Αφηρημένο

κινάσες είναι προς τα κάτω ρυθμιστές και τελεστές πολλών καταρράκτες κυτταρική σηματοδότηση και παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της νεοπλασματικής νόσου. Σε αυτή τη μελέτη, με στόχο να αξιολογήσει SRC, LYN και πρωτεΐνη CKB και mRNA έκφραση, όπως επίσης και μεθυλίωση προαγωγού τους, σε γαστρικό καρκίνο. Βρήκαμε αυξημένη έκφραση του SRC και LYN mRNA της κινάσης και της πρωτεΐνης αλλά μειωμένα επίπεδα CKB κινάσης, αλλοιώσεις που μπορεί να έχουν κάποιο ρόλο στην διεισδυτικότητα και τη μετάσταση των γαστρικών όγκων. Η έκφραση των τριών μελετήθηκαν κινάσες συσχετίστηκε επίσης με MYC ογκογονιδίου έκφρασης, μια πιθανή βιοδείκτη για καρκίνο του στομάχου. Για να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την έκφραση αυτών των γονιδίων, αξιολογήσαμε τη μεθυλίωση προαγωγού DNA των τριών κινασών. Βρήκαμε ότι μειώνεται

SRC

και

LYN

μεθυλίωση και αυξημένη

CKB

μεθυλίωση συνδέθηκε με καρκίνο του στομάχου. Η μειωμένη

SRC

και

LYN

μεθυλίωση συσχετίστηκε με αυξημένα επίπεδα mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μεθυλίωση του DNA εμπλέκεται στην ρύθμιση της έκφρασης αυτών των κινασών. Αντιστρόφως, η μειωμένη

CKB

μεθυλίωση παρατηρήθηκε σε δείγματα με μειωμένη mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης, υποδηλώνοντας έκφραση CKB βρέθηκε να μόνο εν μέρει ρυθμίζεται από μεθυλίωσης DNA. Επιπλέον, βρήκαμε ότι οι μεταβολές του τρόπου διεξαγωγής μεθυλίωσης του DNA από τα τρία που μελετήθηκαν κινάσες επίσης σχετίζεται με το γαστρικό εμφάνιση καρκίνου, προχωρημένο καρκίνο του στομάχου, βαθύτερη εισβολή όγκου και η παρουσία της μετάστασης. Ως εκ τούτου, SRC, LYN και CKB έκφραση ή μεθυλίωσης του DNA θα μπορούσε να είναι χρήσιμοι δείκτες για την πρόβλεψη της εξέλιξης του όγκου και η στόχευση σε στρατηγικές για την καταπολέμηση του καρκίνου

Παράθεση:. Mello AA, Leal MF, Rey JA, Pinto GR, Lamarão LM, Μαυροβούνιο RC, et al. (2015) η απορρύθμιση της έκφρασής του SRC, LYN και CKB κινασών από μεθυλίωση του DNA και του δυνητικού ρόλου της στην γαστρικός καρκίνος της διεισδυτικότητας και μετάσταση. PLoS ONE 10 (10): e0140492. doi: 10.1371 /journal.pone.0140492

Επιμέλεια: Jose Γ Trevino, Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: May 27, 2015? Αποδεκτές: 25η Σεπτεμβρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 13 Οκτωβρίου 2015

Copyright: © 2015 Mello et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Τεχνολογικό (CNPq? επιχορηγήσεις # 471072 /2012-5 και 402283/2013-9? υποτροφία για να MCS και RRB), Fundação de Amparo à Pesquisa do Pará (FAPESPA? χορηγήσει #ICAAF 123/2014 για RRB) και Fundação de Amparo à Pesquisa κάνει Estado de São Paulo (FAPESP? επιχορήγηση # 2009/07145 έως 9? υποτροφία για να MFL) ως υποτροφίες και τα βραβεία υποτροφία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η τέταρτη πιο συχνός τύπος καρκίνου και το δεύτερο υψηλότερο αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Θεραπεία του GC σε προχωρημένα στάδια εξακολουθεί να είναι δύσκολη, και η πρόγνωση παραμένει ανεπαρκής, εν μέρει ως αποτέλεσμα της τοπικής υποτροπής, εισβολή όγκου και /ή μετάστασης. Η συνολική σχετική ποσοστό επιβίωσης 5-ετών είναι λιγότερο από το 20% [2]. Μια καλύτερη κατανόηση της βιολογίας της εξέλιξης αυτής της νεοπλασίας είναι ζωτικής σημασίας για τη μείωση του ποσοστού θνησιμότητας με την ανάπτυξη νέων διαχείριση του ασθενούς και θεραπευτικές στρατηγικές.

Phosphotransferases, επίσης γνωστή ως κινάσες, είναι κατάντη ρυθμιστές και τελεστές αρκετών κυτταρική καταρράκτες σηματοδότησης και παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των νεοπλασματικών ασθενειών [3]. Μέχρι σήμερα, έχουν φάρμακα κινάση που αλληλεπιδρά με διάφορες πρωτεΐνες έχουν καταχωριστεί για κλινικές δοκιμές [4]. Έχουμε προηγουμένως τη διενέργεια του ελέγχου για τον εντοπισμό πρωτεϊνών κινάσης εκφράζονται σε GC χρησιμοποιώντας Capture Ένωση Φασματομετρίας Μάζας [5, 6] (S1 File), και 22 πρωτεΐνες κινάσης, συμπεριλαμβανομένων των SRC, LYN και CKB, ανιχνεύθηκαν (S1 πίνακα). Αυτά τα τρία κινάσες επιλέχθηκαν για περαιτέρω έρευνες (S1 Σχήμα).

