Αφηρημένο

Κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων δεκαετιών, πρωτεάσες της κυτταρικής επιφάνειας που ανήκει στον τύπο II διαμεμβρανική πρωτεάση σερίνης (TTSP) της οικογένειας έχουν αναδειχθεί ως σημαντικό ένζυμα στην degradome θηλαστικών, παίζοντας κρίσιμο ρόλο στη βιολογία επιθηλιακά, τη ρύθμιση της μεταβολικής ομοιοστασίας, και καρκίνο. Ανθρώπινη αεραγωγών πρωτεάση τύπου θρυψίνης 5 (HATL5) είναι ένα από τα λίγα μέλη της οικογένειας που παραμένει μη χαρακτηρισμένο. Εδώ αποδεικνύουμε ότι HATL5 είναι ένα καταλυτικά ενεργό πρωτεάση σερίνης που αναστέλλεται από τους δύο αναστολείς πρωτεάσης σερίνης τύπου Kunitz, ανάπτυξης ηπατοκυττάρου αναστολέα του παράγοντα ενεργοποιητή (ΕΑΒ) -1 και 2, καθώς και από serpinA1. Πλήρους μήκους HATL5 εντοπίζεται στην κυτταρική επιφάνεια των καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών, όπως καταδεικνύεται με συνεστιακή μικροσκόπηση. HATL5 εμφανίζει ένα σχετικά περιορισμένο προφίλ έκφρασης ιστού, τόσο με μεταγραφή και πρωτεΐνη που υπάρχει στον τράχηλο, οισοφάγο, και της στοματικής κοιλότητας. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση αποκάλυψε ένα πρότυπο έκφρασης όπου HATL5 εντοπίζεται στην κυτταρική επιφάνεια των διαφοροποιημένων επιθηλιακών κυττάρων στο στρωματοποιημένων πλακωδών επιθηλίων και των τριών αυτών των ιστών. Είναι ενδιαφέρον, HATL5 μειώνεται σημαντικά σε τραχήλου της μήτρας, του οισοφάγου, και κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό. Ανάλυση των συστοιχιών του τραχήλου της μήτρας και καρκίνο του οισοφάγου ιστών έδειξε ότι τα πλακώδη επιθηλιακά κύτταρα χάνουν την έκφραση τους HATL5 πρωτεΐνης κατά την κακοήθη εξαλλαγή

Παράθεση:. Miller GS, Zoratti GL, Murray AS, Bergum C, Tanabe LM, Λίστα K ( 2014) HATL5: ένα κυτταρικής επιφάνειας της πρωτεάσης της σερίνης εκφράζονται διαφορικά σε επιθηλιακούς καρκίνους. PLoS ONE 9 (2): e87675. doi: 10.1371 /journal.pone.0087675

Συντάκτης: Claudia Daniela andl, Πανεπιστήμιο Vanderbilt, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Οκτώβρη, 2013? Αποδεκτές: 28 Δεκέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 3, Φεβρουαρίου του 2014

Copyright: © 2014 Miller et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από κεφάλαια εκκίνησης από το Wayne State της Ιατρικής Σχολής και η Barbara Ann Karmanos Ινστιτούτο Καρκίνου, Detroit, MI. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο τύπος είναι II πρωτεάσες σερίνης διαμεμβρανική χωρίζεται σε τέσσερις φυλογενετικά διακριτές υπο-οικογένειες: η ανθρώπινη αεραγωγών θρυψίνη-όπως (HAT) /διαφορικά εκφρασμένο σε γονίδιο πλακώδες καρκίνωμα (DESC) υποοικογένεια, σερίνη εψίνη /διαμεμβρανική πρωτεάση (εψίνη /TMPRSS) υποοικογένεια, matriptase υποοικογένεια, και η υποοικογένεια Κορίν. HATL5 ανήκει στην υποοικογένεια HAT /DESC μαζί με καπέλο, DESC1, TMPRSS11A, και καπέλο-όπως 4 [1] -. HATL5 (HATL-5, ΗΑΤ-σαν 5) κωδικοποιείται από το γονίδιο TMPRSS11b βρίσκεται σε μια συγκεκριμένη συστάδα γονιδίων που περιλαμβάνει όλα τα γονίδια ΗΑΤ /DESC τόσο στα ποντίκια όσο και σε ανθρώπους [4]. Όλα τα μέλη της υπο-οικογένειας ΗΑΤ /DESC αποτελείται από μία περιοχή στέλεχος με μία μόνο πρωτεΐνη αχινό σπέρμα, εντεροπεπτιδάση, αγρίνη (ΣΠΕ) τομέα, και έναν Ο-τερματικό τομέα πρωτεάσης σερίνης. Υπάρχει ένα μεγάλο σώμα της βιβλιογραφίας που τεκμηριώνουν κρίσιμους ρόλους των μελών της εψίνη /TMPRSS, matriptase, και Corin υποοικογένειες σε φυσιολογικές και παθολογικές διαδικασίες. έχουν κρίσιμους ρόλους για αυτά TTSPs έχουν περιγραφεί σε διάφορους τομείς και περιλαμβάνουν επιθηλιακά ανάπτυξη και ομοιόσταση, μεταβολισμός του σιδήρου, ακοή, την πέψη, ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης, καθώς και ιική μόλυνση, φλεγμονή, και ογκογένεση [3] [5], [6]. έχουν συγκριτικά λίγες μελέτες που χαρακτηρίζουν τις βιοχημικές ιδιότητες του καπέλου /DESC υπο-οικογένεια και /ή να εξερευνήσετε τις φυσιολογικές λειτουργίες τους έχουν δημοσιευθεί. ΗΑΤ έχει αναφερθεί ότι έχει δραστικότητα ινωδογονολυτικά, για να διαμορφώνει τον υποδοχέα ουροκινάσης, και να ενεργοποιούν ενεργοποιημένο υποδοχέα πρωτεάσης (PAR) 2 [7] [8], [9] [10], [11]. Επιπλέον, καπέλο μπορεί uncoat ιοσωμάτια ρεοϊού για την προώθηση της μόλυνσης σε κυτταρική καλλιέργεια και διασπά την γλυκοπρωτεΐνη επιφανείας, αιμοσυγκολλητίνη (ΗΑ), του ιού της γρίπης [12] [13], [14]. Πρόσφατα, μια μελέτη που χρησιμοποιεί γενετική εκτομή του TMPRSS11A και καπέλο σε ποντίκια απέδειξαν ότι οι δύο πρωτεάσες είναι περιττό για την ανάπτυξη, τη γενική υγεία, και μακροχρόνια επιβίωση εν απουσία εξωτερικών προκλήσεων ή πρόσθετων γενετικών ελλειμμάτων [15].

Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια βιοχημική ανάλυση χαρακτηρισμό και την έκφραση του HATL5. Το πλήρους μήκους cDNA HATL5 κατευθύνει την έκφραση ενός 60 kDa Ν-γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη που εντοπίζεται στην κυτταρική επιφάνεια των κυττάρων των θηλαστικών. Το καθαρισμένο ενεργοποιημένο πεδίο HATL5 σερινοπρωτεάσης υδρολύει συνθετικά υποστρώματα πεπτιδίου, και αναστέλλεται από μέλη δύο διαφορετικών οικογενειών αναστολέας πρωτεάσης σερίνης: της τύπου Kunitz? ΕΑΒ-1, ΕΑΒ-2 και απροτινίνη, και το μέλος της οικογένειας serpin? serpinA1. HATL5 εντοπισμός πρωτεΐνη είναι αξιοσημείωτα παρόμοια και στις τρεις διαφορετικούς ιστούς που αναλύθηκαν: τραχήλου, του οισοφάγου, του βλεννογόνου του στόματος. Έτσι, HATL5 ανιχνεύεται κυρίως στην επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων σε αυτά τα στρωματοποιημένων πλακωδών επιθηλίων. Κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης, η έκφραση της πρωτεάσης της κυτταρικής επιφάνειας σε μεγάλο βαθμό μειωμένη, και σε πολλές περιπτώσεις, μη ανιχνεύσιμη στα κύτταρα πλακώδους καρκινώματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η χρήση των συστοιχιών παραφίνης ανθρώπινου ιστού εγκρίθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος από το Wayne State University Institutional Review Board Διοίκησης (# 2013 – 43).

Κλωνοποίηση και έκφραση του πλήρους μήκους ανθρώπινου HATL5

Ανθρώπινα οισοφαγικός RNA ελήφθη από Biochain (Newark, CA). Η σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA πραγματοποιήθηκε με ολίγο (dT) αρχικά τεμάχια χρησιμοποιώντας κιτ RETROscript σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Ambion, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ). Gene ειδικοί εναρκτήρες σχεδιάστηκαν για πλήρους μήκους ανθρώπινο HATL5 χρησιμοποιώντας την αποτίθεται αλληλουχία για

Homo sapiens

διαμεμβρανική πρωτεάση, 11Β σερίνη, mRNA, GenBank # BC126195.1. Οι εκκινητές 5′- GCCACCATGTAC-AGGCACGGCATATC-3 ‘και 5′-GAGTCCAGTCTTGGATGTAATCC-3’ χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχυθεί το cDNA χρησιμοποιώντας μια υψηλής πιστότητας πολυμεράση Platinum®Taq (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) το οποίο στη συνέχεια εισάγεται εντός pcDNA 3.1 /V5-His TOPO® ΤΑ (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) εντός πλαισίου με ένα C-τερματικό Ηίδ-ετικέτα και V-5 επιτόπου. Κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση (ΑΒΙ Prism 3730 DNA Analyzer, Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη). Η επιμόλυνση των ΗΕΚ293 και COS-7 κύτταρα (ATCC, Manassas, VA) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εντός μέσου Dulbecco τροποποιημένο Eagle (Gibco, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε με 4.0 μg πλήρους μήκους HATL5 περιέχει πλασμιδιακό DNA. Τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό ΚΙΡΑ: 150 mM NaCl, 50 mM Tris /HCl, ρΗ 7,4, 0,1% SDS, 1% ΝΡ-40, και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) και καθαρίζεται με φυγοκέντρηση σε 12000 × g στους 4 ° C °. Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ). Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE χρησιμοποιώντας 4-12% πηκτές NuPAGE Bis-Tris (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) κάτω από αναγωγικές συνθήκες και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα πρωτογενές V-5 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Invitrogen, Life Technologies, grand Island, ΝΥ) και ένα αντίσωμα φωσφατάση-συζευγμένο δευτερεύον αλκαλική αντι-ποντικού κατσίκας (Millipore, Billerica, ΜΑ).

Κλωνοποίηση και Έκφραση Ανθρώπινου HATL5 πρωτεάση σερίνης τομέα Pro-μορφή

Η πρωτεάση σερίνης ανθρώπινη HATL5 (SP) περιοχή κλωνοποιήθηκε εντός του πλασμιδίου pSecTag2a (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) για έκφραση και ανάλυση σε καλλιέργεια κυττάρων θηλαστικών. HATL5 αλληλουχία τομέα πρωτεάσης σερίνης από το ανθρώπινο πλήρους μήκους HATL5-V5-His πλασμίδιο ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: 5′-CCAAGGATCCATGTTGTGGGAGACAAGTAGCCAAC-3 ‘και 5′-CCAAGCGGCCGCGAGTCCAGTCTTGGATGTAATCC-3’. Το προκύπτον PCR θραύσμα κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pSecTag2a μεταξύ των θέσεων BamHI και NotI χρησιμοποιώντας πρότυπες τεχνικές. Η επιμόλυνση των κυττάρων CHO (ATCC, Manassas, VA), εκχύλιση πρωτεϊνών και ανάλυση κηλιδώσεως Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Ένα αντι-Μγο μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση με western αποτύπωση.

