Αφηρημένο

Ιστορικό

μεταγραφικών παραγόντων ETS ρυθμίζουν σημαντικά μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση και την ανάπτυξη των κυττάρων σε πολλούς ιστούς και έχουν αναδειχθεί ως σημαντικοί παράγοντες στον καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, η βιολογική επίδραση των παραγόντων ETS στην ογκογένεση του προστάτη είναι ακόμη υπό συζήτηση.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση της γονιδιακής οικογένειας ETS, χρησιμοποιώντας δεδομένα μικροσυστοιχιών και σε πραγματικό χρόνο PCR σε κανονική και τους ιστούς του όγκου μαζί με λειτουργικές μελέτες σε κανονικές και καρκινικές κυτταρικές σειρές για να κατανοήσουν τις επιπτώσεις στην ογκογένεση του προστάτη και να προσδιορίσει βασικούς στόχους αυτών των παραγόντων μεταγραφής. Βρήκαμε συχνή απορύθμιση των γονιδίων ETS με ογκογόνο (δηλαδή, ERG και ESE1) και καταστολέα όγκου (δηλαδή, ESE3) ιδιότητες σε όγκους του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικό προστάτη. υποομάδες του όγκου (δηλαδή, ERG

υψηλή, ESE1

υψηλή, ESE3

χαμηλή και NoETS όγκοι) προσδιορίστηκαν βάσει της κατάστασης έκφρασης ETS τους και έδειξε διακριτή μεταγραφική και βιολογικά χαρακτηριστικά. ERG

υψηλή και ESE3

χαμηλή όγκοι είχαν τις πιο ισχυρές υπογραφές γονίδιο με δύο διακριτές και επικαλυπτόμενες λειτουργίες. Ενσωμάτωση γονιδιωματικών δεδομένων με λειτουργικές μελέτες σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές, αποδείξαμε ότι ERG και ESE3 ελέγχονται σε αντίθετη κατεύθυνση μεταγραφής της πρωτεΐνης ομάδας Polycomb ΕΖΗ2, ένα βασικό γονίδιο σε ανάπτυξη, διαφοροποίηση, στέλεχος κυτταρικής βιολογίας και ογκογένεση. Δείξαμε επίσης ότι το ειδικό προστατικό ογκοκατασταλτικό γονίδιο Nkx3.1 ελεγχόταν από ERG και ESE3 τόσο άμεσα όσο και μέσω της επαγωγής της ΕΖΗ2.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτά τα ευρήματα παρέχουν νέες γνώσεις για την ρόλος του δικτύου μεταγραφική ETS στην ογκογένεση του προστάτη και να αποκαλύψει προηγουμένως μη αναγνωρισμένη δεσμών μεταξύ ανώμαλη έκφραση των παραγόντων ETS, η απορρύθμιση των επιγενετικών τελεστές και αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Η σύνδεση μεταξύ ανώμαλης δραστηριότητας ETS και επιγενετικές γονιδιακή σίγηση μπορεί να είναι σχετική για την κλινική διαχείριση του καρκίνου του προστάτη και το σχεδιασμό νέων θεραπευτικών στρατηγικών

Παράθεση:. Kunderfranco P, Mello-Grand M, Cangemi R, Πελλήνη S, Mensah Α, Albertini V, et al. (2010) ETS μεταγραφικοί παράγοντες ελέγχουν τη μεταγραφή του ΕΖΗ2 και Επιγενετική αποσιώπηση του γονιδίου καταστολής όγκου Nkx3.1 στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 5 (5): e10547. doi: 10.1371 /journal.pone.0010547

Συντάκτης: Τσαντ Creighton, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Νοέμβρη του 2009? Αποδεκτές: 12 του Απριλίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: May 10, 2010

Copyright: © 2010 Kunderfranco et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Oncosuisse (OCS-01913-08), ελβετικό Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (FNS-31003A-118113) και Ticino Ίδρυμα για την Έρευνα του Καρκίνου στο GMC. MGM και CG υποστηρίχθηκαν από την Compagnia di San Paolo, Τορίνο, Ιταλία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου και η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις δυτικές χώρες [1]. Ο καρκίνος του προστάτη έχει μια εξαιρετικά ετερογενής κλινική συμπεριφορά και λίγα είναι γνωστά για τους μοριακούς μηχανισμούς που συμβάλλουν σε αυτή την ετερογένεια [1]. Πρόσφατα, οι παράγοντες μεταγραφής ETS έχουν αναδειχθεί ως σημαντικά στοιχεία στην ογκογένεση του προστάτη που οφείλεται στη διαπίστωση των επαναλαμβανόμενων μετατοπίσεων που αφορούν ETS γονιδίων, η πιο συχνή είναι η TMPRSS2: σύντηξη γονιδίου erga που οδηγεί σε υπερέκφραση του πλήρους μήκους ERG [2], [3] , [4]. Ωστόσο, η βιολογική επίδραση των γονιδίων μετατοπίζεται ETS συζητείται ακόμα. Πρόσφατες αναφορές προτείνουν ότι ERG υπερ-έκφραση δεν είναι επαρκής για να επάγει νεοπλασματικό μετασχηματισμό και συνεργασία με άλλους ογκογόνο οδούς, όπως η απώλεια ΡΤΕΝ και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ απορύθμιση, είναι αναγκαία [5], [6], [7], [8], [9]. Η οικογένεια του ανθρώπου ETS περιλαμβάνει 27 μέλη που μοιράζονται μια εξαιρετικά διατηρημένη περιοχή δέσμευσης του DNA και είναι κομβικά σημεία των διαφόρων οδών σηματοδότησης που ελέγχει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση και την επιβίωση [10]. Παρά το γεγονός ότι υπάρχουν μεγάλες δυνατότητες για την επικάλυψη, ατομικούς παράγοντες ETS έχουν διακριτά χαρακτηριστικά που εκδηλώνονται μέσα από θετική και αρνητική ρύθμιση των διαφορετικών υποσυνόλων των γονιδίων και των βιολογικών διεργασιών [10]. Επιπλέον, σε πολλούς ιστούς ETS παράγοντες συνιστούν σύνθετων ρυθμιστικών δικτύων με ειδικές κυτταρικές αποκρίσεις ανάλογα με την ισορροπία μεταξύ παραγόντων με παρόμοιες ή αντίθετες λειτουργίες [10]. Πιο ETS παράγοντες, όπως αυτές που μεταφέρονται σε καρκίνο του προστάτη, την προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την επιβίωση και την μετατροπή, ενώ άλλοι δρουν ως καταστολείς όγκων [10]. Πρόσφατα, βρέθηκε ότι η επιθηλιακή-ειδικό παράγοντα ETS ESE3 ήταν συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνο του προστάτη, που επηρεάζονται αρνητικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση, και λειτούργησε ως καταστολέα όγκου σε επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη [11]. Έτσι, για να κατανοήσει τη συνολική επίδραση των γονιδίων απορρύθμισης ETS στην ογκογένεση και να προσδιορίσει βασικούς στόχους της απελευθερωμένης παράγοντες ETS, θα ήταν σημαντικό να εξετάσει το σύνολο των γονιδίων ETS εκφράζονται σε ένα συγκεκριμένο ιστό.