SRC ήταν η πρώτη πρωτο-ογκογονίδιο ανακαλυφθεί, και αυτό παίζει ένα κεντρικό ρόλο σε οδούς μεταγωγής κυτταρικού σήματος. Η ανώμαλη δραστηριότητα SRC παρατηρείται σε αρκετούς ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των GC [7-9], και μπορεί να είναι σημαντικό κατά τη διάρκεια της ανάπτυξη και εξέλιξη [10, 11] όγκου. Η μιτογόνος λειτουργία του SRC είναι, τουλάχιστον εν μέρει, μεσολαβείται από την επαγωγή του MYC, ενός ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου και παράγοντα μεταγραφής [12, 13]. Η ομάδα μας που περιγράφηκε προηγουμένως προς τα πάνω ρύθμιση MYC στην ανθρώπινη GC και σε μη ανθρώπινα πρωτεύοντα Ν-μεθυλ-νιτροζουρία επεξεργασμένου [14-19]. Επειδή η ενεργοποίηση του SRC, καθώς και εκείνη άλλων κινασών, έχει πλειοτροπικές επιδράσεις που εξαρτώνται από τον τύπο του κυττάρου και το πλαίσιο [20], εξακολουθεί να είναι σημαντικό να κατανοήσουμε τη πιθανή σχέση μεταξύ των κινασών και την έκφραση MYC στο γαστρικό καρκινογένεση και του μοριακού μηχανισμού εμπλέκονται στη ρύθμισή τους.

LYN είναι ένα άλλο μέλος της οικογένειας SRC των κινασών, και το

LYN

γονίδιο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 8q13. Η ομάδα μας έχει ήδη αναφερθεί η παρουσία των κερδών του χρωμοσώματος 8 (κατά την οποία η

MYC

γονίδιο βρίσκεται επίσης) σε περιπτώσεις GC από τη Βόρεια Βραζιλία [16, 21-23], καθώς και σε όλες τις κυτταρικές σειρές GC ιδρύθηκε από νεοπλασίες σε αυτός ο πληθυσμός [24, 25]. Επομένως, αυτή η χρωμόσωμα μπορεί να περιέχει σημαντικά γονίδια που εμπλέκονται στην γαστρική καρκινογένεση. Για τις γνώσεις μας, καμία προηγούμενη μελέτη δεν έχει διερευνηθεί ο ρόλος των LYN και η ρύθμισή της στο GC. Ωστόσο, η υπερέκφραση LYN έχει αναφερθεί σε αρκετές καρκίνους [26-32]. Επιπλέον, η ρύθμιση της

LYN από

DNA μεθυλίωση καταδείχτηκε τόσο καρκίνο του παχέος εντέρου και σάρκωμα Ewing [33, 34], και

LYN

μεθυλίωση έχει παρατηρηθεί σε ορισμένα αιμοποιητικών και μη αιμοποιητικών κυτταρικές γραμμές [35]. Μεθυλίωση του DNA είναι ένα μοριακό τροποποίηση του DNA που είναι στενά συνδέεται με λειτουργία γονιδίου και της λειτουργίας των γονιδίων των κυττάρων ειδικού τύπου [36]. Επιπλέον, μεθυλίωση του DNA μπορεί να είναι ένα ισχυρό βιοδείκτη, καθώς είναι πολύ πιο σταθερό από RNA ή πρωτεΐνης και συνεπώς είναι ένα υποσχόμενο στόχο για την ανάπτυξη νέων προσεγγίσεων για την διάγνωση και την πρόγνωση καρκίνων [36].

CKB είναι ένα από τα δύο κυτοσολίου ισομορφές κινάσης της κρεατίνης και μπορεί να συμμετέχει σε μεταβολικές διαδικασίες που περιλαμβάνουν τη γλυκόλυση σε μη μυϊκά κύτταρα [37]. Σε αντίθεση με τα κανονικά κύτταρα, τα οποία παράγουν κυρίως ενέργειας μέσω οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα προτιμούν αερόβια γλυκόλυση, η οποία είναι γνωστή ως φαινόμενο Warburg [38]. Είναι ενδιαφέρον ότι το ογκογονίδιο MYC φαίνεται να ενεργοποιεί διάφορους μεταφορείς γλυκόζης και γλυκολυτικά ένζυμα, συμβάλλοντας έτσι στο φαινόμενο Warburg [39]. προηγούμενη πρωτεομική μελέτη μας αποκάλυψε ότι πολλές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στις διαδικασίες παραγωγής ενέργειας έχουν απελευθερωθεί σε δείγματα GC και ενίσχυσε το αποτέλεσμα Warburg σε αυτό το νεοπλασία [40]. Ο ρόλος της CKB στο GC παραμένει ελάχιστα κατανοητή: μερικές transcriptomic μελέτες ανέφεραν τη ρύθμιση προς τα άνω του

CKB

σε δείγματα GC [41, 42], ενώ ένα άλλο έδειξε

CKB

ρύθμιση προς τα κάτω [43]. Επιπλέον, όπως και για το

LYN

γονίδιο,

CKB

μεθυλίωση προηγουμένως περιγράφεται στο αιματολογικές και στερεά καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων κυτταρικών γραμμών GC [44]. Η μεθυλίωση του

CKB

φαίνεται να σχετίζεται με μειωμένο επίπεδο της έκφρασης? Ωστόσο, περαιτέρω έρευνα εξακολουθεί να είναι αναγκαία για την κατανόηση της ρύθμισης των

CKB

από επιγενετικές τροποποιήσεις.

Ως εκ τούτου, το πρώτο με στόχο να αξιολογηθεί η έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης του SRC, LYN και CKB σε ένα μεγάλο σετ δειγμάτων GC. Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε εάν αυτά τα γονίδια μπορούν να ρυθμίζονται από μεθυλίωση του DNA στο γαστρικό καρκινογένεση. Επιπλέον, μελετήσαμε την πιθανή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της κινάσης ή μεθυλίωση και κλινικές μεταβλητές, καθώς και την έκφραση MYC και μεθυλίωση.

