Αφηρημένο

Παχέος μικροχλωρίδα ζυμώνει μη απορροφάται φυτικές ίνες για να παράγουν τεράστια ποσά των λιπαρών οξέων βραχείας αλύσου (SCFAs) που ωφελούν τον ξενιστή μέσω μια μυριάδα των μεταβολικών, τροφικών, και χημειοπροφυλακτική αποτελέσματα. Οι χημειοπροφυλακτική αποτελέσματα του βουτυρικού SCFA είναι, εν μέρει, με τη μεσολάβηση μέσω επαγωγής της έκφρασης του γονιδίου ρ21. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε το ρόλο του microRNA (miRNA) σε επαγωγή βουτυρικό της έκφρασης p21. Τα προφίλ έκφρασης των miRNAs σε HCT-116 κύτταρα και σε ανθρώπινους σποραδικούς καρκίνους του παχέος εντέρου αξιολογήθηκαν από μικροσυστοιχιών και ποσοτική PCR. Ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης p21 από miR-106b αξιολογήθηκε από 3 ‘UTR δοκιμασίες αναφοράς της λουσιφεράσης και επιμόλυνση των συγκεκριμένων μιμείται miRNA. Το βουτυρικό άλλαξε την έκφραση του 44 miRNAs σε HCT-116 κύτταρα, πολλά από τα οποία εκφράζονται ανώμαλα σε ιστούς καρκίνου του κόλου. Μέλη της οικογένειας miR-106b μειώθηκαν στην πρώην και αυξήθηκε το τελευταίο. έκφραση της πρωτεΐνης p21 βουτυρικό επαγόμενη μετριάστηκε από τη θεραπεία με miR-106b μιμούνται. Μεταλλαγμένα κατασκευάσματα 3’UTR-ρεπόρτερ p21 εκφράζεται σε HCT-116 κύτταρα επιβεβαίωσε την άμεση miR-106b στόχευση. Βουτυρικό μειωμένη HCT-116 πολλαπλασιασμό, δράση αντιστρέφεται με την προσθήκη του miR-106b μιμούνται. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το μικρόβιο που προέρχονται SCFAs ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση ξενιστή που εμπλέκονται στην εντερική ομοιοστασία, καθώς και την καρκινογένεση μέσω της διαφοροποίησης των miRNAs

Παράθεση:. Hu S, Dong TS, Dalal SR, Wu F, Bissonnette Μ, Kwon JH, et al. (2011) του μικροβίου-Προέρχεται μικρής αλυσίδας λιπαρών οξέων βουτυρικό Στόχοι miRNA-Εξαρτημένων p21 Gene Expression στην Ανθρώπινη καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (1): e16221. doi: 10.1371 /journal.pone.0016221

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 23 Αυγούστου 2010? Αποδεκτές: 16 Δεκεμβρίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 20 Ιαν 2011

Copyright: © 2011 Hu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τον microbiome Πρόγραμμα του Ανθρώπινου (DK083993, HG004858), R37 DK47722 (EBC), K08 DK078046 (JHK), το Digestive Disease Research Πυρήνας Κέντρο DK-42086 του Πανεπιστημίου του Σικάγο, και το γαστρεντερικό Ίδρυμα Ερευνών και Μελετών Συνεργάτες «Board (SRD). Οι εκπαιδευόμενοι υποστηρίζονται από μια υποτροφία Βραβείο Έρευνας από την Crohn και Κολίτιδα Ίδρυμα της Αμερικής (SH), Τ35 DK62719 (TSD), και Τ32 DK07074 (SRD). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα περισσότερα ανθρώπινα σποραδικών καρκίνων του παχέος εντέρου αναπτύσσουν σταδιακά, καθώς συσσωρεύονται οι μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση μετατρέψει φυσιολογικό επιθήλιο του κόλου σε αδενοκαρκίνωμα. Αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση μεταξύ γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων, η τελευταία υποστηρίζεται από την επιδημιολογική συσχέτιση μεταξύ της αυξημένης εμφάνισης ορθοκολικού καρκίνου και παράγοντες όπως η αυξημένη μακροβιότητα, την έκθεση σε καρκινογόνους παράγοντες, και οι δίαιτες με υψηλά βιομηχανοποιημένες χώρες [1]. Μεταξύ των προτεινόμενων διατροφικών παραγόντων κινδύνου είναι χαμηλής περιεκτικότητας σε ίνες, οι οποίες μπορεί να μειώσει τη βιοδιαθεσιμότητα των λιπαρών οξέων βραχείας αλυσίδας (SCFAs) που σχηματίζονται από μικροβιακή αναερόβια ζύμωση των φυτικών ινών [2]. Οι SCFAs όπως οξικό, προπιονικό, βουτυρικό και παράγονται σε τεράστια ποσά και είναι τα πιο άφθονα ανιόντα σε κολονικό υγρό αυλού και τα περιττώματα [3]. Αυτά τα μικροβιακά προϊόντα όχι μόνο παρέχουν μια σημαντική πηγή ενέργειας στο επιθήλιο του κόλου, αλλά έχουν επίσης διαδεδομένη τροφικές επιδράσεις που περιλαμβάνουν ρύθμιση των γονιδίων του ξενιστή που εμπλέκονται στη διατήρηση της ομοιόστασης του εντέρου [4].

