Αφηρημένο

Τόσο S100A14 και S100A16 είναι μέλη του πολυλειτουργικού οικογένεια πρωτεϊνών S100. Σχηματισμός ομο /ετεροδιμερή θεωρείται ένας από τους σημαντικότερους μηχανισμούς S100 πρωτεΐνες να εκτελέσει ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες τους. Με τη χρήση μιας οθόνης κλασική ζυμομύκητα δυο υβριδίων (Υ-2 Η), προσδιορίσαμε S100A16 ως ενιαίου αλληλεπίδραση εταίρος της S100A14. Αυτή η αλληλεπίδραση επιβεβαιώθηκε με συν-ανοσοκαταβύθιση, διπλό έμμεσο ανοσοφθορισμό και διπλό ανοσοχρώση σε δείγματα από στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων και τη φυσιολογική του βλεννογόνου του στόματος. Η λειτουργική σημασία αυτής της αλληλεπίδρασης εξετάστηκε με την απασχόληση ρετροϊικής μεσολάβηση υπερ-έκφραση και knock-down αυτών των πρωτεϊνών σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου. Υπερ-έκφραση και knock-down της S100A14 οδήγησε στην ταυτόχρονη πάνω και προς τα κάτω ρύθμιση των S100A16 πρωτεϊνών στις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν. Ωστόσο, δεν υπήρχε πάνω ρύθμιση του mRNA S100A16 κατόπιν S100A14 υπερέκφραση, υποδεικνύοντας ότι η τροποποίηση της έκφρασης S100A16 δεν οφειλόταν σε αυξημένη μεταγραφική δραστικότητα, αλλά πιθανώς με μετα-μεταγραφική ρύθμιση. Αντίθετα, η υπερβολική έκφραση της S100A16 συσχετίστηκε ούτε με την ρύθμιση προς τα πάνω του S100A14 mRNA ούτε πρωτεΐνη του, υποδηλώνοντας μια μονόδρομη ρύθμιση μεταξύ S100A14 και S100A16. Κυτταρική θεραπεία με αναστολέα της πρωτεϊνικής σύνθεσης κυκλοεξιμίδιο έδειξε μια εξαρτώμενη από το χρόνο ενδοκυτταρική αποικοδόμηση των δύο πρωτεϊνών S100A16 και S100A14. Επιπλέον, η ρύθμιση της S100A16 και S100A14 αποικοδόμηση βρέθηκε να είναι ανεξάρτητη από τις κλασικές του πρωτεασώματος και λυσοσωματική οδούς αποικοδόμησης πρωτεϊνών. Ως εκ τούτου, περαιτέρω μελέτες θα είναι αναγκαίο να κατανοήσουμε τη λειτουργική σημασία αυτής της αλληλεπίδρασης και τους μηχανισμούς για τον τρόπο S100A14 εμπλέκεται στη ρύθμιση της έκφρασης S100A16

Παράθεση:. Sapkota D, Κωστέα DE, Ιμπραήμ SO, Johannessen AC, Bruland O (2013) S100A14 αλληλεπιδρά με S100A16 και ρυθμίζει την έκφραση του σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 8 (9): e76058. doi: 10.1371 /journal.pone.0076058

Επιμέλεια: Zhihua Liu, Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών, η Κίνα

Ελήφθη: 14, Μαρτίου του 2013? Αποδεκτές: 20 του Αυγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 27η Σεπτεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Sapkota et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο του Μπέργκεν (μετα-διδακτορική ταμείο, DS) και Μπέργκεν Ίδρυμα Ιατρικής Έρευνας (DEC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η οικογένεια πρωτεϊνών S100 είναι μια πολυλειτουργική ομάδα της δέσμευσης EF-χέρι ασβεστίου πρωτεΐνες. Αυτή η οικογένεια αποτελείται από μικρά όξινων πρωτεϊνών (10-12 kDa) που εκφράζονται μόνο σε σπονδυλωτά σε ένα συγκεκριμένο κύτταρο και ιστό τρόπο. Μέχρι σήμερα, έχουν 25 μέλη πρωτεΐνη S100 έχουν περιγραφεί στον άνθρωπο. Μέλη της πρωτεΐνης S100 έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει ένα αριθμό βιολογικών διεργασιών, όπως του κυτταρικού κύκλου, την κυτταρική κινητικότητα, μεταδιέγερση σήματος, φωσφορυλίωση πρωτεϊνών, μεταγραφή, την επιβίωση των κυττάρων και την απόπτωση, που σχετίζονται με τη φυσιολογική ανάπτυξη και την καρκινογένεση [1,2]. Παρά αυτές τις διαφορετικές λειτουργικές ρόλους, S100 πρωτεΐνες δεν έχουν καμία ενζυματική δραστηριότητα να λογοδοτήσουν για τις κυτταρικές τους δράσεις [3,4]. Ένας από τους μηχανισμούς για ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες τους είναι η ικανότητα της πλειοψηφίας των πρωτεϊνών S100 να αλληλεπιδρά άμεσα με έναν αριθμό άλλων κυτταρικών πρωτεϊνών, διαμορφώνοντας με αυτόν τον τρόπο τις λειτουργίες τους [3]. Πολλά μέλη των πρωτεϊνών S100 μπορεί να σχηματίσει ομοδιμερή /ολιγομερή (για παράδειγμα: S100A4 [5], S100B [6]) ή ετεροδιμερή (για παράδειγμα: αλληλεπιδράσεις μεταξύ S100A8 και S100A9 [7], μεταξύ S100A4 και S100A1 [8], μεταξύ S100B και S100A6 [6]) και οι homo σχηματισμό /heterodimer- θεωρείται σημαντική για κυτταρικές λειτουργίες τους.

