-ειδική μεθυλίωση χρησιμεύει ως ένα σημαντικό βιοδείκτη για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου. Αυτοί οι δείκτες μπορεί να συμπληρώσει την κυτταροπαθολογικά αξιολόγηση των βιοψιών ιστού ή δυνητικά σταθούν στα δικά τους ως δείκτες της νόσου σε διάφορα σωματικά υγρά, όπως σκαμνί. Για το σκοπό αυτό, η συχνότητα μεθυλίωση των γονιδίων που ταυτοποιούνται στο πρωτογενές ιστούς έχει σημαντικές κλινικές επιπτώσεις.

Ένας αριθμός γονιδίων συνήθως υπερμεθυλίωση σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC), συμπεριλαμβανομένων των

hMLH1

,

p16INK4a

,

p14ARF

,

RAR-β

,

APC

,

MGMT

,

κυκλίνη Α1

,

CDX1

,

MYOD1

,

COX-2

και

WT-1

[21], [22], [23]. Ωστόσο, τα γονίδια μεθυλιωμένο μόνο σε νεοπλαστικούς ιστούς με υψηλή συχνότητα (πάνω από 40%) είναι σπάνιες. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε

PAPSS2

,

TUBG2

,

NTRK2

,

B4GALT1

και

OSMR

[12], [ ,,,0],24] ως γονίδια που φέρουν ειδική για τον καρκίνο μεθυλίωση προαγωγού σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου. Η θεωρητική ευαισθησία κάθε μεθυλιωμένο γονίδιο ήταν πάνω από 70% και οι ιδιαιτερότητες ήταν πάνω από 90% κατά TaqMan-MSP. Η συχνότητα μεθυλίωση του κάθε γονιδίου κατατάσσεται με μόνο μερικά άλλα γονίδια μεθυλιωμένη σε υψηλή συχνότητα σε CRC (

Κυκλίνης Α1, CDX1, RAR-β, MYOD1, p15INK4b και COX-2

) σε μία ειδική για τον καρκίνο τρόπο [ ,,,0],10].

Μελέτες για

B4GALT1

και

OSMR

έχουν αναφερθεί στον καρκίνο του ανθρώπου.

B4GALT1

εντοπίζεται τόσο στο Golgi σύμπλοκο και στην κυτταρική επιφάνεια [25], και εκφράζεται ιδιοσυστατικά σε όλους τους ιστούς περιλαμβανομένων των ανθρωπίνων παχέος βλεννογόνο [26] με την εξαίρεση του εγκεφάλου [27]. Ο ρόλος της κυτταρικής επιφάνειας

B4GALT1

στον καρκίνο του ανθρώπου έχει αναφερθεί? είναι ένα γονίδιο οιστρογόνο-ελεγχόμενα σε MCF-7 κύτταρα [28], και το επίπεδο της μεταβλήθηκε σε εξαιρετικά μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα σε σύγκριση με λιγότερο μεταστατικά γονικά κύτταρα του [29].

B4GALT1

προάγει την απόπτωση μέσω αναστολής της οδού του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα [30] και αυξάνει κυκλοεξιμίδιο επαγόμενη απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα ηπατοκαρκινώματος [31]. Πρωτεΐνη κινάση Β /Akt αναστέλλει την απόπτωση με ρύθμιση προς τα κάτω του

B4GALT1

[25]. Επιπλέον, η ενισχυμένη επιθηλιακών κυττάρων του πολλαπλασιασμού του δέρματος και του λεπτού εντέρου και ανώμαλη διαφοροποίηση των εντερικών λαχνών βρέθηκαν σε

B4GALT1

ελλιπή ως ποντικούς [32], υποδηλώνοντας ότι

B4GALT1

διαδραματίζει σημαντικό και κατασταλτική ρόλο στον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων. Έτσι, η απενεργοποίηση του με μεθυλίωση προαγωγού μπορεί να οδηγήσει σε διαφυγή των φυσιολογικών κυτταρικών ελέγχων και εξέλιξη του καρκίνου.