Σε αδιαφοροποίητο, ιδιαίτερα πολλαπλασιαστικές κακοήθη κύτταρα, βουτυρικό αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την διαφοροποίηση μέσω μιας ποικιλίας μηχανισμών καθώς και οι μεταβολές στο DNA μεθυλίωση, η επιλεκτική αναστολή της φωσφορυλίωσης ιστόνης και απακετυλίωση ιστόνης (HDAC), και ρύθμιση της ενδοκυτταρικής κινάσης σηματοδότησης [5] – [7]. Σε ένα ανθρώπινο κολονικό επιθηλιακή κυτταρική γραμμή (ΗΤ29), ταυτοποιήθηκαν 221 βουτυρικό αποκρίνονται γονίδια που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση και [6]. Μεταξύ των γονιδίων που μεταβάλλονται με επεξεργασία βουτυρικού πολλές εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, όπως το ρ21 εξαρτώμενη από κυκλίνη αναστολέα κινάσης, GADD45A, και ΡΤΕΝ [6].

Υπό κανονικές συνθήκες, ο πολλαπλασιασμός ρυθμίζεται στενά μέσω της δράσης του κυκλίνες, εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών (CDKs), και οι αναστολείς CDK τα οποία ρυθμίζουν τις μεταβάσεις από G1 προς S φάση και G2 σε μίτωση και να ενεργεί ως σημείο ελέγχου για την πρόληψη της αντιγραφής του DNA εάν έχει υποστεί βλάβη [8]. Σε συνάρτηση με τις ενδείξεις υποδεικνύουν βλάβη του DNA, ρ21 και ρ27 συνδέονται με σύμπλοκα κυκλίνης-CDK και προκαλούν αναστολή του κυτταρικού κύκλου [8], [9]. Ωστόσο, στον καρκίνο, αυτό ρυθμιζόμενη διαδικασία της κυτταρικής διαίρεσης και της ανάπτυξης χάνεται. Για παράδειγμα, απώλεια της λειτουργίας του G1 σημείου ελέγχου εξαρτώμενη από κυκλίνη αναστολέα κινάσης ρ21 έχει συνδεθεί με την καρκινογένεση και ρ21 απώλεια παρατηρείται στο 79% των όγκων καρκίνου του παχέος εντέρου με ανοσοϊστοχημεία [10], [11].

βουτυρικό επάγει μεταγραφή του γονιδίου ρ21 μέσω μιας ανεξάρτητης οδού ρ53 που περιλαμβάνουν μη-ανταγωνιστική αναστολή της HDAC [12] – [14]. Ωστόσο, η πιθανότητα ότι μερικές από τις δράσεις βουτυρικού για γονιδιακή έκφραση p21 μπορεί να προκαλείται μέσω μεταφραστικών μηχανισμών miRNA-εξαρτώμενο δεν έχει προηγουμένως εξερευνηθεί. Οι αναστολείς HDAC έχουν πρόσφατα μελετηθεί ως μια νέα ομάδα αντικαρκινικών επιγενετική εργαλεία θεραπείας, και ενός αναστολέα HDAC, σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA), είναι εγκεκριμένη από την FDA για τη θεραπεία της δερματικό λέμφωμα κυττάρων Τ [15]. Επιπλέον, οι αναστολείς HDAC έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση miRNA σε πολλαπλούς τύπους κακοηθειών. Θεραπεία της κυτταρικής γραμμής καρκίνου του μαστού SKBR3 με το υδροξαμικό LAQ824 αναστολέα HDAC οξύ οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στην ~ 40% των εκφράζονται miRNAs του κυττάρου [16]. αγωγή SAHA του ανθρώπινου καρκινώματος πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στην έκφραση των 64 miRNAs [17]. Η επίδραση του αναστολέα HDAC και βουτυρικό μικροβιακό προϊόν έκφρασης miRNA σε ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου δεν έχει διερευνηθεί.

miRNAs είναι ~ 22 νουκλεοτιδίων, μη-κωδικοποιητική RNAs που παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης, και διαφοροποίηση [18]. έχουν μεγαλύτερη από 1000 τα ανθρώπινα miRNAs έχουν προσδιοριστεί, και τα περισσότερα πιστεύεται ότι στοχεύουν εκατοντάδες γονίδια [19]. Δυσλειτουργία της έκφρασης miRNA μπορεί να συμβάλει στην καρκινογένεση αυξάνοντας πρωτο-ογκογονίδιο έκφραση ή προς τα κάτω ρύθμιση καταστολείς όγκων [20]. Για παράδειγμα, miRNAs ρυθμίζουν πολλές βασικές πρωτεΐνες στα μονοπάτια σηματοδότησης του καρκίνου του παχέος εντέρου, π.χ. η οικογένεια miR-106b μειώνει την έκφραση ρ21 και επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [21] – [23]. Μεταξύ των miR-106b προβλέψει στόχους, αποσιώπηση του p21 με siRNA phenocopies πιο στενά miR-106b κέρδος της λειτουργίας [22].

Σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε ότι οι αντικαρκινικές επιδράσεις του μικροβίου που προέρχεται ΕΕΑΥ βουτυρικό μπορεί να διαμεσολαβείται εν μέρει μέσω αλλαγές στην έκφραση των miRNAs. Πραγματοποιήσαμε μελέτες miRNA μικροσυστοιχιών για HCT-116 κύτταρα ανθρώπινου καρκίνου του κόλου σε επεξεργασία με βουτυρικό και βρέθηκαν σημαντικές μεταβολές στα προφίλ miRNA, συμπεριλαμβανομένης μειωμένης έκφρασης του miR-106b οικογένεια. miRNA ανάλυση μικροσυστοιχιών των σποραδικών τύπου καρκίνους ανθρώπινου παχέος εντέρου βρέθηκε αυξημένη έκφραση της οικογένειας miR-106b. Το βουτυρικό βρέθηκε να επάγει την έκφραση ρ21, η οποία συνδέεται με μια σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Η προσθήκη ενός miR-106b μιμούνται ανέστρεψε την αυξημένη έκφραση ρ21 και μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων που προκαλείται από το βουτυρικό. Αυτά τα ευρήματα έχουν αποκαλύψει ένα μοναδικό μηχανισμό μικροβιακής αλληλεπίδραση με γονιδιακή έκφραση ξενιστή που περιλαμβάνει μεταβολές των προφίλ miRNA να συγκρατήσει κύκλου ζωής των κυττάρων και να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Χειρουργική ανθρώπινου παχέος βιοψίες ελήφθησαν από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου στο Πανεπιστήμιο του Ιατρικού Κέντρου του Σικάγο υπό ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο αναθεώρηση Θεσμική. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε πριν από τη συλλογή των δειγμάτων ιστού. Όλες οι κλινικές έρευνες που χρησιμοποιούν ανθρώπινα υποκείμενα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Cell Culture