Κλωνοποίηση και έκφραση του HATL5 Active πρωτεάσης της σερίνης Τομέα στο

Pichia pastoris

Ο τομέας πρωτεάσης σερίνης ενεργό ανθρώπινο HATL5 παρήχθη σε ζύμη χρησιμοποιώντας μια έκφραση Pichia Kit (Τεχνολογίες Invitrogen, ζωή, Grand Island, Νέα Υόρκη). Για κλωνοποίηση μέσα στον φορέα pPIC9, HATL5 αλληλουχία πρωτεάσης σερίνης από το pcDNA 3.1 V5 //ΤΟΡΟ HIS ανθρώπινης-HATL5 πλασμίδιο μεταλλάχθηκε για την απομάκρυνση μία θέση XhoI χρησιμοποιώντας την τοποθεσία Agilent γρήγορης αλλαγής II ™ κατευθυνόμενη κιτ μεταλλαξογένεσης (Agilent Technologies, Inc. Σάντα Clara, CA). Εκκινητές για μεταλλαξογένεση ήταν: 5′-gccaggtgtctatactcgggtgacttcttatcgcaattgg-3 ‘και 5′-ccaattgcgataagaagtcacccgagtatagacacctggc-3’. Μεταλλαξογένεση οδήγησε σε ενιαίο συνώνυμη μετάλλαξη σημείου, αναπαράγοντας έτσι την φυσική αλληλουχία αμινοξέων. Μετά την μεταλλαξογένεση, την ανθρώπινη περιοχή σερίνης πρωτεάσης HATL5 ενισχύθηκε και κλωνοποιήθηκε στον φορέα pPIC9 στις θέσεις XhoI και NotI, χρησιμοποιώντας τους εκκινητές 5′-tctctcgagaaaagaattgtgaatggaaaaagctccc-3 ‘και 5′-attcgcggccgctcagagtccagtcttgg-3’. Κλωνοποίηση οδήγησε σε HATL5 ενεργοποιημένη αλληλουχία σερίνης πεδίο πρωτεάσης (Ile-Val-Asn) που εισάγεται αμέσως μετά από μια θέση διάσχισης ΚΕΧ2 Leu-Glu-Lys-Arg που κωδικοποιείται από τον φορέα. Η Leu-Glu-Lys-Arg-Ile-Val-Asn διασπάται μεταξύ Arg και Ile από την ΚΕΧ2 πρωτεάσης ζύμης η οποία είναι μία διαμεμβρανική πρωτεάση που βρίσκεται στο Golgi, καθιστώντας μια εκκρίνεται ενεργοποιείται HATL5 περιοχή σερίνης πρωτεάσης. Έκφραση matriptase δραστικής περιοχής σερίνης πρωτεάσης σε

Pichia pastoris

διεξήχθη παραλλήλως όπως περιγράφεται [19]. Ο μετασχηματισμός πραγματοποιήθηκε σε ικανά κύτταρα TOP-10 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) και pPIC9-HATL5 θετικοί κλώνοι απομονώθηκαν και ενισχύθηκαν με τη χρήση τυποποιημένων τεχνικών. Για το μετασχηματισμό του

Pichia pastoris

, 40 μg του pPIC9-ανθρώπου-HATL5, pPIC9-matriptase, pPIC9 κενό φορέα υποβλήθηκε σε πέψη με SalI, και καθαρίστηκε με εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου. Η ηλεκτροδιάτρηση του γραμμικοποιημένου πλασμιδίου στο στέλεχος ζυμομύκητα GS115 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) πραγματοποιήθηκε σε 1.5 kV, χρησιμοποιώντας 0,2 cm κυψελίδες (BioRad, Hercules, CA) σε ένα ΒΤΧ-Transporator Plus (Harvard Συσκευή Holliston, ΜΑ). Η έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεασών στο ρυθμισμένο μέσο από επιμέρους κλώνους ζύμης αναλύθηκε με SDS-PAGE και κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας κουνελιού αντι-TMPRSS11b (Abcam, Cambridge, ΜΑ) ή ένα αντι-matriptase αντίσωμα κουνελιού (Bethyl Laboratories, Montgomery, ΤΧ) . πρωτεΐνες HATL5 και matriptase καθαρίστηκαν με χρωματογραφία ανταλλαγής ανιόντων χρησιμοποιώντας μια στήλη HiTrap Q ΗΡ (GE Healthcare, Pittsburgh, PA), όπως περιγράφεται [16].

Χρωμογονικός πρωτεϊνάση Αναλύσεις

Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε συνολικό όγκο αντίδρασης 100 μι χρησιμοποιώντας 50 mM Tris-HCl ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 0.01% Tween-20, 0,01% BSA για αραίωση όλων των δειγμάτων. 5 ηΜ καθαρή δραστική ανασυνδυασμένη HATL5 ή πρωτεάσης σερίνης matriptase τομέα επωάστηκε στους 37 ° C για 60 λεπτά με 100 μm του συνθετικού πεπτιδίου L-1720 Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (Bachem, Bubendorf, Switzerland) σε η απουσία ή παρουσία (αναστολέας και προστέθηκε υπόστρωμα ταυτόχρονα) της ΕΑΒ-1 (60 ηΜ) (R &? D, Minneapolis, ΜΝ), ΕΑΒ-2 (40 ηΜ) (R &? D, Minneapolis, ΜΝ), απροτινίνη (2 μm) , λευπεπτίνη (20 μm), βενζαμιδίνη (2 mM), ή serpinA1 (60 ηΜ) (όλα από την Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ). Αλλαγές στην απορρόφηση στα 405 nm παρακολουθούνταν χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη Pro πλάκα Magellan NanoQuant Άπειρο M200 (Tecan ΗΠΑ, Inc., Morrisville, NC).

Απογλυκοζυλίωση HATL5

Οι πρωτεΐνες σε λύματα ή ρυθμισμένο μέσο που παρασκευάζεται όπως αναφέρεται παραπάνω απογλυκοζυλιώθηκαν χρησιμοποιώντας μια ενζυματική Kit πρωτεΐνη Απογλυκοζυλίωση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Sigma, St. Louis, ΜΟ).