Σε αυτή τη μελέτη, μέσα από μια ολοκληρωμένη ανάλυση της γονιδιακής οικογένειας ETS σε προστάτη φυσιολογικών και καρκινικών ιστών, εντοπίσαμε υποομάδες όγκου με διακριτά πρότυπα έκφρασης ETS. Εκτός ήδη γνωστών στόχων ETS, ανακαλύψαμε προηγουμένως μη αναγνωρισμένα γονίδια και τα μονοπάτια που συνδέονται με την ανώμαλη δραστικότητα ETS. Με την ενσωμάτωση γονιδιωματικών δεδομένων με λειτουργικές μελέτες, διαπιστώσαμε ότι η Polycomb Group (PCG) πρωτεΐνη ΕΖΗ2 είναι ένας άμεσος στόχος της ERG και ESE3, και ένας παίκτης-κλειδί στην μεταγραφική αποσιώπηση του ειδικού προστατικού γονίδιο Nkx3.1 ογκοκατασταλτικό. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν πιο συχνές και πολύπλοκες μεταβολές των γονιδίων ETS από ότι προηγουμένως αναγνωριστεί και να προσδιορίσει βασικά γονίδια, όπως ΕΖΗ2 και Nkx3.1 συμβάλλοντας στην επαναπρογραμματισμό μεταγραφικό επιθηλιακό κύτταρο του προστάτη σε απόκριση σε παρεκκλίνουσα έκφραση ογκογόνων και όγκου παράγοντες καταστολής ETS. Τα ευρήματα αυτά μπορεί να έχουν σημασία για την κλινική διαχείριση για τον καρκίνο του προστάτη και το σχεδιασμό νέων θεραπευτικών στρατηγικών.

Αποτελέσματα

ETS Gene πρότυπα έκφρασης Ορισμός του προστάτη υποομάδες του καρκίνου

Για να αποκτήσουν μια ολοκληρωμένη όψη του δικτύου ETS μεταγραφική στον καρκίνο του προστάτη, εξετάσαμε την έκφραση της οικογένειας γονιδίων ETS σε μικροσυστοιχιών σύνολα δεδομένων από πρωτοπαθή καρκίνο του προστάτη (

n = 59

) και φυσιολογικό προστάτη (

n = 14

) κλινικά δείγματα. Η ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών έδειξαν ότι αρκετά γονίδια ETS εκφράστηκαν διαφορικά σε δείγματα όγκων συγκριτικά με φυσιολογικό προστάτη. Ποσοτική RT-PCR (QRT-PCR) χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί η διαφορική έκφραση των συχνότερα μεταβάλλονται παράγοντες ETS (Εικ. S1). Οι περισσότεροι επηρεάζονται σημαντικά γονίδια ETS ήταν ERG, ESE3 και το επιθηλιακό ειδικά ETS παράγοντα-1 (ESE1 /ELF3 /ESX). Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι ESE3, ότι εκφράζεται σε φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα, επηρέασε αρνητικά τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη και πρότεινε ότι ενήργησε ως καταστολέας όγκου [11]. ESE1, η οποία συνδέεται στενά με ESE3, εκφράζεται σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα διαφόρων οργάνων, συμπεριλαμβανομένων του προστάτη, του μαστού και των πνευμόνων και είναι γνωστό ότι δρα ως ένα ογκογονίδιο όταν υπερ-εκφράζονται σε επιθηλιακά κύτταρα του μαστού [12], [13]. Ωστόσο, πάνω ρύθμιση ESE1 σε όγκους του προστάτη δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως. Συνολικά, απορυθμισμένη έκφραση των γονιδίων ΣΕΔΕ ήταν πολύ συχνή σε όγκους του προστάτη. Πράγματι, οι περισσότεροι από τους όγκους είχαν τουλάχιστον ένα άνω ή κάτω ρυθμίζονται γονίδιο ETS σε σύγκριση με το φυσιολογικό προστάτη και συχνά επηρεάστηκαν ταυτόχρονα πολλαπλές ETS.

Ο στόχος μας ήταν να κατανοήσουμε πώς αυτά τα ατομικά και επιδεινώνεται μεταβολές ETS θα μπορούσε να επηρεάσει η βιολογία του καρκίνου του προστάτη. Χρησιμοποιώντας στοιχεία QRT-PCR για την έκφραση του γονιδίου ETS και γονιδιακά δεδομένα θα αξιολογηθεί κατά πόσον συγκεκριμένο μεταγραφικό προφίλ συνδέθηκαν με τα διαφορετικά πρότυπα έκφρασης ETS. Χρησιμοποιήσαμε διάφορα κριτήρια για την ελαχιστοποίηση των πιθανών σύγχυση συνέπειες της παρουσίας πολλαπλών παραγόντων ETS. Πρώτον, τα δεδομένα QRT-PCR χρησιμοποιήθηκαν για να ταξινομήσει με ακρίβεια τους όγκους, σύμφωνα με το καθεστώς της γονιδιακής έκφρασης ETS τους. Στη συνέχεια, οι όγκοι μόνο με πολύ υψηλή ή πολύ χαμηλή έκφραση ενός δεδομένου ETS (δηλαδή, ≥4 φορές υψηλότερη ή χαμηλότερη από τη μέση τιμή σε φυσιολογικό προστάτη) έχουν ανατεθεί σε μια ομάδα και περιλαμβάνονται στην ανάλυση. Χρησιμοποιώντας αυτά τα κριτήρια περίπου το 80% των καρκίνων του προστάτη είχαν υψηλά απορυθμισμένη έκφραση ενός τουλάχιστον κυρίαρχο γονίδιο ETS. Σε αυτές τις βάσεις, εντοπίσαμε τρεις μεγάλες υποομάδες του όγκου που χαρακτηρίζεται από την κυρίαρχη απορύθμιση ενός παράγοντα ETS: i) όγκους με υψηλή έκφραση ERG (ERG

