Αφηρημένο

Ιστορικό

λυσοσώματα που σχετίζονται 4β διαμεμβρανική πρωτεΐνη -35 (LAPTM4B-35), ένα μέλος της 4-tetratransmembrane εκτείνονται υπεροικογένεια πρωτεϊνών θηλαστικών, έχει αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται σε διάφορους καρκίνους. Ωστόσο, η έκφραση του LAPTM4B-35 και το ρόλο του στην εξέλιξη του γαστρικού καρκίνου (GC) παραμένει άγνωστη. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει LAPTM4B-35 έκφρασης σε GC, το δυναμικό της σημασίας του για κλινικοπαθολογική παραμέτρους και το ρόλο της LAPTM4B-35 κατά τη διάρκεια της γαστρικής καρκινογένεσης.

Μέθοδοι

Στην παρούσα μελέτη, παραφίνη -embedded δείγματα με GC (n = 240, συμπεριλαμβανομένων των 180 ζεύγη δειγμάτων) και 24 ζεύγη φρέσκων κατεψυγμένων ιστών αναλύθηκαν. qRT-PCR και ανοσοϊστοχημεία (IHC) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της έκφρασης του LAPTM4B-35 σε GC. Τα αποτελέσματα της LAPTM4B-35 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC, τη μετανάστευση και την εισβολή προσδιορίστηκαν από υπερέκφραση και νοκ ντάουν δοκιμασίες.

Αποτελέσματα

IHC έδειξε ότι LAPTM4B-35 εκφράστηκε σε 68,3% (123/180 ) των ιστών GC, ενώ στο 16,1% (29/180) των ζεύγη γειτονικών noncancerous γαστρικό ιστούς τους (

P

= 0.000).

LAPTM4B-35

επίπεδα mRNA σε ιστούς GC ήταν επίσης σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση με τα ζεύγη γειτονικών noncancerous ιστούς τους (

P

= 0,017). Η υπερέκφραση του LAPTM4B-35 ήταν σημαντικά σχετίζεται με τον βαθμό διαφοροποίησης, το βάθος της εισβολής, lymphovascular εισβολή και λεμφαδένα μετάσταση (

P

& lt? 0,05). καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με LAPTM4B-35 έκφραση είχαν μια σημαντική μείωση στη συνολική επιβίωση (OS) σε στάδια ασθενείς GC I-III (

P

= 0,006). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε υψηλή έκφραση του LAPTM4B-35 ήταν ένα ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για το OS σε ασθενείς GC Ι-ΙΙΙ (

P

= 0,025) στάδιο.

Συμπέρασμα

Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι LAPTM4B-35 υπερέκφραση μπορεί να σχετίζονται με την εξέλιξη της GC και φτωχή πρόγνωση και, συνεπώς, μπορεί να χρησιμεύσει ως νέος δείκτης πρόβλεψη της πρόγνωσης σε ασθενείς GC

Παράθεση:. Cheng Χ, Zheng Ζ, Bu Z, X Wu , Zhang L, Xing Χ, et al. (2015) LAPTM4B-35, Καρκίνος-σχετικό γονίδιο, σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε TNM Στάδια Ι-ΙΙΙ γαστρική Καρκινοπαθών. PLoS ONE 10 (4): e0121559. doi: 10.1371 /journal.pone.0121559

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Ken-ichi Mukaisho, Shiga Πανεπιστήμιο της Ιατρικής επιστήμης, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 10 Απρ, 2014? Αποδεκτές: 12η, Φεβρουαρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 7 του Απρίλη, 2015

Copyright: © 2015 Cheng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ 30471677 και 81141024) και Εθνικό Key τεχνολογίας Ε & amp? Α Προγράμματος (Πεκίνο Δημοτική Επιστήμης και Τεχνολογίας. έργο Z121100007512010). Οι χρηματοδότες συνέβαλαν στο σχεδιασμό της μελέτης, τις επιδόσεις, τα αντιδραστήρια, υλικά, ανάλυση των δεδομένων και την απόφαση να δημοσιεύσει

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικός καρκίνος είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στην Κίνα και η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με την Κίνα [1]. Η πλειοψηφία των ασθενών GC βρίσκονται ήδη σε προχωρημένο στάδιο κατά το χρόνο της διάγνωσης (σταδίου III και IV), καθιστώντας την πρόγνωση να είναι μελαγχολική, παρά τη βελτίωση της χειρουργικής και επικουρική θεραπευτική προσέγγιση [2-5]. Ανεξάρτητα από τη χημειοθεραπεία και προορίζονται θεραπευτική χειρουργική επέμβαση, σχεδόν το 60% των ασθενών με GC αναπτύσσουν υποτροπή και τελικά πεθαίνουν από μεταστατική νόσο [6]. GC εξέλιξη είναι μια πολυπαραγοντική και πολυσταδιακή διαδικασία κατά την οποία κληρονόμησε και περιβαλλοντικοί παράγοντες παίζουν ζωτικό ρόλο [7]. Προηγούμενες παρατηρήσεις δείχνουν ότι η κλασική βιοδείκτες και συστημάτων στάσης, με βάση την κλινική και παθολογικών ευρημάτων, μπορεί να έχουν τα όριά τους σε κλινικές εφαρμογές και ωθούν στην ανάπτυξη νέων μοριακών βιοδεικτών που μπορεί να προβλέψει το αποτέλεσμα και τη θεραπεία των ασθενών [8, 9].