Υλικό και Μέθοδοι

δείγματα ιστών

έκφραση

κινάσης και μοτίβα μεθυλίωσης αξιολογήθηκαν σε 138 ζεύγη δειγμάτων GC και τα αντίστοιχα μη-νεοπλασματικές δείγματα γαστρικού ιστού τους που λαμβάνονται από ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε γαστρεκτομή στη Βόρεια Βραζιλία. Όλοι οι ασθενείς είχαν αρνητικό ιστορικό έκθεσης σε είτε χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από την επέμβαση, και δεν υπήρχε συνύπαρξη άλλων διάγνωση καρκίνων. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του João de Barros Barreto Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (Πρωτόκολλο # 316737). Γραπτή συγκατάθεση με την έγκριση της επιτροπής δεοντολογίας λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν από τη συλλογή του δείγματος.

Μέρος της κάθε αποσυντίθενται δείγμα του όγκου ήταν φορμόλη-σταθερές και εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE). Τομές ιστού FFPE χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη για ιστολογική εκτίμηση ή να χρησιμοποιηθούν για ανοσοϊστοχημεία ανάλυση (IHC). Πρόσθετα τμήματα κάθε όγκου και ζεύγη δειγμάτων μη νεοπλαστικό ιστό καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι πρωτεΐνη και καθαρισμού νουκλεϊκών οξέων.

Όλα τα δείγματα ταξινομήθηκαν σύμφωνα με την Lauren [45 ], και οι όγκοι σταδιακή σύμφωνα με τα κριτήρια σταδιοποίησης TNM [46]. Η παρουσία του

Helicobacter pylori

, ένα κλάσης Ι καρκινογόνο, σε γαστρικό δείγματα ανιχνεύθηκε με την ταχεία δοκιμή ουρεάσης, και λοιμογόνος παράγοντας κυτταροτοξικότητα της που συνδέονται γονίδιο Α (CagA γονίδιο) ήταν ανίχνευση με PCR χρησιμοποιώντας DNA καθαρίζεται ταυτόχρονα με πρωτεΐνες και mRNA, όπως εκτελείται στο παρελθόν από την ομάδα μας [47]. ιός Epstein-Barr (EBV) ανιχνεύθηκε από την RNA in situ υβριδισμού [47].

Για 49 από αυτά τα ζεύγη των νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών δειγμάτων, εκτιμήσαμε την ανοσοαντιδραστικότητα MYC, mRNA έκφραση και την κατάσταση μεθυλίωσης δεδομένα προηγουμένως που δημοσιεύθηκε από την ομάδα μας [18].

Protein, mRNA και DNA καθαρισμό

η συνολική πρωτεΐνη, mRNA, και ϋΝΑ ταυτόχρονα απομονώθηκαν από δείγματα γαστρικού ιστού χρησιμοποιώντας το AllPrep DNA /RNA /Protein Kit ( Qiagen, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το σφαιρίδιο πρωτεΐνη διαλύθηκε σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 1% Κοκτέιλ Αναστολέα Πρωτεάσης (Sigma-Aldrich, USA), και 0,5% κάθε Cocktail Φωσφατάση Αναστολέας 1 και 2 (Sigma -Aldrich, USA), όπως εκτελείται στο παρελθόν από την ομάδα μας [48]. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο του Bradford (Sigma-Aldrich, USA). Η συγκέντρωση του RNA και η ποιότητα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop (Kisker, Germany) και πηκτές 1% αγαρόζης, αντίστοιχα. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

Protein ανοσοαντιδραστικότητα ανάλυση

τομές ιστών όγκου (3 ή 4-mm πάχος) αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης. Μετά ανάκτηση επιτόπιου θερμότητα επαγόμενη, οι τομές ιστών επωάστηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα πρωτογενή ποντικού έναντι SRC (αραίωση 1: 400? Κλώνος 28, Life Technologies, USA), LYN (αραίωση 1: 400? Κλώνος C13F9? Life Technologies, USA) ή CKB (αραίωση 1: 250? HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA). Μια καθολική κιτ δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (LSAB System, DakoCytomation, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση. Χρησιμοποιήσαμε 3,30-διαμινο-βενζιδίνη /H

2O

2 (DakoCytomation, Δανία) ως χρωμογόνο και αιματοξυλίνη ως επίχρωση. Μια πρωτεΐνη ανοσοαντιδραστικότητα-θετικό δείγμα ορίστηκε ως μία που έχει 10% ή περισσότερο νεοπλασματικών κυττάρων που ήταν θετικά για την πρωτεΐνη.

ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης ανάλυση

κηλίδος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως από την ομάδα μας [49]. Μειωμένη πρωτεΐνη (25 μg) από κάθε δείγμα διαχωρίζεται κατά 12,5% ομοιογενής SDS-PAGE και ηλεκτρο-στυπώθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Hybond-P, GE Healthcare, USA). Η μεμβράνη PVDF μπλοκαρίστηκε με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο που περιέχει 0.1% Tween 20, και 5% άπαχο γάλα και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα αντίστοιχα πρωτογενή αντισώματα: αντι-SRC (αραίωση 1: 1000? Κλώνος 28, Life Technologies, USA), αντι-LYN (αραίωση 1: 1000? κλώνος C13F9? Τεχνολογίες ζωής, USA), αντι-CKB (αραίωση 1: 400? HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA), και αντι-ACTB (αραίωση 1: 250? Ac -15, Life Technologies, USA). Μετά από εκτεταμένη πλύση, ένα δεύτερο αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση προστέθηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο κηλίδωση Western λουμινόλη, και οι εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό σύστημα εικόνας ImageQuant 350 (GE Healthcare, Σουηδία). ACTB χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας αναφοράς φόρτωσης.