Ανθρώπινο HCT-116 κύτταρα καρκίνου κόλου αποκτήθηκαν από την ATCC. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε μέσο DMEM υψηλής γλυκόζης (Invitrogen) που περιέχει 10% (ο /ο) βόειο εμβρυϊκό ορό, 50 μg /ml Ε-γλουταμινικού, 50 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 50 U /ml πενικιλίνη. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1-2 mM βουτυρικού για 24 έως 48 ώρες πριν από τη συγκομιδή για κάθε δοκιμασία. Τα κύτταρα ξεπλένονται δύο φορές και αποξέστηκαν σε παγωμένο αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), σφαιροποιήθηκαν (14,000 g χ 20 sec), στη συνέχεια λύθηκαν για RNA και πρωτεΐνη εκχύλισης.

Ανθρώπινο κολονική βιοψίες

Χειρουργική ανθρώπινο κολονικό βιοψίες από καρκινικό ιστό και περιβάλλοντα φυσιολογικό εμφανίζονται βλεννογόνο του κόλου (τουλάχιστον 5 cm μακριά τα σύνορα του όγκου) ελήφθησαν με ένα παχέος χειρούργο. Μετά την απομάκρυνση, βιοψίες τοποθετήθηκαν αμέσως σε πάγο και ξεπλύθηκαν σε παγωμένο PBS πριν στην κυτταρική λύση για την εκχύλιση RNA.

miRNA μικροσυστοιχιών

Ολικό RNA εξήχθη από HCT-116 κύτταρα και ανθρώπινα κολικά δείγματα ιστού χρησιμοποιώντας το mirVana ™ miRNA κιτ απομόνωσης (Ambion) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. HCT-116 κυττάρων miRNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το μικροσυστοιχιών v.11.0 miRCURY LNA ™ (Exiqon) που περιέχει ανιχνευτές σύλληψης που στοχεύουν όλα τα miRNAs για τον άνθρωπο, ποντίκι ή αρουραίος είναι νηολογημένα στην έκδοση miRBase 13 στο Ινστιτούτο Sanger. Όλα τα δείγματα ενώθηκαν για να δημιουργήσουν ένα κοινό σημείο αναφοράς. Ενα μα ολικού RNA από κάθε δείγμα και το συγκεντρωμένο κοινό σημείο αναφοράς σημάνθηκε χρησιμοποιώντας την miRCURY ™ LNA κιτ επισήμανσης Array ισχύος (Exiqon, Δανία). Η Hy3 ™ -επισημασμένο δείγματα και ένα hY5 ™ -επισημασμένο δείγμα RNA αναφοράς αναμείχθηκαν κατά ζεύγη και υβριδοποιήθηκε σε συστοιχίες LNA miRCURY ™. Τα πλακίδια μικροσυστοιχιών σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας την Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies, Inc., USA) και η ανάλυση εικόνας διεξήχθη χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImaGene 8.0 (BioDiscovery, Inc., USA). Οι ποσοτικοί σήματα διορθώθηκαν φόντο (Normexp με offset τιμή 10) και ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την παγκόσμια Lowess (τοπικά σταθμισμένη Scatterplot Smoothing) αλγόριθμο παλινδρόμησης [24]. Τα δεδομένα εκφράζονται ως η κανονικοποιημένη log2 μετασχηματισμένο αναλογία Hy3 /hY5.

Με έναν παρόμοιο τρόπο, τα ανθρώπινα miRNAs κολικού ιστού αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας mirVana miRNA Bioarrays ν.2 (Ambion), το οποίο χρησιμοποιεί την έκδοση 8.0 της αλληλουχίας miRBase βάση δεδομένων. Τα δείγματα σημάνθηκαν με το κιτ επισήμανσης mirVana miRNA και υβριδοποιήθηκε στους bioarrays miRNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συστοιχίες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας το GenePix4000B στο Πανεπιστήμιο του Σικάγο Λειτουργική Γονιδιωματική Διευκόλυνσης Core. Συνολικά 12 προφίλ miRNA παρήχθησαν από 6 ζεύγη δειγμάτων ιστού του κόλου.

Real-time PCR για miRNAs

Το συνολικό RNA εξήχθη από κατακρημνίστηκαν HCT-116 κύτταρα με ΤπζοΙ (Invitrogen, Grand Island , ΝΥ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συμπληρωματικό DNA συντέθηκε από ολικό RNA δείγματα εξάγονται από HCT-116 κύτταρα ή ανθρώπινους ιστούς κόλου χρησιμοποιώντας το nCode ™ miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με ένα iCycler (Bio-Rad) χρησιμοποιώντας το iQSYBR Πράσινη PCR Supermix (Bio-Rad) με miRNA ειδικούς εκκινητές και ένα καθολικό εκκινητή qPCR σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για την nCode Kit (Πίνακας S1). Χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο του ποδηλάτου ποσοτικοποίηση δύο σταδίων (45 κύκλοι των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια 60 ° C για 15 δευτερόλεπτα). Η τιμή Ct ορίζεται ως ο αριθμός κύκλου στον οποίο ο φθορισμός διασχίζει ένα σταθερό κατώφλι πάνω από τη βασική γραμμή. Ένα μικρό πυρηνισκικός RNA, RNU48, μετρήθηκε ως ενδογενή έλεγχο [25]. Για μια σχετική ποσοτικοποίηση, φορές οι αλλαγές μετρήθηκαν με τη μέθοδο της ΔΔCt. Για κάθε δείγμα, η τιμή Ct κάθε miRNA μετρήθηκε και συγκρίθηκε με RNU48 ως ΔΟΙ, (ΔΟΙ = Ct

miRNA – Ct

RNU48). Η πτυχή της αλλαγής του miRNA σε πειραματικά δείγματα σε σχέση με τον έλεγχο των δειγμάτων προσδιορίστηκε από 2

