Αφηρημένο

Η ανάπτυξη νέων στοχευμένων θεραπειών έχει γίνει μια σημαντική εστίαση της έρευνας για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. προηγούμενη μελέτη μας έχει δείξει leptomycin Β (ΕΜΒ) ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα? Ωστόσο, ρ53 άγριου τύπου καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα ήταν ανθεκτικά σε LMB. Ως εκ τούτου, ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να αναπτύξει και να αξιολογήσει μια νέα θεραπευτική στρατηγική για την ευαισθητοποίηση LMB ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα, συνδυάζοντας LMB και δοξορουβικίνη (ϋΟΧ). Μεταξύ των διαφόρων θεραπευτικά σχήματα, προ-θεραπεία με DOX (προ-DOX) και μετέπειτα επεξεργασία με LMB σε κύτταρα Α549 μείωσε σημαντικά την συγκέντρωση αναστολής 50% (IC50) σε σύγκριση με εκείνη του μόνο (4.4 ηΜ

vs LMB.

10,6 nM,

P

& lt? 0,05). Ανάλυση κυτταρικού κύκλου και απόπτωση με κυτταρομετρία ροής επιβεβαίωσαν περαιτέρω τα κυτταροτοξικά δεδομένα. Για να διερευνηθεί μοριακοί μηχανισμοί για αυτό το συνδυασμό φαρμάκων επιδράσεις, οδοί ρ53 αναλύθηκαν με κηλίδα Western, και πυρηνικών πρωτεώματος αξιολογήθηκε με δύο ηλεκτροφόρηση διαστάσεων-διαφορά γέλη (2D-ΨΗΦΟ) και φασματομετρία μάζας. Σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου, τα επίπεδα του p53, φωσφο-ρ53 (Ser15), και οι πρωτεΐνες p21 ήταν σημαντικά αυξημένη, ενώ φωσφο-p53 (Thr55) και survivin μειώθηκαν σημαντικά μετά τις θεραπείες της προ-DOX και LMB (

P

& lt? 0,05). Η ανάλυση 2D-ΨΗΦΟ /MS διαπιστώνεται ότι sequestosome 1 (SQSTM1 /ρ62) είχε μια σημαντική αύξηση της προ-DOX και LMB-κατεργασμένων κυττάρων (

P

& lt? 0,05). Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ανθεκτικά στα φάρμακα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα με ρ53 άγριου τύπου θα μπορούσε να ευαισθητοποιηθεί σε κυτταρικό θάνατο με προγραμματισμένη θεραπεία συνδυασμού DOX και LMB μέσω ενεργοποίησης και την αποκατάσταση της ρ53 καθώς επίσης και ενδεχομένως άλλα οδού (ες) σημάτων που περιλαμβάνουν sequestosome 1.

Παράθεση: Lu C, Shao C, Cobos Ε, Singh KP, Gao W (2012) Τα χημειοθεραπευτικά Ευαισθητοποίηση των Leptomycin Β ανθεκτικά κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα με προεπεξεργασία με δοξορουβικίνη. PLoS ONE 7 (3): e32895. doi: 10.1371 /journal.pone.0032895

Επιμέλεια: Ασράφ Β Abdel-Ναΐμ, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Ain Shams, την Αίγυπτο

Ελήφθη: 13 Δεκέμβρη του 2011? Δεκτές: 7 Φεβ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 7, Μαρτίου 2012 |

Copyright: © 2012 Lu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα εξακολουθεί να είναι η κύρια αιτία του καρκίνου. θανάτου παγκοσμίως και στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. καρκίνο του πνεύμονα μη μικρών κυττάρων (NSCLC) παραμένει η κυρίαρχη μορφή του καρκίνου του πνεύμονα (περίπου το 85% όλων των καρκίνων του πνεύμονα), μεταξύ των οποίων το αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα (AC) είναι η πιο συχνή ιστολογική υπότυπος για όλα τα φύλα και φυλές συνδυασμένα [2]. Η πρόγνωση του καρκίνου του πνεύμονα είναι πολύ φτωχή, με ποσοστό επιβίωσης 5-χρόνια μικρότερη από 15% στις Ηνωμένες Πολιτείες. Η χημειοθεραπεία συνεχίζει να είναι η πιο συχνή θεραπεία για να παρατείνει την επιβίωση και τη βελτίωση της ποιότητας ζωής [3], [4], [5], [6].