έκφραση του mRNA ανάλυση

Κατ ‘αρχάς, το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το υψηλής χωρητικότητας σετ cDNA Αρχείο σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Life Technologies, USA) . Συμπληρωματικό DNA στη συνέχεια ενισχύθηκε με πραγματικού χρόνου αντίστροφης μεταγραφής ποσοτική PCR (RT-qPCR) με χρήση ανιχνευτών TaqMan αγοράζονται ως προσδιορισμοί-on-demand Προϊόντα για γονιδιακή έκφραση (Life Technologies, USA) και ένα γρήγορο Real-Time όργανο PCR 7500 (Life Technologies , ΗΠΑ). Η

GAPDH

γονιδίου επιλέχθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για την είσοδο του RNA και αντίστροφη μεταγραφή απόδοσης. Όλα τα RT-qPCRs διεξήχθησαν εις τριπλούν τόσο για τα γονίδια στόχου (

SRC

: Hs01082246_m1?

LYN

: Hs00176719_m1?

CKB

: Hs00176484_m1) και τον εσωτερικό έλεγχο (

GAPDH

:. NM_002046.3)

Η σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης του γονιδίου υπολογίστηκε σύμφωνα με Livak και Schmittgen [50]. Το αντίστοιχο δείγμα ελέγχου ορίστηκε ως βαθμονομητής από κάθε όγκο.

μεθυλίωσης του DNA ανάλυση

Το μοτίβο μεθυλίωσης και η συχνότητα των γονιδίων κινάσης αξιολογήθηκαν με μεθυλίωση-ειδική PCR (MSP) [51]. Το κιτ EZ μεθυλίωσης του DNA-Lightning ™ (Zymo Research, USA) χρησιμοποιήθηκε για να τροποποιήσετε το gDNA με όξινο θειώδες επεξεργασία, μετατροπή μη μεθυλιωμένες κυτοσίνες σε ουρακίλες και αφήνοντας μετουσιωμένο κυτοσίνες αμετάβλητες. Οι Ειδικοί εκκινητές για τους προαγωγούς γονιδίων που περιγράφονται στον Πίνακα 1.

Η

PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας dNTPs 0,1 μmol /L, 2 mmol /L MgCl

2, 0,5 μmol εκκινητές, 1.25 U Taq DNA πολυμεράση και 100 ng διθειώδες-τροποποιημένο DNA. Μετά την αρχική μετουσίωση για 5 λεπτά στους 94 ° C, 40 κύκλοι στους 94 ° C για 45 s, η θερμοκρασία ανόπτησης (Πίνακας 1) για 45 s και 72 ° C για 30 s διεξήχθησαν, ακολουθούμενη από μία τελική επέκταση επί 5 min στους 72 ° C. Τα προϊόντα PCR φορτώνονται απευθείας σε πήγματα αγαρόζης 3% και ηλεκτροφορήθηκε. Η γέλη χρωματίστηκε με SYBR

® Safe DNA Gel Stain (Life Technologies, USA) και έγινε ορατό άμεσα κάτω από φωτισμό UV. Ως θετικός έλεγχος για όλες τις αντιδράσεις MSP, ένα δείγμα gDNA ήταν εντελώς μεθυλιωμένη χρησιμοποιώντας CpG μεθυλάση (SSSI, New England Biolabs, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Επιπλέον, εκκινητές για την ανίχνευση του άγριου τύπου αλληλουχία χρησιμοποιήθηκαν για την παρακολούθηση της πλήρους μετατροπής του DNA που ελήφθη εις την αντίδραση όξινου θειώδους

Τα δείγματα στρωματοποιημένη ως εξής: α. 1) ένα δείγμα ορίστηκε ως μεθυλιωμένος όταν μια θετική ενίσχυση προϊόν ανιχνεύθηκε μόνο στην PCR με ειδικούς εκκινητές για μη μεθυλιωμένες ακολουθίες? 2) ένα δείγμα ορίστηκε ως υπερμεθυλιωμένο όταν θετική ενίσχυση ανιχνεύθηκε μόνο στην PCR με ειδικούς εκκινητές για μεθυλιωμένο αλληλουχίες? 3) ένα δείγμα ορίστηκε ως μερικώς μεθυλιωμένες όταν θετική ενίσχυση ανιχνεύθηκε στο PCR με τα δύο σύνολα μορίων θεμελίωσης μορίων.

Ειδικότητα Η εκκινητές »και τα αποτελέσματα MSP επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση προσδιορισμού αλληλουχίας διθειώδους PCR (BSP) [52] . BSP χρησιμοποιήθηκε επίσης για την αξιολόγηση του ποσοστού της μεθυλίωσης. Οι εκκινητές και anneling θερμοκρασίες BSP περιγράφονται στον Πίνακα 1. Μετά την ενίσχυση, τα θραύσματα καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το NucleoSpin Gel και PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Γερμανία), συνδέθηκε εντός ρΟΕΜ-Τ Easy (Promega, Γερμανία) και κλωνοποιήθηκε σε αρμόδια

E

.

coli

JM109 κύτταρα. Μετά από χρόνο επώασης, επιλέχθηκαν λευκές αποικίες για PCR με M13 εμπρός (5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ‘) και Μ13 ανάστροφου (5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ εκκινητές) [53]. Μετά την αρχική μετουσίωση επί 3 λεπτά στους 94 ° C, η ενίσχυση PCR αποτελούνταν από 35 κύκλους στους 94 ° C για 30 s, 55 ° C για 30 s, και 72 ° C για 90 s διεξήχθησαν, ακολουθούμενη από μία τελική επέκταση για 5 λεπτά στους 72 ° C. Τα PCR προϊόντα οπτικοποιήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης. Επελέγησαν έξι κλώνοι για καθαρισμό και προσδιορισμό αλληλουχίας σε ένα ΑΒΙ310 αυτόματο sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Όλες οι αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν με BioEdit v7.0.5 [54], και οι αναλύσεις μεθυλίωση διεξήχθησαν με το λογισμικό BIQ Analyzer [55]. Το ποσοστό της μεθυλίωσης για κάθε δείγμα υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό των μεθυλιωμένων CpGs με το συνολικό αριθμό των CpGs αλληλουχία (CpGs σε όλες τις έξι κλώνοι).

Στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα παρουσιάζονται όπως η συχνότητα, μέση και διατεταρτημοριακό εύρος (IQR). Η δοκιμή Shapiro-Wilk χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της κατανομής της ηλικίας, mRNA, έκφραση πρωτεΐνης και το ποσοστό των δεδομένων μεθυλίωσης και να καθοριστεί η κατάλληλη μετέπειτα δοκιμή για στατιστικές συγκρίσεις. Η δοκιμασία Mann-Whitney χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει πιθανές συσχετίσεις μεταξύ mRNA κινάσης ή την έκφραση της πρωτεΐνης και κατηγορικές μεταβλητές, όπως η ανοσολογική αντίδραση, πρότυπο μεθυλίωσης και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Η δοκιμασία Mann-Whitney χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει πιθανές συσχετίσεις μεταξύ του ποσοστού της μεθυλίωσης και η ανοσολογική και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. δοκιμή Wilcoxon χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση του ποσοστού της μεθυλίωσης μεταξύ ζευγών των νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών δειγμάτων. Μια ένωση μεταξύ κατηγορικών μεταβλητών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Chi-τετράγωνο (χ

2) τεστ. Μια δοκιμή συσχέτιση Spearman χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η πιθανή συσχέτιση μεταξύ mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης, όπως επίσης και μεθυλίωση προαγωγού. Μια ρ-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική. Bonferroni προσαρμογή του p-value εφαρμόστηκε όταν έγιναν πολλαπλές συγκρίσεις, με το άλφα επίπεδο που διαιρείται με τον αριθμό των συγκρίσεων.

Αποτελέσματα

έκφρασης κινάσης σε γαστρικών όγκων

μη άτυπα γαστρικά κύτταρα δεν παρουσίασαν SRC ή LYN ανοσολογική αντίδραση (Σχήμα 1Α και 1C). Ωστόσο, SRC ανοσοαντιδραστικότητα παρατηρήθηκε σε δυσπλαστικά κύτταρα. μεμβράνη των κυττάρων και κυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα για SRC και LYN ανιχνεύθηκε σε νεοπλασματικά κύτταρα (Εικόνα 1Β και 1 D), και LYN παρουσίασε επίσης νουκλεϊκά ανοσοαντιδραστικότητα. CKB ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε στο κυτταρόπλασμα ή στην κυτταρική μεμβράνη σε μη νεοπλασματικά γαστρικά κύτταρα (Σχ 1Ε). Σε αντίθεση, τα κύτταρα GC δεν παρουσίασαν CKB ανοσολογική αντίδραση (Σχήμα 1 F)

Α) γαστρικό βλεννογόνο χωρίς SRC ανοσολογική αντίδραση.? Β) διάχυτου τύπου γαστρικό καρκίνο παρουσιάζουν κυτταρική μεμβράνη και κυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα του SRC? Γ) μη-νεοπλασματικές γαστρικό ιστό χωρίς LYN ανοσολογική αντίδραση? D) εντερική τύπου γαστρικό καρκίνο παρουσιάζοντας LYN ανοσολογική αντίδραση? Ε) μη-νεοπλασματικές γαστρικού βλεννογόνου που δείχνει αδύναμη χρώση κυτταροπλασματική CKB σε αδενικά κύτταρα? F) διάχυτου τύπου γαστρικό καρκίνο κύτταρα χωρίς CKB ανοσοαντιδραστικότητα.

Η

SRC, LYN και CKB ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε σε 72 (52,2%), 66 (47,8%) και 0 (0%) του όγκου δείγματα. SRC και LYN ανοσοαντιδραστικότητα σχετίστηκαν με υψηλότερα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης σε δείγματα GC (ρ & lt? 0.001, για όλες τις συγκρίσεις? Mann-Whitney test? Σχήμα 2Α, 2C, 2Ε και 2G). Τα επίπεδα πρωτεΐνης και του mRNA του SRC αυξήθηκαν τουλάχιστον 1,5 φορές (τουλάχιστον 50% αύξηση στην έκφραση) σε 67 (48,6%) και 80 (58%), αντίστοιχα, τα δείγματα GC σε σχέση με συμφωνημένα μη νεοπλασματικών γαστρική τους δείγματα (Σχήμα 2Β, 2D και 2K). Επιπλέον, η πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA του LYN αυξήθηκαν τουλάχιστον 1,5 φορές σε 36 (26,1%) και 72 δείγματα (52,2%) GC, αντίστοιχα (Σχήμα 2F, 2Η και 2K). Αντιστρόφως, προς τα κάτω ρύθμιση πρωτεΐνης CKB και mRNA (τουλάχιστον 50% μείωση της έκφρασης) ανιχνεύθηκε σε 104 (75,4%) και 49 δείγματα (35,5%) GC, αντίστοιχα (Σχ 2I, 2J και 2K). Μια ισχυρή και άμεση συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ του mRNA και της έκφρασης πρωτεϊνών για SRC (p & lt? 0.001, ρ = 0,856, Spearman τεστ συσχέτισης), LYN (p & lt? 0.001, ρ = 0,762) και CKB (p & lt? 0.001, ρ = 0,819)