υψηλή,

n = 14

), ii) όγκους με υψηλά ESE-1 έκφρασης (ESE1

υψηλή,

n = 12

) και iii) όγκους με χαμηλή έκφραση ESE3 (ESE3

χαμηλή,

n = 13

). Μια τέταρτη ομάδα (NoETS,

n = 14

) περιλαμβάνονται όγκοι που είχαν φυσιολογικά-σαν επίπεδα όλων των ETS γονιδίου (Σχ. 1Α). Οκτώ όγκων με ≥4 φορές υπερ-έκφραση είτε της ETV1, ETV4, ETS2 ή ETS1 εξαιρέθηκαν από την ανάλυση λόγω του περιορισμένου αριθμού τους. ESE1 ήταν εντόνως εκφρασμένα σε 26 από τα 59 (44%) όγκους του προστάτη, αλλά μόνο σε 12, οι οποίες περιλαμβάνονται στην ESE1

υψηλής έκφρασης ομάδα, ήταν η μόνη υπερεκφράζεται ETS. ESE3 ήταν κάτω-ρυθμίζονται ≥4 φορές σε 27 από τα 59 (46%) των όγκων του προστάτη, αλλά μόνο στις 13 περιπτώσεις, οι οποίες περιλαμβάνονται στην ESE3

χαμηλή ομάδα που εκφράζουν, ήταν η μόνη απελευθερωμένη ETS. Έχουμε εφαρμόσει μια παρόμοια προσέγγιση των διαθέσιμων στο κοινό σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών από μια ανεξάρτητη μελέτη [14] απόκτηση παρόμοια κατανομή των όγκων του προστάτη σε τέσσερις κύριες υποομάδες (Εικ. S2). Είναι ενδιαφέρον ότι, στη σειρά μας 6 και 8 των υψηλών όγκων 14 ERG

είχε ταυτόχρονα απορρυθμισμένης έκφρασης ESE3 και ESE1, αντίστοιχα (Εικ. 1Α). Ομοίως στο δημόσιο σύνολο δεδομένων τα 15 ERG

υψηλή όγκοι είχαν ταυτόχρονα δυσρυθμισμένη έκφραση ESE3 και ESE1 (Εικ. S2A). Έτσι, ERG υπερ-έκφραση μπορεί να συνυπάρχει με σαφήνεια με την απορυθμισμένη έκφραση αυτών των άλλων παραγόντων ETS. Στη σειρά των όγκων μας, 11 από τις υψηλές όγκων 14 ERG

(79%) ήταν θετικά για την TMPRSS2: απομαγνητοφώνηση σύντηξης ΕΡΓΑ αξιολογηθεί μέχρι το τέλος του σημείου RT-PCR (Εικ S3A.). Τα άλλα ERG υπερεκφράζουν όγκοι είχαν πιθανόν άλλους τύπους μεταγραφές σύντηξης δεν ανιχνεύθηκε με την δοκιμασία. Επτά όγκοι είχαν πολύ χαμηλά επίπεδα του TMPRSS2: ΕΡΓΑ μεταγραφή μέχρι το τέλος του σημείου RT-PCR, κανονική-σαν έκφραση της ERG με QRT-PCR και δεν συμπεριλήφθηκαν στην ομάδα του υψηλού ERG

. Κανένα από τα 8 κανονικά δείγματα και από τα 11 της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη δείγματα (ΚΥΠ) που εξετάστηκαν είχαν ενδείξεις του TMPRSS2: ΕΡΓΑ μεταγραφή (Εικ. S3A). Τα κλινικά και παθολογικά παραμέτρων των τεσσάρων υποομάδων του όγκου που φαίνεται στο Σχ. S3b. Δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των υποομάδων ETS και οποιοδήποτε από τα αξιολογούνται κλινικά /παθολογικών παραμέτρων.

Α. Έκφραση της ERG, ESE1 και ESE3 καθορίζεται από qRT-PCR σε φυσιολογικό προστάτη και του προστάτη όγκων. Οι όγκοι ομαδοποιούνται ανάλογα με το κυρίως εκφράζεται παράγοντα ETS. Β ανάλυση κύριων συστατικών. Τελείες αντιπροσωπεύουν μεμονωμένα δείγματα με τη θέση τους προσδιορίζεται από τα κύρια συστατικά του μεταγραφικό. C. Αριθμός των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων με Q≤0.1 σε κάθε υποομάδα ETS. D-E. Venn διαγράμματα που δείχνουν από κοινού και διακριτή διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ των υποδεικνύεται υποομάδες του όγκου.

Η

Η μεταγραφική Προγράμματα στον προστάτη υποομάδες Καρκίνο

Χρησιμοποιήσαμε Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA) για την αξιολόγηση της παγκόσμιας βαθμό ομοιότητα ή απόκλιση των επιμέρους transcriptomes των φυσιολογικών και προστάτη δείγματα καρκίνου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, οι όγκοι που ανήκουν σε διάφορες υποομάδες που σχηματίζονται εν μέρει διακριτές συστάδες που υποδηλώνει ότι η απόκλιση μεταξύ των μεταγραφικών προγραμμάτων εξαρτάται τουλάχιστον εν μέρει από τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης ETS τους. ERG

υψηλή και ESE3

χαμηλή όγκοι ήταν το πιο απομακρυσμένο από την κανονική του προστάτη και σε μεγάλο βαθμό διαφορετική από τις άλλες υποομάδες. Στη συνέχεια, συγκρίναμε τις μεταγραφικό προφίλ των υποομάδων όγκου με εκείνη του φυσιολογικού προστάτη με τη χρήση γονιδιακής έκφρασης Σουίτα Προφίλ Ανάλυση (GEPAS) [15] για να εντοπίσουν τα κοινά και διαφορετικά χαρακτηριστικά και να εξαγάγετε ETS-συγκεκριμένες υπογραφές γονίδιο. Ο αριθμός των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (Q≤0.1) σε κάθε υποομάδα παρουσιάζεται στο Σχ. 1C και οι λίστες γονιδίων φαίνονται στον Πίνακα S1. ERG

υψηλή και ESE3

χαμηλή όγκοι είχαν τις πιο ισχυρές υπογραφές γονίδιο με το μεγαλύτερο αριθμό των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε σχέση με το φυσιολογικό προστάτη, ενώ ο αριθμός των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων ήταν σημαντικά μικρότερη σε ESE1

υψηλή και NoETS όγκους .