-ΔΔCT, όπου ΔΔCt = ΔCt

Άγνωστη -ΔCt

Ελέγχου [26]

.

Ακίνητα -Ώρα PCR για p21 mRNA

Το συνολικό RNA εξήχθη από κατακρημνίστηκαν HCT-116 κύτταρα με ΤπζοΙ. Συμπληρωματικό DNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας SuperScript III (Invitrogen) και ένα τυχαίο εκκινητή hexonucleotide. Οι εκκινητές με νόημα και αντινόημα για ρ21 (CDKN1A, NM_000389.3) είναι: 5′-TCACTGTCTTGTACCCTTGTGCTT-3 ‘και 5′-AGAAATCTGTCATGCTGGTCTGCC-3′? για GAPDH: 5’-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3 ‘και 5′-AGATGGTGATGGGCTTCCC-3’. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση iCycler Supermix iQSYBR Πράσινη PCR (Bio-Rad). Για κάθε δείγμα, η τιμή Ct του mRNA ρ21 μετρήθηκε και σε σύγκριση με τον ενδογενή έλεγχο GAPDH ως ΔΟΙ, (ΔΟΙ = Ct

p21 – Ct

GAPDH). Το φορές μεταβολής miRNA σε πειραματικά δείγματα σε σχέση με τον έλεγχο δειγμάτων προσδιορίστηκε με 2

-ΔΔCT.

Western Blot

υπό μορφή σφαιριδίων HCT-116 κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε 10 mM Tris, ρΗ 7.4 , 5 mM MgCl

2, πλήρης κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Molecular Biochemicals), 50 U /ml ϋΝΑση (Amersham), και 50 U /ml RNAse (Ambion). Η πρωτεΐνη προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας τη μέθοδο δικιγχονινικού οξέος. Η πρωτεΐνη solubolized σε διάλυμα διακοπής 3Χ Laemmli με θέρμανση στους 65 ° C για 10 λεπτά.

Είκοσι δείγματα πρωτεΐνης μικρογραμμαρίων διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες σε 25 mM Tris, ρΗ 8.8 ? 192 mM γλυκίνη? 15% vol /vol μεθανόλη. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% β /ο άπαχο ξηρό γάλα σε Tween-τρις ρυθμισμένο φυσιολογικό ορό (TTBS). Πρωτογενή αντισώματα, ειδικά για ρ21 (BD Bioscience), Hsc70 (SPA815? Stressgen) και β-ακτίνη (Cell Signaling), προστέθηκαν και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες πλύθηκαν με TTBS, επωάστηκαν με συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερογενή αντισώματα είδη κατάλληλα (Jackson Immunoresearch, West Grove, ΡΑ) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας (SuperSignal? Pierce, Rockford, IL).

η ποσοτικοποίηση των εικόνων έγινε με σάρωση πυκνότητας χρησιμοποιώντας ΝΙΗ Image J 1.54 του λογισμικού (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο WST-1 (Roche Applied Science) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. HCT-116 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων επίπεδου πυθμένα. Μετά την επίτευξη του 50% συρροή, τα φρεάτια υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση βουτυρικού επί 24 ώρες. Οι πλάκες αναγνώστηκαν σε αναγνώστη μικροπλακός στα 450 nm πριν και 45 λεπτά μετά την προσθήκη του αντιδραστηρίου WST-1. Το μήκος κύματος αναφοράς ήταν 650 nm. ρυθμούς πολλαπλασιασμού των κυττάρων υπολογίστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Κυττάρων επιμόλυνση με miRNA

διαμετακόμιση LT1 (Mirus, WI) αντιδραστήριο διαμόλυνσης χρησιμοποιήθηκε για να μορφομετατρέψει HCT-116 κυττάρων με μια γενετικά ΜΙΚ 106b (Ambion προ-mir miRNA πρόδρομα μόρια) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ένας έλεγχος miRNA (MIR-C), με το ίδιο περιεχόμενο σε GC, αλλά όχι ομολογία αλληλουχίας προς miR-106b, χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν για 48 ώρες πριν από την συγκομιδή.

Luciferase Reporter Δοκιμασίες

Τροποποιημένο pGL3 κατασκευάσματα με την ρ21 3’UTR καθοδικά της πυγολαμπίδας αλληλουχίας που κωδικοποιεί λουσιφεράση ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Dr. V. Narry Kim του Τμήματος Βιολογικών Επιστημών, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ [27]. Έξι ώρες μετά την αγωγή βουτυρικό, HCT-116 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με τροποποιημένα κατασκευάσματα pGL3 και πλασμίδια ρΡΙ_-ΤΚ (Renilla λουσιφεράση κατευθύνεται από προαγωγό κινάσης θυμιδίνης, E2241, Promega) χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης TransIT ίΤ-1. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με ανακίνηση σε 500 μΙ ρυθμιστικού λύσης (Promega). Firefly και

Renilla

λουσιφεράσης δραστηριότητες στο προϊόν λύσης προσδιορίστηκε εις τριπλούν με Dual-Luciferase Reporter σύστημα δοκιμασίας, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega). δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly κανονικοποιήθηκε σε

Renilla

δραστικότητα λουσιφεράσης.

