Αφηρημένο

όγκων που σχετίζονται με τα μακροφάγα έχουν δείξει ότι την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου. Μπορούν να έχουν μια υποχρεωτική λειτουργία στην αγγειογένεση, εισβολή, και μετάσταση μέσω απελευθέρωση φλεγμονωδών μεσολαβητών. Η παρουσία τους στον καρκίνο των ωοθηκών έχει συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση σε αυτούς τους ασθενείς. Η ανθρώπινη κατιονική αντιμικροβιακή πρωτεΐνη-18 (hCAP18) /LL-37 ταυτοποιήθηκε αρχικά ως ένα μόριο τελεστή του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος. Κυκλοφορεί από έμφυτο ανοσοποιητικό κύτταρα, όπως τα μακροφάγα, για την καταπολέμηση μικροοργανισμών. Προηγούμενες μελέτες έχουν χαρακτηρίσει την hCAP18 /LL-37 ως παράγοντα ανάπτυξης που έχει αποδειχθεί ότι προάγει την εξέλιξη του όγκου των ωοθηκών. Ωστόσο, ο ρόλος hCAP18 /LL-37 έχει στην ανάπτυξη των ωοθηκών των όγκων μακροφάγων-προωθείται και πώς η έκφρασή του ελέγχεται στο πλαίσιο αυτό παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Εδώ, έχουμε αποδείξει με πειράματα συν-καλλιέργεια των μακροφάγων και ωοθηκικών καρκινικών κυττάρων μία σημαντική αύξηση του

in vitro

πολλαπλασιασμό και διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων παρατηρείται. Αυτές οι βελτιωμένες ιδιότητες της ανάπτυξης και της εισβολής συσχετίζεται με hCAP18 /LL-37 επαγωγή. HCAP18 /LL-37 έκφραση ελαττώθηκε με την προσθήκη δύο εξουδετερωτικών αντισωμάτων, TLR2 ή TLR6, καθώς και αναστολέων Cyp27B1 ή VDR. Επιπλέον, είτε η ΤΙ_Ρ2 ή TLR6 αντίσωμα μείωσε την εξέλιξη του κυτταρικού βιταμίνης D3 σηματοδότησης και του όγκου

in vitro

. Η προσθήκη αναστολέων Cyp27B1 ή VDR κατήργησε TLR2 /6 που προκαλείται από ενεργοποίηση έκφραση του hCAP18 /LL-37 στα μακροφάγα. Knockdown του όγκου που παράγεται βερσικάνη V1 με RNAi σε αυτά τα κύτταρα όγκου οδήγησε σε μειωμένη επαγωγή hCAP18 /LL-37 στα μακροφάγα. Βερσικάνη V1 knockdown ανέστειλε επίσης TLR2 και σηματοδότηση της βιταμίνης D3, καθώς και την ανάπτυξη και διηθητικότητα των κυττάρων αυτών όγκου στο

in vitro

συν-καλλιέργεια. Περιληπτικά, βρήκαμε ότι βερσικάνη V1 ενισχύει hCAP18 /LL-37 έκφραση σε μακροφάγα μέσω της ενεργοποίησης του TLR2 και την επακόλουθη μηχανισμούς βιταμίνη D-εξαρτώμενη τα οποία προωθούν την εξέλιξη του όγκου των ωοθηκών

in vitro

.

Citation : Li D, Wang Χ, Wu JL, Quan WQ, Ma L, Yang F, et al. (2013) Tumor-Παράγεται βερσικάνη V1 Ενισχύει hCAP18 /LL-37 έκφραση στα μακροφάγα μέσω της ενεργοποίησης των TLR2 και βιταμίνη D3 Σηματοδοσίας για την Προώθηση των ωοθηκών Εξέλιξη

In Vitro

. PLoS ONE 8 (2): e56616. doi: 10.1371 /journal.pone.0056616

Επιμέλεια: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Ιουλίου 2012? Αποδεκτές: 15 Γενάρη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 12η, Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας Επιχορηγήσεις (81272603)? Ερευνητικό Πρόγραμμα της Επιτροπής Επιστήμης και Τεχνολογίας του Putuo District, Shanghai (PTKW09-B02). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ένα μικροπεριβάλλον του όγκου διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην έναρξη του όγκου και την προώθηση. Αυτό το μοναδικό μικροπεριβάλλον περιέχει έμφυτη κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, τα λεμφοκύτταρα και του συνδετικού ιστού, καθώς και κακοήθων κυττάρων [1]. Έμφυτο ανοσοποιητικό κύτταρα (επίσης γνωστά ως μυελοειδή κύτταρα), περιλαμβάνουν τα μακροφάγα, κυτοκίνες απελευθέρωσης και χημειοκινών, καθώς και την επιρροή ογκογένεση [1] – [3]. Tumor-σχετίζεται μακροφάγα (ΤΑΜ) είναι ένα σημαντικό συστατικό των φλεγμονωδών διηθημάτων σε όγκους. ΤΑΜ προέρχονται από κυκλοφορούντα μονοκυτταρικούς προδρόμους με χημειοελκτικά, που εκκρίνεται από τα δύο καρκινικά κύτταρα και στρωματικά [4], [5]. Κλινικές μελέτες συνεχίζουν να επιδεικνύουν μία συσχέτιση μεταξύ ενός υψηλού πληθυσμών ΤΑΜ κακή πρόγνωση σε ωοθηκών, του μαστού, του προστάτη, του πνεύμονα, του τραχήλου της μήτρας και τους καρκίνους [6] – [8]. Υπάρχει ένα αυξανόμενο σώμα αποδείξεων ότι πολλές προ-φλεγμονώδεις παράγοντες που παράγονται από τα μακροφάγα, την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου, αγγειογένεση, εισβολή και μετάσταση [1], [5], [9]. Ωστόσο, ο πραγματικός ρόλος μια σειρά βασικών προ-φλεγμονωδών μορίων έχουν στην προώθηση των όγκων και των μηχανισμών τους, της έκφρασης και της λειτουργίας παραμένει ελάχιστα κατανοητή.