λυσόσωμα πρωτεΐνη που συνδέεται διαμεμβρανική 4 βήτα (LAPTM4B) έχει αρχικά κλωνοποιήθηκε σε ηπατοκυτταρικά καρκινώματα (HCCs) με Shao et al, το οποίο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 8q22, μια περιοχή συχνά ενισχύεται σε καρκίνο του μαστού και HCC [10, 11]. Κωδικοποιεί δύο πρωτεΐνες με διαφορετικό μοριακό βάρος, 24 kDa και 35 kDa πρωτεΐνες-(LAPTM4B-24 και -35) με τους τέσσερις υποθετικές διαμεμβρανικές περιοχές [12]. Ο εντοπισμός του LAPTM4B-35 βρέθηκε όχι μόνο στον λυσόσωμα, αλλά και στην πλασματική μεμβράνη και την εσωτερική οργανίδια όπως συσκευή Golgi και ενδοσώματα [13]. Έχει αναφερθεί ότι LAPTM4B-35 εκφράζεται ευρέως σε διάφορους τύπους καρκινώματος. Προηγούμενες αναφορές έδειξαν ότι η υπερέκφραση του LAPTM4B-35 συνδέεται με δυσμενείς βιολογικές συμπεριφορές και κακή πρόγνωση σε πολλούς καρκίνους, όπως ο καρκίνος του μαστού [14], το HCC [15-17], καρκίνωμα της χοληδόχου κύστης [18, 19], ορθοκολικό καρκίνο [20] , επιθηλιακό καρκίνωμα ωοθήκης [21] και του ενδομητρίου καρκινώματος [22]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι αλληλική παραλλαγή του LAPTM4B συνδέθηκε με γενετική ευαισθησία του GC [23]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του LAPTM4B-35 με επιμόλυνση LAPTM4B cDNA προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, εισβολή σε HCC ξενομοσχεύματα σε γυμνούς ποντικούς και επάγει αντίσταση σε πολλά φάρμακα [24]. Νοκ ντάουν της LAPTM4B από την RNA παρεμβολής αντιστραφεί αντιθέτως όλα αυτά τα κακοήθη φαινοτυπικά χαρακτηριστικά στο HCC [24, 25].

Ωστόσο, LAPTM4B-35 έκφρασης, συνάφειά του με τους κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά, και βιολογικός ρόλος του LAPTM4B-35 GC παραμένουν ασαφείς. Στην παρούσα μελέτη, με στόχο να εντοπίσει LAPMT4B-35 έκφρασης σε GC και πιθανή σχέση της με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, και προγνωστική σημασία της. Επιπλέον, in vitro λειτουργικές δοκιμασίες διεξήχθησαν για τον χαρακτηρισμό των βιολογικών αποτελεσμάτων του LAPTMEB-35 σε γαστρικό ογκογονικότητας.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική

Όλοι οι ασθενείς είχαν υπογράψει συγκατάθεση για τη λήψη δειγμάτων ιστού, και το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Κλινική Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας του Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο.

δείγματα ανθρώπινου γαστρικού ιστού

Ένα σύνολο 240 (167 άνδρες και 73 γυναίκες, ηλικίας 22-87 ετών, και η διάμεση ηλικία ήταν 60 έτη) φορμόλη σταθερά ενσωματωμένα σε παραφίνη ιστούς GC, συμπεριλαμβανομένων 180 ζεύγη καρκινικών και συμφωνημένα δίπλα noncancerous γαστρικού βλεννογόνου ιστούς, συλλέχθηκαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε GC γαστρεκτομή στο Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο τον Ιανουάριο του 2003 έως τον Δεκέμβριο 2011. Η κλινική και ιστολογική πληροφορίες για κάθε υπόθεση και εισπράττεται σύμφωνα με εγκεκριμένες κατευθυντήριες οδηγίες των ιδρυμάτων. Τα κριτήρια UICC-TNM 1997 χρησιμοποιήθηκαν για την ταξινόμηση των γαστρικών καρκίνων. Η διάμεση διάρκεια παρακολούθησης από τη στιγμή της διάγνωσης ήταν 26,2 μήνες (εύρος, 2,4 έως 119,0 μήνες). Συνολικά, 112 (46,7%) ασθενείς έχασαν τη ζωή τους κατά την περίοδο παρακολούθησης.

Η ανοσοϊστοχημεία

τομές παραφίνης (4 μm) αποκηρώθηκαν και ενυδατώνεται σε ξύλημα και αιθανόλη. Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16] χρησιμοποιώντας αντι-LAPTM4B-35 αντίσωμα (1: 200) (προικισμένος με Pro RL Zhou.). Ως αρνητικοί έλεγχοι, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως το ίδιο πρωτόκολλο εκτός του ότι επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C εντός διαλύματος αποκλεισμού χωρίς το πρωτεύον αντίσωμα.