Στατιστική Ανάλυση

αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM για τον αναφερόμενο αριθμό των πειραμάτων. Τα αποτελέσματα των πολλαπλών πειραμάτων αναλύθηκαν με t-test σπουδαστή ή ANOVA χρησιμοποιώντας διόρθωση Bonferroni για πολλαπλές συγκρίσεις.

Για τους συστοιχίες miRNA, δύο tailed t-test υπολογίζεται μεταξύ των ομάδων δείγματος και αναφοράς που προσδιορίζονται με ρ miRNAs -τιμές χαμηλότερες από 0.05. Αυτά τα miRNAs στη συνέχεια επιλέγονται για περαιτέρω μελέτη με RT-PCR.

Αποτελέσματα

βουτυρικό μεταβάλλει την έκφραση miRNA στον καρκίνο του παχέος εντέρου HCT-116 ανθρώπινα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των μελών του miR-106b οικογένεια

για να μελετηθούν οι επιδράσεις του βουτυρικού στην έκφραση miRNA σε κολικό καρκινικά κύτταρα, προφίλ έκφρασης των miRNAs σε βουτυρικού επεξεργασμένο HCT-116 κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μια μικροσυστοιχία. Όχημα-επεξεργασμένα κύτταρα HCT-116 αναλύθηκαν ως έλεγχος. Σαράντα τέσσερις miRNAs κατέδειξε σημαντικές αλλαγές στην έκφραση σε απόκριση σε θεραπεία βουτυρικό. Οι αλλαγές στην έκφραση των 13 από τα 26 miRNAs που μειώθηκε και 5 από τα 18 miRNAs ότι η αυξημένη επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου, ποσοτική PCR (Σχήμα S1). Τριάντα-ένα από τα 44 miRNAs με αλλαγές στην έκφραση φαίνονται στον χάρτη θερμότητας στον αριστερό πίνακα του σχήματος 1Α. Πολλά μέλη του miR-17-92a, miR-18b-106a και miR-25-106b συστάδες μειώθηκαν σημαντικά σε απάντηση βουτυρικό.

Α) προφίλ μικροσυστοιχιών miRNA πραγματοποιήθηκαν σε RNA που εξάγεται από HCT- 116 κύτταρα κατεργασμένα με φορέα ή 1 mM βουτυρικό και ανθρώπινους ιστούς κόλου από ασθενείς με σποραδικό καρκίνο του παχέος και παρακείμενο ιστό που φαίνεται φυσιολογικός. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την παγκόσμια αλγόριθμο παλινδρόμησης Lowess και εκφράζεται ως βάση log 2 μετασχηματίζεται αναλογίες του σήματος δείγματος προς το σήμα αναφοράς πισίνα ελέγχου. Οι χάρτες θερμότητας εκπροσωπούνται. Το κόκκινο χρώμα στο χάρτη θερμότητα αντιπροσωπεύει αυξημένη έκφραση σε σύγκριση με την ομαδοποιημένη ελέγχου αναφοράς, και το πράσινο αντιπροσωπεύει μειωμένη έκφραση σε σύγκριση με την ομαδοποιημένη ελέγχου. Αλλαγές στην έκφραση του miR-17 – 106β οικογένεια επιβεβαιώθηκαν με PCR πραγματικού χρόνου στο Β) HCT-116 κύτταρα και C) ανθρώπινων ιστών κόλον. Τα αποτελέσματα είναι μέσα ± SE, η = 4. * υποδηλώνει ρ & lt?. 0,05 για το δείγμα, σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Τα επίπεδα έκφρασης αυτών των miRNAs αξιολογήθηκαν επίσης σε ανθρώπινο σποραδικούς καρκίνους του παχέος εντέρου και περιβάλλοντα φυσιολογικό εμφανίζονται κόλον με μικροσυστοιχία και φαίνονται στο δεξί πίνακα του σχήματος 1Α. Τα miRNAs μειώθηκε το βουτυρικό επεξεργασμένο ΗΟΤ-116 κύτταρα αυξήθηκε δραματικά σε ιστούς όγκων συγκριτικά με φυσιολογικούς ελέγχους. Mirs-17, -20a, -20b, -93, -106a και -106b ήταν όλοι μειώθηκαν σε απόκριση σε θεραπεία βουτυρικό. Αυτά τα miRNAs μοιράζονται την ίδια αλληλουχία περιοχής σπόρων και έτσι στοχεύουν τις ίδιες θέσεις δέσμευσης στο 3’UTRs των mRNAs στόχου. Χρησιμοποιώντας PCR σε πραγματικό χρόνο, επιβεβαιώσαμε ότι το βουτυρικό ρυθμισμένα προς τα κάτω αυτών των miRNAs σε HCT-116 κύτταρα (Εικόνα 1Β). Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι αυτά τα miRNAs ήταν εξαιρετικά υπερ-εκφράζεται σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου (Σχήμα 1 C), υποδηλώνοντας ότι μερικές αντικαρκινικές επιδράσεις του βουτυρικού που προκαλούνται από την καταστολή των miRNAs που ρυθμίζεται προς τα πάνω σε καρκίνο του παχέος εντέρου.

miR -106b αναστέλλει την έκφραση της πρωτεΐνης ρ21 βουτυρικό επαγόμενη

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η 3 ‘UTR του ρ21, η οποία ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, περιέχει δύο θέσεις πρόσδεσης για το miR-17 – 106b αλληλουχία σπόρου (Σχήμα 2Α) και αναστέλλεται από αυτά τα miRNAs σε διάφορους τύπους καρκίνου [επανεξεταστεί 13-15, 22]. Εμείς, ως εκ τούτου, αναλύθηκαν τα αποτελέσματα της βουτυρικού και miR-106b μιμούνται επί του mRNA p21 και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε HCT-116 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β και 2C, βουτυρικό αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης ρ21 τετραπλάσια μετά από 24 ώρες θεραπείας. Ένα εξωγενές miR-106b μιμούνται νοτισμένο έκφραση πρωτεΐνης ρ21 βουτυρικό επαγόμενη σε σύγκριση με κύτταρα επεξεργασμένα με βουτυρικό μόνος ενώ ελέγχει τα μόρια miRNA δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του p21.