S100A14 είναι μια πρόσφατη προσθήκη στην οικογένεια πρωτεϊνών S100 [9,10]. Διαφορική έκφραση του S100A14 έχει αναφερθεί σε ένα αριθμό ανθρώπινων καρκίνων [9,11]. Έχουμε αναφέρει πρόσφατα ένα ρόλο του S100A14 στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της εισβολής του στόματος ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (OSCCs) [12,13]. S100A14 βρέθηκε να ρυθμίζουν την έκφραση αρκετών μορίων συμπεριλαμβανομένων ρ21, ΜΜΡ1 και ΜΜΡ9 σε OSCC προερχόμενα κυττάρων [12,13]. Επιπλέον, ο βιολογικός ρόλος αυτής της πρωτεΐνης έχει αναφερθεί σε άλλες ανθρώπινους καρκίνους, όπως του οισοφάγου [14] και του παχέος εντέρου [15]. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός και μοριακή σηματοδότηση S100A14 στον ανθρώπινο καρκίνο δεν είναι πλήρως κατανοητός. Όντας κατά κύριο λόγο μια μεμβρανώδη πρωτεΐνη [12] με θέση Ν-μυριστοϋλίωσης στο Ν-άκρο [9], μπορεί να σκεφτεί ότι S100A14 μπορεί να αλληλεπιδρά με άλλες πρωτεΐνες δυνητικά εμπλέκονται στη μεταγωγή σήματος. Κατά συνέπεια, S100A14 έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με ένα εξαρτώμενο από το ασβέστιο τρόπο με nucleobindin [10], μια πρωτεΐνη προταθεί ότι εμπλέκεται σε μεταγωγή σήματος συζευγμένου με πρωτεΐνη [16]. Ωστόσο, δεν έχει εξεταστεί η ικανότητα των S100A14 να σχηματίσουν ετεροδιμερή με άλλες πρωτεΐνες S100. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι S100A14 αλληλεπιδρά με άλλη πρωτεΐνη S100, το S100A16, και διαμορφώνει την έκφρασή του σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπείες

Οι προφορικές καρκίνωμα προερχόμενο κυτταρικές σειρές πλακωδών κυττάρων: CaLH3 [17], H357 [18], VB6 [19] και OSCC1 [13] καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. κύτταρα HeLa (ATCC, CCL-2

TM) διατηρήθηκαν με συνήθη τρόπο σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (Cat Νο: D6429, Sigma) συμπληρωμένο με 10% FCS. Όλες οι κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν σε υγροποιημένο περιβάλλον με 5% CO

2 στους 37 ° C. Είκοσι τέσσερις ώρες πριν από τη θεραπεία με αναστολείς, 1.0×10

5 έως 1.5×10

5 κύτταρα ανά πηγάδι τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 50, 100 ή 150 αναστολέα proteosomal μΜ MG-132 (Cat Νο: C2211, Sigma) για 5 και 10 ώρες? 0, 50, 100 ή 150 μΜ λυσοσωματική χλωροκίνη αναστολέα (Cat Νο: C6628, Sigma) για 24 ώρες και 200 ​​μg /mL αναστολέα πρωτεϊνικής σύνθεσης κυκλοεξιμίδιο (Cat Νο: # 239763, Calbiochem) για 0, 3, 5, 7 και 8 ώρες. Μετά τις θεραπείες, τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA 1Χ και χρησιμοποιείται για ανοσοκηλίδωση. Η έκφραση της πρωτεΐνης S100A16 υπολογίστηκε σε σχέση με την έκφραση των επιπέδων GAPDH (χρησιμοποιώντας πολλαπλών λογισμικό Gauge, Version 3.2, Fujifilm Corporation) και παριστάνεται ως εκατοστιαία S100A16 πρωτεΐνη που παραμένει μετά την κατεργασία με κυκλοεξιμίδιο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). S100A16 ημίσειας ζωής (

t

1/2) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism 5.03 για Windows (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com).

δύο Μαγιά υβριδική οθόνη (οθόνη Υ-2Η)

Οι κωδικεύουσες αλληλουχίες της ανθρώπινης S100A14 συντήχθηκαν εντός πλαισίου με την περιοχή σύνδεσης DNA GAL4 του φορέα pGBT9 να παράγει κατασκεύασμα δόλωμα pGBT9-S100A14. υπηρεσία ελέγχου Υ-2Η αγοράστηκε από τη γερμανική Cancer Research Center, Heidelberg, Γερμανία. Εν συντομία, pGBT9-S100A14 κατασκεύασμα συν-διαμολύνθηκε με ανθρώπινο cDNA βιβλιοθήκες κερατινοκυττάρων σε

Saccharomyces cerevisiae

. Οι θετικοί κλώνοι ταυτοποιήθηκαν με επιλογή TRP1 στους 0 mM 3-αμινοτριαζόλης. Όλα τα θετικά κλώνοι αλληλουχήθηκαν με αλληλούχηση Sanger. Οι λεπτομέρειες της κατασκευής δόλωμα pGBT9-S100A14 και τα πρωτόκολλα διαλογής Υ-2Η είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος.

συνανοσοκαθίζησης (Co-IP)

κύτταρα CaLH3 λύθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ( ρυθμιστικό 1Χ RIPA, cat Νο: 89901, Pierce Biotechnology), συμπληρωμένο με πρωτεάση (αναστολέας πρωτεάσης Halt κιτ κοκτέιλ, cat Νο: 78410, Pierce Biotechnology) και φωσφατάσης (αναστολέας φωσφατάσης κοκτέιλ 2, cat Νο ρ 5726, Sigma) αναστολείς. Τα κυτταρικά εκχυλίσματα προκαταρκτική διαύγαση με επώαση με Πρωτεΐνη Α /G PLUS-αγαρόζης (Cat Νο: SC-2003, Santa Cruz) για 30 λεπτά. Πεντακόσια μικρογραμμάρια εκχύλισμα προδιαυγασθέντος κυττάρων επωάστηκε με 3 μg πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ανθρώπινο S100A14 (Cat Νο: 10489 – 1-ΑΡ, Proteintech) ή αντι-ανθρώπινο αντίσωμα S100A16 πολυκλωνικό κουνελιού (11456-1-ΑΡ, Proteintech) για 1 ώρα στους 4 ° C σε έναν περιστρεφόμενο τροχό με την παρουσία 0-2 mM ΟαΟ