Η χημειοθεραπεία καρκίνου έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε μια ποικιλία περιστάσεων που περιλαμβάνουν κακοήθειες, ωστόσο, η αποτελεσματικότητά του έχει συχνά περιορίζεται από αντοχή φαρμάκου και τις παρενέργειες [7]. Θεραπείες με επίκεντρο συγκεκριμένες μόριο (-α) /μονοπατιού (ες) έχουν τη δυνατότητα να ξεπεραστούν αυτοί οι περιορισμοί [7]. Leptomycin Β (ΕΜΒ) ή /και τα παράγωγά του, τα οποία μπορούν να αναστείλουν αποτελεσματικά την πυρηνική εξαγωγή από ειδική αναστολή συντήρηση περιοχή χρωμοσώματος 1 (CRM1), έχει αναγνωριστεί ως μία νέα κατηγορία καρκίνου θεραπευτικών [8], [9], [10], [11], [12]. CRM1, το καλύτερο χαρακτηρισμένο υποδοχέα πυρηνικής εξαγωγής, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην κανονική σήμα πυρηνικής εξαγωγής (NES) εξαρτώμενη από την πυρηνική εξαγωγών, συμπεριλαμβανομένων των μεγάλων ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών (κουταλιές), όπως p53, FOXO, pRB, p21, p27, κλπ, όπως καθώς και τον αναστολέα του ΝΡ-κΒ, δηλαδή Ι-κΒ [9], [13]. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει ότι CRM1 εκφράζεται σε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο σε καρκίνο του τραχήλου, σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό [14] και μπορεί να χρησιμεύσει ως προγνωστικός παράγοντας για τον καρκίνο των ωοθηκών [15] και οστεοσαρκώματος [16]. Μας πρόσφατα δημοσιευθείσα

in vitro μελέτες με χρήση

φυσιολογικού πνεύμονα επιθηλιακά κύτταρα [17] και ένα bitransgenic μοντέλο ποντικού [18] έχουν προτείνει ότι CRM1 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα. Επιπλέον, CRM1 ήταν υπερ-εκφράζεται σε ένα καρκινογόνο που προκαλείται μοντέλο ποντικού πνεύμονα AC καπνού, και ανθρώπινου πνεύμονα AC (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν CRM1 μπορούσε να χρησιμεύσει ως μοριακός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα.

LMB είναι μια πολύ ειδική και ισχυρός αναστολέας της λειτουργίας CRM1 μέσω μιας μη αναστρέψιμης δέσμευσης με την ομάδα σουλφυδρυλίου του υπολείμματος Cys πλησίον ή εντός της φορτίο περιοχή πρόσδεσης του CRM1 (αλκυλίωσης Cys 528) [19], [20]. Έτσι, θα μπορούσε να αποτρέψει LMB κυτταροπλασματική εντόπιση και διαμορφώνουν ειδική για τον καρκίνο οδούς, όπως η αδρανοποίηση σημαντικών καταστολείς όγκων, όπως το ρ53 [10]. πρόσφατη μελέτη μας έδειξε ότι πνεύμονα AC Α549 κυτταρική γραμμή (ρ53 άγριου τύπου) ήταν περισσότερο ανθεκτική σε LMB από άλλες κυτταρικές σειρές με τη μεταλλαγμένη ρ53 ή null [12]. Είναι γνωστό ότι η ρ53 παίζει σημαντικό ρόλο στην προώθηση γονιδιωματική σταθερότητα, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, την επιδιόρθωση του DNA, και γήρανση. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι λειτουργίες του άγριου τύπου ρ53 κατά τη σύλληψη κυτταρική ανάπτυξη και επιδιόρθωση του DNA θα μπορούσε να αυξήσει την αντίσταση σε ράδιο- ή χημείο- θεραπευτικούς παράγοντες? είναι επίσης επιρρεπείς να ενισχύει την απόπτωση σε απόκριση σε σοβαρή βλάβη του DNA [21], [22], [23]. Ως εκ τούτου, να ευαισθητοποιήσει τον καρκίνο του πνεύμονα με το χημειοθεραπευτικό αποτέλεσμα του LMB, έχουμε εδώ προτείνει μία θεραπευτική στρατηγική που συνδυάζει LMB με άλλα φάρμακα με διέγερση σοβαρή βλάβη του DNA και της ενεργοποίησης p53 η οποία θα μπορούσε τελικά να οδηγήσει σε αυξημένη λειτουργία της ρ53 σε απόπτωση και όχι στην επιδιόρθωση του DNA. Η δοξορουβικίνη (ΔΟΞ) είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο χημειοθεραπευτικό παράγοντα που επάγει απόπτωση σε διάφορα καρκινικά κύτταρα μέσω της ενεργοποίησης της ρ53. Έχει χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία μιας ποικιλίας στερεών όγκων. Ωστόσο, η αντίσταση των ναρκωτικών στην DOX σχήματα που περιέχουν είναι ένα μείζον ζήτημα που εμποδίζει καλύτερα ποσοστά ανταπόκρισης και θεραπείες και καρδιοτοξικές παρενέργειες έχουν αναφερθεί σε ασθενείς με καρκίνο που έλαβαν θεραπεία με DOX [24], [25], [26]. Ατομικές θεραπείες DOX οδήγησε σε μια ισχυρή αντίσταση σε πολλές καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων των Α549, οφείλεται σε διάφορους μηχανισμούς που περιλαμβάνουν την βιοδιαθεσιμότητα του φαρμάκου [27], [28] ή ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ [29]. Αν DOX συνδυάζεται με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα, χαμηλότερες δόσεις μπορεί να χρησιμοποιηθεί όχι μόνο για να μειώσει τις παρενέργειες, αλλά επίσης να αυξήσει την αποτελεσματικότητα [30].

Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να επανέλθει φαρμακευτικής αντοχής σε ϋΟΧ ή /και LMB σε Α549 κύτταρα μέσω διαφορετικών θεραπευτικές αγωγές ενός συν-θεραπεία της ΔΟΞ και LMB, καθώς και την αξιολόγηση πιθανών μοριακών μηχανισμών τους. Βρήκαμε ότι προκατεργασία DOX με την επακόλουθη κατεργασία του LMB ευαισθητοποιημένων των κυττάρων Α549 φάρμακο ανθεκτικά στην χημειοθεραπευτική δράση του LMB. Αυτές οι αλλαγές μπορεί να προκύψουν από την αρχική ενεργοποίηση της p53 με επεξεργασία DOX και, κατά συνέπεια, CRM1 κλείδωμα λειτουργίας με αγωγή LMB να συσσωρεύονται ενεργοποιηθεί p53 στον πυρηνικό διαμέρισμα. Επιπλέον, τα μονοπάτια σηματοδότησης με μόρια διαφορετικά από το ρ53 θα μπορούσε επίσης να παίξει σημαντικό ρόλο στην προώθηση της θεραπευτικά αποτελέσματα της συνδυασμένης θεραπείας της ΔΟΞ και LMB.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

δοξορουβικίνη (DOX) και διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, ΜΟ. LMB (1 mM) αγοράστηκε από LC Labs, Woburn, MA. Τα αποθέματα του DOX (10 mg /ml) και LMB αραιώθηκαν στην επιθυμητή συγκέντρωση αμέσως πριν από τη χρήση με μέσο ανάπτυξης. 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) αγοράστηκε από την Corporation USB. RPMI-1640, πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, και ορό εμβρύου μόσχου (FBS) αγοράσθηκαν από την Thermo επιστημονικές, Logan, UT. Πρωτογενή αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων των p53, φωσφο-ρ53 (Ser15), φωσφο-ρ53 (Thr55), ρ21, sequestosome 1 (SQSTM1 /Ρ62), και survivin, αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. Πρωτογενής πολυκλωνικό κουνελιού αντι-α-τουμπουλίνης αγοράστηκε από Abcam, Cambridge, ΜΑ. Η υπεροξειδάση χράνου (HRP), συζευγμένης γαϊδάρου αντι-κουνελιού IgG και μία ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) Κιτ αγοράστηκαν από GE Healthcare, Piscataway, NJ. δοκιμασία ραδιοανοσοκαταβύθιση (RIPA) ρυθμιστικό λύσης αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology.

Cells and Cell Culture

Ανθρώπινο πνευμονικό αδενοκαρκίνωμα επιθηλιακών κυτταρικών σειρών Α549 και ΝΟΙ-Η358 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC ). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 50 U /mL πενικιλλίνη, και 50 mg /mL στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 95% αέρα και 5% CO