Α) Σχηματική κοινών περιοχών σπόρων στην miR-17 – οικογένεια 106β που στοχεύουν στην 3’UTR p21 σε δύο σημεία. HCT-116 κύτταρα κατεργάστηκαν με βουτυρικό (2 mM) ή οχήματος και επιμολύνθηκαν με miR-106b μιμούνται ή ελέγχου miRNA (MIR-C) για 24 ώρες πριν από την συγκομιδή. Β) στυπώματα Western για ρ21, β-ακτίνη και Hsc70 δεικνύεται, και είναι αντιπροσωπευτικά 4 ξεχωριστά πειράματα, όλα με παρόμοια αποτελέσματα. Γ) Αποτελέσματα πυκνομετρία Western blots του p21 ομαλοποιήθηκε ως προς β-ακτίνης. Δ) αφθονία mRNA ρ21 αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Τα αποτελέσματα είναι μέσοι όροι ± SE, η = 4. * υποδηλώνει ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με το βασικό. # Δεικνύει ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Για να προσδιοριστεί η επίδραση του βουτυρικού και miRNAs στην έκφραση των γονιδίων p21, τα επίπεδα mRNA κυτταρικής ρ21 μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR (Σχήμα 2D).. Το βουτυρικό επάγουν μία αύξηση κατά 3,6 φορές σε αφθονία mRNA p21. Σε αντίθεση, το miR-106b μιμούνται δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του mRNA p21.

Το 3’UTR της p21 μεσολαβεί μεταγραφική ρύθμιση από βουτυρικό και miR-106b

Για να διερευνηθεί η επίδραση της ΜΙΚ 106b στη μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης p21, HCT-116 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με τροποποιημένους φορείς ανταποκριτή λουσιφεράσης που περιέχουν είτε την άγριου τύπου ρ21 3’UTR ή ρ21 3’UTRs που περιέχουν μεταλλάξεις σε είτε ένα ή και τα δύο του miR-106b θέσεις δέσμευσης (Σχήμα 3Α). έκφραση λουσιφεράσης Firefly χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση cis ρύθμιση μέσω του p21 3 ‘UTR. Ο φορέας ρΡΙ_-ΤΚ που εκφράζουν λουσιφεράση της Renilla συν-επιμολύνθηκε για τον έλεγχο για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Κάτω από βασικές συνθήκες, μεταλλάξεις στα επιμέρους miR-106b περιοχές στόχους στο 3’UTR ρ21 στα νουκλεοτίδια 468-474 και τα νουκλεοτίδια 1148-1154 οδήγησε σε αύξηση κατά 28% και 26% της δραστικότητας λουσιφεράσης αντιστοίχως (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, οι μεταλλάξεις σε αμφότερες miR-106b περιοχές στόχους οδήγησε σε αύξηση κατά 57% στην δραστικότητα της λουσιφεράσης, υποδηλώνοντας ότι και οι δύο θέσεις πρόσδεσης διαμεσολαβούν miRNA αναστολή της βασικής έκφρασης ρ21 σε καρκινικά κύτταρα.

Α) Σχηματική των κατασκευασμάτων αναφοράς λουσιφεράσης που περιέχουν την ρ21 mRNA 3’UTR, το οποίο περιλαμβάνει δύο θέσεις πρόσδεσης για το miR-17-106b οικογένεια. Μεταλλάξεις που παράγονται σε αυτές τις περιοχές-στόχους miR-106b. ΗΟΤ-116 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς με πυγολαμπίδας φορείς pGL3 λουσιφεράσης που περιέχει την άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη ρ21 3’UTR και ρΡΙ_-ΤΚ Renilla φορέα ελέγχου λουσιφεράσης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με βουτυρικό (2 mM) ή όχημα και miR-106b μιμούνται ή να ελέγξει μόρια miRNA (MIR-C). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για μέτρηση φωταύγειας 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Β) Η βασική έκφραση της λουσιφεράσης των ρεπόρτερ κατασκευάζει με άγριου τύπου ή μεταλλαγμένα 3’ΙΙΤΡ p21. * Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με ρ21 3’UTR C) έκφραση λουσιφεράσης σε κύτταρα μετά βουτυρικού και θεραπεία miRNA. * Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με το μάρτυρα. Τα αποτελέσματα είναι μέσα ± SE, η = 4.

Η

βουτυρικό διεγείρεται δραστικότητα λουσιφεράσης 85% πάνω από τον έλεγχο σε HCT-116 κύτταρα επιμολυσμένα με το λουσιφεράσης που περιέχει ρ21 3 ‘UTR φορέα (Σχήμα 3C). επιδράσεις βουτυρικό για έκφραση λουσιφεράσης αντιστράφηκαν με την προσθήκη εξωγενούς miR-106b μιμείται, αλλά όχι έλεγχο μόρια miRNA (MIR-C). Περαιτέρω, η δραστικότητα λουσιφεράσης των HCT-116 κύτταρα επιμολυσμένα με το χιμαιρικό φορέα που περιέχει και τα δύο μεταλλαγμένα σημεία miR-106b στόχος δεν μετεβλήθη με κατεργασία βουτυρικό ή με βουτυρικό παρουσία εξωγενούς miR-106β.