2 ή 2 mM ΟαΟ

2 με 5 mM EDTA. Μόνο λύμα (χωρίς αντίσωμα) και πολυκλωνικό αντι-ΜΜΡ9 αντίσωμα (Cat Νο: SC-10737, Santa Cruz? Ισότυπου IgG) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι για την συν-ΠΕ. Στη συνέχεια, 70 μλ του αναδιαλυμένου Πρωτεΐνης Α /G PLUS-αγαρόζης (Cat Νο: SC-2003, Santa Cruz) προστέθηκε στο λύμα-αντισώματος μίγμα και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε έναν περιστρεφόμενο τροχό. Μετά την επώαση, τα σφαιρίδια φυγοκεντρήθηκαν στα 1000xg για 5 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο απορρίφθηκε. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν 4 φορές με PBS, επαναιωρήθηκαν και βράζεται στους 90 4 ° C για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος 30 μL SDS και ανοσοστυπώθηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ανθρώπινο S100A16 (11456-1-ΑΡ, Proteintech, Chicago, IL, USA, 1 : 500 αραιώσεις) ή αντι-αντίσωμα ανθρώπου S100A14 πολυκλωνικό κουνελιού (10489 με 1-AP, Proteintech, 1: 1000 αραιώσεις)

Κατασκευή και επιμόλυνση της έκφρασης και shRNA φορείς

φορέα έκφρασης S100A14. δομήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Ανθρώπινο cDNA που κωδικοποιεί S100A16 ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ζεύγη εκκινητών (F: 5 ‘-ATCCCGCGGCAGGGAGATGTCAGACTGCTA-3′ και R: 5’-TGAGGATCCCTAGCTGCTGCTCTGCTG-3 ‘) και υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα έκφρασης ρετροϊικού pRetroX-IRES-ZsGreen1 (Clontech Laboratories, Inc., CA , ΗΠΑ). shRNA στόχευσης

S100A14

mRNA κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα ολιγονουκλεοτίδια: shRNA1 (F: 5′- GATCCCCTTGTGTAAGAGCCAAAGAATTCAAGAGATTCTTTGGCTCTTACACAATTTTTGGAAA-3 ‘? R: 5′- AATTTTTCCAAAAATTGTGTAAGAGCCAAAGAATCTCTTGAATTCTTTGGCTCTTACACAAGGG-3′), shRNA2 (F: 5’- GATCCCCAGGGTCTTTAAGAACCTACTTCAAGAGA GTAGGTTCTTAAAGACCCTTTTTTGGAAA- 3 ‘? R: 5′- AATTTTTCCAAAAAAGGGTCTTTAAGAACCTAC TCTCTTGAAGTAGGTTCTTAAAGACCCTGGG-3′), shRNA3 (F: 5’- GATCCCCGAACCTACTTCCTAATCTCTTCAAGAGAGAGATTAGGAAGTAGGTTCTTTTTGGAAA-3 ‘? R: 5′- AATTTTTCCAAAAA GAACCTACTTCCTAATCTCTCTCTTGAAGAGATTAGGAAGTAGGTTCGGG-3’). Τα ολιγονουκλεοτίδια ανοπτήθηκαν και ενσωματώνονται στο RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-DsRed-Express φορέα έκφρασης (Cat Νο:. 632487, Clonetech). shRNA στόχευση

LacZ

γονίδιο χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας για την S100A14-Τα siRNAs. κυτταρικές σειρές του καρκίνου μολύνθηκαν με τους ρετροϊούς που προέρχονται από τη συσκευασία κύτταρα (Phoenix Α), ταξινόμηση (GFP /DsRed ως δείκτης), που μεταδίδονται, επαληθεύεται για υπερ-έκφραση και knockdown των αντίστοιχων πρωτεϊνών και χρησιμοποιούνται για λειτουργικές δοκιμασίες.

εκχύλιση RNA, σύνθεση cDNA και ποσοτική RT-PCT (qRT-PCR)

Ολικό RNA εξήχθη από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου χρησιμοποιώντας RNeasy ινώδους ιστού πρωτόκολλο μίνι κιτ (cat Νο: 74704, Qiagen Inc. , Valencia, CA, USA). Ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, 600 νανογραμμάρια ολικού RNA μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας υψηλής χωρητικότητας σύστημα Kit cDNA Archive (Cat Νο: 4.368.814, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Όλα qRT-ενισχύσεις PCR εκτελέστηκαν σε ΑΒΙ Prism Sequence Detector 7900 ΗΤ (Applied Biosystems, Foster City, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [12]. δοκιμασία TaqMan για

S100A16

(Hs00293488_m1) και το πράσινο SYBR βασίζονται qRT-PCR (με χρήση των ίδιων ζευγών εκκινητών όπως και για την κατασκευή του φορέα έκφρασης S100A14) πραγματοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση

S100A16

και

S100A14

mRNAs στις κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Συγκριτική 2

μέθοδος -ΔΔ Ct χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης σε σχέση mRNA.