Στη συνέχεια, περάσαμε τους καταλόγους των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε σχέση με την κανονική του προστάτη για να προσδιοριστεί ο βαθμός επικάλυψης και απόκλισης μεταξύ των υποομάδων των όγκων (Σχ. 1D-E). Αξίζει να σημειωθεί ότι, ERG

υψηλή και ESE3

χαμηλή όγκους μοιράζονται πολλά διαφορικά εκφρασμένα γονίδια με μεγάλη επικάλυψη μεταξύ των δύο up-ρυθμίζονται και υποβαθμίσουν τα ρυθμιζόμενα γονίδια, υποδεικνύοντας ότι αλλοιωμένη έκφραση της ERG και ESE3 είχε εν μέρει παρόμοια αποτελέσματα. Από την άλλη πλευρά, ERG

υψηλή και ESE3

χαμηλή όγκοι είχαν ένα μεγάλο αριθμό ιδιαίτερα χαρακτηριστικά σε σχέση με αριθ ETS (Εικ. 1 D) και (1Ε Εικ.) Όγκοι ESE1

υψηλή. Αυτές οι διαφορές στη σειρά επικάλυψη γονίδιο ήταν στατιστικά σημαντικές (Ρ & lt? 0,0001, ακριβές τεστ Fisher). Τα γονίδια διαμορφωμένο τόσο στην ERG

υψηλή και ESE3

χαμηλή όγκοι, αλλά όχι σε άλλες υποομάδες του όγκου, προσδιορίζονται μέσω 3-way (Σχ. 1D) και 4-τρόπο (Εικ. S4) διαγράμματα Venn, παρατίθενται στον πίνακα S2.

για να κατανοήσουμε τις λειτουργικές επιπτώσεις από τις διαφορές μεταξύ των υποομάδων του όγκου που χρησιμοποιούνται Metacore, μια σουίτα λογισμικού για την ολοκληρωμένη λειτουργική ανάλυση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης [16]. Metacore επιτρέπεται να χαρτογραφήσει κοινή, παρόμοια και μοναδικά χαρακτηριστικά μεταξύ των υποομάδων των όγκων και καθορίζουν συνήθως επηρεάζονται και διαφορετικά μονοπάτια Gene Ontology. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, υπήρχαν πολλά κοινά και παρόμοια χαρακτηριστικά μεταξύ των υποομάδων του όγκου. Από την άλλη πλευρά, ERG

υψηλή και ESE3

χαμηλή όγκοι είχαν το μεγαλύτερο αριθμό από μοναδικά χαρακτηριστικά. Η κορυφή που επηρεάζονται συνήθως χάρτες GeneGo οδού (GGPM), φαίνεται στο Σχ. 2Β, περιλαμβάνεται

ανοσολογική απόκριση, κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση, την ανάπτυξη, τον κυτταρικό κύκλο

και

μεταγραφική ρύθμιση

. Μπορούν να αντιπροσωπεύουν γονίδια και τα μονοπάτια που συνήθως ενεργοποιείται σε όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό. Τα επηρεάζονται διαφορετικά GGPMs ήταν κατά κύριο λόγο ή αποκλειστικά εμπλουτισμένο σε ERG

υψηλή και ESE3

χαμηλή όγκους (Σχ. 2C). Η κορυφή διαφορικά πληγείσα GGMPs περιλαμβάνονται

προσκόλληση κυττάρου-ιντεγκρίνης μεσολάβηση

,

κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση

,

πρόσφυση-ECM κυτταρική ανάπλαση

και

προσκόλληση κυττάρου-χημειοκινών

, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση αυτών των οδών, που σχετίζονται με την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, θα μπορούσε να είναι κυρίαρχο χαρακτηριστικά αυτών των όγκων. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα δεδομένα αυτά εμπλέκονται επίσης ότι η απώλεια ESE3 είχε συνέπειες αρκετά παρόμοια με ERG υπερ-έκφραση στο μεταγραφικό πρόγραμμα των όγκων του προστάτη.

Α. Αριθμό των μοναδικών, παρόμοια και κοινά χαρακτηριστικά μεταξύ των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε σύγκριση με το φυσιολογικό προστάτη σε ERG

υψηλή, ESE3

χαμηλή, ESE1

υψηλή και NoETS όγκους σύμφωνα με Metacore. Β επηρεάζονται συνήθως GeneGo Διαδρομή Χάρτες στις υποομάδες των όγκων. Γ διαφορικά επηρεάζονται GeneGo Διαδρομή Χάρτες στο ERG

υψηλή, ESE3

χαμηλή, ESE1

υψηλή και NoETS όγκων.