OSMR είναι ένας υποδοχέας της ογκοστατίνης Μ (OSM), μία ιντερλευκίνη-6 (IL-6) -τύπου κυτοκίνης προσδιορίζονται ως ένας ισχυρός καταστολέας των καρκινικών κυττάρων. Ανθρώπινα OSM αρχικά περιγράφηκε από την ικανότητά της να αναστέλλει πολλαπλασιασμό μελανώματος in vitro [33], [34], και τους στόχους της για την αναστολή της ανάπτυξης περιλαμβάνουν καρκινώματα του πνεύμονα [35], καρκινώματα των ωοθηκών [36], και όγκους του μαστού [37]. Αντοχή στην αναστολή της ανάπτυξης από OSM σε μεταστατικές κυτταρικές σειρές μελανώματος συσχετίζεται με ένα συγκεκριμένο απώλεια OSMR, σε συνδυασμό με ένα χαμηλότερο επίπεδο ακετυλίωσης ιστόνης στην περιοχή OSMR υποκινητή, υποδεικνύοντας ότι μεταστατικά κύτταρα μελανώματος θα μπορούσε να ξεφύγει τον έλεγχο της ανάπτυξης του OSM από την επιγενετικές σίγηση του OSMR [15]. Ανακαλύψαμε ότι η μεθυλίωση προαγωγού συσχετίζεται έντονα με την έκφραση OSMR και βρήκαν επίσης μια συσχέτιση της αντίστασης στην αναστολή της ανάπτυξης από OSM με απώλεια OSMR σε κυτταρικές γραμμές CRC. Έτσι, η μεθυλίωση υποκινητής είναι ένας ρυθμιστής κλειδί της έκφρασης OSMR και όλα αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν μία λειτουργία καταστολής για OSMR στον ανθρώπινο καρκίνο

Ανθρώπινο OSM σχηματίζει δύο τύποι συμπλοκών ετεροδιμερών σηματοδότησης.? /Λευχαιμίας του υποδοχέα gp130 ανασταλτικό παράγοντα (LIFR) (σύμπλοκο υποδοχέα τύπου Ι OSM) [39] και OSMR (σύμπλεγμα II OSM υποδοχέα τύπου) gp130 /[40]. gp130 /LIFR μπορεί να ενεργοποιηθεί με LIF ή OSM, αλλά gp130 /OSMR ενεργοποιείται από μόνο OSM. Το σύμπλεγμα του υποδοχέα τύπου ΙΙ ενεργοποιεί OSM-ειδικά μονοπάτια σηματοδότησης μέσω της JNK /SAPK και μονοπάτια Stat1 /Stat5, ενώ τόσο τύπου Ι και τύπου ΙΙ συγκροτήματα ενεργοποιήσετε Stat3 και Erk ως κοινά μονοπάτια σηματοδότησης σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [41]. Επιπλέον, ο τύπος Ι και σηματοδότηση υποδοχέα τύπου II μπορεί να εμφανίζουν ανταγωνιστική λειτουργίες [42]. Βρήκαμε ότι OSM μεσολάβηση αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης δεν παρατηρήθηκε σε HCT116 κύτταρα με χαμηλό επίπεδο OSMR παρά Stat 3 φωσφορυλίωση. Δεδομένου ότι τα κύτταρα HCT116 εκφράζεται gp130 και LIFR, rhOSM πιθανό φωσφορυλιώνει Stat3 μέσω σηματοδότηση μεσολαβούμενη από υποδοχέα Ι OSM τύπου, αλλά εν τη απουσία της gp130 /OSMR αποτέλεσμα αυτό δεν είναι επαρκής για να μεσολαβήσει παρατεταμένη καταστολή της ανάπτυξης [41]. Προς στήριξη αυτής της έννοιας, rhOSM δεν αυξάνει φωσφορυλίωση Stat3 στα SW480 κύτταρα, τα οποία δεν έχουν έκφραση LIFR

Από κλινική άποψη, τα αποτελέσματά μας έχουν τη δυνατότητα άμεσης διάγνωσης και θεραπείας επιπτώσεις και χρήζουν περαιτέρω προσοχής. Σε τύφλωσε δοκιμή που διεξάγεται στα κόπρανα DNA από ασθενείς CRC,

B4GALT1

και

OSMR

μεθυλίωση επιτυχία ανιχνεύθηκαν με υψηλή συχνότητα και έτσι έχουν το δυναμικό για τον εντοπισμό ατόμων με καρκίνο του παχέος εντέρου. Όταν ελέγξαμε ένα πρόσθετο γνωστό μετουσιωμένο γονίδιο,

SFRP1

[18], σε συνδυασμό με το

OSMR

την ευαισθησία της δοκιμασίας αυξήθηκε? 60% (12/20) των καρκίνων του παχέος εντέρου ανιχνεύθηκε στα κόπρανα DNA με τέλεια ειδικότητα (

P & lt? 0.001

). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η μεθυλίωση προαγωγού του

OSMR

θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια πραγματική δείκτης για την παρουσία του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Θεραπευτικά, και τα δύο γονίδια παρέχουν δελεαστική ενδείξεις για νέες προσεγγίσεις στην θεραπεία της CRC. Οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα S1.