Το ανθρώπινο κατιονική αντιμικροβιακή πρωτεΐνη-18 (hCAP18) /LL-37 είναι η μόνο γνωστό πεπτίδιο cathelicidin σε ανθρώπους [10]. HCAP18 /LL-37 ιδιοσυστατικά παράγεται σε πολυάριθμους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων μακροφάγων, ουδετερόφιλων, επιθηλιακά κύτταρα του δέρματος του δέρματος, του γαστρεντερικού σωλήνα και των ουροφόρων οδών, από την επιδιδυμίδα και από επιθηλιακά κύτταρα του αναπνευστικού συστήματος [11], [12]. Το γονίδιο HCAP18 αποτελείται από 3 περιοχές: η περιοχή Ν-τερματικό πεπτίδιο σήματος, το εξαιρετικά διατηρημένη καθελίνης πεδίο που ομοιάζει και το C-τερματική περιοχή ονομάζεται LL-37 πεπτίδιο [13]. Η LL-37 πεπτιδίου διατηρείται σε προ-πεπτίδιο μορφή του μέχρι διάσπαση από την πρωτεάση 3 μόλις πριν από την έκκριση [14], [15]. Το πεπτίδιο LL-37 εξυπηρετεί διάφορες λειτουργίες σε διαφορετικές αντιδράσεις του ανοσοποιητικού, συμπεριλαμβανομένων ανοσορύθμιση, φλεγμονώδης αντίδραση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την αγγειογένεση, και αντιαποπτωτικών δραστηριότητα [16]. LL-37 έχει καθιερωθεί ως μια συμβολή στην ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου [16], [17]. Μελέτες έχουν δείξει σε καρκίνους των ωοθηκών LL-37 συμβάλλει στην πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εισβολή, και την πρόοδο του καρκίνου μέσω της άμεσης διέγερσης των κυττάρων του όγκου, την έναρξη της αγγειογένεσης και τη στρατολόγηση των ανοσοκυττάρων [14], [18], [19]. Η θεραπεία με ένα συνθετικό, βιολογικά ενεργό LL-37 πεπτιδίου ή διαγονιδιακή έκφραση LL-37 αυξάνει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων των πνευμόνων του όγκου. Αυτή η έρευνα υποδεικνύει ότι LL-37 δρα ως αυξητικός παράγοντας για τον καρκίνο του πνεύμονα ανθρώπου [20]. Επιπλέον, LL-37 επίσης θεωρείται ότι αυξάνει τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση των όγκων του μαστού και κακοήθη μελανώματα [21], [22]. Όλα μαζί αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι LL-37 λειτουργίες έναν αυξητικό παράγοντα σε μετασχηματισμένα κύτταρα.

Μια ποικιλία ερεθισμάτων, συμπεριλαμβανομένων των προ-φλεγμονωδών μορίων, αυξητικούς παράγοντες, τα θρεπτικά συστατικά, τα βακτηριακά προϊόντα, και ιδιαίτερα η φλεγμονή και τραυματισμό επάνω -regulate έκφραση του hCAP18 /LL-37 [16]. Στους ανθρώπους 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 (1,25D3) ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του hCAP18 /LL-37 μέσω του υποδοχέα της βιταμίνης D (VDR) σε μονοκύτταρα, μακροφάγα, κερατινοκυττάρων στην επιδερμίδα [23], [24]. Προηγούμενη έρευνα που επικεντρώνεται στην ενδοκυτταρική

Mycobacterium tuberculosis

αποδειχθεί ενεργοποίηση TLR2 σε ανθρώπινα μακροφάγα επάνω ρυθμισμένη έκφραση VDR και γονιδίων Cyp27B1. Αυτή η αλληλουχία των γεγονότων αυξάνει την παραγωγή του 1,25D3, η οποία με τη σειρά της οδηγεί στην επαγωγή της hCAP18 /LL-37 [24]. Πρόσφατες μελέτες του μικροπεριβάλλον του όγκου έδειξαν καρκίνωμα πνεύμονος Lewis κύτταρα (LLC) που παράγεται παράγοντες, όπως βερσικάνη, είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη των πνευμόνων και μετάσταση όγκου. Επιπλέον, αυτή η διαδικασία εξαρτάται από TLR2-μεσολαβητική ενεργοποίηση μυελοειδούς κυττάρου [25], με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ φλεγμονωδών παραγόντων TNFa, IL-6 παραγωγή [26], [27].

Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι να διερευνήσει τους μηχανισμούς ρύθμισης του hCAP18 /LL-37 στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Εδώ αναφέρουμε το βερσικάνη V1 που προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα ενισχύει hCAP18 /LL-37 έκφραση σε μακροφάγα μέσω της ενεργοποίησης του TLR2 και την επακόλουθη μηχανισμούς βιταμίνη D-εξαρτώμενη. Επιπλέον, είναι αυτή η αλυσίδα των κυτταρικών γεγονότων σηματοδότησης που προωθεί τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και εισβολή. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν νέο μηχανισμό για hCAP18 /LL-37 ρύθμιση στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Επιπλέον παρέχουν γνώσεις για κρίσιμους παράγοντες που εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

Οι ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών OV-90 και SKOV3 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection, και άλλες ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών HO-8910, τα κύτταρα 3AO αγοράστηκαν από Shanghai Institute of Cell Biology, κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο Eagles μέσο Dulbeccos (DMEM) (εργαστήρια Hyclone. Inc, South, Utah, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA), 100 U /mL πενικιλλίνη , και 100 U /mL στρεπτομυκίνη (εργαστήρια Hyclone. Inc). Οι κυτταρικές καλλιέργειες διεξήχθησαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο αέρα με 5% CO