η ανοσοκυτταροχημεία

απεικόνισης κυττάρων επιφάνειας εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ΗΕΚ293 ή COS -7 κύτταρα επιμολυσμένα με ανθρώπινο πλήρους μήκους HATL5-V5. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες επικαλυμμένες με αρουραίου τύπου-2 κολλαγόνου (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) και αφέθηκαν να προσκολληθούν και να αναπτυχθούν για 36 ώρες, στο οποίο σημείο, μέσα απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 30 min σε θερμοκρασία δωματίου. HATL5-V5 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-V5 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) ή ένα αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου (Sigma, St. Louis, ΜΟ) και ένα δευτερεύον AlexaFlour-568-συζευγμένο κατσίκας-αντι-ποντικού αντίσωμα (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη). χρώση κυττάρων απεικονίστηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιώντας μια Leica TCS SP2 συνεστιακό μικροσκόπιο (Leica, Buffalo Grove, IL)

Βιοπληροφορική ανάλυση

Η Oncomine βάση δεδομένων μικροσυστοιχιών (http:. //www.oncomine. org) [17] χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει μια μετα-ανάλυση της έκφρασης του ανθρώπινου

TMPRSS11b

σε τέσσερις μελέτες της μεταγραφικό σε καρκινώματα του τραχήλου της μήτρας, του οισοφάγου, και το κεφάλι και το λαιμό, σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς έλεγχο (Πίνακας S1).

δείγματα ιστών και ανοσοϊστοχημεία

Ο «CR802», «ES482», και «Τ271» του τραχήλου της μήτρας, του οισοφάγου, και συστοιχίες καρκίνο του στόματος ιστού, συμπεριλαμβανομένων των φυσιολογικά ή καρκινικά παρακείμενο φυσιολογικό ιστού, ελήφθησαν από US Biomax, Inc. (Rockville, MD).

συστοιχίες ιστών αποπαραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο και ενυδατώθηκαν με κλιμακούμενες λύσεις αιθανόλη. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα, μειωμένο ρΗ (Bethyl Laboratories, Montgomery, ΤΧ). Οι συστοιχίες αποκλείσθηκαν με 2,5% κανονικό ορό αλόγου (Vector Laboratories, Burlingame, CA) σε PBS, και ανοσοχρωματίστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με 4 μg /ml κουνελιού αντι ανθρώπινο TMPRSS11b /HATL5 (Sigma, St. Louis, ΜΟ). Ως αρνητικός έλεγχος, μη-άνοση IgG κουνελιού (4 μg /ml) (Millipore, Billerica, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε. Τα δεσμευμένα αντισώματα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας βιοτίνη-συζευγμένο αντι-κουνελιού (Vector Laboratories, Burlingame, CA) δευτερεύοντα αντισώματα, και ένα κιτ Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Το 3,3′-διαμινοβενζιδίνη χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα (Sigma, St. Louis, ΜΟ) και συστοιχίες με αιματοξυλίνη. Όλες οι μικροσκοπικές εικόνες αποκτήθηκαν σε ένα Πεδίο Α.1 Zeiss χρήση ψηφιακής απεικόνισης.

Αξιολόγηση της χρώσης Εντάσεις και Στατιστική Ανάλυση

Η αξιολόγηση των εντάσεων χρώση του οισοφάγου και δείγματα τραχηλικού ιστού έγινε από έναν ερευνητή απληροφόρητοι της ταυτότητας του δείγματος. Οι βαθμολογίες αποδόθηκαν με βάση την ένταση και την έκταση της επιθηλιακής κηλίδωσης σε 20χ μικροσκοπικά πεδία χρησιμοποιώντας έναν αυθαίρετο κλίμακα από το μηδέν έως τρία όπου 0 = καμία θετική χρώση σε επιθηλιακά κύτταρα ανιχνεύονται, 1 = ορισμένα επιθηλιακά κύτταρα βάφονται ασθενώς, 2 = κάποια επιθηλιακά κύτταρα χρωματισμένο μέτρια ή η πλειοψηφία των επιθηλιακών κυττάρων βάφονται ασθενώς, 3 = μερικές επιθηλιακά κύτταρα βάφονται έντονα ή την πλειοψηφία των επιθηλιακών κυττάρων βάφονται μέτρια. Δύο-ουρά ανάλυση χ2 χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών στη συχνότητα της χρώσης HATL5 μεταξύ των ομάδων. Η στατιστική σημαντικότητα της διαφοράς HATL5 ένταση χρώσης μεταξύ των ομάδων προσδιορίσθηκε με την δύο ουρών δοκιμή Mann-Whitney U.

Αποτελέσματα

Ακολουθία Αμινοξέων και Domain Δομή HATL5

η ανάλυση της αλληλουχίας αμινοξέων του υποθετικού πρωτεάσης ανθρώπινης HATL5 αποκάλυψε οκτώ πιθανές θέσεις Ν-γλυκοζυλίωσης? πέντε εκ των οποίων βρίσκονται στην περιοχή σερίνης πρωτεάσης (σχ. 1Α και Β). Η καταλυτική περιοχή της HATL5 ποντικιού περιέχει τις βασικές πρωτεάσης σερίνης καταλυτική τριάδα υπολείμματα, H

225, D

270, S

366, και το υπόστρωμα δεσμευτική υπολείμματα τσέπη, D

360, S

386 και G

388. Το μοτίβο SWG στην καταλυτική περιοχή είναι συντηρημένη σε όλα τα μέλη του καπέλου /DESC υποοικογένεια και προβλέπεται να βρίσκεται στην κορυφή του θύλακα σύνδεσης υποστρώματος, την τοποθέτηση του σχιζόμενο δεσμό του υποστρώματος με το σωστό προσανατολισμό (S

386WG σε HATL5). Πρωτεολυτική ενεργοποίηση του HATL5 προβλέπεται να συμβεί μέσα σε ένα μοτίβο (Κ

184IVNG) στη συμβολή των θετικών και καταλυτικές περιοχές. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η