Η

ERG απορυθμίζει ΕΖΗ2 έκφραση σε προστάτη όγκοι

Ολοκληρωμένη αξιολόγηση της γονιδιακής έκφρασης ETS και γονιδιακά δεδομένα έδειξαν ισχυρή και μερικώς επικαλυπτόμενες υπογραφές γονιδίου στα ERG

υψηλή και ESE3

χαμηλή όγκους με πολλές ενεργοποιείται και καταπιεσμένη γονίδια. Στη συνέχεια, ψάξαμε ERG

υψηλή και ESE3

χαμηλή υπογραφές για τα γονίδια-στόχους που θα μπορούσαν να δράσουν ως βασικοί κόμβοι μεσολαβούν τα αποτελέσματα αυτών εκφράζονται ανώμαλα παράγοντες ETS στο μεταγραφικό καρκίνο του προστάτη. ΕΖΗ2 ήταν μεταξύ των 169 έως ρυθμιζόμενα γονίδια τόσο στην ERG

υψηλή και ESE3

χαμηλή όγκους γονίδια (Εικ. S4 και Πίνακας S2), ενώ δεν αυξήθηκε στις άλλες υποομάδες του όγκου. ΕΖΗ2 επίσης συσχετίζεται θετικά με την ERG και αρνητική συσχέτιση με ESE3 σε μια ανάλυση συσχέτισης του συνόλου των μικροσυστοιχιών σύνολο δεδομένων (Πίνακας S3). ΕΖΗ2 είναι ένα ιστονών H3 λυσίνη 27 (H3K27) μεθυλοτρανσφεράση και ένα βασικό στοιχείο για την επιγενετική αποσιώπηση γονιδίου [17], [18]. H3K27 μεθυλίωση είναι ένα σημάδι της ιστόνης που δημιουργεί ένα σημείο αγκύρωσης για την πρόσληψη επιπλέον παράγοντες αναδιαμόρφωσης χρωματίνης που προκαλεί μια κατασταλτική χρωματίνης κατάσταση [17]. Έτσι, η επαγωγή του ΕΖΗ2 σχετίζεται με κέρδος ERG και απώλεια ESE3 θα μπορούσε να συμβάλει στην ευρεία κατασταλτική υπογραφή παρατηρήθηκε σε αυτούς τους όγκους (Σχ. 1 C). ΕΖΗ2 έχει δειχθεί ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε καρκίνους του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικό προστάτη με ιδιαίτερα υψηλά επίπεδα σε υψηλής ποιότητας και μεταστατικούς όγκους [19]. Ωστόσο, λίγοι παράγοντες έχουν ταυτοποιηθεί που μπορεί να αυξήσουν την έκφραση ΕΖΗ2 σε όγκους του προστάτη [20], [21], [22], [23]. Βρήκαμε ότι ΕΖΗ2 ήταν σημαντικά up-ρυθμίζεται ERG

υψηλή όγκους σε σύγκριση με τόσο φυσιολογικό προστάτη και NoETS όγκους (Εικ. 3Α), που δείχνει ότι μπορεί να υπάρχει μια άμεση σχέση μεταξύ της έκφρασης ΕΖΗ2 και ERG που δεν είχαν αναγνωρισθεί στο παρελθόν. Συνεπής με αυτό το εύρημα, ΕΖΗ2 ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ERG

υψηλή σε σύγκριση με NoETS όγκους (Q & lt? 0.0001). Επίσης, σε ένα ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων (Εικ. 3Β)

Α. έκφραση ΕΖΗ2 σε δείγματα ιστού. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως Microarray αναλογίες log2 σε σύγκριση με την αναφορά. έκφραση Β ΕΖΗ2 στην NoETS και ERG

υψηλή όγκους στο Wallace et al. μικροσυστοιχιών σύνολο δεδομένων. έκφραση Γ ΕΖΗ2 στα κύτταρα LNCaP και 22Rv1 παροδικά επιμολυσμένα με άδειο (

ev

) ή έκφραση ERG (

Erg

) φορέα προσδιορίζεται με RT-PCR (

αριστερά

) και κηλίδας Western (

δεξιά

). επίπεδο Δ ΕΖΗ2 στον έλεγχο και σταθερή ERG εκφράζουν 22Rv1 και LNCaP κυττάρων προσδιορίστηκε με RT-PCR (

πάνω

) και κηλίδας Western (

κάτω

). επίπεδο Ε ΕΖΗ2 στα κύτταρα vcap παροδικά επιμολυσμένα με τον έλεγχο και την ERG-ειδική (siERG) siRNA καθορίζεται με RT-PCR (

αριστερά

) και κηλίδας Western (

δεξιά

). ΣΤ μάρκα στην ενδεικνυόμενη κυτταρικές σειρές με ERG αντίσωμα και qPCR με σύνολα εκκινητών περιλαμβάνει την EBS στον υποκινητή ΕΖΗ2. Θετικές (ΜΜΡ3 προαγωγός) και αρνητικό (ETS2) μάρτυρες φαίνονται στο Σχ. S6a-Β και 7Α, αντίστοιχα. G δείγματα ιστών της ERG

υψηλή και NoETS όγκοι υποβλήθηκαν σε τσιπ με αντι-ERG αντισώματος και αναλύθηκαν με qPCR. ETS2 χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (Σχ. S7B). *, P & lt? 0,01? ** P & lt?. 0.0001

Η

Στη συνέχεια, διερευνάται η λειτουργική σχέση μεταξύ της ERG και ΕΖΗ2 και τη δυνατότητα άμεσης ρύθμισης των ΕΖΗ2 από ERG στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, στην οποία πειραματικά πάνω και κάτω -regulated ERG. Σε αυτά τα πειράματα μπορούμε υπερεκφράζεται ERG το ERG-μετατόπιση αρνητικών 22Rv1 και LNCaP καρκίνου του προστάτη κύτταρα που δεν εκφράζουν ενδογενή ERG. Μετά την επιμόλυνση, 22Rv1 και LNCaP κύτταρα εξέφρασαν ERG σε επίπεδα παρόμοια με TMPRSS2: ERG μετατόπιση θετικών κυττάρων vcap (Εικ. S5A). Παράλληλα, knock-down της ERG πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα vcap χρησιμοποιώντας ένα ειδικό siRNA ERG. Το επίπεδο της ERG RNA και πρωτεΐνη ήταν σημαντικά μειωμένη σε siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου VCAP (Εικ. S5B). Για την επικύρωση αυτών των κυτταρικών μοντέλων, εξετάσαμε την έκφραση των γονιδίων, όπως ΜΜΡ3, PLA-1 και CRISP3, τα οποία ήταν στην κορυφή της λίστας των up-ρυθμιζόμενα γονίδια σε ERG

υψηλή όγκους και είχε προηγουμένως δειχθεί ότι ελέγχεται από ERG σε άλλα συστήματα κυττάρων [6]. Η έκφραση αυτών των γονιδίων είναι αυξημένο μετά την ERG υπερ-έκφραση σε 22Rv1 και LNCaP κύτταρα (Σχ. S5c) και μειώθηκε κατά ERG knock-down σε κύτταρα VCAP (Εικ. S5D). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν την επάρκεια των κυτταρικών μοντέλων μας να διερευνήσει πιθανά γονίδια-στόχους ERG μαζί με την προγνωστική αξία των υπογραφών γονιδίου που προέρχεται από καρκίνο του προστάτη κλινικά δείγματα.