2. FCS αντικαταστάθηκε με 10% ανθρώπινο ορό συμπλήρωμα αδρανοποιημένο (ΕΣ) (που λαμβάνεται από την τράπεζα αίματος του Tongji Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Tongji. Θεσμικών έγκριση από τις επιτροπές δεοντολογίας τοπική έρευνα (Εσωτερική κριτική και των τμημάτων Δεοντολογίας του Νοσοκομείου Tongji, Πανεπιστήμιο Tongji ) λήφθηκε πριν από τη διεξαγωγή αυτής της μελέτης) 24 ώρες πριν από το πείραμα. Εξουδετερωτικά αντισώματα αντι-hCAP18 /LL-37 (2 μg /ml, κλώνος # mAb 3D11, HyCult βιοτεχνολογίας, Netherland), anti-TLR2 (10 μg /ml, κλώνος # mAb 383 936, R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA ), αντι-TLR6 (10 μg /ml, κλώνος # mAb C5C8, Invivogen, San Diego, CA, USA) και η ιτρακοναζόλη αναστολέα Cyp27B1 (10

-7 Μ, Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ) ή VDR ανταγωνιστής ZK159222 (10

-7 Μ, ένα δώρο από τη Schering AG, Βερολίνο, Γερμανία) προστέθηκαν όπως δεικνύεται 2 ώρες πριν συγκαλλιέργεια ή άλλων διέγερση. TLR2 /6 συνδέτη Pam2CSK4 ελήφθη από Invivogen. 25D3 (το 25-υδροξυβιταμίνης D3, ο πρόδρομος 1,25D3) αγοράστηκε (Biomol, Plymouth Meeting, ΡΑ, USA) και επαναιωρήθηκαν σε αιθανόλη σε 10

-2 Μ σε κεχριμπάρι σωλήνες και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C σε μικρά κλάσματα.

Δημιουργία ανθρώπινου μακροφάγα προερχόμενα από μονοκύτταρα περιφερικού αίματος

Θεσμικό έγκριση από τις επιτροπές δεοντολογίας τοπική έρευνα (εσωτερική κριτική και των τμημάτων Δεοντολογίας της Tongji Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Tongji) λήφθηκε πριν από την διεξαγωγή της μελέτης. Ανθρώπινα προερχόμενα από μονοκύτταρα περιφερικού αίματος μακροφάγα δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Εν συντομία, ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) από υγιείς δότες αίματος από την τράπεζα αίματος του Tongji Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Tongji απομονώθηκαν από φλεγμονώδεις πλακούντες με Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) φυγοκέντρηση πυκνότητας. PBMC αφέθηκαν να προσκολληθούν σε φιάλες καλλιέργειας για 1 ώρα στους 37 ° C σε DMEM συμπληρωμένο με ανθρώπινο ορό 1%, μετά την οποία τα μη προσκολλημένα κύτταρα απομακρύνθηκαν με έντονη έκπλυση με PBS. Τα προσκολλημένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 20 ml DMEM (10% FCS) συμπληρωμένο με 50 ng /ml αποικίας μακροφάγων παράγοντα διέγερσης (Μ-CSF) (eBioscience, San Diego, CA, USA) για 7 ημέρες για να επιτραπεί η διαφοροποίηση σε μακροφάγα.

συγκαλλιέργεια των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα και μακροφάγα

Για μελέτες συγκαλλιέργεια με τα καρκινικά κύτταρα και τα μακροφάγα, τα καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν στο κάτω μέρος των πλακών και των μακροφάγων πολλαπλών φρεατίων καλλιέργειας κυττάρων τοποθετήθηκαν σε ένθετα φρεατίων (0.4 μm, Corning Incorporated, Coming, ΝΥ, USA) με μια μεμβράνη διαπερατή για υγρά, αλλά όχι για τα κύτταρα. Τα κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ανθρώπινο ορό. Οι transwells εισήχθησαν στο φρεάτιο πλάκας καλλιέργειας πολλαπλών φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για υποδεικνυόμενο χρόνο.

Ο αριθμός των κυττάρων καταμέτρηση

μακροφάγα προερχόμενα από μονοκύτταρα (1 χ 10

4 κύτταρα) και τον καρκίνο κύτταρα (1 χ 10

4 κύτταρα) σπάρθηκαν σε πλάκες trans-φρεατίων ή καλλιέργεια κυττάρων 24 φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 4 ημέρες και στη συνέχεια Transwell ένθετα (περιέχουν μακροφάγα) απομακρύνθηκαν, τα κύτταρα του καρκίνου συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και μετρήθηκαν με ένα αιμοκυτταρόμετρο (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).

BrdU ELISA δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων

πολλαπλασιασμός των ωοθηκών καρκινικών κυττάρων προσδιορίστηκε με χρήση της εμπορικά διαθέσιμης πολλαπλασιασμού κυττάρων ELISA, BrdU (χρωματομετρική) Kit (Roche, Mannheim, Germany). Μετά από 4 ημέρες συγκαλλιέργειας με μακροφάγα, Transwell ένθετα (περιέχουν μακροφάγα) απομακρύνθηκαν, και τα υπερκείμενα των κυττάρων του όγκου αναρροφήθηκαν και προστέθηκαν 400 μΙ /φρεάτιο μέσου ανάπτυξης που περιείχε 10 μΜ BrdU. Τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 2 ώρες στους 37 ° C. μέσον επισήμανση απομακρύνθηκε πατώντας και τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με την προσθήκη 200 μΙ FixDenat. λύση FixDenat αφαιρέθηκε προσεκτικά πατώντας. διαλύματος εργασίας 400 μΐ /φρεάτιο αντι-BrdU-POD προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν για 90 λεπτά σε RT. Το συζυγές αντίσωμα απομακρύνθηκε με τίναγμα off και τα φρεάτια πλύθηκαν 3 φορές με PBS. Μετά από αυτό, 400 μΐ /φρεάτιο ενός διαλύματος υποστρώματος προστέθηκαν και το διάλυμα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 5-30 λεπτά. 200 μΙ 3Ν H

2SO

4 προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν για 1 λεπτό στον αναδευτήρα. Η απορρόφηση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA στα 450 nm.