επίδραση βουτυρικό σχετικά πολλαπλασιασμό των κυττάρων αναστέλλεται από miR-106b

από p21 αναστέλλει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, εξετάσαμε το ρόλο του miR-106b για αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις βουτυρικό του. HCT-116 κύτταρα κατεργάστηκαν με πολλαπλές αραιώσεις του βουτυρικού για 24 ώρες και μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού WST-1 πραγματοποιήθηκε. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Α, με δοσοεξαρτώμενο βουτυρικό ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Οι αντι-πολλαπλασιαστική συγκεντρώσεις βουτυρικού ήταν στο φυσιολογικό εύρος από 0,5 έως 20 mM [28], [29]. Κύτταρα επιμολυσμένα με εξωγενή miR-106b ή ελέγχου για 24 ώρες πριν από την έκθεση 2 mM βουτυρικού αναλύθηκαν επίσης (Σχήμα 4Β). Το βουτυρικό επαγόμενη αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού αντιστράφηκε με την προσθήκη miR-106b μιμούνται μόρια σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Β). Αντιθέτως, το συγκριτικό μόρια miRNA (MIR-C) δεν έδειξε καμία επίδραση στην βουτυρικό επαγόμενη αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

HCT-116 ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετρήθηκε με το κιτ πολλαπλασιασμού WST-1. Α) HCT-116 κύτταρα κατεργάστηκαν με τη δεικνυόμενη συγκέντρωση βουτυρικού ή οχήματος για 24 ώρες πριν την μέτρηση WST-1. * Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τη βασική Β) HCT-116 κύτταρα επιμολύνθηκαν με το miR-106b μιμούνται ή να ελέγχουν miRNA (MIR-C) με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις αμέσως πριν από την αγωγή με 2 mM βουτυρικού. Κύτταρα κατεργασμένα μόνο με βουτυρικό αναλύθηκαν ως έλεγχος. * Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με το βουτυρικό μόνο. Τα αποτελέσματα είναι μέσα ± SE, η = 5.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε εντοπίσει, για πρώτη φορά, ένα σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο ανάπτυξης για παχέος επιθηλιακών miRNAs στη μεσολάβηση του αποτελέσματα του βουτυρικού λιπαρού οξέος βραχείας αλυσίδας μικρόβιο προερχόμενο στη γονιδιακή έκφραση ξενιστή. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε HCT-116 κύτταρα, βουτυρικό καταστέλλονται πολλά από τα ίδια miRNAs αυξήθηκε σε ανθρώπινους καρκίνους του παχέος εντέρου. Ένα από αυτά τα miRNAs, miR-106b, βρέθηκε να στοχεύσει ρ21. Βουτυρικό και miR-106b θεραπεία ενός κατασκευάσματος ανταποκριτή λουσιφεράσης p21 3’UTR σε κύτταρα HCT116 υποδεικνύει ότι το βουτυρικό διεγείρεται έκφραση ρ21 μεταφραστικά αναστέλλεται εν μέρει από miR-106b. Αυτή η μερική αναστολή από miR-106b επιβεβαιώνει προηγούμενες αναφορές ότι το βουτυρικό ρυθμίζει επίσης την έκφραση του p21 μέσω ενός ανεξάρτητου μηχανισμού miRNA, μέσω της αναστολής της HDAC [7], [13], [14]. Προτείνουμε ότι το βουτυρικό μικροβιακό προϊόν ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο τόσο μέσω επιγενετικών και μεταφραστική ρύθμιση μέσω του διπλού ρόλου της ως αναστολέας της HDAC και αναστολέας του miR-106b έκφρασης (Σχήμα 5).

Το βουτυρικό αναστέλλει deactylases ιστόνης (HDAC) , επιτρέποντας την αυξημένη ακετυλίωση των ιστονών, μειώθηκε υψηλότερο αναδίπλωση προκειμένου χρωματίνης, και την αύξηση της μεταγραφής του p21. Το βουτυρικό μειώνει επίσης την έκφραση του miR-106b, και διάφορα άλλα miRNAs με την ίδια περιοχή αλληλουχίας σπόρων. Η οικογένεια miR-106b αναστέλλει τη μετάφραση p21, και ως εκ τούτου μειωμένη έκφραση του miR-106b της οικογένειας οδηγεί σε αυξημένη μετάφραση p21.

Η

Τα αποτελέσματα αυτά έχουν σημαντικές συνέπειες για την εντερική ομοιοστασία και καρκινογένεση. Αυτά τα δεδομένα θα προτείνουν ότι αυτά τα miRNAs παίζουν ρόλο στην καρκινογένεση του κόλου και ότι η μείωσή τους από το βουτυρικό είναι ένας σημαντικός μηχανισμός της αντικαρκινικές επιδράσεις του. Έξι από αυτά τα miRNAs βρίσκονται στην ίδια οικογένεια miRNA (miR-17, miR-20a, miR-20b, miR-93, miR-106a και miR-106β), μοιράζονται την ίδια ακολουθία σπόρων, και έτσι στοχεύουν τις ίδιες θέσεις πρόσδεσης στα 3’UTRs των mRNA στόχου. Ως εκ τούτου, η καταστολή των γονιδίων στόχων τους κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης διαδικασία μπορεί να αντιπροσωπεύουν ένα διαμορφωμένο κυτταρική απόκριση για την προώθηση του πολλαπλασιασμού και /ή συντήρηση του αδιαφοροποίητη κατάσταση κύτταρο.