2 κατ ‘όγκο. Τα κύτταρα υπο-καλλιεργήθηκαν ή κάλυψη για επακόλουθη επεξεργασία έως ότου προσέγγισαν 80% περίπου συρροή.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 5 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Με βάση την κυτταροτοξικότητα της ΔΟΞ ή LMB παρατηρήθηκαν σε αυτή τη μελέτη και οι προηγούμενες εκθέσεις [9], [12], [26], [31], [32], [33], 0.5 ηΜ LMB ή επιλέχθηκε 0,5 μΜ ϋΟΧ για συνεργασία -Θεραπεία ή προεπεξεργασίας. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα ακόλουθα: 1) DOX μόνη της (0-5 μΜ) για 24 και 48 ώρες? 2) LMB μόνο (0-10 ηΜ) για 24 και 48 ώρες? 3) συν-επεξεργασία των 0,5 nM LMB και DOX (0-5 μΜ) ταυτόχρονα (DOX + LMB (0,5 nM)) για 24 και 48 ώρες? 4) συν-θεραπεία των 0,5 μΜ ϋΟΧ και LMB (0-10 ηΜ) ταυτόχρονα (LMB + DOX (0,5 μΜ)) για 24 και 48 ώρες? 5) προεπεξεργασία των 0.5 ηΜ LMB για 24 ώρες (προ-LMB) και μετέπειτα DOX (0-5 μΜ) για 48 ώρες (προ-LMB + DOX)? και 6) προεπεξεργασία των 0,5 μΜ ϋΟΧ για 24 ώρες (προ-DOX) και μετέπειτα LMB (0-5 ηΜ) για 48 ώρες (προ-ϋΟΧ + LMB). Η αιθανόλη (EtOH, 0.1%) χρησιμοποιήθηκε ως ο έλεγχος του οχήματος για LMB. Τρεις ώρες πριν από το τέλος του κάθε χρονικό σημείο, 15 μL ΜΤΤ (10 mg /mL) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται στους 37 ° C. Σε κάθε χρονικό σημείο, όταν πορφυρό ίζημα ήταν σαφώς ορατή υπό το μικροσκόπιο, 100 μι 100% DMSO προστέθηκε σε όλα τα φρεάτια και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 570 nm (μήκος κύματος αναφοράς = 630 nm) χρησιμοποιώντας ένα SpectraMax Plus φασματομετρία φωτόμετρο (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Έξι επαναλήψεις σε κάθε συγκέντρωση και χρονικό σημείο αναλύθηκαν. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν ανεξάρτητα. έλεγχοι και τα κενά των οχημάτων επεξεργασμένο επωάστηκαν στο ίδιο πλάκα κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Κλασματική απορρόφηση υπολογίστηκε με βάση τον ακόλουθο τύπο:. Βιωσιμότητα των κυττάρων% = μέση απορρόφηση στα φρεάτια δοκιμών /μέση απορρόφηση σε φρεάτια ελέγχου × 100

Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής

Cells δόθηκε αρχικά προεπεξεργασία των 0,5 μΜ ϋΟΧ για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΕΜΒ για επιπλέον 48 ώρες. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από συνολικά 72 ώρες της θεραπείας. Με βάση την δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας, συνολικά 6 ομάδες των Α549 κυττάρων με διαφορετικές θεραπείες αναλύθηκαν, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου, 0.5 μΜ ϋΟΧ (προ-DOX), 1 ηΜ LMB (LMB1), προ-DOX και 1 ηΜ LMB (προ- DOX + LMB1), 5 nM LMB (LMB5), και προ-DOX και 5 nM LMB (προ-DOX + LMB5). Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, ένα σύνολο 2 × 10

5 κύτταρα από κάθε ομάδα θεραπείας συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη για περισσότερο από 24 ώρες στους 4 ° C. Τα κύτταρα χρωματίζονται με το αντιδραστήριο γκουάβα κυτταρικού κύκλου (Millipore) και να τρέξει σε ένα γκουάβα EasyCyte Cytometer ™ Flow (Millipore). Ένα σύνολο 5 × 10

3 εκδηλώσεις μετρήθηκαν, και το ποσοστό των κυττάρων στην προ-G1, G0 /G1, S και G2 /M φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίσθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GuavaSoft (Millipore). Για την ανάλυση απόπτωσης, δοκιμασία ViaCount διεξήχθη για τον προσδιορισμό ζώντων και νεκρών κυττάρων. Εν συντομία, το κυτταρικό εναιώρημα (5 × 10

5 κύτταρα /ml) αναμίχθηκε με αντιδραστήριο γκουάβα ViaCount (Millipore), και το μίγμα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά με τη χρώση κύτταρα. Τα βαμμένα δείγματα κυττάρων έτρεξαν σε γκουάβα EasyCyte Κυτταρόμετρο ™ Flow (Millipore). Ένα σύνολο από 5 × 10

3 εκδηλώσεις μετρήθηκαν και τα δεδομένα που αποκτήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού γκουάβα ViaCount (Millipore). Κάθε δείγμα εις τριπλούν και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Western Blot