Τόσο παροδική και σταθερή έκφραση του ERG σε ERG-αρνητικά LNCaP και 22Rv1 κύτταρα οδήγησε σε αυξημένο επίπεδο ΕΖΗ2 (Σχ. 3C-D). Επιπλέον, ΕΖΗ2 mRNA και της πρωτεΐνης μειώθηκαν κατά siRNA μεσολάβηση knock-down του ERG σε κύτταρα VCAP (Σχ. 3Ε). Οι αλλαγές στην έκφραση ΕΖΗ2 παρατηρείται κατά την ανάντη και κατάντη ρύθμιση της ERG πρότεινε τη δυνατότητα της άμεσης ρύθμισης με ERG. Ταυτοποιήσαμε υποθετικές θέσεις ETS (EBSS) εντός 1 kb του ΕΖΗ2 TSS με υπολογιστική ανάλυση και εκτελέστηκε πειράματα ChIP πρόσδεσης για να καθοριστεί αν ERG ήταν σε θέση να συνδέεται με αυτές τις περιοχές (Εικ. 3F). Η δέσμευση του ERG με τον προαγωγέα ΕΖΗ2 παρατηρήθηκε σε ERG μετατόπιση κύτταρα θετικά VCAP και σε LNCaP και 22Rv1 κύτταρα κατά σταθερή έκφραση του ERG, ενώ καθόλου δέσμευση παρατηρήθηκε σε μη-ERG που εκφράζουν τη γονική LNCaP και κυττάρων 22Rv1 (Σχ. 3F). Ομοίως, ERG συνδέθηκε με το γονίδιο ΜΜΡ3, ένα γνωστό στόχο ERG χρησιμοποιείται εδώ ως θετικός έλεγχος, μόνο σε ERG κλώνους έκφρασης και σε κύτταρα VCAP (Εικ. S6a). Αριθ πρόσδεση του ERG παρατηρήθηκε στον προαγωγέα ETS2, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (Σχ. S7A). Η περιοχή του υποκινητή ETS2 αξιολογείται με ChIP περιελάμβανε την θέση έναρξης μεταγραφής και τόσο RNA πολυμεράση II και Sp1 είχε δειχθεί ότι προσδένονται σε αυτή την περιοχή σε μετατόπιση γέλης και δοκιμασίες πλινθίου ([24] και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποστήριξαν το συμπέρασμα ότι ERG ενήργησε ως ένας μεταγραφικός ενεργοποιητής του ΕΖΗ2 με σύνδεση προς προαγωγό της. Τέλος, για να αποδείξει ότι αυτή η αλληλεπίδραση συνέβη και σε κλινικά δείγματα όγκων πραγματοποιήσαμε τσιπ για να αξιολογηθεί σύνδεση της ERG στον υποκινητή ΕΖΗ2 στο ERG

υψηλή και NoETS δείγματα (Σχ. 3G). ERG συνδέθηκε με τον προαγωγέα ΕΖΗ2 σε ERG

υψηλή όγκους ενώ ήταν απούσα σε NoETS όγκους, συνεπής με την υπόθεση ότι το ελεγχόμενο μεταγραφή αυτού του γονιδίου. Ειδικότητα καταδείχθηκε από την απουσία δέσμευσης της ERG στον υποκινητή ETS2 στα δείγματα των όγκων (Σχ. S7B).

ERG καταστέλλει Nkx3.1 στον προστάτη όγκοι μέσω ΕΖΗ2 και ιστόνης H3K27 μεθυλίωση

Εκτός από την up-ρυθμιζόμενα γονίδια, το μεταγραφικό του ERG

υψηλή όγκων περιλαμβάνονται πολλά γονίδια των οποίων η έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με κανονικό προστάτη, προτείνοντας ότι αυτά τα γονίδια θα μπορούσε να καταστέλλεται είτε άμεσα είτε έμμεσα με ERG. Ο κατάλογος των γονιδίων κάτω-ρυθμίζονται στο ERG

υψηλή όγκους περιλαμβάνονται πολλές σχετικές γονίδια που θα μπορούσαν να έχουν σημαντικές επιπτώσεις στη βιολογία του καρκίνου του προστάτη. Μεταξύ των γονιδίων με γνωστές λειτουργίες ογκοκατασταλτικό, εστιάσαμε στην Nkx3.1, η οποία επηρεάστηκε παρομοίως στην ERG

υψηλή και ESE3

χαμηλή όγκους. Nkx3.1 είναι ένας προστάτη-ειδικό γονίδιο ομοιοακολουθίας και ένας παράγοντας μεταγραφής που έχει κρίσιμες λειτουργίες σε ανάπτυξη του προστάτη και την καταστολή του όγκου [25]. Η απώλεια της έκφρασης Nkx3.1 είναι ένα συχνό συμβάν στην ογκογένεση του προστάτη και έχει αποδοθεί σε διάφορους μηχανισμούς συμπεριλαμβανομένων αλληλικών απώλειας, μεθυλίωση και μετα-μεταγραφική σίγηση [25], [26], [27], [28]. Βρήκαμε ότι το επίπεδο της Nkx3.1 ήταν σημαντικά μειωμένη σε ERG