δοκιμασία Invasion

δοκιμασία Εισβολή εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας BD Biocoat Matrigel εισβολής τμήμα (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ, USA) με ένα 8 μm των πόρων της μεμβράνης μέγεθος PET, ομοιόμορφα επιχρισμένα με BD Matrigel Matrix όπως περιγράφεται [18], [29]. Στερούνται ορού καρκινικών κυττάρων προστέθηκαν στον άνω θάλαμο σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο. 1 × 10

4 μακροφάγα τοποθετήθηκαν μέσα στο κάτω θάλαμο. Θάλαμος γέμισε με DMEM συν 10% του ΕΣ. Στα ενδεικνυόμενα χρονικά, τα προσκολλημένα κύτταρα στο κάτω μέρος της μεμβράνης απομακρύνθηκαν και σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση. Το κυτταρικό σφαιρίδιο επιλύθηκε σε 100 μΙ PBS και περιδινήθηκαν κάτω στις διαφάνειες. Μετά ξήρανση στον αέρα, τα κυτταροσπίν χρωματίστηκαν με 5 μΙ DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Κύτταρα που μετανάστευσαν ανά πεδίο υψηλής ισχύος προσδιορίστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού.

SKOV3 ή μακροφάγων ρυθμισμένο μέσο

Ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε από κύτταρα SKOV3 ή ανθρώπινα μακροφάγα προερχόμενα από μονοκύτταρα περιφερικού αίματος επωάστηκαν σε DMEM ελεύθερο ορού για 24 ώρες, και διηθείται μέσω ενός φίλτρου 0,2 μm. SKOV3 ρυθμισμένο μέσο (SKOV3-CM) δείγματα προστέθηκαν σε ανθρώπινα πρωτογενή μακροφάγα για 24 ώρες, μετά την οποία προσδιορίστηκαν έκφραση διαφόρων γονιδίων. Μακροφάγων ρυθμισμένο μέσο (Μ-CM) προστέθηκαν σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών για 24 ώρες και τα υπερκείμενα των κυττάρων μετρήθηκαν με ELISA για βερσικάνη V1.

Κυττάρων μεταγωγή

Μητρώο κύτταρα SKOV3 ανάπτυξης ήταν πλένονται 1 φορά με PBS και επαναιωρηματοποιήθηκαν σε 2 × 10

7 κύτταρα /ml σε 1 ml Gene Pulser αντιδραστηρίου ρυθμιστικού ηλεκτροδιάτρησης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), αναμιγνύεται με 20 μα βερσικάνη πλασμιδίων V1 RNAi ή ψευδο RNAi πλασμίδια (αμφότερα από ΟηΟεηε Technologies, Inc. Rockville, MD, USA). Ηλεκτροδιατρήσεις εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Gene-Pulser (Bio-Rad) στα 280 V και 960 μΡ σε κυψελίδας 0,4 cm (Bio-Rad). Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας που περιέχουν πλήρες μέσο ϋΜΕΜ with10% FCS σε 25 cm

2 και επωάζονται στους 37 ° C σε 5% CO

2. 48 ώρες αργότερα, το μέσο ανάπτυξης μεταβλήθηκε και πουρομυκίνη (Invitrogen) προστέθηκε σε μία συγκέντρωση 5 μg /ml. Το μέσο καλλιέργειας αλλαζόταν κάθε 4 ημέρες χρησιμοποιώντας φρέσκο ​​μέσο ανάπτυξης (που περιείχε 5 μg /ml πουρομυκίνη). Μετά από 4 εβδομάδες, θετικός πολυκλωνικό πληθυσμούς (πισίνες) ταυτοποιήθηκαν με βάση την ανάλυση στυπώματος Western για έκφραση βερσικάνη V1. Μεμονωμένα θετικοί κλώνοι τελικά απομονώθηκαν με περιοριστική ανάλυση αραίωσης σε πλάκες 96 φρεατίων.

Ανάλυση κηλίδας Western κηλίδωση Western

διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Εν συντομία, 30 μg συνολική πρωτεΐνη εκχυλίσματα φορτώθηκαν σε 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές, υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση, και κηλιδώθηκε επί Hybond-C έξτρα μεμβράνες (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο). Τα υπερκείμενα των κυττάρων πρώτα συμπυκνώθηκαν στο 1/10 του αρχικού όγκου τους με φυγοκέντρηση σε κενό και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε πήγματα βαθμίδωσης NU /PAGE 4-12% (Invitrogen). Τα πρωτογενή αντισώματα περιελάμβαναν: αντι-βερσικάνη V1 (1:1000? Abcam, Cambridge, UK) και αντι-hCAP18 /LL-37 (1:500? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), αντι-ποντικιού β-ακτίνης (1:10000? Sigma Aldrich, Steinheim, Γερμανία). HRP-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (1:5000? Santa Cruz Biotechnology) ή αντι-ποντικού κουνελιού (1:1000? Dako, Glostrup, Denmark) χρησιμοποιήθηκαν ως δευτερεύον αντίσωμα