TMPRSS11b

γονίδιο πιθανό κωδικοποιεί ένα λειτουργικό πρωτεάσης σερίνης

ακολουθία (Α) αμινοξέος της ανθρώπινης HATL5 (UniProtKB /Swiss-Prot: Q86T26.3).. Τα υπολείμματα αμινοξέων που κωδικοποιεί την διαμεμβρανική περιοχή είναι υπογραμμισμένες. Η περιοχή με ομολογία με πρωτεΐνη σπέρμα αχινού, εντεροπεπτιδάση, αγρίνη (SEA) περιοχές υποδεικνύεται από ένα στερεό κιβώτιο γραμμή και την παρόμοια με θρυψίνη περιοχή σερίνης πρωτεάσης υποδεικνύεται με μία διακεκομμένη γραμμή κουτί. Η καταλυτική κατάλοιπα του

225 (H), Asp

270 (Δ), και Ser

366 (S) υποδεικνύονται με τετράγωνα. Οι πιθανές θέσεις Ν-γλυκοζυλίωσης υποδεικνύονται με κύκλους. Η θέση διάσπασης ενεργοποίησης υποδεικνύεται με ένα βέλος, και τα δύο κατάλοιπα κυστεΐνης αναμένεται να σχηματίσουν μια γέφυρα δισουλφιδίου που συνδέει την περιοχή στέλεχος στον τομέα πρωτεάσης σερίνης κατά τη διάσπαση ενεργοποίηση υποδεικνύονται με τρίγωνα. (Β) Σχηματική απεικόνιση της προβλεπόμενης αρχιτεκτονική του τομέα του HATL5. ΤΜ = διαμεμβρανική περιοχή, SEA = Sea πρωτεΐνη αχινό σπέρμα, εντεροπεπτιδάση, αγρίνης τομέα, Ν υποδεικνύει προβλεπόμενες θέσεις Ν-γλυκοζυλίωσης, η θέση διάσπασης ενεργοποίησης υποδεικνύεται με ένα βέλος, και SS αντιπροσωπεύει τη γέφυρα δισουλφιδίου που συνδέει τις περιοχές πρωτεάσης SEA και σερίνη [31 ].

η

HATL5 είναι ένα 60 kDa γλυκοσυλιωμένη πρωτεΐνη

Για να χαρακτηριστεί η πρωτεΐνη HATL5 που κωδικοποιείται από το

TMRSS11b

γονίδιο, το πλήρους μήκους ανθρώπινο cDNA παρήχθη με PCR υψηλής πιστότητας χρησιμοποιώντας μια ανθρώπινη βιβλιοθήκη cDNA οισοφάγο. Το cDNA υποβλήθηκε σε καθορισμό αλληλουχίας, επιβεβαιώθηκε ότι ήταν ταυτόσημη με την προβλεπόμενη αλληλουχία cDNA και εισήχθη σε πλασμίδιο έκφρασης θηλαστικών που έδωσε την εκφρασμένη πρωτεΐνη με ένα V5-His ετικέτα επιτόπου στο άκρο C- (Σχ. 2Α, κορυφή). Επιπλέον, ένας φορέας έκφρασης θηλαστικών που περιέχει το προ-μορφή της περιοχής σερίνης πρωτεάσης, συμπεριλαμβανομένων 15 αμινοξέα ανοδικά από την θέση ενεργοποίησης, και μια Ο-τερματική επισήμανση myc δημιουργήθηκε (Σχήμα 2Α, μεσαίο), καθώς και ένα

Pichia pastoris

φορέα για την έκκριση του διασπάται δραστική μορφή του τομέως πρωτεάσης σερίνης (Σχήμα 2Α, κάτω). Μετά την επιμόλυνση του φορέα πλήρους μήκους HATL5 σε ΗΕΚ293, COS-7, ή τα κύτταρα CHO, αντίστοιχα, τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE και στύπωμα Western. Σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές, ένα προϊόν πρωτεΐνης περίπου 60 kDa ανιχνεύτηκε (Εικ. 2Β). Αυτή η φαινομενική μοριακή μάζα είναι σημαντικά υψηλότερη από την προβλεπόμενη μοριακή μάζα 46 kDa, γεγονός που υποδηλώνει ότι HATL5 υπόκειται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Για να εξεταστεί εάν η εκφρασμένη HATL5 μπορεί να είναι μετα-μεταφραστικά τροποποιημένο με γλυκοζυλίωση, εκχυλίσματα πρωτεΐνης από επιμολυσμένα ΗΕΚ293, COS-7, ή τα κύτταρα CHO υποβλήθηκαν σε ενζυματική απογλυκοσυλίωση πριν από την ανάλυση κηλίδος western. Απογλυκοσυλίωση του πλήρους μήκους HATL5 οδήγησε στην εμφάνιση ενός είδους -48 kDa που ήταν παρούσα σε εκχυλίσματα από όλες τις τρεις κυτταρικές σειρές (Εικ. 2Β). Λαμβάνοντας υπόψη ότι η His-tag V5 προσθέτει περίπου 5 kDa με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη, η απογλυκοζυλιωμένη μορφή του πλήρους μήκους HATL5 έχει φαινόμενη μοριακή μάζα πολύ κοντά στην προβλεπόμενη μοριακή μάζα. Πέντε από τους οκτώ πιθανές θέσεις Ν-γλυκοζυλίωσης βρίσκονται στην περιοχή σερίνης πρωτεάσης. Για να καθοριστεί εάν η περιοχή σερίνης πρωτεάσης της HATL5 είναι γλυκοζυλιωμένη, η πρωτεάση σερίνης προ-μορφή που εκκρίνεται από τα επιμολυσμένα κύτταρα CHO υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ένζυμα απογλυκοζυλίωση και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Πριν από την απογλυκοζυλίωση αυτή τη μορφή είχε ένα φαινόμενο μοριακό βάρος 45 kDa (Σχ. 2C, αριστερά). Η προβλεπόμενη μοριακή μάζα αυτής της εκκρινόμενης μορφής της HATL5 είναι 30 kDa, συμπεριλαμβανομένων των myc-tag. Μετά την απογλυκοζυλίωση, η μείωση του φαινόμενη μοριακή μάζα, σε μία μορφή 30 kDa, παρατηρήθηκε. Μία παρόμοια παρατήρηση έγινε κατά την απογλυκοζυλίωση του χωρίς tag διασπάται ενεργό HATL5 περιοχή σερίνης πρωτεάσης που εκκρίνεται από μετεμβολιασμένα