Οι ίδιες ομάδες 6 κατεργασία των κυττάρων Α549 όπως περιγράφεται στην κυτταρομετρία ροής αναλύθηκαν για στύπωμα Western. Τα κύτταρα σε κάθε ομάδα υποβλήθηκαν σε λύση σε ρυθμιστικό λύσης RIPA επί πάγου. Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε υπερήχους και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 13.000 χ g για 5 λεπτά στους 4 ° C για να συλλεχθεί το υπερκείμενο. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad Bradford. Ένα σύνολο 30 μg πρωτεΐνης ανά δείγμα διαχωρίστηκε με 12% SDS-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πηκτής (SDS-PAGE) και μετά μεταφέρθηκαν σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες. Τα ακινητοποιημένα πρωτεΐνες στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε ρυθμιστικό αποκλεισμού που περιέχει 3% άπαχο ξηρό γάλα σε 1 χ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) και 0.1% Tween 20 (1 χ PBST). Μετά τον αποκλεισμό, οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα για 1 ώρα. Η σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε με γαϊδάρου αντι-κουνελιού IgG-HRP σε αραίωση 1:1,000 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από μια σύντομη επώαση με ECL, τα σήματα επί μεμβρανών εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ (Fujifilm Corporation, Tokyo). Σχετική πυκνομετρική ψηφιακή ανάλυση των ζωνών πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με τη χρήση Ποσότητα One λογισμικού (Bio-Rad) και κανονικοποιήθηκαν από την ένταση του γονιδίου housekeeping (α-τουμπουλίνης, 1:10,000 αραίωση) για κάθε δείγμα.

Επιδράσεις της DOX και LMB για πυρηνική πρωτεΐνη Προφίλ

για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της ΔΟΞ και LMB επί πρωτεϊνών εκτός εκείνων στο μονοπάτι ρ53, μία γέλη με βάση το πρωτεομική προσέγγιση, δύο διαστάσεων ηλεκτροφόρηση πηκτής-διαφορά (2D-ΨΗΦΟ), ήταν η πρώτη για να ερευνηθεί προφίλ πυρηνικής πρωτεΐνης μετά τη θεραπεία LMB. κηλίδες πρωτεΐνης που δείχνουν σημαντικές αλλαγές ταυτοποιήθηκαν με υγρή φασματομετρία μάζας χρωματογραφίας (LC /MS /MS) και επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western. Αλλαγές στην πρωτεΐνη (ες) αξιολογήθηκαν περαιτέρω σε κύτταρα με συνδυασμένη θεραπεία της ΔΟΞ και LMB με κηλίδα Western.

πυρηνική πρωτεΐνη Εκχύλιση.

Για πρωτεομική ανάλυση, πυρηνικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν ακολουθώντας τα πρωτόκολλα ως περιγράφεται από Lu

et al

[34]. Εν συντομία, με βάση την προηγούμενη μελέτη μας [12], Α549 ή ΝΟΙ-Η358 κύτταρα, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τον έλεγχο του οχήματος (0.1% EtOH) ή 20 ηΜ LMB για 24 ώρες (εις διπλούν), ξεπλύθηκαν με παγωμένο PBS, συλλέχθηκαν, και αιωρήθηκε σε παγωμένο ρυθμιστικό Α που περιέχει 10 mM Tris-HCl (ρΗ: 7,4, Bio-Rad), 8 Μ Ουρία (Bio-Rad), 4% (β /ο) 3 – [(3-χολαμιδοπροπυλο) διμεθυλαμμωνιο] -1-προπανοσουλφονικό (CHAPS, Bio-Rad), 0,5 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA, Bio-Rad), 2.5 mM MgCl

2 (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ), 0.5 mM PMSF (Santa Cruz Biotechnology), 1 × κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Βασιλεία, Ελβετία), και 1% (ν /ν) ΝΡ-40 (Corporation USB, Cleveland, ΟΗ). Το μίγμα ομογενοποιήθηκε με μια βελόνα 21-gauge, που ακολουθείται από φυγοκέντρηση του ομογενοποιήματος σε 700 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C για την κατακρήμνιση των πυρήνων. Τα κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα σε υπερκείμενα συλλέχθηκαν και τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 1 mL παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος Β (20 mM Tris-HCl, ρΗ 8,5 και 1 χ πρωτεάσης κοκτέιλ αναστολέα), κατεργασία με υπερήχους επί πάγου, και αναμιγνύεται με 0,737 g ουρία, 0,267 g θειουρία, και 0,07 g (w /v) CHAPS. Μετά την επώαση σε πάγο για 1 ώρα, τα υπερκείμενα που περιέχουν πυρηνικά εκχυλίσματα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 100.000 χ g για 1 ώρα στους 4 ° C. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν με τη δοκιμασία Bradford (Bio-Rad). Η ποιότητα της πυρηνικής εκχύλισης προσδιορίστηκε, και η ταυτοποιημένη πρωτεΐνη επιβεβαιώθηκε με Western blots. α-τουμπουλίνης (που υπάρχουν στο κυτταρόπλασμα) και της ιστόνης 3 (που υπάρχουν στο πυρήνα) χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση και επιβεβαίωση της καθαρότητας των κλασμάτων πρωτεΐνης.