Η έκφραση του LAPTM4B-35 εκτιμήθηκε από δύο έμπειρους παθολόγους (Y ήλιο και Β Dong), που εργάστηκαν ανεξάρτητα και δεν γνώριζαν την κλινική έκβαση των ασθενών. Αποκλίσεις μεταξύ των παρατηρητών βρέθηκαν σε λιγότερο από το 10% των εξεταζόμενων διαφάνειες και συναίνεση επιτεύχθηκε μετά από περαιτέρω επανεξέταση. Χρώση αξιολόγηση χρησιμοποιήθηκε μόλις τα ημιποσοτική μεθόδους για την ταξινόμηση των LAPTM4B-35 έκφρασης ως αρνητική και θετική χρώση ανοσοδραστικών κυττάρων. Η αναλογία θετικότητας βαθμολογήθηκε ως » 0 «(& lt? 10% θετικά καρκινικά κύτταρα), » 1″ (10-50% θετικά κύτταρα όγκου), και » 2 «(& gt? 50% θετικών καρκινικών κυττάρων). Η ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε ως » 0 «(καμία χρώση ή ελαφρώς χρωματισμένο), » 1″ (μέτρια χρώση), ή » 2 «(ισχυρή χρώση). Το άθροισμα της βαθμολογίας ένταση χρώσης και το ποσοστό βαθμολογίας χρησιμοποιήθηκε για τον καθορισμό των επιπέδων LAPMT4B έκφρασης: 0-2, αρνητική έκφραση και 3-4, θετική έκφραση (14). Η θετική έκφραση αξιολογείται μόνο από τα τμήματα με τουλάχιστον 10% θετικών έκταση των όγκων.

Κυτταρική καλλιέργεια, LAPTM4B-35 πλασμίδιο έκφρασης και hCas9 /gRNA διαμόλυνση

κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (ΓΓΕ- 7901, BGC-823, MGC-803, ΜΚΝ-28 και AGS) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Wisent Inc., St-Bruno, QC, Canada) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (HyClone, Logan, UT, USA) και 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2. Η

pcDNA3

.

0-AF

που περιέχει το σύνολο ORF της LAPTM4B παραγωγή LAPTM4B-35 πρωτεΐνη ήταν προικισμένος από τον καθηγητή RL Zhou [11]. Η διαμόλυνση εκτελέστηκε με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Θετικοί κλώνοι κυττάρων που λαμβάνονται με επιλογή αντιβιοτικού με G418 (Gibco, Grand Island, ΝΥ) σε συγκέντρωση 800 ng /ml.

hCas9 και διανυσματικά gRNA είχαν πάρει από την Κίνα Ζεβρόψαρο Resource Center (CZRC). Το πλήρες μήκος του Cas9 cDNA κλωνοποιήθηκε στον φορέα pXT7 και γραμμικοποιημένο, και καλυμμένο mRNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας mMessage mMACHINE mRNA κιτ σύνθεση μεταγραφής (Life Technologies, Carlsbad, California, USA). Οι αλληλουχίες εκκινητή gRNA που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: πρόσθιος εκκινητής, 5′-TACGACTCACTATAGGGGGATGGTGCCGGTGCGGACAGTTT TAGAGCTAGAAATAGC-3 ‘, και αντιπαράλληλος εκκινητής: 5′-πρωτόκολλο AGCACCGACTCGGTGCCACT-3’.The ακολουθήθηκε από την προηγούμενη δημοσιευμένη εργασία [26]. hCas9 mRNA (3 ng /μl) και gRNA (0,2 ng /μΙ) συνδιαμολύνθηκαν σε SGC-7901 κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

απομόνωση RNA, ποσοτική πραγματικού χρόνου αντίστροφης μεταγραφής PCR (qRT-PCR)

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA χρησιμοποιώντας M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Promega, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα PCR ταχύ και συνεχή χρόνο ΑΒΙ 7500 (Life Technologies, Carlsbad, California, USA). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Οι αλληλουχίες εκκινητή χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται παρακάτω: LAPMT4B-35: εμπρόσθιος εναρκτήρας: 5′-GGAAGCAGGACAGCCAACTT-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής: 5′-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3′? β-ακτίνης: πρόσθιος εκκινητής: 5’-CCTGTGGCATCCACGAAACT-3 ‘ανάστροφος εναρκτήρας: 5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8. (CCK-8) (Dojindo, Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ένας όγκος 100 μΙ του κυτταρικού εναιωρήματος (3000 κύτταρα ανά φρεάτιο) επωάστηκε σε πλάκα 96 φρεατίων (Costar, Corning, ΝΥ) για 24, 48, 72, 96 ώρες. 10 μΙ του διαλύματος CCK-8 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 3 ώρες στους 37 ° C. Οι τιμές απορρόφησης από όλα τα φρεάτια στη συνέχεια προσδιορίζεται στα 450nm με ένα μήκος κύματος αναφοράς 630 nm σε Microplate Reader (Bio-Rad, USA). Το πείραμα έγινε εις τριπλούν και επαναλήφθηκε δύο φορές.