Α) σύνδεσης μεταξύ SRC ανοσολογική αντίδραση και την έκφραση της πρωτεΐνης του.? Β) έκφραση της πρωτεΐνης SRC? Γ) Σύνδεσης μεταξύ SRC ανοσολογική αντίδραση και την έκφραση του mRNA του? Δ)

SRC

έκφραση του mRNA. Ε) Σύνδεσης μεταξύ LYN ανοσολογική αντίδραση και την έκφραση της πρωτεΐνης του? ΣΤ) LYN έκφραση της πρωτεΐνης? G) Σύνδεσης μεταξύ LYN ανοσολογική αντίδραση και την έκφραση του mRNA του? H)

LYN

mRNA έκφραση? Ι) την έκφραση της πρωτεΐνης CKB? J)

CKB

mRNA έκφραση? K) αντιπροσωπευτική εικόνα της δυτικής κηλίδας, σε κάθε ΤΝΜ κάθε δείγματος είναι show. Πρωτεΐνη και η έκφραση του mRNA προσδιορίστηκαν από τη Western κηλίδας και ανάλυση RT-qPCR, αντίστοιχα. Σε όλες τις γραφικές παραστάσεις, η έκφραση σε γαστρικών όγκων ομαλοποιήθηκε με συμφωνημένα μη νεοπλασματικών γαστρικό ιστό. * Σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων με Mann-Whitney (ρ & lt? 0,05). IHC +: υποθέσεις που παρουσιάζουν πρωτεΐνη ανοσολογική αντίδραση? IHC-: περιπτώσεις χωρίς πρωτεΐνη ανοσολογική αντίδραση? . NM: κανονικό δείγμα βλεννογόνου

Η

Η ανοσολογική αντίδραση του SRC συνδέθηκε με την ανοσολογική αντίδραση του LYN (p & lt? 0.001, χ

2 test), με 52 (37,7%) των δειγμάτων GC παρουσιάζοντας ανοσοαντιδραστικότητα για τις δύο πρωτεΐνες. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μία άμεση συσχέτιση μεταξύ της SRC και της πρωτεΐνης LYN (ρ & lt? 0.001, ρ = 0,556) και του mRNA (ρ & lt? 0.001, ρ = 0.779) έκφραση. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης CKB και έκφρασης του mRNA συσχετίζονταν αντίστροφα με SRC (ρ & lt? 0.001, ρ = -0.734? Ρ & lt? 0.001, ρ = -0.806, αντίστοιχα) και LYN (ρ & lt? 0.001, ρ = -0.643? P & lt?. 0,001, ρ = -0,703, αντίστοιχα)

Ο Πίνακας 2 δείχνει τα αποτελέσματα για την SRC, LYN και έκφραση CKB και τα κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Οι όγκοι των ασθενών με όψιμη έναρξη της GC παρουσιάζονται σημαντικά υψηλότερες SRC και πρωτεΐνη LYN (κατά IHC και κηλίδωση Western) και mRNA (με RT-qPCR) έκφραση, καθώς και μειωμένη πρωτεϊνική έκφραση CKB με κηλίδωση Western, σε σύγκριση με πρώιμη έναρξη CG δείγματα (ρ & lt? 0,05, για όλες τις συγκρίσεις? Πίνακας 2). Αυξημένη πρωτεΐνη και η έκφραση του mRNA του SRC και LYN και μειωμένη έκφραση CKB συνδέθηκαν με προχωρημένο στάδιο, βαθύτερα εισβολή όγκου, και η παρουσία του λεμφαδένα και απομακρυσμένες μεταστάσεις (ρ & lt? 0,05, για όλες τις συγκρίσεις? Πίνακας 2)

Μια σταδιακή σημαντική αύξηση στην πρωτεΐνη SRC (με κηλίδωση Western) και η έκφραση mRNA παρατηρήθηκε που αντιστοιχεί στο στάδιο του όγκου (ρ & lt? 0.008, για τις περισσότερες από τις συγκρίσεις? δοκιμή Mann-Whitney ακολουθούμενη από διόρθωση Bonferroni? σχήμα 3Α και 3Β). Σε αντίθεση, η σταδιακή σημαντική μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης και του mRNA CKB παρατηρήθηκε που αντιστοιχεί στο στάδιο του όγκου (ρ & lt? 0.008, για τις περισσότερες από τις συγκρίσεις? Σχ 3G και 3Η). Όσον αφορά την έκφραση LYN, εμείς δεν παρατηρούμε μια σημαντική διαφορά μεταξύ των σταδίων Ι και II ή μεταξύ των σταδίων III και IV. Ωστόσο, τα στάδια Ι και ΙΙ ήταν σημαντικά διαφορετικό από τα στάδια ΙΙΙ και IV (p & lt? 0.008, για αυτές τις συγκρίσεις? Σχήμα 3D και 3Ε)

Α) έκφραση της πρωτεΐνης SRC.? Β)

SRC

mRNA έκφραση? Γ) Ποσοστό

SRC

μεθυλίωση? Δ) έκφραση της πρωτεΐνης LYN? E)

LYN

mRNA έκφραση? ΣΤ) Ποσοστό

LYN

μεθυλίωση? G) CKB έκφραση της πρωτεΐνης? H)

έκφραση του mRNA CKB

? Ι) Ποσοστό

CKB

μεθυλίωσης. Πρωτεΐνη και η έκφραση του mRNA προσδιορίστηκαν από τη Western κηλίδας και ανάλυση RT-qPCR, αντίστοιχα. Σε αναλύσεις αυτές έκφραση, η έκφραση σε γαστρικό όγκους ομαλοποιήθηκε με συμφωνημένα μη νεοπλασματικών γαστρικό ιστό. Μεθυλίωσης του DNA προσδιορίστηκε με όξινο θειώδες σειράς PCR. * Σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων με τη δοκιμασία Mann-Whitney ακολουθείται από Bonferroni διορθώσεων για την ανάλυση πολλαπλής σύγκρισης (p & lt? 0.008)? ** Σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων με τη δοκιμασία Mann-Whitney ακολουθείται από Bonferroni διορθώσεων για την ανάλυση πολλαπλής σύγκρισης (p & lt? 0.001)?