2D-ΨΗΦΟ.

Πυρηνική εκχυλίσεις πρωτεΐνης για 2D- ΨΗΦΟ έτρεξαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Εν συντομία, η πρωτεΐνη εξαγωγές πυρηνικών από το Α549 ή κύτταρα NCI-H358 με ή χωρίς επεξεργασία LMB (εις διπλούν) ήταν αντίστροφα σημανθεί με Cy3 και Cy5, αντίστοιχα (GE Healthcare). Σωλήνες που περιέχουν 50 μg εκάστου δείγματος συνδυάσθηκαν με 1 μL αραιωμένου Cy3 ή Cy5 (400 ριποΙ /μικρολίτρο σε Ν, Ν-διμεθυλοφορμαμίδιο, Sigma). Μετά τη φυγοκέντρηση, το μίγμα αφέθηκε σε πάγο για 30 λεπτά χωρίς έκθεση στο φως. Στη συνέχεια, η αντίδραση σταμάτησε με την προσθήκη 1 μλ 10 mM λυσίνη (Sigma) και την τοποθέτηση των δειγμάτων σε πάγο για 10 λεπτά στο σκοτάδι. Δείγματα (που περιέχει 100 μα πρωτεϊνών) επισημασμένο με Cy3 και Cy5, αραιώθηκαν σε 300 μΐ με προσθήκη 2D ρυθμιστικού επανυδάτωση (BioRad) που αποτελείται από 8 Μ ουρία, 0,5% CHAPS, 10 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT, Bio-Rad), 0,2% biolytes αμφολυτικά, και ίχνη κυανού βρωμοφαινόλης. Τα δείγματα στη συνέχεια εφαρμόστηκαν σε 17-cm ακινητοποιημένη γραμμική κλίση ρΗ 3-10 (IPG) λωρίδες (BioRad) για όλη τη νύχτα επανυδάτωση. Η ισοηλεκτρική εστίαση διεξήχθη στα 250 V για 20 λεπτά, βαθμιαία αυξήθηκε σε 10.000 εντός 2,5 h, και διατηρήθηκε στους 10000 V για συνολικά τις 50,000 ωρες Τάσης (VH). IPG λωρίδες στη συνέχεια εξισορροπήθηκαν με ρυθμιστικό Ι (6 Μ ουρία, 2% SDS, 375 mM Tris-HCl (ρΗ 8.8), 20% γλυκερόλη, 130 mM DTT, και ιχνοστοιχεία βρωμοφαινόλη μπλε) και ρυθμιστικό II (6 Μ ουρία, 2% SDS, 375 mM Tris-HCl, 20% γλυκερόλη, 135 mM ιωδοακεταμίδιο, και ιχνοστοιχεία βρωμοφαινόλη μπλε). Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE και κατέστησαν ορατά χρησιμοποιώντας ένα Typhoon Trio Imager (GE Healthcare) σε μήκη κύματος διέγερσης 532 και 633 nm για Cy3 και Cy5, αντίστοιχα. Εικόνες παραποιήθηκαν και αναλύθηκαν από DeCyder και λογισμικό ImageQuant (GE Healthcare)? διαφορές έντασης πρωτεΐνη υπολογίστηκαν για κάθε κηλίδα σε κάθε τζελ.

In-gel πέψη.

Οι 2D πηκτές βάφτηκαν με SYPRO-RUBY (Bio-Rad). Οι κηλίδες του ενδιαφέροντος απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σημείο επιλογέα, και τοποθετήθηκε σε έναν σωλήνα Eppendorf 0,5 mL για την πέψη με θρυψίνη σε PROGEST (Genomic διαλύματα) workstation [35]. Εν συντομία, τα βύσματα γέλη πλύθηκαν με DIH

2O, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ακετονιτρίλιο (ACN) για 15 λεπτά. Τα τεμάχια γέλης επανυδατώθηκαν με 10 mM DTT και 0,1 Μ διττανθρακικού αμμωνίου (ΝΗ