επούλωση της πληγής δοκιμασία

Η μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκε με προσδιορισμό επούλωση της πληγής από το σύστημα IncuCyte HD (IncuCyte ZOOM, Essen BioScience, USA). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 6 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο. Τραύματος έγινε μέσω κυττάρων συρρέουσα μονοστιβάδα με ένα μπλοκ πείρο και τα κύτταρα πλύθηκαν με 1 χ PBS, καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο DMEM με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Φωτογραφίες των κυττάρων απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα HD IncuCyte σε διαστήματα 4-ωρών από 2 χωριστές περιοχές ανά φρεάτιο χρησιμοποιώντας ένα αντικειμενικό 10χ. Οι τιμές από 2 περιοχές κάθε φρεάτιο συνενώθηκαν και ο μέσος όρος σε όλους τους 3 επαναλήψεις

προσδιορισμούς εισβολής Transwell

Ο Transwell (8 μm μέγεθος πόρου? Κυττάρων Biolabs, USA). Δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των κυττάρων εισβολής σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 8 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε άνω θαλάμους σε μέσα άνευ ορού, και οι κάτω θάλαμοι πληρώθηκαν με ϋΜΕΜ και 10% FBS. Μετά την επώαση για 72 ώρες στους 37 ° C, μη επεμβατική κύτταρα επί της άνω επιφανείας των μεμβρανών αφαιρέθηκαν με ένα βαμβάκι. Οι μεμβράνες σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη για 10 λεπτά και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες επί 10 λεπτά. Τα κύτταρα στην κάτω πλευρά του φίλτρου ήταν από μετρήθηκαν πέντε τυχαία επιλεγμένα μικροσκοπικά θέα.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης των κυτταρικών γραμμών GC μετρήθηκαν με ανάλυση Western Blot. Τα κύτταρα λύθηκαν σε προ-ψύξη RIPA ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) που περιείχε κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Basel, Switzerland) για 30 λεπτά μετά από φυγοκέντρηση σε 15.000 χ g επί 20 λεπτά, λήφθηκε το υπερκείμενο. 50μg εκχυλισμάτων πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS πολυακρυλαμιδίου 10%, και μεταφέρεται επάνω στο 0,45 μm διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Whatman, Γερμανία). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (ρΗ 7.6) που περιέχει 5% άπαχο ξηρό γάλα, στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-LAPTM4B-35 αντίσωμα (1: 800? Προικισμένος από τον Καθηγητή RL Zhou) στους 4 ° C όλη τη νύκτα . Ποντικού αντι-ανθρώπινης β-ακτίνης αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) εφαρμόστηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

Στατιστική ανάλυση

Chi-square test χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η διαφορά στην LAPTM4B-35 έκφραση πρωτεΐνης μεταξύ GC ιστών και των παρακείμενων noncancerous ιστούς. Άνευ όρων μοντέλα λογιστικής ανάλυσης παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των σχέσεων μεταξύ της έκφρασης LAPTM4B-35 και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων προσαρμόζονται ανάλογα με την κατάσταση των δύο φύλων. Η διαφορά του

έκφραση LAPMT4B-35

mRNA μεταξύ GC και των παρακείμενων noncancerous ιστούς αναλύθηκε με την Wilcoxon συμφωνημένα τεστ ζεύγους.

Η συνολική επιβίωση (OS) καμπύλη υπολογίστηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier και αναλύθηκαν με τη δοκιμασία log-rank. Σχετικούς κινδύνους (ΕΑ) του θανάτου που σχετίζεται με LAPTM4B-35 έκφρασης και άλλες μεταβλητές πρόβλεψης εκτιμήθηκε από την μονοπαραγοντική Cox μοντέλο αναλογικού κινδύνου πρώτον. μοντέλα πολυμεταβλητή Cox επίσης κατασκευάστηκαν για να εκτιμηθεί η RR για την έκφραση LAPMT4B-35. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS στατιστικό πακέτο (έκδοση 20.0? SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Ένα δύο όψεων

P

τιμή μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Η ανάλυση έκφρασης των LAPTM4B-35 σε κυτταρικές σειρές GC και ΔΘ

Εξετάσαμε πρώτον την έκφραση του

LAPTM4B-35

με RT-PCR σε 5 κυτταρικές σειρές GC (MGC-803, BGC-823, ΜΚΝ-28, ΓΓΕ-7901 και AGS), και στη συνέχεια ανιχνεύονται της έκφραση πρωτείνης με στύπωμα Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι LAPTM4B-35 εκφράστηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές σε αμφότερες mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 1Α, άνω και κάτω πάνελ), τότε εμείς επιλέξαμε BGC-823 και SGC-7901 κυττάρων για ακόλουθες δοκιμές κυτταρικής λειτουργίας μας.

(Α) mRNA (άνω πάνελ) και πρωτεΐνης (κατώτερο πάνελ) έκφραση LAPTM4B-35 σε πέντε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. (Β) σχετική έκφραση του mRNA του

LAPTM4B-35

σε γαστρικό καρκίνο και των παρακείμενων ιστών noncancerous τους.

Η

LAPTM4B-35

έκφραση επίσης ανιχνεύθηκε σε 24 ζεύγη της εκτομή δείγματα GC από qRT-PCR. Όπως μπορούμε να δούμε στο σχήμα 1Β, το

LAPTM4B-35

έκφραση σε ιστούς GC ήταν σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση με τα ζεύγη γειτονικών noncancerous ιστούς (

P

= 0,017) (Εικόνα 1Β).