+ Διαφορά μεταξύ των ομάδων, αλλά όχι στατιστικά σημαντική μετά την προσαρμογή κατά Bonferroni (p & lt? 0,05).

Η

κινάσης γονίδιο μοτίβα μεθυλίωσης στο γαστρικό δείγματα

Ο Πίνακας 3 δείχνει το μοτίβο μεθυλίωσης οι πρωτεϊνικές κινάσες μελετήθηκε σε νεοπλασματικά και μη νεοπλασματικά γαστρικού δείγματα με MSP. Περίπου το 60% και το 30% των δειγμάτων GC παρουσιάζονται θετική ενίσχυση με μόνο το σετ μη μεθυλιωμένο εκκινητή (μεθυλιωμένος δείγματα) για το

SRC

και

LYN

γονίδια, αντίστοιχα (Σχήμα 4Α και 4Β). Υπομεθυλίωση από αυτά τα γονίδια δεν παρατηρήθηκε σε οποιοδήποτε μη νεοπλασματικά δείγμα. Ως εκ τούτου, η συχνότητα του

SRC

και

LYN

υπομεθυλίωση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε GC από ό, τι σε μη νεοπλασματικά γαστρικό δείγματα (p & lt? 0,001 για όλες τις συγκρίσεις? Ακολουθείται χ

2 τεστ από Bonferroni διορθώσεων)

η

Α)

SRC

ανάλυση μεθυλίωσης υποκινητή, στην οποία τα δείγματα 1 και 2 παρουσιάζονται μεθυλιωμένος υποκινητή, δείγμα 3 παρουσιάζεται μερική μεθυλίωση και το δείγμα 4 παρουσιάζεται υπερμεθυλιωμένων υποκινητή.? Β)

LYN

ανάλυση μεθυλίωσης υποκινητή, στην οποία τα δείγματα 1 παρουσιάζονται μεθυλιωμένος υποκινητή, δείγμα 2 παρουσιάζονται μερική μεθυλίωση και τα δείγματα 3 και 4 παρουσιάζονται υπερμεθυλιωμένων υποστηρικτής? C)

CKB

ανάλυση μεθυλίωσης υποκινητή, στην οποία τα δείγματα 1 και 2 παρουσιάζονται υπερμεθυλιωμένων προαγωγό, και τα δείγματα 3 και 4 παρουσιάζονται μεθυλιωμένος υποκινητή. Γ-: κενό? C +: θετικός μάρτυρας, gDNA δείγμα πλήρως μετουσιωμένο? U: PCR με μη μεθυλιωμένα σετ εκκινητών? Μ: PCR με μετουσιωμένο σετ εκκινητών? MW: δείκτης μοριακού βάρους? BP:. ζεύγη βάσεων

Η

Η ανάλυση BSP επιβεβαίωσε την ανάλυση MSP. Με BSP, 82 (59,4%) των νεοπλασματικών δειγμάτων και 0 (0%) των μη νεοπλασματικά δείγματα παρουσίασε κλωνοποιημένη αλληλουχία χωρίς CpG μεθυλίωσης σε

SRC

υποκινητή. Επιπλέον, το 4 (2,89%) και 1 (0,72%) των νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών δειγμάτων παρουσίασε κλωνοποιημένη αλληλουχία χωρίς CpG μεθυλίωσης σε ποσοστό

LYN

υποκινητή, αντίστοιχα. Με BSP, το ποσοστό των

SRC

[0,135 (0,31)

έναντι

0.563 (0,23)? p & lt? 0.001] και

LYN

[0,238 (0,40)

έναντι

0,7063 (0,26)? p & lt? 0.001] μεθυλίωση ήταν χαμηλότερη σε νεοπλασματικά δείγματα από ό, τι σε μη νεοπλασματικά δείγματα (Σχήμα 5Α και 5Β)

Α)

SRC

μεθυλίωση σε γαστρικών όγκων και τα δείγματα μη-όγκου.? Β)

LYN

μεθυλίωση σε γαστρικών όγκων και δείγματα μη-όγκου? Γ)

CKB

μεθυλίωση σε γαστρικών όγκων και δείγματα μη-όγκου? Δ) Η συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού των

SRC

μεθυλίωσης στο γαστρικό όγκους και σε συνδυασμό δείγματα μη-όγκου? Ε) Η συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού των

LYN

μεθυλίωσης στο γαστρικό όγκους και σε συνδυασμό δείγματα μη-όγκου? ΣΤ) Η συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού των

CKB

μεθυλίωσης στο γαστρικό όγκους και σε συνδυασμό δείγματα μη-όγκου. * Σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων με τη δοκιμασία Mann-Whitney (p & lt? 0,05).

Η

Το

SRC

και

LYN

μοτίβα μεθυλίωσης του νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικά δείγματα, ενώ βρέθηκε να σχετίζεται (p & lt? 0.001, και για τις δύο αναλύσεις? χ

2 τεστ). Παρατηρήσαμε ότι οι 70/81 (86,4%) των όγκων με μεθυλιωμένος

SRC

παρουσίασε μερική μεθυλίωση του γονιδίου αυτού στην συμφωνημένα μη-νεοπλασματικές δείγμα. Επιπλέον, βρήκαμε ότι 37/41 (90,24%) των όγκων με μεθυλιωμένος

LYN

παρουσιάζονται μερική μεθυλίωση του γονιδίου αυτού στην συμφωνημένα μη νεοπλασματικά δείγμα.