Ανοσοστύπωμα

Είκοσι με σαράντα μg πρωτεΐνης επιλύθηκε σε NuPAGE® Novex 4-12% ή 10 % δις-TrisTris γέλη (Life Technologies, ΝΥ, USA) σε NuPAGE® MOPS /MES SDS ρέον ρυθμιστικό (Life Technologies, ΝΥ, USA) και ανοσοστυπώθηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ανθρώπινο S100A14 (10.489 – 1-ΑΡ, Proteintech, Chicago, IL, USA, 1: 1000 αραιώσεις), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-ανθρώπινης S100A16 (11.456 – 1-ΑΡ, Proteintech, Chicago, IL, USA, 1: 500 αραιώσεις) και μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι ανθρώπινης-p53 (sc-263, Santa Cruz Biotechnologies, CA, USA, 1: 1000 αραιώσεις) ακολουθώντας πρότυπο πρωτόκολλο κηλίδος western. Anti-GAPDH (SC-25778, Σάντα Κρουζ, 1: 5000 αραιώσεις) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης. Οι κηλίδες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (SuperSignal

® West Pico? Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) και οι εικόνες ανιχνεύθηκαν σε Fujifilm Las-4000 scanner

Διπλή έμμεσο ανοσοφθορισμό (DIF)

η χρήση των OSCCs και της αντίστοιχης κανονικής βλεννογόνου τους για DIF και ανοσοϊστοχημεία εγκρίθηκε από την περιφερειακή επιτροπή για την ιατρική και την υγεία Δεοντολογίας, Western-Νορβηγία. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τον συμμετέχοντα της μελέτης. Πέντε μm τομές του OSCCs και αντίστοιχο φυσιολογικό βλεννογόνο τους από-παραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν ακολουθώντας πρότυπες διαδικασίες και ανάκτηση επιτόπιου θερμότητα προκαλούμενη εκτελέστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (ρΗ 9.0) με τη χρήση μικροκυμάτων (Cat Νο: ΝΝ-L564W, Panasonic, Osaka , Ιαπωνία). Στη συνέχεια, το πρώτο πρωτεύον αντίσωμα (πολυκλωνικό κουνελιού αντι αντίσωμα S100A16, 11.456-1-ΑΡ, Proteintech, διαλύματα 1:50) εφαρμόστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και πλένονται. Τα δείγματα επωάστηκαν με Fab θραύσμα Goat anti-Rabbit IgG (Cat Νο 111-007-003, Jackson ImmunoResearch, διαλύματα 1:50) για 2 ώρες, για να επιτρέψει για μεταγωγή της IgG κουνελιού με κατσίκα Fab [20]. Στη συνέχεια, τα δείγματα επωάστηκαν με ποντικού αντι-GoatDyLight 488IgG (Cat Νο 205-485-108, Jackson ImmunoResearch, διαλύματα 1:50) δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα, πλύθηκαν, δεσμεύτηκαν με 10% ορό κατσίκας για 1 ώρα και το δεύτερο πρωτεύον αντίσωμα , πολυκλωνικά κουνελιού αντι-S100A14 (cat Νο: 10489-1-AP, Proteintech, 1: 600 αραιώσεις), εφαρμόσθηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το πλύσιμο, δευτερεύον αντίσωμα αίγας αντι-κουνελιού Alexa φθόριο

® 568 (κατ: Α-11011, Invitrogen, 1: 200 αραιώσεις) εφαρμόστηκε για 1 ώρα, πλένονται και οι πλάκες τοποθετούνται σε παρατείνουν

® Gold αντιξεθωριάσματος αντιδραστήριο με DAPI (cat Νο: P36935, Invitrogen). Τα δείγματα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας Leica TCS SP2 AOBS (Leica Microsystems, Γερμανία) ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ.

μονού και διπλού ανοσοϊστοχημεία (IHC)

μονού και διπλού IHC πραγματοποιήθηκαν στις σειριακές τομές των OSCCs και αντίστοιχο φυσιολογικό βλεννογόνο τους. Ενιαία IHC για S100A16 και S100A14 διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [12]. Για διπλό IHC, πέντε μm τομές-παραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν ακολουθώντας πρότυπες διαδικασίες και ανάκτηση επιτόπιου θερμότητα προκαλούμενη εκτελέστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (ρΗ 9.0) με τη χρήση μικροκυμάτων (Cat Νο: ΝΝ-L564W, Panasonic, Osaka, Japan) . Μετά από αποκλεισμό με μπλοκ υπεροξειδάση και 10% ορό κατσίκας, οι τομές επωάστηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-S100A16 (Cat Νο: 11.456 έως 1-ΑΡ, Proteintech, αραιώσεις 1: 200) επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν και δευτερογενή αντι-κουνελιού αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας σημασμένο πολυμερές (cat Νο: K4011, ϋΑΚΟ, Golstrup, DK) εφαρμόστηκε και η αντίδραση έγινε ορατή χρησιμοποιώντας ImmPACT VIP (cat Νο: SK-4605, Vectorlabs, California, USA) ως υπόστρωμα ενζύμου, με αποτέλεσμα ένα μωβ προϊόν αντίδρασης. Για να αποφευχθεί διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με επακόλουθη ανοσοϊστοχημική αντίδραση, τα αντισώματα της πρώτες αντιδράσεις μετουσιώθηκαν με θέρμανση των δειγμάτων σε ρΗ 6,0 Target Ανάκτηση Buffer (Cat Νο: S1699, ϋΑΚΟ, Golstrup, DK) με τη χρήση μικροκυμάτων (1000 Watts για 2 λεπτά και 250 watts για πέντε και μισό λεπτά? NN-L564W, Panasonic, Osaka, Ιαπωνία) [21]. Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν με μπλοκ υπεροξειδάση και 10% ορό αίγας και πάλι και το δεύτερο πρωτεύον αντίσωμα (πολυκλωνικό κουνελιού αντι-S100A14, 10489-1-ΑΡ, Proteintech, αραιώσεις 1: 1400) εφαρμόστηκε και πλύθηκε. Στη συνέχεια, δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας σημασμένο πολυμερές (Cat Νο: K4011, ϋΑΚΟ, Golstrup, DK) εφαρμόστηκε και οπτικοποιήθηκε με ImmPACT SG (Cat Νο: SK-4705, Vectorlabs, California, USA) με αποτέλεσμα ένα γκρίζο προϊόν αντίδρασης. Τα δείγματα στη συνέχεια με αιματοξυλίνη (cat no: S3301, ϋΑΚΟ, Golstrup, DK), αφυδατωμένο και τοποθετείται με μέσο στερέωσης EuKit. Τα δείγματα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας Leica DMLB μικροσκόπιο.