LAPTM4B-35 έκφρασης πρωτεΐνης που παρατηρούνται συχνά στην ανθρώπινη GC

Ερευνήσαμε την έκφραση του LAPTM4B-35 σε GC και των παρακείμενων noncancerous ιστούς μέσω της ανοσοϊστοχημική ανάλυση. LAPTM4B-35 δεν εκφράζουν σε φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο (Σχήμα 2Α), αλλά εκφράζεται σε εντερικό μεταπλασία βλάβη δυσπλασία (Τα δεδομένα δεν αποδείχθηκε) και καρκινικά κύτταρα, και εντοπίζεται κυρίως εντός του κυτταροπλάσματος ή επί της κυτταρικής μεμβράνης (Σχήμα 2Β και 2D 2Η). LAPTM4B-35 που παρατηρείται συχνά στους ιστούς GC σε σχέση με συμφωνημένα δίπλα noncancerous βλεννογόνο (68,3% έναντι 16,1%,

P

= 0.000) (Πίνακας 1).

(Α) LAPTM4B-35 ήταν δεν εκφράζεται σε φυσιολογικό βλεννογόνο του στομάχου. (Β) LAPTM4B-35 εκφράστηκε στην αλλοίωση δυσπλασία. (C) LAPTM4B-35 αρνητική χρώση σε ιστό GC. (Ε-Η) LAPTM4B-35 θετική χρώση σε ιστούς GC. Αρχική μεγέθυνση:. 100 ×

Η

Σχέση μεταξύ LAPTM4B-35 έκφρασης και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά

Εμείς ανέλυσε τη σχέση μεταξύ LAPTM4B-35 έκφρασης και κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά των ασθενών GC. Όπως το φύλο, τα αντικείμενα στη μελέτη μας έχει απόκλιση τους (167 έναντι 73, Πίνακας 2), υπολογίσαμε τη σχέση τους με ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης και προσαρμοσμένο για την κατάσταση των δύο φύλων. LAPTM4B-35 παρατηρήθηκε συχνότερα φτωχά διαφοροποιημένα GCs σε σύγκριση με μέτρια-καλά διαφοροποιημένο αυτούς (65,4% έναντι 57,9%,

P

= 0,017). Επιπλέον, LAPTM4B-35 έκφρασης συνδέθηκε με lymphovascular εισβολή (

P

= 0.000), το βάθος της εισβολής (

P

= 0,016) και λεμφαδένα μετάσταση (

P

= 0.029) (Πίνακας 2).

η

LAPTM4B-35 έκφραση και την πρόγνωση των ασθενών GC

το σχήμα 3 απεικονίζει την ανάλυση του LAPTM4B-35 έκφρασης και κλινικά αποτελέσματα. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι υπήρχε μια τάση μικρότερη συνολική επιβίωση (OS) σε ασθενείς GC με LAPTM4B-35 θετική έκφραση σε σχέση με τις αρνητικές (

P

= 0,064, log-rank = 3.425) (Εικ 3Α). Μετά από ασθενείς ταξινομήθηκαν από ΤΝΜ Ι-ΙΙΙ ή ασθενείς χωρίς lypmphovascular εισβολή, οι ασθενείς με LAPTM4B-35 θετική έκφραση έδειξαν σημαντικά μικρότερη OS από αυτές τις αρνητικές (

P

= 0.006 και

P

= 0.001 , αντίστοιχα) (Σχήμα 3Β και 3D).

Ένα, καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier για το OS σε ασθενείς GC με LAPTM4B-35 θετικών και αρνητικών έκφρασης. (B, C, D) Kaplan-Meier για OS σε υποομάδα ασθενών GC στρωματοποιημένη κατά ΤΝΜ φάσεις Ι-ΙΙΙ, IV και ασθενείς χωρίς lymphovascular εισβολή, αντίστοιχα.

Η

Τα αποτελέσματα της μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική μοντέλα Cox, για το OS ασθενών GC στο ΤΝΜ Στάδιο Ι-ΙΙΙ εκτίθενται ότι το βάθος της εισβολής (RR = 3.103, 95% CI: 1,427 – 6,748?

P

= 0.004), λεμφικό μετάσταση στους λεμφαδένες (RR = 3.015, 95% CI: 1,552 – 5,858?

P

= 0,001) και-35 LAPTM4B επίπεδο έκφρασης (RR = 2.249, 95% CI: 1,242 – 4,072?

P

= 0,007) επηρέασε σημαντικά την επιβίωση του GC, αντίστοιχα (Πίνακας 3)? Επιπλέον, LAPTM4B-35 θετική έκφραση ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας (RR = 1.897, 95% CI: 1,041 – 3,457?

P

= 0,025). λεμφαδένα μετάσταση (RR = 2.665, 95% CI: 1,362 – 5,213?