απομόνωση RNA και σε πραγματικό χρόνο. PCR

κυττάρων συνολικό RNA που παρασκευάστηκαν με RNeasy συν μίνι κιτ (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Οι σε πραγματικό χρόνο μίγματα αντίδρασης PCR έχουν περιγραφεί προηγουμένως [28]. Εν συντομία, το cDNA συνετέθη με αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης πρώτου κλώνου οϋΝΑ (Invitrogen). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του SYBR Green QPCR Mix (Bio-Rad) σε πραγματικό χρόνο μηχανή σύστημα PCR ΑΒ 7300 (ΑΒ Applied Biosystems, Σιγκαπούρη). Οι ακόλουθες PCR εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: β-ακτίνη, 5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 ‘και 5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′? hCAP18 /LL-37, 5’-TGGGCCTGGTGATGCCT-3 ‘και 5′-CGATGTTCCTTCGACAGGAAGC-3′? VDR, 5’-AAGGACAACCGACGC CACT-3 ‘και 5′-ACACACCTGTAGCCGTACTA-3′? Cyp27B1, 5’-ACCCGACAC GGAGACCTTC-3 ‘και 5′-CACAGGTGCGACAACTGGTA-3′? Cpy24, 5’-CGCAG CGGCTGGAGAT-3 ‘και 5′-ATGGCGTTTCTTCCGATGCC-3′? TLR1, 5’-AACCC ATTCCGCAGTACTCCA-3 ‘και 5′-AAGGCCACGTTTGCTCTTTTC-3′? TLR2, 5’-CAATGATGCTGCCATTCTCAT-3 ‘και 5′-ATTATCTTCCGCAGCTTGC Α-3′? TLR3, 5’-ACAACTTTAGCACGGCTCTGGA-3 ‘και 5′-ACCTCAACTGGGATC TCGTCA-3′? TLR4, 5’-AGTTTCCTGCAATGGATCAAGG-3 ‘και 5′-CTGCTT ATCTGAAGGTGTTGCAC-3’? TLR6, CCCATTCCACAGAACAGCAT-3 ‘και 5′-Α TAAGTCCGCTGCGTCATGA-3′? CD14, 5’-TGTGAGCTGGACGATGAAGAT-3 ‘και 5′-CAGACACACACTGGAAGGCTT-3’. Ιδιαιτερότητα της RT-PCR ελέγχθηκε με τους ελέγχους «no αντίστροφη μεταγραφή και ανάλυση καμπύλης τήξης. Ποσοτικά αποτελέσματα PCR ελήφθησαν χρησιμοποιώντας την μέθοδο ΔΔCT (κατώφλι κύκλου). Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη επίπεδα σε κάθε δείγμα.

δοκιμασία ELISA για βερσικάνη

Δείγματα των υπερκειμένων κυτταρικής καλλιέργειας αναλύθηκαν με ανθρώπινο βερσικάνη ELISA (USCN επιστήμης της ζωής, INC. Houston, ΤΧ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το όριο ανίχνευσης της δοκιμασίας ήταν 0.107 ng /

Στατιστική ανάλυση

Οι τιμές εμφανίζονται ως μέση τιμή συν ή μείον SEM mL.. Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με τη δοκιμασία t (διπλής όψης). Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές για τις τιμές P λιγότερο από 0.05.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της hCAP18 /LL-37 στα μακροφάγα την προώθηση της διάδοσης και της εισβολής των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

ΤΑΜ αντικαταστάθηκε με μακροφάγα που προέρχονται από μονοκύτταρα περιφερικού αίματος για

in vitro

πείραμα συγκαλλιέργειας είχαν αναφερθεί από διάφορες ομάδες. Οι εκθέσεις αυτές δείχνουν ότι μακροφάγα προερχόμενα από μονοκύτταρα περιφερικού αίματος έχουν ισοδύναμη λειτουργία με ΤΑΜ [27], [31]. Για να προσδιοριστεί η επίδραση των μακροφάγων επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, Transwell ένθετα χρησιμοποιήθηκαν ως μοντέλο συν-καλλιέργειας. Ανθρώπινα προερχόμενα από μονοκύτταρα περιφερικού αίματος μακροφάγα τοποθετήθηκαν σε ένθετα transwell και διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών σπάρθηκαν στον πυθμένα των πλακών 24 φρεατίων. κύτταρα συν-καλλιέργεια αναπτύχθηκαν για 4 ημέρες συν-καλλιέργειας σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% HS ή θεραπεία με EGF, ως θετικός έλεγχος. Η ανάπτυξη του ΗΟ-8910, OV-90, τα κύτταρα SKOV3, και 3AO αυξήθηκαν σημαντικά όταν συν-καλλιεργήθηκαν με τα ανθρώπινα μακροφάγα που προέρχονται από μονοκύτταρα περιφερικού αίματος (Σχ. 1Α). Για την πρόληψη hCAP18 /LL-37 κύτταρα μονοκυττάρων λειτουργία προκατεργάστηκαν με ένα αντίσωμα εξουδετέρωσης hCAP18 /LL-37, πριν συν-καλλιέργεια με τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Στην συν-καλλιέργειας πειράματα όπου τα μονοκύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με το αντίσωμα εξουδετέρωσης hCAP18 /LL-37 μία σημαντική αναστολή της HO-8910, OV-90, παρατηρήθηκε SKOV3 και 3AO ανάπτυξη των κυττάρων (Σχ. 1Α). Δεν παρατηρήθηκε αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης παρατηρήθηκε στα πειράματα αντίσωμα συν-καλλιέργεια IgG1 ελέγχου (Εικ. 1Α). Για να εκτιμηθεί μακροφάγων που προκαλείται από την ανάπτυξη των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα της ενσωμάτωσης BrdU σε πρόσφατα συντεθειμένο έλικες του DNA μετρήθηκε με τη χρήση αντισωμάτων αντι-BrdU σε μία δοκιμασία ELISA. Συνεπής η παρατηρούμενη αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, της σύνθεσης του DNA σε HO-8910, OV-90, τα κύτταρα SKOV3, και 3AO ήταν αξιοσημείωτα αυξημένο όταν τα κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα (Εικ. 1Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, η προσθήκη του αντισώματος εξουδετέρωσης hCAP18 /LL-37 μειωμένο αποτέλεσμα της μακροφάγων επί καρκινικών κυττάρων πολλαπλασιασμού των ωοθηκών (σχ. 1Β). Στη συνέχεια, ωοθηκών καρκινικά κύτταρα εισβολή διερευνήθηκε. ικανότητα αυτών των κυττάρων να εισβάλλουν Matrigel επικαλυμμένα ενθέματα ενισχύθηκε επίσης σημαντικά από τα μακροφάγα (Σχ. 1C, D). Μετά μέσων συν-καλλιέργεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το αντίσωμα εξουδετέρωσης HCAP /LL-37, αυτό των καρκινικών κυττάρων εισβολή εξασθενημένα σημαντικά (Σχ. 1C, D). Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν έναν άμεσο ρόλο για HCAP /LL-37 για την προώθηση των καρκινικών κυττάρων εισβολή. Ένα αντίσωμα ελέγχου IgG δεν παρεμβαίνει με καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών εισβολή (Σχ. 1C, D). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι hCAP18 /LL-37 απαιτείται για μακροφάγα επαγόμενο πολλαπλασιασμό και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Για πειράματα συν-καλλιέργειας των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με μακροφάγα, τα ανθρώπινα περιφερικού αίματος προερχόμενα από μονοκύτταρα μακροφάγα (1 × 10