Στατιστικά

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Για στατιστικές αναλύσεις, Student’s-

t

δοκιμής (ζεύγη) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 5.03 για Windows (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com), με το επίπεδο σημασίας καθορίζεται σε 5% .

Αποτελέσματα

S100A16 ταυτοποιήθηκε ως εταίρος αλληλεπίδραση S100A14 τόσο

in vivo

στα κύτταρα μαγιάς και

in vitro

στη στοματική καρκινογόνες κύτταρα προερχόμενα από

Για να προσδιορίσετε την αλληλεπίδραση των εταίρων της S100A14, μια ανθρώπινη βιβλιοθήκη cDNA κερατινοκυττάρων προβλήθηκε με το δόλωμα pGBT9-S100A14 κατασκευάσει στο

Saccharomyces cerevisiae

. Από 54 θετικών κλώνων αλληλουχία, η ανθρώπινη S100A16 ταυτίστηκε 53 φορές. DCAF8 ταυτοποιήθηκε να είναι μια ψεύτικη θετική αλληλεπίδραση εταίρος της S100A14. Η αλληλεπίδραση μεταξύ πρωτεϊνών και S100A14 S100A16 επαληθεύθηκε με συν-ανοσοκαταβύθιση χρησιμοποιώντας το καρκίνο του στόματος προέρχεται CaLH3 κυτταρική γραμμή (Σχήμα 1Α). Αν και προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ενισχυμένη αλληλεπίδραση μεταξύ των άλλων πρωτεϊνών S100 στην παρουσία της αύξησης Ca

2 + συγκεντρώσεις, δεν θα μπορούσαμε να εντοπίζει αυξημένη ανοσοκατακρήμνιση μεταξύ S100A14 και S100A16 με την αύξηση του Ca

2 + συγκεντρώσεις (0,5 και 2 mM του CaCl

2) (Σχήμα 1Α). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση μεταξύ S100A14 και S100A16 όταν 5mM δισθενούς μετάλλου EDTA χηλικοποιητή ιόντων χρησιμοποιήθηκε μαζί με 2 mM του CaCl

2 (Σχήμα 1Α). Αντίστροφη δοκιμασία συν-ανοσοκαθίζηση χρησιμοποιώντας αντίσωμα ειδικό για S100A16 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω την αλληλεπίδραση μεταξύ S100A14 και S100A16 πρωτεΐνες (Σχήμα 1Β).

Πεντακόσια μικρογραμμάρια προ-καθαριστεί κυτταρικό εκχύλισμα από κύτταρα CaLH3 επωάστηκε με αντι-αντίσωμα σε S100A14 η παρουσία 0-2 mM ΟαΟ

2 ή 2 mM ΟαΟ

2 με 5 mM EDTA (Α) ή αντι-S100A16 αντίσωμα (Β), που ακολουθείται από επώαση με πρωτεΐνη Α /G PLUS-αγαρόζης. Τα ανοσοσύμπλοκα ανοσοστυπώθηκαν με αντι-S100A16 (Α) ή αντι-S100A14 αντίσωμα (Β). Μόνο λύμα (χωρίς αντίσωμα) και αντίσωμα αντι-ΜΜΡ9 χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι για την συν-ΠΕ. (Α) Μ, δείκτης μοριακού βάρους? λωρίδα 1, είσοδος? λωρίδα 2, μόνο λύμα? λωρίδα 3, τον έλεγχο αντι-ΜΜΡ9 αντισώματος? λωρίδες 4-7 (αντι-S100A14 αντίσωμα): διαδρομή 4, 0 mM ΟαΟ

2? λωρίδα 5, 0,5 mM ΟαΟ

2? λωρίδα 6, 2 mM ΟαΟ

2? διαδρομή 7, 2 mM ΟαΟ

2 με 5 mM EDTA. (Β) λωρίδα 1, είσοδος? λωρίδα 2, μόνο λύμα? λωρίδα 3, τον έλεγχο αντι-ΜΜΡ9 αντισώματος? λωρίδα 4, αντι-S100A16 αντισώματος με 0 mM ΟαΟ

2.

Η

S100A14 συν-εντοπίζεται με S100A16 δειγμάτων OSCCs και φυσιολογικό βλεννογόνο του στόματος

DIF και διπλά IHC ήταν εκτελούνται σε OSCCs και των αντίστοιχων φυσιολογικό βλεννογόνο για να εξετάσει την υπο-κυτταρικό εντοπισμό των S100A14 και S100A16. DIF έδειξε μεμβρανώδη συν-εντοπισμό των πρωτεϊνών S100A16 και S100A14 στα επιθηλιακά κύτταρα και των δύο κανονικής βλεννογόνου του στόματος (Σχήμα 2Α1-Α4) και OSCC (Σχήμα 2Β1-Β4). Παράλληλα με αυτά τα αποτελέσματα, μεμβρανώδη συν-εντοπισμό αυτών των πρωτεϊνών παρατηρήθηκε επίσης στις σειριακές τομές φυσιολογικού βλεννογόνου του στόματος (Σχήμα 2C1-C3) και στην εισβολή νήσο OSCC (καλά διαφοροποιημένο βλάβη) (Σχήμα 2D1-Δ3) με ενιαία και διπλά IHC.

Κυτταρική εντόπιση των S100A14 και S100A16 εξετάστηκε εκτελώντας DIF και IHC στα τμήματα της φορμόλης σταθερών και παραφίνη ενσωματωμένα OSCC και κανονική του στοματικού βλεννογόνου ιστούς. Κατά κύριο λόγο μεμβρανώδη εντοπισμός του S100A16 (πράσινο), S100A14 (κόκκινο) και S100A16 /Α14 (κίτρινο) οπτικοποιήθηκε στα επιθηλιακά κύτταρα του φυσιολογικού βλεννογόνου (Α1-Α4) και OSCC (Β1-Β4) ιστούς με DIF (Epth, επιθήλιο? CT , συνδετικού ιστού). Ομοίως, με μονά και διπλά IHC στις διαδοχικές τομές, κυρίως μεμβρανώδη έκφραση S100A16 (μωβ), S100A14 (γκρι) και S100A16 /Α14 (μικτό χρώμα) ανιχνεύθηκε στο φυσιολογικό βλεννογόνο (C1-C3) και στην OSCC (D1 -θ3).