P

= 0,001) και ανεξάρτητα προέβλεψε OS (Πίνακας 3)

Η

LAPTM4B-35 προωθείται καρκινικών κυττάρων. πολλαπλασιασμό

για να διερευνηθεί η επίδραση της LAPMT4B-35 στη λειτουργία της κυτταρικής βιολογίας, ιδρύθηκαν δύο κυτταρικές σειρές. BGC-823 και SGC-7901 κύτταρα που παρουσιάζουν σχετικά χαμηλότερη ή υψηλότερη έκφραση της LAPTM4B-35 ξεχωριστά επιλεγεί για υπερέκφραση και νοκ ντάουν δοκιμασία (Σχήμα 1Α). Στην πρώτη, η κυτταρική γραμμή BGC-823-AF που υπερεκφράζουν LAPTM4B-35 σταθερώς ιδρύθηκε και MOCK χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για αυτή την κυτταρική γραμμή. Δεύτερον, LAPTM4B-35 ήταν σταθερώς χτυπηθεί κάτω towarding να SGC-7901 (hCas9 /gRNA) από το σύστημα II συγκεντρωμένα τακτικά διάκενα μεταξύ τους μικρή παλινδρομική επαναλήψεις (CRISPR) τύπου, και τα αποτελέσματα ταυτοποιήθηκαν με στύπωμα Western (Εικόνα 4Α).

(Α) έκφραση LAPTM4B-35 στην BGC-823 και SGC-7901 μετά από επιμόλυνση με φορέα έκφρασης LAPTM4B και hCas9 /gRNA ταυτοποιήθηκαν με Western κηλίδας. BGC-823-AF δείχνει BGC-823 που υπερεκφράζουν τον κλώνο. καμπύλες (Β) Ανάπτυξη προσδιορίζεται με CCK-8 δοκιμασίας. Αριστερό πλαίσιο: η υπερέκφραση του LAPTM4B-35 προάγει την ταχεία αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων BGC-823 σε σύγκριση με το άγριου τύπου και ψευδο. Μεσαίο πάνελ: νοκ ντάουν της LAPTM4B-35 έκφρασης αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο και την SGC-7901. Δεξιά πίνακα: διαφορετική κατάσταση πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετά από επώαση 3 ημερών για BGC-823 και 2 ημέρες για την ΓΓΕ-7901. *

P

& lt? 0,05, BGC-823-AF vs MOCK, νοκ ντάουν vs SGC-7901. Για όλα τα δεδομένα ο μέσος όρος και η τυπική απόκλιση αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετρήθηκε με CCK-8 κιτ μέτρησης κυττάρων. Η τιμή απορρόφησης των κυττάρων BGC-823-AF σε 72 ώρες μετά από τη διάδοση ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι αυτών των μητρικών κυττάρων και ψευδο κύτταρα, και το αποτέλεσμα ήταν ακριβώς απέναντι από την κατάρριψη του LAPTM4B-35 στη ΓΓΕ-7901 κύτταρα (Σχήμα 4Β).

LAPTM4B-35 ενισχύεται η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και την ικανότητα εισβολής

Μετά την επιμόλυνση με pcDNA3.0-AF και hCas9 /gRNA, πραγματοποιήσαμε ανάλυση επούλωση της πληγής για να αναλύσει την ικανότητα μετανάστευσης των LAPTM4B-35 υπερέκφραση /knockdown γαστρικού καρκίνου κύτταρα (Σχήμα 5Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι LAPTM4B-35 προωθείται BGC-823 (BGC-823-AF) μετανάστευση των κυττάρων σε σύγκριση με το BGC-823 και εικονικές (

P

& lt? 0.05), και προς τα κάτω ρύθμιση των LAPTM4B-35 έκφρασης θα μπορούσε αντιστρέψει αυτό το φαινόμενο στη ΓΓΕ-7901 κύτταρα (

P

& lt? 0.05, Σχήμα 5Β)

(Α) στο πάνω αριστερό μέρος του πίνακα:. επούλωση της πληγής δοκιμασία της BGC-823-AF, μακέτα και BGC-823? αριστερή κάτω πίνακα: Δοκιμασία επούλωση της πληγής της hCas9 /gRNA, Ελέγχου και SGC-7901. Φωτογραφίες συνελήφθησαν από ένα μικροσκόπιο ανεστραμμένης φάσης-αντίθεσης σε 24 ώρες μετά τον τραυματισμό. Μεγέθυνση = 100 ×. (Β) Ποσοτικοποίηση των ποσοστών επούλωση της πληγής. Για όλα τα δεδομένα ο μέσος όρος και η τυπική απόκλιση αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Κατά συνέπεια, η επίδραση του LAPTM4B-35 σχετικά με την ικανότητα εισβολής των κυττάρων του όγκου μελετήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία transwell (Σχήμα 6Α). Βρήκαμε ότι ο αριθμός εισέβαλαν κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη στα LAPTM4B-35-επιμολυσμένα BGC-823 κύτταρα και χαμηλότερη στα knockdown SGC-7901 κύτταρα, παρά σε κύτταρα ελέγχου, αντίστοιχα (

P

& lt? 0,05, Σχήμα 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι LAPTM4B-35 προάγει την μετανάστευση και την εισβολή των γαστρικών καρκινικών κυττάρων

(Α), αριστερό άνω πίνακα:. Φρεατίων δοκιμασία της BGC-823-AF, μακέτα και BGC-823 κύτταρα? αριστερή κάτω πίνακα: φρεατίων δοκιμασία της hCas9 /gRNA, Ελέγχου και SGC-7901. Επεμβατική κύτταρα μετρήθηκαν σε τυχαία 5 επιλεγμένα μικροσκοπικά πεδία. Μεγέθυνση = 100 ×. (Β) Ποσοτικοποίηση των μεταναστευτικών και μεταστατικών κυττάρων. Για όλα τα στοιχεία η μέση τιμή και τυπική απόκλιση αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Συζήτηση