4 κύτταρα) τοποθετήθηκαν σε ένθετα transwell και τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (1 × 10

4 κύτταρα) σπάρθηκαν στον πυθμένα των πλακών 24 φρεατίων. Τα κύτταρα προεπωάστηκαν με 2 μg /ml αντι-hCAP18 /LL-37 ή ένα στοιχείο ελέγχου IgG1 ισοτύπου Ab (2 μg /ml) για 2 ώρες. Τα κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν σε DMEM (10% HS) για 4 ημέρες. 100 ng /ml EGF (Sigma, Steinheim, Germany) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. (Α) Ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών μετρήθηκε με καταμέτρηση του αριθμού των κυττάρων. πολλαπλασιασμό (Β) των κυττάρων μετρήθηκε με ELISA (επισήμανση BrdU) ανάλυση. δοκιμασίας (C) Invasion. δοκιμασίες εισβολή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα BD Biocoat Matrigel εισβολής τμήμα με μία μεμβράνη μεγέθους πόρων ΡΕΤ 8 μm, ομοιόμορφα επικαλυμμένα με Matrigel BD Matrix. Τα αποτελέσματα είναι μέσα ± SEM, σημαντική διαφορά, η = 3, * ρ & lt? 0.05. δοκιμασία εισβολής (D) Matrigel των SKOV3. ΫΑΡΙ βαφή μετανάστευσαν καρκινικών κυττάρων. Αντιπροσωπευτικά τμήματα εμφανίζονται (α) SKOV3 καμία θεραπεία. (Β) SKOV3 + μακροφάγα. (Γ) SKOV3 + μακροφάγα + εξουδετερωτικών αντι-hCAP18 /LL-37 (2 μg /ml). (Δ) SKOV3 + μακροφάγα + έλεγχο IgG1 ισότυπου Ab (2 μg /ml). (Ε) SKOV3 + EGF (100 ng /ml).

Η

Τα καρκινικά κύτταρα ενεργοποιούν ενεργοποίηση της βιταμίνης D3 και TLR2 σηματοδότησης και μέχρι ρύθμιση του hCAP18 /LL-37 στα μακροφάγα

Για διερευνηθεί η μορφή έκφρασης του hCAP18 /LL-37, ανθρώπινα μακροφάγα ήταν συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα SKOV3. Η επαγωγή hCAP18 /LL-37 mRNA (σχ. 2Α) και πρωτεΐνης (πλήρους μήκους hCAP18 /LL-37 και διασπάται LL-37, Σχ. 2Β) τα επίπεδα αυξάνονται σε μακροφάγα. Αντιθέτως, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα hCAP18 /LL 37-mRNA ή προ-πεπτιδίου επίπεδα που παρατηρήθηκαν σε κύτταρα SKOV3 (Σχ. 2Α, Β). Όχι, ώριμο LL-37 δεν ανιχνεύθηκε σε κύτταρα SKOV3 (Εικ. 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα μακροφάγα και δεν SKOV3 κύτταρα συμβάλλουν στην απελευθέρωση του LL-37 πεπτιδίου. Για να αξιολογηθεί το επίπεδο hCAP18 /LL-37 και διασπάται LL-37 στο μέσο κύτταρο, πραγματοποιήσαμε western αποτύπωση σε υπερκείμενα των κυττάρων μετά από 24 ώρες συν-καλλιέργειας. Μία σημαντική αύξηση στα επίπεδα του προδρόμου και διασπασμένο πεπτίδιο παρατηρήθηκαν σε σύγκριση με μακροφάγα ή κύτταρα SKOV3 (Σχ. 2C).

Ανθρώπινα μακροφάγα που προέρχονται από μονοκύτταρα περιφερικού αίματος και τα κύτταρα SKOV3 συν-επωάστηκαν όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1 . Σύνολο RNA και πρωτεΐνες των κυττάρων και των μακροφάγων SKOV3 απομονώθηκαν 24 ώρες μετά την συν-καλλιέργεια. (Α) Η έκφραση του hCAP18 /LL-37 mRNA μετρήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου. (Β) Η έκφραση της hCAP18 /LL-37 πρωτεΐνη αναλύθηκε με western blot. β-ακτίνης χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) κηλίδα Western των κυτταρικών υπερκειμένων από κύτταρα SKOV3, μακροφάγα, και συν-καλλιέργειας σε 24 ώρες. (D, E) Επαγωγή της VDR, CYP24, Cyp27B1, TLRs και CD14 mRNA μετρήθηκε στα μακροφάγα με πραγματικού χρόνου PCR. Τα αποτελέσματα είναι μέσες φορές αλλαγή ± SEM, σημαντική διαφορά, η = 3, * ρ & lt? 0,05? ns, δεν είναι σημαντική.

Η

Λόγω του VDR έχει αναφερθεί ότι προκαλεί την έκφραση της hCAP18 /LL-37 [23], [24] Διερευνούμε αν σχετίζονται με την έκφραση του VDR και γονίδια που επάγονται κατά τη διάρκεια της συν-καλλιέργεια. Πράγματι, η αύξηση των επιπέδων mRNA VDR παρατηρήθηκε όταν μακροφάγα συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα SKOV3 (Σχ. 2D). Επιπλέον, το 1,25 D3 καταβολική ένζυμο CYP24 (επίσης γνωστή ως Cyp24A1) προκλήθηκε σε μακροφάγα όταν ήταν συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα όγκου. Cyp27B1, το οποίο καταλύει την μετατροπή του ανενεργού προβιταμίνη D3 ορμόνη (25D3) στη βιοδραστική μορφή (1,25D3) [24], τα επίπεδα mRNA ήταν επίσης πάνω ρυθμισμένα στο μοντέλο συν-καλλιέργειας (Σχ. 2D). Έχει αναφερθεί ότι η ενεργοποίηση TLR2 οδηγεί σε βιταμίνη D-εξαρτώμενη επαγωγή hCAP18 /LL-37 στα μακροφάγα [32]. TLR2, 6 και CD14 mRNA επίπεδα όλες έδειξαν την αναμενόμενη αύξηση σε συν-καλλιεργημένα μακροφάγα. Τα επίπεδα έκφρασης του TLR1, TLR3, και TLR4 δεν είχαν αλλάξει σε αυτά τα μακροφάγα κύτταρα (Σχ. 2Ε).