Η

S100A16 πρωτεΐνη αλλά όχι έκφραση mRNA ρυθμίζεται από S100A14 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου

Η βιολογική σημασία της αλληλεπίδρασης μεταξύ S100A14 και S100A16 ήταν επόμενο εξετάστηκε από υπερεκφράζουν S100A14 σε ένα αριθμό ανθρώπινων κυτταρικών σειρών καρκίνου (CaLH3, VB6, H357, OSCC1 και HeLa) χρησιμοποιεί μια στρατηγική γονιδιακής έκφρασης διαμεσολαβείται ρετροϊικά. επίπεδα πρωτεΐνης S100A16 βρέθηκαν να αυξηθεί σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν μετά την υπερ-έκφραση του S100A14 (Σχήμα 3Α). Επιπλέον, shRNA μεσολάβηση knock-down του S100A14 συνδέθηκε με την καταστολή της S100A16 πρωτεΐνης σε CaLH3 και κυτταρικές σειρές OSCC1 (Σχήμα 3Β). Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία αύξηση στα επίπεδα έκφρασης του mRNA της S100A16 σε αυτές S100A14 υπερεκφράζουν κυτταρικές σειρές καρκίνου (Σχήμα 3C).

(Α) Οι ρετροϊικοί μεσολαβούμενες υπερέκφραση S100A14 συσχετίστηκε με ταυτόχρονη απότομη ανωφέρεια ρύθμιση της S100A16 πρωτεΐνης σε CaLH3, VB6, H357, OSCC1 και κυτταρικές σειρές HeLa (-, κατασκεύασμα ελέγχου? +, κατασκεύασμα έκφρασης S100A14). (Β) Επιπλέον, shRNA μεσολάβηση knock-down της S100A14 στην CaLH3 και OSCC1 κυτταρικές σειρές συνδέθηκε με ρύθμιση προς τα κάτω της πρωτεΐνης S100A16 (-, κατασκεύασμα ελέγχου? +, S100A14 shRNA κατασκευάζει). (Γ) Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία επίδραση στα επίπεδα έκφρασης του mRNA της

S100A16

με υπερ-έκφραση S100A14 στο CaLH3, VB6, και H357 κυτταρικές σειρές.

S100A14

και

S100A16

επίπεδα έκφρασης του mRNA ομαλοποιήθηκαν σε

GAPDH

έκφραση του mRNA. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM από 3 βιολογικής επαναλήψεων γίνεται σε 3 επαναλήψεις τεχνική. Student’s-

t

δοκιμής (ζεύγη) πραγματοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση.

Η

S100A16 δεν ρυθμίζει την έκφραση του

S100A14

mRNA ή πρωτεΐνης σε ανθρώπινο σε κύτταρα καρκίνου γραμμές

επόμενο εξετάστηκε εάν S100A16 υπερέκφραση συνδέεται επίσης με την ταυτόχρονη αλλαγή στην έκφραση του S100A14 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου. Δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή ούτε στο mRNA (Σχήμα 4Α), ούτε τα επίπεδα πρωτεΐνης (Σχήμα 4Β) του S100A14 μετά την υπερ-έκφραση του S100A16 χρησιμοποιώντας ρετροϊικών κατασκευές έκφρασης.

Δεν υπήρχε καμία επίδραση στο mRNA (Α) ή πρωτεΐνη (Β) επίπεδα έκφρασης του S100A14 με ρετροϊικής μεσολάβηση υπερέκφραση S100A16 σε CaLH3 και κυτταρικές σειρές H357 (-, κατασκεύασμα ελέγχου? +, κατασκεύασμα έκφρασης S100A16).

S100A14

και

S100A16

επίπεδα έκφρασης του mRNA ομαλοποιήθηκαν σε

GAPDH

έκφραση του mRNA. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM από 3 βιολογικής επαναλήψεων γίνεται σε 3 επαναλήψεις τεχνική. Student’s-

t

δοκιμής (ζεύγη) πραγματοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση.

Η

Οι πρωτεΐνες Τόσο S100A16 και S100A14 υποβαθμιστεί ενδοκυτταρικά με μηχανισμό (ες) ανεξάρτητα από πρωτεασώματος και λυσοσωμικών μονοπάτια

Χρήση θεραπεία κυκλοεξιμίδιο, εξαρτώμενη από το χρόνο αποικοδόμησης των S100A16 και S100A14 παρατηρήθηκε και στον έλεγχο και S100A14 υπερ-κύτταρα που εκφράζουν CaLH3 (Σχήμα 5Α). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην S100A16 ημίσειας ζωής (

t

1/2) μεταξύ του ελέγχου και της S100A14 υπερ-κύτταρα που εκφράζουν CaLH3 (~ 4,8 ώρες έναντι ~ 5,0 ώρες) (Σχήμα 5Α). Οι οδοί του πρωτεασώματος και λυσοσωμικών που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση της πλειονότητας των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών. Ο αναστολέας του πρωτεασώματος MG-132 εμποδίζει αποτελεσματικά η πρωτεολυτική δραστηριότητα του πρωτεασώματος [22] και το χλωροκίνη αναστολέας λυσοσωμικής αναστέλλει υδρολάσες λυσοσωμική με τη μείωση της οξίνισης του ενδοσωμιακό /λυσοσωμιακό διαμερίσματα [23]. Με τη θεραπεία τα κύτταρα CaLH3 και HeLa με πρωτεασώματος (MG-132) και αναστολείς (χλωροκίνη) λυσοσωμικού, είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον αυτές οι οδοί που εμπλέκονται στην αποδόμηση του S100A16. Αριθ αισθητή αύξηση στα επίπεδα του S100A16 παρατηρήθηκε μετά την αναστολή της πρωτεασώματος (στοιχεία για 10 ώρες αγωγή με MG-132 δεν φαίνεται) (Σχήμα 5Β) ή πορείες λυσοσωμικού (Σχήμα 5C). Το επίπεδο της ρ53, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για τα πειράματα αναστολής του πρωτεασώματος, αυξήθηκε όπως αναμενόταν με την αγωγή MG-132 (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, καμία αισθητή πάνω ρύθμιση S100A16 και S100A14 παρατηρήθηκε είτε στον έλεγχο ή στην S100A14 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα CaLH3 με MG-132 (Σχήμα 5D) ή θεραπείες χλωροκίνη (Σχήμα 5Ε).