4HCO

3) για 30 λεπτά στους 60 ° C σε υδατόλουτρο. Μετά συρρίκνωση πάλι με ACN, ένα διάλυμα που περιέχει 55 mM ιωδοακεταμίδιο (Bio-Rad) και 0.1 Μ ΝΗ

4HCO

3 προστέθηκαν για 20 λεπτά χωρίς έκθεση στο φως, στη συνέχεια αντικαταστάθηκε από 0,1 Μ NH

4HCO

3 για 15 λεπτά. Τα βύσματα του πηκτώματος ακολούθως πλύθηκαν σε 0.1 Μ NH

4HCO

3 για 5 λεπτά, ενώ προστίθεται ένας ίσος όγκος ACN για 5 λεπτά. Μετά την επανάληψη του σταδίου πλύσης δύο φορές, τα τεμάχια της πηκτής αφυδατώθηκαν με ACN, και στη συνέχεια ξηραίνεται για 30 λεπτά. Μεμονωμένα τεμάχια γέλης επανυδατώθηκαν σε ρυθμιστικό πέψης που περιέχει 12,5 ng /μL θρυψίνη (Promega), 40 mM ΝΗ

4HCO

3, και 10% ACN σε 37 ° C για 4 ώρες. Μυρμηκικό οξύ προστέθηκε για να σταματήσει η αντίδραση και το υπερκείμενο αναλύθηκε άμεσα.

LC /MS /MS Αναγνώριση.

θρυψίνη πεπτίδια αναλύθηκαν με νανο LC /MS /MS σε ThermoFisher LTQ Orbitrap XL. Εν συντομία, 30 μL του υδρολύματος φορτώθηκε σε 5 mm × 75 μm ID C12 (Jupiter Proteo, Phenomenex) εξαερώνονται στήλη με ταχύτητα ροής 10 μL /λεπτό. Η βαθμιαία έκπλυση διεξήχθη σε 15 cm επί στήλης 75 μm ID C12 στα 300 ΝΙ /min. Μία βαθμίδα 30 λεπτών χρησιμοποιήθηκε. Το φασματόμετρο μάζας λειτούργησε σε κατάσταση δεδομένων που εξαρτώνται από, και επιλέχθηκαν οι έξι πιο άφθονα ιόντα για MS /MS. Μάζα αποτελέσματα φασματομετρίας αναζητήθηκαν χρησιμοποιώντας μασκότ (www.matrixscience.com). Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία στον αλγόριθμο ικριωμάτων χρησιμοποιώντας αρχεία DAT δημιουργούνται από μασκότ. Παράμετροι για τα δεδομένα LTQ Orbitrap XL απαιτούν ένα ελάχιστο 2 πεπτιδίου αγώνες ανά πρωτεΐνη με ελάχιστες πιθανότητες 90% στο επίπεδο της πρωτεΐνης.

Στατιστικές Αναλύσεις

Παραγοντικό ANOVA διεξήχθη για να εξεταστούν τα αποτελέσματα της DOX ή /και LMB συγκεντρώσεις και χρόνοι επώασης στη βιωσιμότητα των κυττάρων. ανάλυση Probit χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστούν οι συγκεντρώσεις αναστολής 50% (IC50s). Για τα δεδομένα που ελήφθησαν από κυτταρομετρία ροής, τα μέσα ποσοστά των κυττάρων υπολογίστηκαν και η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε μέσω μονόδρομης ANOVA και post hoc δοκιμασίες. Για τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης μεταξύ ελέγχου, προ-DOX, LMB1, χρησιμοποιήθηκαν προ-DOX + LMB1, LMB5, και προ-DOX + LMB5, μονόδρομη ΑΝΟνΑ και κατά Tukey τεστ post hoc να συγκρίνουν πυκνομετρική ένταση των μεμονωμένων δειγμάτων μεταξύ των ομάδων. Για 2D-ΨΗΦΟ, ανάλυση εικόνας διεξήχθη με το λογισμικό DeCyder (GE Healthcare) και το λογισμικό ImageMaster. Για το λογισμικό DeCyder, η διαφορική In-Gel Ανάλυση μονάδα (DIA) χρησιμοποιήθηκε για την επεξεργασία ενός ζεύγους των εικόνων από ένα ενιαίο τζελ, και να εκτελέσει ανίχνευση τόπου και ποσοτικοποίηση. Η Ανάλυση βιολογική ποικιλία (BVA) χρησιμοποιήθηκε για να υπολογίσει αναλογίες μεταξύ των δειγμάτων και ελέγχων εκτελώντας μια αντίστοιχη γέλη-προς-γέλη του ζεύγους των επιτόπιων χαρτών από κάθε γέλη. Οι κηλίδες με περισσότερες από δύο φορές αλλαγή σε αντίστροφη επισημασμένο διπλότυπο πειράματα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου θεωρήθηκαν ως πρωτεΐνες-στόχους. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) και οι διαφορές με το