ωοθηκών μεσολάβηση κυττάρων πρόκληση καρκίνου του hCAP18 /LL-37, VDR, CYP24, και Cyp27B1 σε μακροφάγα εξαρτάται από TLR2 και TLR6

Είμαστε δίπλα φρόντισε να διαπιστώσει αν η επαγωγή της hCAP18 /LL-37 εξαρτιόταν από την επαγωγή TLR2. Ανθρώπινα μακροφάγα που προέρχονται από μονοκύτταρα περιφερικού αίματος επωάστηκαν για 2 ώρες με αντίσωμα TLR2-εξουδετέρωσης ή ένα αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου IgG1, στη συνέχεια διεγέρθηκαν για 24 ώρες σε SKOV3 κυττάρων ρυθμισμένα μέσα (SKOV3-CM) με 10% HS. Σε μακροφάγων κύτταρα κατεργασμένα με το αντίσωμα εξουδετέρωσης TLR2 παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στην hCAP18 /LL-37 επαγωγή, καμία σημαντική επίδραση στην επαγωγή του γονιδίου παρατηρήθηκε στα δείγματα που κατεργάζονται αντίσωμα ελέγχου (Σχ. 3Α). Για να καθοριστεί εάν η επαγωγή του VDR, CYP24, και Cyp27B1 επηρεάστηκε επίσης από την έκθεση στο αντίσωμα εξουδετέρωσης TLR2, μετρήθηκαν τα επίπεδα mRNA. Τα δείγματα εκτίθενται σε αντίσωμα sameTLR2 δεν έδειξαν επαγωγή VDR, CYP24, ή Cyp27B1, και πάλι χωρίς αναστολέα επηρεάζει παρατηρήθηκαν στα δείγματα ελέγχου IgG αντίσωμα (Σχ. 3Β-D). Αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα TLR6 αντίσωμα εξουδετέρωσης, παρατηρήθηκε το ίδιο μοτίβο της αναστολής, με επαγωγή hCAP18 /LL-37, VDR, CYP24, και Cyp27B1 μπλοκάρεται στα δείγματα TLR6 αντισωμάτων, αλλά όχι την ομάδα ελέγχου (Σχ. 3Α -ΡΕ). Συνδυάζοντας TLR2 και TLR6 αντισώματα εξουδετέρωσης προσφέρεται η δυνατότητα μια συνεργιστική επίδραση απενεργοποίησης αυτών των γονιδίων (Εικ. 3Α-D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν επαγωγή όγκων με τη μεσολάβηση της hCAP18 /LL-37 απαιτεί TLR2 /6 δραστηριότητα στα μακροφάγα. Αυτός ο μηχανισμός επαγωγής πιστεύεται ότι εμπλέκεται στη σηματοδότηση της βιταμίνης D3. Σε περαιτέρω υποστήριξη του μοντέλου μας, η προσθήκη αντισωμάτων εξουδετέρωσης έναντι TLR2 ή TLR6 κατέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και SKOV3 διεισδυτικότητα (Σχ. 4Α, Β). Συνδυάζοντας TLR2 και TLR6 αντισώματα εξουδετέρωσης οδήγησε σε συνεργική δράση αναστολής επί της προόδου του κυτταρικού SKOV3 (Σχ. 4Α, Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν την ενεργοποίηση του TLR2 ή TLR6 απαιτείται για την πρόοδο του κυτταρικού όγκου.

Ανθρώπινα μακροφάγα προεπωάστηκαν με 10 μg /ml anti-TLR2, 10 μg /ml αντι-TLR6 ή ένα αντίσωμα IgG 1 ισότυπου ελέγχου (10 μg /ml) για 2 ώρες. Στη συνέχεια, τα μακροφάγα ήταν καλλιέργεια με ϋΜΕΜ (10% HS) ή SKOV3-CM (10% HS) για 24 ώρες, και τα συνολικά RNAs εξήχθησαν για PCR δοκιμασία πραγματικού χρόνου. (Α) hCAP18 /LL-37 mRNA. (Β) mRNA VDR. (Γ) mRNA CYP24. (D) mRNA Cyp27B1. Η μέση μεταβολή φορές ± SEM, η = 3, * ρ & lt?. 0.05

Η

Ανθρώπινα μακροφάγα που προέρχονται από μονοκύτταρα περιφερικού αίματος και τα κύτταρα SKOV3 προεπωάστηκαν με 10 μg /ml anti-TLR2, 10 μg /ml αντι -TLR6 ή ένας έλεγχος IgG1 ισοτύπου Ab (10 μg /ml) για 2 ώρες. Τα κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν σε DMEM (10% HS) για 4 ημέρες. 100 ng /ml EGF χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Μετρήθηκαν (Α) Ο αριθμός των κυττάρων, πολλαπλασιασμό και εισβολή των κυττάρων SKOV3. Η μέση μεταβολή φορές ± SEM, η = 3, * ρ & lt? 0.05. δοκιμασία εισβολής (Β) Matrigel των SKOV3. ΫΑΡΙ βαφή μετανάστευσαν καρκινικών κυττάρων. Αντιπροσωπευτικά τμήματα που παρουσιάζονται όπως υποδεικνύεται. (Α) SKOV3 καμία αγωγή. (Β) SKOV3 + μακροφάγα. (Γ) SKOV3 + μακροφάγα + εξουδετερωτικών αντι-TLR2. (Δ) SKOV3 + μακροφάγα + εξουδετερωτικών αντι-TLR6. (Ε) SKOV3 + μακροφάγα + εξουδετερωτικών αντι-TLR2 και αντι-TLR6. (Στ) SKOV3 + μακροφάγα + IgG1 ισότυπο ελέγχου Ab. (Ζ) SKOV3 + EGF (100 ng /ml).