υψηλή όγκους σε σύγκριση με κανονικό προστάτη και όγκους NoETS (Σχ. 4Α). Για να προσδιορίσετε αν Nkx3.1 κάτω κανονισμός που συνδέονται λειτουργικά με ERG υπερέκφραση, εξετάσαμε το επίπεδο των Nkx3.1 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη μετά από διαμόρφωσης της ERG. ERG knock-down σε κύτταρα VCAP οδήγησε σε αυξημένη έκφραση Nkx3.1 στο mRNA και επίπεδο πρωτεΐνης (Εικ. 4Β). Από την άλλη πλευρά, το επίπεδο Nkx3.1 μειώθηκε κατά σταθερή έκφραση του ERG σε ERG αρνητική LNCaP και 22RV1 κύτταρα, παρέχοντας περαιτέρω απόδειξη του ελέγχου της έκφρασης Nkx3.1 με ERG (Εικ. 4Β). Δεδομένου ότι οι παράγοντες ETS μπορούν να δράσουν ως μεταγραφικοί ενεργοποιητές ή καταστολείς ανάλογα με το πλαίσιο υποκινητή [10], [29], ψάξαμε τον υποκινητή Nkx3.1 για πιθανές EBS που θα μπορούσε να μεσολαβεί δεσμευτικός ERG. Υπολογιστική ανάλυση έδειξε την παρουσία ενός υποθετικού EBS στον υποκινητή Nkx3.1. δοκιμασίες ChIP έδειξαν πρόσδεση του ERG σε αυτή την περιοχή του υποκινητή σε κύτταρα VCAP (Εικ. 4C). ERG κατέλαβαν τον προαγωγό Nkx3.1 επίσης σε LNCaP και 22Rv1 κύτταρα κατά σταθερή έκφραση ERG και ταυτόχρονα με την αποσιώπηση του γονιδίου (Σχ. 4C). Έτσι, η δέσμευση του ERG με τον προαγωγέα Nkx3.1 συνδέθηκε με μεταγραφική καταστολή του γονιδίου. Παρατηρήσαμε χωρητικότητα Nkx3.1 υποκινητή από ERG και σε κλινικά δείγματα όγκων εκτελώντας τσιπ ERG

υψηλή και NoETS όγκων. ERG ήταν υποχρεωμένη να τον υποκινητή Nkx3.1 στο ERG

υψηλή όγκους, σύμφωνα με την υπόθεση που ελέγχεται αρνητικά τη μεταγραφή του γονιδίου σε αυτή την υποομάδα των όγκων (Σχ. 4D).

Α. έκφραση Nkx3.1 σε φυσιολογικά και καρκινικά δείγματα ιστού. επίπεδο Β Nkx3.1 στα κύτταρα LNCaP παροδικά επιμολυσμένα με άδειο (

ev

) ή έκφραση ERG (

Erg

) φορέα που καθορίζεται από κηλίδας Western (άνω πάνελ), το επίπεδο Nkx3.1 σε vcap κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με siERG και τον έλεγχο siRNA προσδιορίστηκε με RT-PCR και κηλίδας Western (μεσαίο πλαίσιο), το επίπεδο Nkx3.1 στον έλεγχο και σταθερή ERG εκφράζουν 22Rv1 και LNCaP κύτταρα αναλύθηκαν με RT-PCR και κηλίδας Western (κάτω πίνακας). Γ δέσμευση του ERG με τον υποκινητή Nkx3.1 καθορίζεται από chip και qPCR στην ενδεικνυόμενη κυτταρικές σειρές. Οι αρνητικοί έλεγχοι φαίνεται στο Σχ. S7A. Δ δείγματα ιστών της ERG

υψηλή και NoETS όγκου υποβλήθηκαν σε τσιπ με αντι-ERG αντισώματος και αναλύθηκαν με qPCR. Οι αρνητικοί έλεγχοι φαίνεται στο Σχ. S7B. Ε VCAP, γονική (έλεγχος) και ERG εκφράζουν (ERG 18) LNCaP κύτταρα επιμολυσμένα με ΕΖΗ2 ειδική (siEZH2) και τον έλεγχο siRNA και αναλύθηκαν με RT-PCR. ΣΤ τσιπ με ένα αντίσωμα για το μετουσιωμένο H3K27 και qPCR με σύνολα εκκινητών περιλαμβάνει το EBS (

πάνω πίνακα

) και ανδρογόνων ανταποκρίνεται ενισχυτή (ARE) (

κάτω πίνακα

) στο Nkx3.1 γονίδιο. ETS2 χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (Σχ. S8A). δράση υποκινητή G. Nkx3.1 σε κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με ανταποκριτή υποκινητή της ανθρώπινης Nkx3.1 μαζί με τις υποδεικνυόμενες φορείς έκφρασης. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ανταποκριτή μετρήθηκε μετά από 24 ώρες. πρωτεϊνικό επίπεδο H. Nkx3.1 σε κύτταρα LNCaP παροδικά επιμολυσμένα με άδειο (-) ή είτε ERG (PERG) ή ΕΖΗ2 (pEZH2) φορέα έκφρασης προσδιορίζεται με στύπωμα Western. μεθυλίωση προαγωγού I. Nkx3.1 εκτιμήθηκε με αλληλούχιση του DNA κατεργασμένου με όξινο θειώδες. Άδειο και γεμάτο κύκλοι αντιπροσωπεύουν μη μεθυλιωμένες και μεθυλιωμένες CpG θέσεις, αντίστοιχα. *, P & lt? 0,01? **, P & lt?. 0.001