Pichia pastoris

(προβλεπόμενο μοριακό βάρος = 26 kDa) που είχε ως αποτέλεσμα σε μια μορφή με μια φαινόμενη μοριακή μάζα ~ 28 kDa ( Εικ. 2C, δεξιά). Στο σύνολό τους, αυτή η ανάλυση καταδεικνύει ότι η ανθρώπινη HATL5 είναι μία γλυκοπρωτεΐνη 60-kDa και ότι μία ή περισσότερες από τις πέντε πιθανά

N

-συνδεδεμένης γλυκοζυλίωσης στην περιοχή σερίνης πρωτεάσης χρησιμοποιούνται.

( Α) Σχηματική αναπαράσταση των τριών διαφορετικών ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών HATL5 δημιουργήθηκε για αυτή τη μελέτη. V5-H = V5-His ετικέτα επιτόπου (B) Σύνολο πρωτεΐνη κυτταρολύματα από ΗΕΚ293, COS-7, ή τα κύτταρα CHO που εκφράζουν την πλήρους μήκους V5-His επισημασμένη ανθρώπινη HATL5. (C) προσαρμοσμένα μέσα από κύτταρα CHO που εκφράζουν myc-tagged HATL5 τομέα πρωτεάσης σερίνης ή ρυθμισμένα μέσα από

Pichia pastoris

εκφράζουν διασπάται, ενεργή πρωτεάση σερίνης HATL5 αναλύθηκαν. (Β και Γ) Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και αναλύθηκαν με western αποτύπωση χρησιμοποιώντας αντι-V5, αντι-myc ή αντισωμάτων αντι-HATL5 όπως υποδεικνύεται. Οι λωρίδες με εκχυλίσματα πρωτεΐνης σε επεξεργασία με ένζυμα απογλυκοζυλίωση πριν από SDS-PAGE έδειξε (+), και μη επεξεργασμένων εκχυλίσματα (-). Τα μαύρα βέλη δείχνουν τη θέση των γλυκοζυλιωμένη μορφές HATL5, και τα ανοικτά βέλη δείχνουν τη θέση των απογλυκοζυλιωμένη μορφές.

Η

HATL5 είναι ένα καταλυτικά ενεργό πρωτεάσης

Για τη διερεύνηση της ενζυμικής ιδιότητες του HATL5, τομέα πρωτεάσης σερίνης, συμπεριλαμβανομένης της θέσης διάσπασης ενεργοποίησης και 15 επιπλέον αμινοξέα ανοδικά από την θέση διάσπασης, εκφράστηκε σε κύτταρα CHO (Εικ. 2 μεσαία). Η πρωτεΐνη HATL5 εκκρίθηκε εντός του μέσου ως μία μονή αλυσίδα προ-ένζυμο. Μια παρόμοια προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως για matriptase-3 οδήγησε σε μια εκκρινόμενη πρωτεΐνη ικανή να υποστεί αυτο-ενεργοποίηση, όπως αποδεικνύεται από μία ελαφρά αύξηση στην ηλεκτροφορητική κινητικότητα και απέκτησε πρωτεολυτική δραστικότητα του [18]. Η εκκρινόμενη μορφή της HATL5 δεν, ωστόσο, φαίνεται να έχουν αυτο-καταλυτικές ιδιότητες αφού επώαση κάτω από διάφορες διαφορετικές συνθήκες (σύνθεση ρυθμιστικού, θερμοκρασίας και χρόνου) δεν απέδωσαν καμία ανιχνεύσιμη μετατόπιση της κινητικότητας ή καταλυτική δραστικότητα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να εκφραστεί HATL5 και μεσολαβούν πρωτεολυτική διάσπαση στη θέση ενεργοποίησης, η

Pichia pastoris

σύστημα έκφρασης χρησιμοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την ενδοκυτταρική πρωτεάση ζυμομυκήτων, ΚΕΧ2. Η πρωτεάση σερίνης ΚΕΧ2 διαμεμβρανική ανήκει στην σουμπτιλισίνη-σαν προ-πρωτεΐνη οικογένεια κονβερτάσης με ειδικότητα για διάσπαση μετά ζευγαρωμένα βασικά αμινοξέα και εντοπίζεται στο διαμέρισμα αργά Golgi. Με κλωνοποίηση του τομέα πρωτεάσης σερίνης HATL5 εντός του φορέα PIC9 με την ενεργή αλληλουχία τομέα πρωτεάσης σερίνης HATL5 (

185IVNG) αμέσως μετά τη θέση διάσπασης LGKR ΚΕΧ2 κωδικοποιείται από τον φορέα, μία νέα θέση διάσπασης σύντηξης δημιουργήθηκε (Εικ. 2, κάτω μέρος ). Η αλληλουχία LGKRIVNG διασπάται μεταξύ Arg (R) και Ile (Ι) με ΚΕΧ2, καθιστώντας μια εκκρίνεται περιοχή σερίνης πρωτεάσης δραστικής HATL5. Έκφραση matriptase δραστικής περιοχής σερίνης πρωτεάσης σε

Pichia pastoris

διεξήχθη παραλλήλως όπως περιγράφεται [19]. Η παρουσία πρωτεάσης σερίνης HATL5 σε ρυθμισμένα μέσα από