(Α ) κύτταρα CaLH3 Ελέγχου και S100A14 υπερεκφράζουν υποβλήθηκαν σε αγωγή με αναστολέα πρωτεϊνικής σύνθεσης κυκλοεξιμίδιο σε μια χρονική πορεία (0, 3, 5, 7 και 8 ώρες) και το σύνολο κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν με αντι-S100A16 και -S100A14 αντισώματα. Σχετική έκφραση S100A16 (κανονικοποιημένη σε έκφραση πρωτεΐνης GAPDH) σχεδιάστηκε έναντι χρονική πορεία και ημίσειας ζωής (

t

1/2) υπολογίστηκε τόσο για τον έλεγχο και S100A14 υπερ-κύτταρα που εκφράζουν CaLH3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). -, Κατασκεύασμα ελέγχου? +, S100A16 κατασκεύασμα έκφρασης. Κυκλο, κυκλοεξιμίδιο.

(Β) CaLH3 και HeLa κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις αναστολέα πρωτεασώματος MG-132 (0-150 μΜ) για 5 και 10 ώρες (στοιχεία για 10 ώρες δεν φαίνεται) και λύματα ολόκληρων κυττάρων ανοσοστυπώθηκαν με αντι-S100A16 και -ρ53 αντισώματα. Η θεραπεία με MG-132 συνδέεται με αυξητική ρύθμιση της ρ53 (που χρησιμοποιείται ως θετικός έλεγχος για τα πειράματα αναστολής του πρωτεασώματος), αλλά όχι S100A16 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές.

(C) CaLH3 και HeLa κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του αναστολέα χλωροκίνη λυσοσωμικών (0-150 μΜ) για 24 ώρες και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου ανοσοστυπώθηκαν με αντι-S100A16 αντίσωμα. θεραπεία χλωροκίνη δεν συνδέεται με αλλαγή στην έκφραση S100A16 τόσο στα κύτταρα-γραμμών. Συγκεντρώσεις υψηλότερες από 50 μΜ χλωροκίνη οδήγησε σε υπερβολική θάνατο κυττάρων HeLa και ως εκ τούτου δεν χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα. Χλωρό, χλωροκίνη.

(D) Έλεγχος και S100A14 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα CaLH3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του αναστολέα πρωτεασώματος MG-132 (0-150 μΜ) για 5 ώρες και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου ανοσοστυπώθηκαν με αντι- S100A16 και -S100A14 αντισώματα.

(Ε) Έλεγχος και S100A14 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα CaLH3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του αναστολέα χλωροκίνη λυσοσωμικών (0-150 μΜ) για 24 ώρες και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου ανοσοστυπώθηκαν με αντι- S100A16 και -S100A14 αντισώματα. Χλωρό, χλωροκίνη.

Η

Συζήτηση

Παρά τις διαφορετικές λειτουργικές τους ρόλους που διαδραματίζουν οι πρωτεΐνες S100, αυτές οι πρωτεΐνες δεν έχουν καμία ενζυματική δραστηριότητα να λογοδοτήσουν για τις διάφορες κυτταρικές λειτουργίες τους [3,4 ]. Ένας από τους μηχανισμούς μέσω των οποίων πρωτεΐνες S100 εκτελούν ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες τους είναι μέσω της αλληλεπίδρασης με τη διαμόρφωση και τις λειτουργίες άλλων πρωτεϊνών τελεστών. Πρόσφατα, [12,13] και άλλοι [14,15] έχουν δείξει ένα λειτουργικό ρόλο των S100A14 στην ανθρώπινη καρκινογένεση. Συμμετοχή των S100A14 στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού του καρκίνου και την εισβολή του στόματος, με ρύθμιση της έκφρασης αρκετών μορίων συμπεριλαμβανομένων ρ21, ΜΜΡ1 και ΜΜΡ9, αναφέρθηκε από πρόσφατες μελέτες μας [12,13]. Τα ευρήματα αυτά μας οδήγησαν να διερευνήσει πιθανούς εταίρους αλληλεπίδραση S100A14 που θα μπορούσαν να ρυθμίζουν τις κυτταρικές λειτουργίες του. Χρησιμοποιώντας την οθόνη Υ-2Η, εντοπίσαμε S100A16, ένα άλλο μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών S100, ως η μόνη αληθινή αλληλεπίδραση εταίρος της S100A14. Αυτό το εύρημα ήταν μάλλον έκπληξη για πολλούς λόγους. Πρώτον, λαμβάνοντας υπόψη πολλαπλές λειτουργίες του στην ογκογένεση με ταυτόχρονη διαμόρφωση της έκφρασης αρκετών άλλων μορίων, S100A14 αναμενόταν να αλληλεπιδρούν με πολλές κυτταρικές πρωτεΐνες για να εκτελέσει διάφορες λειτουργίες του. Δεύτερον, η παρουσία του θέση Ν-μυριστοϋλίωσης στο Ν-άκρο της πρωτεΐνης S100A14 υποδηλώνει ότι αυτή η πρωτεΐνη μπορεί να αλληλεπιδράσει με άλλες πρωτεΐνες δυνητικά εμπλέκονται στη μεταγωγή σήματος [9]. Τρίτον, S100A14 έχει ήδη αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρά με άλλες κυτταρικές πρωτεΐνες όπως nucleobindin [10] και RAGE [14], αλλά αυτές οι πρωτεΐνες δεν ανιχνεύτηκαν στην τρέχουσα οθόνη Υ-2Η. Ωστόσο, τα ευρήματα της τρέχουσας οθόνης Υ-2Η μας είναι σύμφωνες με προηγούμενες οθόνες Υ-2Η για διαφορετικές πρωτεΐνες S100. Παρόμοια με τα ευρήματά μας, τα οποία αλληλεπιδρούν εταίρους για άλλες πρωτεΐνες S100 από προηγούμενες οθόνες Y-2Η επίσης κυριαρχείται σε μεγάλο βαθμό από την πρωτεΐνη ισομορφή S100 (ες) (που επισκοπείται στο 24). Ένας από τους λόγους για τους οποίους προτείνονται S100 ισομορφή κυριαρχείται αλληλεπίδρασης σε Υ-2Η μπορούσε να είναι μια συνάρτηση του ελέγχεται στενά ενδοκυτταρικού Ca