Επειδή πολλά miRNAs βρίσκονται επίσης σε ιντρονικές περιοχές γονιδίων που κωδικοποιούν, η ανταπόκριση miRNA είναι πιθανό να συντονίζονται με transciptionally ενεργοποιούνται γονίδια που συμβάλλουν στη συνολική διαδικασία της καρκινογένεσης. Ως ένα παράδειγμα σχετικό με τα ευρήματά μας, το miR-106b-25 πολυκιστρόνης βρίσκεται εντός ιντρονίου 13 του γονιδίου MCM7 στο χρωμόσωμα 7q22.1 [23]. MCM7 (πρωτεΐνη συντήρηση μικροχρωμόσωμα 7) ρυθμίζει την αντιγραφή του DNA κατά τη διάρκεια της φάσης S. Σε αδρανή κύτταρα, τα ανθρώπινα επίπεδα MCM7 mRNA είναι σχεδόν μη ανιχνεύσιμα, αλλά η έκφρασή του επάγεται καθώς τα κύτταρα εισέρχονται στον κυτταρικό κύκλο. Ο υποκινητής MCM7 έχει τρεις E2F περιοχές, τρία κουτιά GC, και ένα κουτί Ε [30]. Σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), η έκφραση του miR-106b πρόδρομος συσχετίζεται έντονα με την έκφραση MCM7, υποδεικνύοντας ότι το miR-106b-25 πολυκιστρόνης είναι συντονισμένη μεταγράφεται υπό την επίδραση του προαγωγού MCM7. Υψηλά επίπεδα έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα E2F1 σε HCC σχετίζεται επίσης με αυξημένη miR-106b έκφραση [31]. Σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα, E2F1 φαίνεται επίσης να ρυθμίζει miR-106b-25 έκφραση παράλληλα με αυξήσεις στην έκφραση MCM7 [32]. Σε ινοβλάστες ποντικού που μετασχηματίζονται με τα ογκογονίδια ΕΠΕ και Ras, βουτυρικό μειώνει μεταγραφές E2F1 και πρωτεΐνη καθώς και την ενεργοποίηση προαγωγέα [33]. Έτσι, βουτυρικό μπορεί να ασκήσει την επίδρασή της στην miR-106b έκφραση μέσω μειωμένη έκφραση E2F1, αν και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες σε HCT-116 κύτταρα που απαιτούνται για να εξετάσουν αυτό το ενδεχόμενο.

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, απορύθμιση της έκφρασης των miRNAs μπορούν να επηρεάσουν την καρκινογένεση, όταν οι στόχοι miRNA είναι καταστολείς των όγκων ή ογκογονίδια. Ενώ η θεραπεία με miR-106b οδηγεί σε μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης p21, τα επίπεδα mRNA ρ21 δεν αλλάζουν, το οποίο είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές ότι το miR-106b ρυθμίζει p21 μέσω μεταγραφική αναστολή αντί mRNA σταθερότητας [32]. Αν και ρύθμιση miR-106b έκφρασης ρ21 έχει περιγραφεί σε πολλούς κυτταρικούς τύπους, υπάρχει αντικρουόμενα δεδομένα σχετικά με το μηχανισμό αυτής της αλληλεπίδρασης. Σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού και τους φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα, miR-106b μείωσε την mRNA p21 κατά περίπου 40% [22]. Αντίθετα, σε HCC, έκφραση ρ21 δεν έδειξε συσχέτιση με την έκφραση του συμπλέγματος miR106b-25, και δεν φαίνεται να είναι ένας στόχος αυτών των miRNAs σε αυτόν τον τύπο κυττάρου [31]. Σε μια ανθρώπινη γαστρικού καρκινώματος κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται, miR-106b καταστέλλεται η έκφραση της πρωτεΐνης ρ21, αλλά δεν προκάλεσε σημαντική αλλαγή στα επίπεδα του mRNA p21 [32].

Συνοπτικά, έχουμε ανακαλύψει ένα νέο μηχανισμό δράσης για αντικαρκινικές επιδράσεις βουτυρικό, που σχετίζονται, διαμόρφωση του προφίλ miRNA και έκφραση γονιδίου που εξαρτάται από τη μετάφραση. Ως ένα παράδειγμα, το βουτυρικό επάγει την έκφραση του p21, ένα βασικό ρυθμιστικό μόριο των διακοπή του κυτταρικού κύκλου, καταστέλλοντας μέλη της οικογένειας miR-106b. αναστολή βουτυρικό του miR-106b συνδέεται επίσης με μια σημαντική μείωση των ποσοστών πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Η τελευταία αντιστρέφεται με την προσθήκη μιμείται miR-106b. Τα ευρήματα αυτά έχουν αποκαλύψει ένα μοναδικό παράδειγμα της μικροβιακής ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης υποδοχής που επιβραδύνει την ποδηλασία κυττάρων και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό του παχέος εντέρου καρκινικών κυττάρων.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

βουτυρικό μεταβάλλει σημαντικά την έκφραση του σαράντα τέσσερις miRNAs σε HCT-116 κύτταρα. HCT-116 κύτταρα κατεργάστηκαν με 1 mM βουτυρικό για 24 ώρες. Απομονωμένα ολικού RNA υποβλήθηκε σε υβριδισμό συστοιχίας miRNA. Σαράντα τέσσερις miRNAs κατέδειξε σημαντικές αλλαγές στην έκφραση σε απόκριση σε θεραπεία βουτυρικό. δεδομένα μικροσυστοιχιών ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο ολικής παλινδρόμησης Lowess και εκφράζεται ως βάση log 2 μετασχηματίζεται αναλογίες του σήματος δείγματος προς το σήμα αναφοράς πισίνα ελέγχου. Οι αλλαγές στην έκφραση των miRNAs επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο, ποσοτική PCR για 13 από τις 26 miRNAs που μειώθηκε και 5 από τα 18 miRNA s που αυξάνεται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016221.s001

( TIF)

πίνακα S1.