Pichia pastoris

κλώνοι επιμολύνθηκαν με το φορέα PIC9-HATL5 επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-HATL5 (Σχ. 3Α, αριστερά). Δεν ανιχνεύθηκε σήμα σε ρυθμισμένα μέσα από κλώνους επιμολυσμένα με τον άδειο φορέα PIC9 ή την PIC9-matriptase φορέα. Παρομοίως, το αντι-matriptase αντίσωμα ανιχνεύεται το εκκρινόμενο τομέα πρωτεάσης σερίνης matriptase σε ρυθμισμένα μέσα από κύτταρα επιμολυσμένα με τον PIC9-matriptase φορέα (Εικ. 3Α, δεξιά) και όχι από κλώνους επιμολυσμένα με τον φορέα έκφρασης PIC9-HATL5 ή τον φορέα PIC9 χωρίς ένθετο της πρωτεάσης. Η καταλυτική δράση του HATL5 και matriptase, αντίστοιχα, επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας την πρωτεάση σερίνης χρωμογόνο υπόστρωμα peptidolytic Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (Σχ. 3Β). Ρυθμισμένα μέσα από κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα PIC9 συμπεριλήφθηκε ως αρνητικός έλεγχος για να διασφαλιστεί η απουσία παρεμβολής εκκρινομένων πρωτεασών ζύμης.

(Α) Ρυθμισμένα δείγματα μέσου από

Pichia pastoris

κλώνους επιμολυσμένα με είτε ο φορέας έκφρασης χωρίς ένθεμα πρωτεάση (vector), με HATL5 cDNA περιοχή σερίνης πρωτεάσης (HATL5 # 1 και # 2) ή τον τομέα matriptase πρωτεάσης σερίνης cDNA αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-HATL5 (αριστερός πίνακας) ή ένα αντι-matriptase αντίσωμα (δεξί πάνελ). Οι θέσεις των HATL5 (ανοικτή κεφαλή βέλους) και matriptase τομέα πρωτεάσης σερίνης (μαύρο κεφάλι βέλος) υποδεικνύεται. (Β) Τα δείγματα από τα προσαρμοσμένα μέσα που περιγράφονται στο (Α) επωάστηκαν στους 37 ° C για 60 λεπτά με το συνθετικό χρωμογόνο πεπτίδιο Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-ρΝΑ (100 μm) και η απορρόφηση στα 405 nm καταγράφηκε (Γ) 5 ηΜ καθαρή δραστική ανασυνδυασμένη HATL5 (λευκές ράβδοι) ή matriptase (μαύρες ράβδοι) περιοχή σερίνης πρωτεάσης επωάστηκε στους 37 ° C για 60 λεπτά με το συνθετικό χρωμογόνο πεπτίδιο MeOSuc-Glu-Val-Lys-Met-ρΝΑ (100 μm ) απουσία ή παρουσία (αναστολέα και υποστρώματος προστίθενται ταυτόχρονα) της ΕΑΒ-1 (60 ηΜ), ΕΑΒ-2 (40 ηΜ), απροτινίνη (2 μm), λευπεπτίνη (20 μm), βενζαμιδίνη (2 mM), ή serpinA1 (60 ηΜ). Οι ενζυμικές δραστηριότητες για κάθε ένζυμο που απεικονίζονται σε σχέση με την δραστικότητα όταν δεν προστέθηκε αναστολέας.

Η

Η επίδραση διαφόρων αναστολέων πρωτεάσης σερίνης για την υδρολυτική δραστικότητα της επικράτειας της πρωτεάσης σερίνης καθαρισμένο HATL5 προς Suc-Ala-Ala- Pro-Arg-ρΝΑ αναλύθηκε επίσης, και πάλι με τη χρήση matriptase ως καλώς χαρακτηρισμένης TTSP αναφοράς (Σχ. 3C). δραστηριότητα HATL5 μειώθηκε κατά τις γενικές μορίου αναστολείς πρωτεασών σερίνης, λευπεπτίνη και βενζαμιδίνη. Πλήρης αναστολή επιτεύχθηκε με την σφαιροειδή πολυπεπτίδιο, αναστολέα πρωτεάσης Kunitz τύπου σερίνης, απροτινίνη (αναστολέα βόειας παγκρεατικής τρυψίνης). Το μακρομοριακό αναστολείς πρωτεάσης σερίνης τύπου Kunitz, ανάπτυξης ηπατοκυττάρου αναστολέα του παράγοντα ενεργοποιητή (ΕΑΒ) -1 και 2, έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι αναστέλλουν διάφορα μέλη της οικογένειας TTSP συμπεριλαμβανομένων matriptase, matriptase-2, καπέλο, εψίνη και TMPRSS13 [20] [21 ], [22] [23] [24] [25] [26] [27]. ΕΑΒ-1 και ΗΑΙ-2 ανέστειλε την δραστικότητα του HATL5 κατά 50% και 75%, αντίστοιχα. Επιπλέον, HATL5 αναστάλθηκε από ένα μέλος της υπεροικογενείας σερπίνης, serpinA1 (α

1-1-αντιτρυψίνη).

HATL5 εντοπίζεται στην κυτταρική επιφάνεια των καλλιεργημένων κυττάρων και στρωματοποιημένων πλακωδών επιθηλίων