2+ συγκέντρωση (200 ηΜ) σε κύτταρο ζυμομύκητα [25], η οποία είναι πολύ κάτω από το ασβέστιο

K

δ τιμές πολλών πρωτεϊνών S100 (10-50 μΜ) και ότι θα μπορούσε να περιορίσει την αλληλεπίδραση μεταξύ S100 λεία και μη-S100 εταίρους αλληλεπίδρασης του που απαιτούν αυστηρή Ca

2+ συγκέντρωση για την αλληλεπίδραση να λάβει χώρα. Παρ ‘όλα αυτά, σε αντίθεση με πολλές άλλες πρωτεΐνες S100, δομικές αναλύσεις έχουν δείξει ότι τόσο S100A14 και S100A16 είναι χαμηλής συγγένειας Ca

2+ συνδετικά ιόν με ελάχιστες αλλαγές διαμόρφωσης μετά από σύνδεση με Ca

2+ [26,27] και ως εκ τούτου αυστηρή Ca

2+ συγκέντρωση δεν μπορεί να είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο πρωτεϊνών. Στην πραγματικότητα, με την αύξηση του Ca

συγκέντρωση 2+, αυξημένη ανοσοκαταβύθιση δεν παρατηρήθηκε μεταξύ S100A14 και S100A16 στην τρέχουσα μελέτη (Σχήμα 1Α). Ωστόσο, καμία αλληλεπίδραση ανιχνεύθηκε μεταξύ S100A14 και S100A16 όταν 5mM δισθενούς μετάλλου EDTA χηλικοποιητή ιόντων χρησιμοποιήθηκε (Σχήμα 1Α). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ S100A14 και S100A16 εξαρτάται από τα βασικά επίπεδα Ca

2+ και ενδεχομένως άλλα δισθενή μεταλλικά ιόντα στα κύτταρα και η αύξηση της συγκέντρωσης του Ca

2+ δεν ενισχύει κατ ‘ανάγκη το αλληλεπίδραση πιθανώς επειδή τόσο S100A14 και S100A16 είναι φτωχοί Ca

2+ συνδετικά με ημι-ανοιχτή διαμόρφωση ακόμα και σε apo-κράτος και αυτή η διαμόρφωση δεν μπορεί να αλλάξει αναγκαστικά ακόμα και μετά από δεσμευτική

2+ ιόντων Ca.

σε συμφωνία με τα ευρήματα του Υ-2Η και συν-ανοσοκαταβύθιση, συν-εντοπισμένη έκφραση S100A14 και S100A16 παρατηρήθηκε στα OSCCs και αντίστοιχο φυσιολογικό βλεννογόνο (Σχήμα 2), υποδεικνύοντας μία πιθανή λειτουργική σημασία αυτής της αλληλεπίδρασης. Πράγματι, η υπερβολική έκφραση και knock-down του S100A14 σε αρκετές κυτταρικές σειρές καρκίνου του συνδέθηκε με ταυτόχρονη πάνω και κάτω ρύθμιση πρωτεΐνης S100A16 (Σχήμα 3Α και Β), αλλά όχι του mRNA (σχήμα 3C). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι S100A14 ρυθμίζει την έκφραση S100A16 όχι στο μεταγραφικό επίπεδο, αλλά πιθανώς με μετα-μεταγραφική ή μεταφραστική ρύθμιση. Αντίθετα, δεν επηρεάζεται αισθητά παρατηρήθηκε και στο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης του S100A14 όταν S100A16 ήταν υπερ-εκφράζεται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου (Σχήμα 4Α και Β), υποδηλώνοντας μια μονόδρομη ρύθμιση μεταξύ S100A14 και S100A16 όπου μόνο S100A14 ρυθμίζει πρωτεΐνη αφθονία της S100A16. Παρόμοια με S100A14, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει διαφορική έκφραση S100A16 σε διαφορετικές ανθρώπινες κακοήθειες, υποδηλώνοντας ένα ρόλο αυτής της πρωτεΐνης σε ανθρώπινους καρκίνους [28]. Λαμβάνοντας υπόψη τον ρόλο των S100A14 σε καρκινικές κυτταρικές πολλαπλασιασμού και εισβολής [12,13] και την ικανότητά του να ρυθμίζει την έκφραση του S100A16 του στόματος, μπορεί να σκεφτεί ότι το ετεροδιμερές S100A14 \\ S100A16 θα μπορούσε να έχει λειτουργική σημασία σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα.

Έχοντας παρατηρήσει μια αύξηση μόνο στην πρωτεΐνη S100A16 και όχι σε

S100A16

έκφραση mRNA όταν S100A14 ήταν υπερ-εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, θα σκεφτεί ότι S100A14 μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της πρωτεϊνικής αποδόμησης S100A16.