Η

Για να καθοριστεί αν η επαγωγή της ΕΖΗ2 από ERG θα μπορούσε να συμβάλει στην αποσιώπηση της Nkx3.1, εμείς νοκ-κάτω ΕΖΗ2 στο ERG κύτταρα που εκφράζουν. siRNA μεσολάβηση knock-down του ΕΖΗ2 σε VCAP κύτταρα αυξημένη έκφραση Nkx3.1, συνεπής με την υπόθεση ότι το γονίδιο ήταν κάτω από τον έλεγχο του ΕΖΗ2 σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 4Ε). Επιπλέον, ΕΖΗ2 knock-down σε ERG κλώνους έκφρασης LNCaP μέρει αποκατασταθεί έκφραση Nkx3.1 σε ένα επίπεδο παρόμοιο με αυτό των γονικών κυττάρων LNCaP (Εικ. 4Ε). Για να αποδειχθεί περαιτέρω ο ρόλος του ΕΖΗ2, προσδιορίσαμε με ChIP αν ο προαγωγός Nkx3.1 απέκτησε το H3K27 μεθυλίωση σήμα χαρακτηριστικό της δραστηριότητας ΕΖΗ2 σε κύτταρα στα οποία είχε κατασταλεί το γονίδιο. Παρατηρήσαμε αυξημένη H3K27 μεθυλίωση στην περιοχή που περιβάλλει το EBS, την οποία αταξινόμητους στον υποκινητή και στο επίπεδο του ενός ανδρογόνου αποκρίνεται ενισχυτή (ARE), το οποίο είναι ένα σημαντικό ρυθμιστικό θέση στο γονίδιο Nkx3.1 [30] σε ERG- μετατόπιση θετικά κύτταρα vcap (Σχ. 4F). Μια παρόμοια εμπλουτισμός του H3K27 μεθυλίωση παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα LNCaP και 22Rv1 με σταθερή έκφραση του ERG (Σχ. 4F). Έτσι, Nkx3.1 αποκτήσει ένα κατασταλτικό χαρακτηριστικό σήμα της δραστηριότητας ΕΖΗ2 σε μια ERG-εξαρτώμενο τρόπο. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά αποδεικνύεται ότι Nkx3.1 ήταν ένας στόχος και των δύο ERG και ΕΖΗ2. ERG καταπιεσμένη Nkx3.1 απευθείας με σύνδεση προς προαγωγό του και έμμεσα μέσω της επαγωγής ΕΖΗ2 και H3K27 μεθυλίωση. Λουσιφεράσης δημοσιογράφος και πειράματα παροδικής επιμόλυνσης υποστήριξε αυτή την υπόθεση. δράση υποκινητή Nkx3.1 και επίπεδο πρωτεΐνης μειώθηκαν κατά παροδική έκφραση του ERG σε κύτταρα LNCaP (Σχ. 4G-Η). Αντιθέτως, η παροδική διαμόλυνση ΕΖΗ2 μόνη δεν είχε καμία επίδραση επί της δραστικότητας προαγωγού Nkx3.1 στον προσδιορισμό ανταποκριτή ή πρωτεϊνικό επίπεδο Nkx3.1 (Σχ. 4G-Η), υποδεικνύοντας ότι απαιτείται ΕΖΗ2 ERG και σταθερή έκφραση να σιγήσει Nkx3.1. Αυτά τα ευρήματα είναι έτσι σύμφωνα με την ικανότητα των παραγόντων ETS να δράσει εναλλακτικά ως μεταγραφικός ενεργοποιητής και καταστολέα [10], [29] και με την υπόθεση ότι οι παράγοντες μεταγραφής μπορούν να επηρεάσουν την πρόσληψη των επιγενετικών τελεστές όπως ΕΖΗ2 να υποκινητές γονιδίων [31].

Απόκτηση κατασταλτικά σήματα των ιστονών, όπως H3K27 μεθυλίωση, είναι μόνο ένα από πολλαπλούς μηχανισμούς που συμβάλλουν στην αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων στα κύτταρα του καρκίνου [18]. Ο υποκινητής του γονιδίου Nkx3.1 περιέχει ένα CpG νησίδα και το γονίδιο έχει αναφερθεί να σιγήσει με μεθυλίωση προαγωγού CpG σε όγκους του προστάτη [26]. Έτσι, καθορίζεται εάν μεθυλίωσης του DNA συμμετείχε επίσης στην ERG που προκαλείται αποσιώπηση Nkx3.1. Bisulfite αλληλούχιση έδειξε την απουσία CpG μεθυλίωσης στον υποκινητή Nkx3.1 σε ERG-μετατόπιση θετικά κύτταρα VCAP και ERG εκφράζουν και μη εκφράζοντα κύτταρα LNCaP (Εικ. 4I). Σε αντίθεση, ο προαγωγέας Nkx3.1 ήταν μεθυλιώνεται ERG-μετατόπιση αρνητικών PC3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα που δεν εκφράζουν Nkx3.1 (Εικ. 4I) υποδεικνύοντας ότι σε αυτά τα κύτταρα Nkx3.1 σίγησε με μεθυλίωση προαγωγού CpG. Έτσι, ERG που προκαλείται αποσιώπηση Nkx3.1 στηρίχθηκε κυρίως στην ΕΖΗ2 και ήταν ανεξάρτητο της μεθυλίωσης υποκινητή, σύμφωνα με την επανενεργοποίηση της έκφρασης Nkx3.1 κατά ΕΖΗ2 knock-down.

ESE-3 καταστέλλει ΕΖΗ2 και Ενεργοποιεί Nkx3.1 μεταγραφή

Το μεταγραφικό της ERG

υψηλή και ESE3

χαμηλή όγκους μοιράζονται πολλά γονίδια κοινά. Αυτό πρότεινε ότι ERG και ESE3 θα μπορούσε να επηρεάσει τη μεταγραφή πολλών γονιδίων σε αντίθετες κατευθύνσεις και ότι η ERG up-ρύθμιση και ESE3 κάτω ρύθμιση θα μπορούσε να έχει ως αποτέλεσμα εν μέρει παρόμοιες επιπτώσεις στο μεταγραφικό καρκίνο του προστάτη. Όπως φαίνεται στο ERG

υψηλή όγκους, ΕΖΗ2 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ESE3

χαμηλή όγκους σε σύγκριση με κανονικό προστάτη και όγκους NoETS (Εικ. 5Α). Η αντίστροφη σχέση μεταξύ ESE3 και επίπεδο έκφρασης ΕΖΗ2 παρατηρήθηκε επίσης σε ένα ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών (Q & lt? 0,0004) [14] (Εικόνα 5Β?. S2D). Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι ESE3 μπορούσε ρυθμίζουν αρνητικά ΕΖΗ2 στον προστάτη και την απώλεια του ESE3 μπορούσε να οδηγήσει σε αυξημένη έκφραση ΕΖΗ2 σε όγκους του προστάτη. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, δημιουργήσαμε κλώνους των κυττάρων LNCaP (ESE3-

kd

) στην οποία σταθερά νοκ-κάτω ESE3 χρήση shRNA κατασκευάζει. Αυτοί οι κλώνοι είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα ESE3 σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα LNCaP, τα οποία εκφράζουν ανιχνεύσιμα επίπεδα ESE3 (Εικ. S5E). Σύμφωνα με την υπόθεσή μας, ESE3-

kd

LNCaP κύτταρα είχαν υψηλότερη έκφραση του ΕΖΗ2 από γονικά κύτταρα (Σχ. 5C). Για να καθοριστεί εάν ESE3 ελέγχεται η έκφραση του ΕΖΗ2 επίσης σε φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα που σταθερώς knock-down ESE3 σε αθανατοποιημένα κύτταρα LHS [32], το οποίο έχουμε δείξει προηγουμένως να εκφράσουν ESE3 [11]. Όπως φαίνεται στο Σχ.