Η

TLR2 /6 μεσολάβηση έκφραση της hCAP18 /LL-37 μέσω Cyp27B1 και VDR

ενεργοποίηση

Η Cyp27B1 εξαρτάται βιομετατροπή του 25D3 με 1,25D3 αποτελεί βασικό χαρακτηριστικό της D-μεσολάβηση hCAP18 /LL-37 έκφρασης βιταμίνη [33]. Για να καθοριστεί εάν η προκαλούμενη από όγκο ενεργοποίηση του TLR2 /6 ενισχυμένη βιοδραστικότητα Cyp27B1, οδηγώντας έτσι σε hCAP18 /LL-37 έκφραση, μακροφάγα εκτέθηκαν στην TLR2-TLR6 συνδέτη Pam2CSK4, παρουσία και απουσία μέσων 25D3 (DMEM χωρίς ορό ). Έκφραση hCAP18 /LL-37 δεν επηρεάστηκε όταν εκτίθεται σε 25D3 ή Pam2CSK4 ανεξάρτητες μεταξύ τους. Ωστόσο, hCAP18 /LL-37expression προκλήθηκε μετά την ταυτόχρονη έκθεση (Εικ. 5Α). Επιπλέον, η αναστολή της Cyp27B1 από την ιτρακοναζόλη μπλοκάρει TLR2 /6 ενεργοποίησης και μια επακόλουθη αύξηση των επιπέδων inhCAP18 /LL-37 mRNA (εικ. 5Α). Η προσθήκη του VDR ανταγωνιστή ZK159222 επίσης ανέστειλε την επαγωγή του hCAP18 LL-37 έκφρασης /όπως προσδιορίζεται με τα επίπεδα του mRNA (εικ. 5Α). Στη συνέχεια, θα συν-καλλιεργημένα πρωτογενή μακροφάγα και SKOV3-CM (χωρίς ορό) υπό την παρουσία μιας σειράς συγκέντρωσης 25D3, και τα επίπεδα του hCAP18 /LL-37 mRNA μετρήθηκαν με qPCR. Σε ένα άλλο πείραμα μακροφάγων /SKOV3-CM συν-καλλιέργεια, η προσθήκη του 25D3 αύξησε σημαντικά τα επίπεδα hCAP18 /LL-37 mRNA με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Σχ. 5Β). Είναι αξιοσημείωτο ότι SKOV3-CM χωρίς HS δεν επάγουν την έκφραση του hCAP18 /LL-37 (Σχ. 5Β), λόγω της ανεπαρκούς βιταμίνης D σε μέσο καλλιέργειας [24], [33]. Αυτά τα αποτελέσματα συνεπώς προτείνουν ότι προκαλούμενη από όγκο ενεργοποίηση του TLR2 /6 σε ανθρώπινα μακροφάγα ενεργοποιεί hCAP18 /LL-37 έκφρασης. Επιπλέον τα δεδομένα υποστηρίζει αυτό επάνω ρύθμιση εξαρτάται από το Cyp27B1 και VDR μεσολάβηση ενδογενούς παραγωγής της 1,25D3.

(Α) Ανθρώπινη μακροφάγα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με τον ανταγωνιστή VDR ZK159222 (10

-7 Μ) ή η ιτρακοναζόλη ανταγωνιστής Cyp27B1 (10

-7 Μ) για 2 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με TLR2 /6 συνδέτη Pam2CSK4 (100 ng /ml) παρουσία ή απουσία του 25D3 (10

-6 Μ) (DMEM χωρίς ορός) για 24 ώρες. Έκφραση hCAP18 /LL-37 mRNA προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο σχήμα 3. (Β) Κανονισμός του hCAP18 /LL-37 γονίδιο στο διέγερση με 25D3 σε ϋΜΕΜ (χωρίς ορό) ή SKOV3-CM (χωρίς ορό). Η μέση φορές αλλαγή ± SEM, n = 3, * ρ & lt?. 0.05

Η

Tumor-εκκρίνεται βερσικάνη V1 ενεργοποιεί TLR2 και TLR6 να προκαλέσει hCAP18 LL-37 έκφρασης /στα μακροφάγα

Όπως αναφέρεται παραπάνω, συν-καλλιέργεια των μακροφάγων /κυττάρων SKOV3 ενεργοποιημένα TLR2 /6 και επομένως αυξημένη hCAP18 /LL-37 έκφραση σε μακροφάγα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν απροσδιόριστο διαλυτούς παράγοντες που παράγονται από τα κύτταρα SKOV3 διαμεσολαβούν αυτή τη διαδικασία. Kim et al. απέδειξε ότι βερσικάνη V1, ένα μακροφάγο ενεργοποιητής που δρα μέσω TLR2 και συνδέκτες του TLR6 και CD14, είναι επάνω ρυθμίζεται σε πολλούς ανθρώπινους όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών και τον καρκίνο του πνεύμονα, και βελτιώνει όγκου του πνεύμονα μεταστατική ανάπτυξη [25]. Για να καθοριστεί εάν βερσικάνη V1 θα μπορούσε να είναι ο διαλυτός παράγοντας που ευθύνεται για την /6 ενεργοποίηση TLR2 παρατηρηθεί εδώ εξετάσαμε βερσικάνη επίπεδα έκφρασης V1 σε κύτταρα όγκου συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα. Σχήμα 6Α έδειξαν έκφραση βερσικάνη πρωτεΐνη V1 αυξήθηκε σε συνολικά κυτταρολύματα των SKOV3, HO-8910, OV-90, και τα κύτταρα 3AO όταν συν-καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Για να διερευνηθεί το επίπεδο των βερσικάνη έκκριση V1 από τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών SKOV3 επωάσαμε, HO-8910, OV-90, και τα κύτταρα 3AO με ρυθμισμένο μέσο από τα μακροφάγα (Μ-CM) για 24 ώρες. δοκιμασίες ELISA διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η παρουσία εκκρινόμενης βερσικάνη V1 σε μέσο κύτταρο.