Ανάλυση της αλληλουχίας της πρωτεΐνης HATL5 αποκάλυψε την παρουσία ενός μόνο διαμεμβρανική περιοχή, υποδεικνύοντας ότι η πρωτεΐνη HATL5, παρόμοια με προηγουμένως χαρακτηριζόμενη μέλη της οικογένειας TTSP, μπορεί να βρίσκεται στην επιφάνεια των κυττάρων. Για να διερευνηθεί η υποκυτταρική εντόπιση του HATL5, κύτταρα ΗΕΚ293 που εκφράζουν τον V5-tagged πρωτεάσης πλήρους μήκους αναλύθηκαν με φθορίζουσες ανοσοκυτταροχημεία. Nonpermeabilized επιμολυσμένα κύτταρα χρωματίστηκαν με ένα πρωτογενές αντίσωμα αντι-V5 και ενός AlexaFluor 568 δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού. Τα επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293 εμφανίζεται ένα έντονο κόκκινο σήμα φθορισμού που περιορίζεται στη μεμβράνη πλάσματος (Σχ. 4Α, αριστερό πάνελ). Όταν πρωτογενή αντισώματα υποκαταστάθηκαν με μη-άνοσο IgG, μη ανιχνεύσιμη χρώση παρατηρήθηκε (Σχ. 4Α, δεξιό πλαίσιο). Μια παρόμοια χρώση μεμβράνης παρατηρήθηκε σε ένα παράλληλο πείραμα χρησιμοποιώντας διαμολυσμένα κύτταρα COS-7 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Μικροφωτογραφίες φθορισμού ανάλυση συνεστιακού δείχνει έκφραση επιφανείας κυττάρου σε αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των κυττάρων ΗΕΚ293 παροδικά επιμολυσμένα με ένα ανθρώπινο πλήρους μήκους πλασμίδιο έκφρασης HATL5-V5. Nonpermeabilized κύτταρα επωάστηκαν με ένα αντίσωμα anti-V5 (αριστερό πάνελ) ή έναν έλεγχο μη-ανοσο αντίσωμα (δεξιός πίνακας), που ακολουθείται από επώαση με AlexaFluor 568-σημασμένο δευτερογενή αντισώματα και χρώση Hoechst να απεικονίσει πυρήνες (μπλε? Δύο πάνελ). Τα κύτταρα οπτικοποιήθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού στα 543 nm (AlexaFluor 568) και 405 μήκη κύματος nm διέγερση (Hoechst). συγχωνεύονται εικόνες που λαμβάνονται στα δύο μήκη κύματος διέγερσης εμφανίζεται. Μέγεθος μπαρ είναι 100 μm. (Β) Έκφραση HATL5 (άνω πάνελ) ή GAPDH μηνύματος (κάτω πίνακας) με ανάλυση RT-PCR του mRNA που εξάγεται από ολόκληρα όργανα ποντικού. (Γ) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης HATL5 σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς. HATL5 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με ένα κουνέλι-αντι αντίσωμα HATL5 σε οισοφαγικού musoca (C1, D1), του τραχήλου της μήτρας του βλεννογόνου (Ε), του βλεννογόνου του στόματος (γλώσσα) (F) και επιγλωττίδα (μέρος του λάρυγγα υπεργλωττιδική) (G). Πρωτογενή αντισώματα υποκαταστάθηκαν με μη-άνοση IgG κουνελιού σε σειριακές τομές από όλα τα δείγματα και δεν παρατηρήθηκε σημαντική χρώση (κεφαλές βελών στο C2, D2 και δεν παρουσιάζονται). Ισχυρή επιθηλιακά χρώσης (βέλη) ανιχνεύεται σε κορυφαία, πλακώδη επιθηλιακά κύτταρα σε φυσιολογικά οισοφάγο (C1, D1), η κανονική τράχηλο (Ε), και της γλώσσας (F) χωρίς σημαντική χρώση στο διαμέρισμα μεσεγχυματικά (υποδεικνύεται με αστερίσκους). Σε υψηλή μεγέθυνση, HATL5 πρωτεΐνη σαφώς εντοπίζεται στην κυτταρική επιφάνεια του κορυφαίου επιθηλιακά κύτταρα (κεφαλή βέλους στο D1). Στο επιγλωττίδα χρώσης (G) παρατηρείται σε πλακώδες επιθήλιο υπερβασικά κύτταρα εκτός από ακραία κύτταρα. Epi = φυσιολογικό επιθήλιο. Μέγεθος μπαρ όλα τα πάνελ? 50 μm.

Η

Για να προσδιοριστεί η έκφραση του HATL5 σε ιστούς, ανάλυση RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ολικό RNA εκχυλίζεται από μια σειρά από ιστούς ενηλίκων ποντικών (Σχ. 4Β). Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε ότι HATL5 εμφανίζει ένα σχετικά περιορισμένο προφίλ έκφρασης ιστού, με mRNA ανιχνεύθηκε σε 4 από τα 19 ιστούς που αναλύθηκαν: οισοφάγου, του τραχήλου, της γλώσσας, και όρχεις. Ένα κοινό χαρακτηριστικό μεταξύ του οισοφάγου, του τραχήλου, και η γλώσσα είναι ότι οι επενδύσεις του βλεννογόνου αυτών των ιστών όλα περιέχουν στρωματοποιημένο πλακώδες επιθήλιο. Αυτό μας ώθησε να εξετάσουμε την κατανομή και την κυτταρική εντόπιση του HATL5 πρωτεΐνης σε αυτούς τους ιστούς με ανοσοϊστοχημεία (IHC). Αντιπροσωπευτικά τομές φυσιολογικού οισοφάγου, του τραχήλου της μήτρας, και της κεφαλής και του λαιμού (γλώσσα και επιγλωττίδα) βλεννογόνο φαίνεται στο Σχήμα 4C. Χρησιμοποιώντας σειριακά τμήματα, τα πλακίδια ανιχνεύθηκαν με ένα αντι-HATL5 πρωτεΐνη κουνέλι ή χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι, όπου το πρωτογενές αντίσωμα υποκαταστάθηκε με μη-άνοση IgG κουνελιού (Σχ. 4C και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε όλους τους τρεις τύπους ιστών ένα ισχυρό επιθηλιακά χρώση ανιχνεύεται στο κορυφαίο πλακώδη κύτταρα χωρίς σημαντική χρώση στα υποβλεννογόνια ή μεσεγχυματικών διαμερίσματα. HATL5 πρωτεΐνη εντοπίζεται κυρίως στις κυτταρικές επιφάνειες των μεγαλύτερων πλακώδη κύτταρα. Αυτή η κυτταρική επιφάνεια εντοπισμός είναι σε συμφωνία με την αναμενόμενη διανομή της προβλεπόμενης μεμβράνη αγκυρώνεται τοπολογία του HATL5. Καμία σημαντική κηλίδωση ανιχνεύθηκε στα μικρά, κυβοειδή και εξαιρετικά μιτωτικών κυττάρων στη βασική στιβάδα.

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η

TMPRSS11b

γονίδιο κατευθύνει την σύνθεση ενός διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που είναι