GC είναι ένα εξαιρετικά ετερογενής νόσος, όπου ακόμη και παρόμοια κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά οδηγούν σε διακριτά αποτελέσματα [ ,,,0],27, 28], που δείχνει ότι το σύστημα TNM στάσης για τη GC έχει περιορισμό τους και ωθούν στην αναζήτηση νέων μοριακών βιοδεικτών που μπορεί να προβλέψει το αποτέλεσμα και τη θεραπεία του ασθενούς. Το ογκογονίδιο LAPTM4B-35 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 8q22, και το κέρδος του αριθμού αντιγράφων του DNA στο χρωμόσωμα 8q22 είναι ένα συχνό εύρημα σε GC σύμφωνα με την προηγούμενη μελέτη μας (αδημοσίευτα δεδομένα). Στον καρκίνο του μαστού, η υπερέκφραση του LAPTM4B-35 και 8q22 πολλαπλασιασμού συνέβαλαν στην

de nove

χημειοαντίσταση με ανθρακυκλίνες και είναι ανεκτική για μεταστατική υποτροπή [29].

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε

LAPTM4B-35

έκφραση σε 24 γαστρικό καρκίνο και αντιστοιχισμένο noncancerous γαστρικού χειρουργικά δείγματα τους qRT-PCR και διαπίστωσε ότι

LAPTM4B-35

mRNA επίπεδο έκφρασης σε καρκίνο του στομάχου ήταν σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση με ότι στην ζευγαρωμένα noncancerous ομάδα ιστού. Επιπλέον, ανοσοϊστοχημική ανάλυση σε 180 ζεύγη γαστρικού καρκίνου έδειξε LAPTM4B-35 υπερεκφράστηκε σε ιστούς GC (68,3%) σε σύγκριση με συζευγμένες noncancerous βλεννογόνο τους (16,1%). LAPTM4B-35 προάγει την ανάπτυξη του όγκου και την ανοχή για μεταβολικές και γενετικές στρες μέσω της επαγωγής αυτοφαγία [30, 31]. Στη παρούσα μελέτη μας, η λειτουργία του LAPTM4B στο γαστρικό καρκίνο διερευνήθηκε με δοκιμασίες in vitro. Η υπερέκφραση του LAPTM4B-35 στην BGC-823 κύτταρα αυξήθηκε επίσης τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε συνθήκες καλλιέργειας ελεύθερης ορού, καθώς και. Αν το φαινόμενο αυτό προκαλείται από autophage χρειάζεται να ερευνηθεί.

Επίσης, αναλύσαμε επίσης τη συσχέτιση των LAPTM4B-35 έκφρασης με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους στον καρκίνο του στομάχου. έκφραση High LAPTM4B-35 συσχετίστηκε σημαντικά με τον βαθμό διαφοροποίησης, lymphovascular εισβολή, το βάθος της εισβολής και της μετάστασης λεμφαδένα, γεγονός που υποδηλώνει ότι LAPTM4B-35 μπορεί να ενεργοποιείται εκτενώς σε γαστρικό καρκίνο και μπορεί να παίζει ένα ζωτικό ρόλο στη γαστρική καρκινογένεση και την εξέλιξη του όγκου. Καθώς ο όγκος lymphovascular εισβολή και τη μετάσταση λεμφαδένα είναι ιδιαίτερα σημαντική κλινική προγνωστικούς δείκτες για την επανεμφάνιση του όγκου, κάναμε μια ανάλυση επιβίωσης. Kaplan-Meier καμπύλες στρωματοποιημένη από LAPTM4B-35 έκφρασης και το στάδιο του όγκου ή lymphovascular εισβολή αποκάλυψε ότι LAPTM4B-35 θετικούς ασθενείς έχουν σημαντικά φτωχότερη OS σε σύγκριση με LAPTM4B-35 αρνητικά σε στάδια TNM Ι-ΙΙΙ ή χωρίς lymphovascular υποομάδα εισβολή. ανάλυση παλινδρόμησης πολυμεταβλητή Cox σε αυτή την υποομάδα έδειξαν ότι μεταξύ όλων αναλύονται παράγοντες, LAPTM4B-35 έκφρασης είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου στην TNM φάσεις Ι-ΙΙΙ, αλλά στο στάδιο IV. Είναι λογικό, διότι ασθενή στο στάδιο IV είναι σε θέση να λάβει ριζοσπαστικές λειτουργία και μπορεί να αντιμετωπιστεί με πολλούς άλλους διαφορετικούς παρηγορητική θεραπείες, οι οποίες θα επηρεάσουν την πρόγνωση. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η τάση για LAPTM4B-35 μπορεί να προβλέπει ειδικά τις πιο επιθετική και θανατηφόρα τύπους καρκίνου του στομάχου σε περιπτώσεις με την έγκαιρη και χωρίς άπω μετάσταση ή χωρίς lymphovascular εισβολή.