SRC

και

LYN

μερική μεθυλίωση σε μη νεοπλασματικά δείγματα παρατηρήθηκε συχνότερα σε άτομα που παρουσιάζουν δείγματα όγκων με υπομεθυλίωση αυτού του γονιδίου σε σύγκριση με όγκους με μερική μεθυλίωση (ρ & lt? 0.001, και για τα δύο αναλύσεις) ή υπερμεθυλίωση (p & lt? 0.001, και για τις δύο αναλύσεις). Επιπλέον, μερικώς μεθυλιωμένα

LYN

σε μη νεοπλασματικά δείγματα ήταν επίσης πιο συχνά ανιχνεύονται σε άτομα που παρουσιάζουν δείγματα όγκου με μερική μεθυλίωση του γονιδίου αυτού σε σύγκριση με όγκους με υπερμεθυλίωση (p = 0.004). Με BSP, παρατηρήσαμε επίσης ότι το ποσοστό των

SRC

(p & lt? 0.001, ρ = 0,6902? Σχήμα 5D) και

LYN

(p & lt? 0.001, ρ = 0,739? Σχήμα 5Ε ) μεθυλίωση των νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών δείγματα συσχετίζονται.

CKB

μερική και υπομεθυλίωση παρατηρήθηκε σε τόσο νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών δειγμάτων. Ωστόσο, 48 (39%) των δειγμάτων GC παρουσιάζονται

CKB

υπερμεθυλίωση (Σχήμα 4C), η οποία δεν ανιχνεύουν τα μη νεοπλασματικά δείγματα. Επιπλέον, η συχνότητα του

CKB

-hypermethylated δείγματα ήταν σημαντικά υψηλότερη σε νεοπλασματικά σε σύγκριση με μη νεοπλαστικά γαστρικού δείγματα (ρ & lt? 0.001), και

CKB

μερική μεθυλίωση ήταν επίσης σημαντικά πιο συχνή σε GC σε σχέση με μη νεοπλασματικά δείγματα (ρ & lt? 0.001). Με BSP, το ποσοστό των

CKB

μεθυλίωση ήταν υψηλότερη σε νεοπλασματικά δείγματα από ό, τι σε μη νεοπλασματικά δείγματα [0,511 (0,42)

έναντι

0,133 (0,12)? p & lt? 0.001? Σχήμα 5C]. Κλωνοποιημένες ακολουθίες χωρίς CpG μεθυλίωση ανιχνεύθηκε σε 4 (2,89%) και 0 (0%) των νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών δείγματα, αντίστοιχα.

Ο

CKB

πρότυπο μεθυλίωσης του νεοπλασματικών και μη -neoplastic δείγματα φάνηκε να σχετίζεται (p = 0,014, με χ

2 τεστ). Μια ανάλυση 2×2 χρησιμοποιώντας το χ

2 τεστ αποκάλυψαν ότι τα ζεύγη στα οποία παρουσιάζονταν υπερμεθυλίωση τα δείγματα όγκων

CKB

και τα συμφωνημένα μη νεοπλασματικά δείγματα που παρουσιάζονται υπομεθυλίωση αυτού του γονιδίου ήταν πιο συχνές από ό, τι τα ζεύγη των όγκων με υπερμεθυλίωση και συμφωνημένα μη νεοπλασματικά δείγματα με μερική μεθυλίωση (p = 0,0381), αλλά το εύρημα αυτό δεν ήταν στατιστικά σημαντική, αν εφαρμοζόταν η προσαρμογή κατά Bonferroni (προσαρμοσμένο α = 0.05 /3 = 0,0167). Ωστόσο, με την BSP, παρατηρήσαμε ότι το ποσοστό των

CKB

μεθυλίωση των νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών δείγματα συσχετίζεται αντίστροφα (ρ & lt? 0.001, ρ = -0.375? Σχήμα 5F).

Μια άμεση συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ του

SRC

και

LYN

μοτίβα μεθυλίωσης στα μη νεοπλασματικά δείγματα (p & lt? 0.001, ρ = 0,627). Επιπλέον, μια αντίστροφη συσχέτιση διαπιστώθηκε μεταξύ

SRC

και

CKB

(p & lt? 0.001, ρ = -0,467) και

LYN

και

CKB

(p & lt? 0.001, ρ = -0,359) μεθυλίωση. Ωστόσο, σε δείγματα GC, μια άμεση συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ του ποσοστού μεθυλίωση των τριών μελετήθηκαν κινάσες:

SRC

και

LYN

(ρ & lt? 0.001, ρ = 0.840)?

SRC

και

CKB

(p & lt? 0.001, ρ = 0,684)?

LYN

και

CKB

(p & lt? 0.001, ρ = 0.663).

ρύθμιση μεθυλίωση των κινασών

Για να διευκρινιστεί η επιγενετική ρύθμιση της μελετημένη γονίδια, αξιολογήσαμε την πιθανή συσχέτιση μεταξύ της μεθυλίωσης υποκινητή και την πρωτεΐνη ανοσοαντιδραστικότητα και mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης (από κηλίδωση Western)

Παρατηρήσαμε ότι τόσο η mRNA και πρωτεΐνης έκφραση της SRC (p & lt?. 0,001, ρ = -0.834? ρ & lt? 0.001, ρ = -0.718? αντίστοιχα? Εικ 6Α και 6Β) και LYN (ρ & lt? 0.001, ρ = -0.792? ρ & lt? 0.001, ρ = -0.654? αντίστοιχα? Σχ 6D και 6Ε) ήταν αντιστρόφως συσχετίζεται με το ποσοστό της μεθυλίωσης του υποκινητή. Επιπλέον, οι όγκοι με SRC [0,062 (0,08)

έναντι

0,375 (0,33)? p & lt? 0.001? Mann-Whitney test? p & lt? Li et al.