Στην παρούσα μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι LAPTM4B -35 θετική έκφραση γενικά συσχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση σε ασθενείς GC στρωματοποιημένη κατά το στάδιο του όγκου ή lymphovascular εισβολή. Για την λειτουργία του LAPTM4B-35 σε GC, εκτελέσαμε περαιτέρω in vitro δοκιμασία. Η υπερέκφραση του LAPTM4B-35 σε BGS-823 κύτταρα αποκάλυψε μια σημαντική αύξηση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή, και προς τα κάτω ρύθμιση LAPMT4B-35 με μόλυβδο στα αντίθετα αποτελέσματα. Zhou et al. έδειξε ότι LAPTM4B-35 υπερέκφραση προωθεί την κυτταρική επιβίωση, απελευθερωμένη πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων HCC [12]. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει ότι LAPTM4B-35 συσχετίστηκε σημαντικά με χειρότερη κλινική έκβαση σε πολλές ανθρώπινες κακοήθειες, όπως HCC [16], μεταστατικού όγκου ωοθήκης [32], της χοληδόχου κύστης [19, 33], εξωηπατική χολαγγειοκαρκίνωμα [34] και του καρκίνου του ενδομητρίου [22]. Αυτές οι συσσωρευμένες αποδείξεις υποστηρίζουν την τρέχουσα ευρήματά μας, υποδεικνύοντας ότι LAPTM4B-35 υπερέκφραση μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στον κακοήθη μετασχηματισμό και την εξέλιξη του GC.

Οι μοριακοί μηχανισμοί της LAPTM4B-35 στις ιδιότητες εξέλιξης του όγκου είναι ακόμα ασαφής. Ορισμένες προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι LAPTM4B-35 είναι απαραίτητη για λυσόσωμα ομοιόσταση, οξίνισης και λειτουργία, και ότι LAPTM4B-35 καθιστά τα καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά σε κυτταρικό θάνατο λυσόσωμα μεσολάβηση ενεργοποιείται από περιβαλλοντικές και γονιδιοτοξικές καταπονήσεις [30, 31]. Η υπερέκφραση του LAPTM4B-35 θα μπορούσε να ενεργοποιήσει κάποιες πρωτο-ογκογονίδια, όπως το c-myc, c-jun και c-fos [35], και προάγουν τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή σε ορισμένες ανθρώπινες γραμμές καρκίνου η οποία θα ενισχύσει την ανάπτυξη και μετάσταση του HCC ξενομοσχεύματα σε γυμνά ποντίκια [36]. Σχετικές έρευνα υπονοείται ότι LAPTM4B μπορούν να βελτιώσουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή την επιβίωση μέσω της συμμετοχής στην οδό μεταγωγής σήματος, όπως είναι η φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση πρωτεΐνης κινάσης Β. Και LAPTM4B-35 μπορεί να αλληλεπιδράσουν με ορισμένα σχετίζονται με τον καρκίνο πρωτεΐνες, όπως πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α και κινάση πρωτεΐνης C [10]. Li et al βρήκαν ότι LAPTM4B-35 παρακινεί πολυφαρμακευτικής αντίστασης καρκινικών κυττάρων με την προώθηση εκροής φαρμάκου και αντι-απόπτωση με ενεργοποίηση ΡΙ3Κ /ΑΚΤ σηματοδότηση [24], υποδεικνύοντας ότι LAPTM4B-35 μπορεί να είναι ένας νέος στόχος της θεραπείας. Ο λειτουργικός ρόλος και ο μηχανισμός της LAPTM4B σε GC χρειάζονται περαιτέρω έρευνα.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι LPTM4B-35 υπερέκφραση παίζει σημαντικό ρόλο στην προαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, τη μετανάστευση και εισβολή σε γαστρικούς καρκίνους. LAPTM4B-35 θετική έκφραση στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς συσχετίζονται με την κακή έκβαση και αποδείχθηκε ότι είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας στην υποομάδα των ασθενών GC στο TNM φάσεις Ι-ΙΙΙ ή χωρίς lymphovascular εισβολή. Έτσι, LAPTM4B-35 μπορεί να αποτελέσει ένα χρήσιμο βιοδείκτη για την πρόβλεψη της πρόγνωσης σε ορισμένες υπο-ομάδα GC. Επιπλέον, όπως οι ρόλοι των LAPTM4B-35 στον περιορισμό λυσόσωμα μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο και την προώθηση αυτοφαγία έχουν σημαντικές επιπτώσεις επιβίωσης σε καρκινικά κύτταρα, και LAPTM4B-35 ήταν υπερ-εκφράζεται σε μια μεγάλη αναλογία του γαστρικού καρκίνου, μπορεί να είναι μια χρήσιμη στόχος για τη θεραπεία του υποτύπου ομάδα του γαστρικού καρκίνου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 συνόλου δεδομένων. Επιμέρους αποτελέσματα σχετικής mRNA έκφρασης LAPTM4B-35, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή, η επιβίωση των pathients και κλινικοπαθολογοανατομικές features.

(Excel)

doi:10.1371/journal.pone.0121559.s001

(XLS)

Acknowledgments

We Ευχαριστώ Guoshuang Feng (από Κινεζικό Κέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων) για την ευγενική βοήθειά του στον τομέα των στατιστικών δεδομένων.