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Η κυτταροτοξικότητα της ΔΟΞ ή LMB

Η δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων σε κάθε χρονικό σημείο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α και 1Β, τόσο ϋΟΧ και LMB ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό κυττάρων Α549 σε δόση και χρονικά εξαρτώμενο τρόπο (

P

& lt? 0.001). Οι IC50s της ΔΟΞ και LMB στις 48 ώρες ήταν 2.2 μΜ και 10,6 ηΜ, αντιστοίχως (Πίνακας 1). Ομοίως, τόσο DOX και LMB ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του NCI-Η358 σε μια δόση και το χρονικό εξαρτώμενο τρόπο (

P

& lt? 0.001, Εικόνα S1 Α και S1B)

Α, Κυτταροτοξικό. επιδράσεις της DOX μόνη της και DOX + LMB για κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το ποσοστό με σύγκριση με το έκδοχο ελέγχου για DOX και LMB (0,5 ηΜ) για DOX + LMB. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσο ± SD, η = 6. Β, Η κυτταροτοξική δράση του LMB μόνο και LMB + DOX για κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το ποσοστό με σύγκριση με το έκδοχο ελέγχου για LMB και DOX (0,5 μΜ) για LMB + DOX. Οι τιμές είναι μέσοι ± SD, η = 6. C, Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της DOX μόνη της και προ-LMB + DOX για κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 στις 48 ώρες, όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το ποσοστό με σύγκριση με το έκδοχο ελέγχου για DOX και προ-LMB για προ-LMB + DOX. Οι τιμές είναι μέσοι ± SD, η = 6. D, Η κυτταροτοξική δράση του LMB μόνο και προ-DOX + LMB για κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 στις 48 ώρες, όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το ποσοστό με σύγκριση με το έκδοχο ελέγχου για LMB και προ-DOX για προ-DOX + LMB. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± SD, η = 6. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν έδωσε παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Η κυτταροτοξικότητα της Συν-θεραπεία του DOX και LMB

Παρόμοια με DOX ή LMB ομάδες, DOX + LMB (0,5 nM) ή LMB + DOX (0,5 μΜ) ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό Α549 σε μια δόση και το χρονικό εξαρτώμενο τρόπο (

P

& lt? 0.001, Εικόνα 1Α και 1Β). Ωστόσο, οι ταυτόχρονες θεραπείες του DOX + LMB (0.5 ηΜ) ή LMB + DOX (0,5 μΜ) δεν άλλαξε τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί κυττάρων Α549 συγκριτικά με DOX μόνη της ή LMB μόνος σε αμφότερα 24 και 48 h (

P

& gt? 0,05, Σχήμα 1Α και 1Β). Οι IC50s της ΔΟΞ + LMB (0,5 ηΜ) και LMB + DOX (0,5 μΜ) στις 48 ώρες ήταν 2.1 μΜ και 10,4 ηΜ, αντιστοίχως (Πίνακας 1). Ομοίως, οι ταυτόχρονες θεραπείες του DOX + LMB (0.5 ηΜ) ή LMB + DOX (0,5 μΜ) δεν άλλαξε τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί κυττάρων NCI-H358 σε σύγκριση με DOX μόνη της ή LMB μόνος σε αμφότερα 24 και 48 h (

P

& gt?. 0.05, Σχήμα S1A και S1B)

Η κυτταροτοξικότητα των προ-ΕΜΒ + ΔΟΞ ή προ-DOX + LMB

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C, προεπεξεργασία των 0.5 ηΜ LMB δεν ενισχύσει τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του DOX σε κύτταρα Α549 στις 48 ώρες σε σύγκριση με DOX μόνη (

P

& gt? 0,05). Οι IC50s στις 48 ώρες από προ-LMB + DOX και DOX μόνη της ήταν 2.8 και 2.2 μΜ, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Ωστόσο, η προεπεξεργασία των 0,5 μΜ ϋΟΧ αύξησε σημαντικά την κυτταροτοξική δράση του LMB σε κύτταρα Α549 στις 48 h (

P

& lt? 0,05, σχήμα 1Δ). Η IC50 στις 48 ώρες από προ-DOX + LMB ήταν 4,4 ηΜ, η οποία ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη της μόνη της LMB (10,6 ηΜ,

P

= 0.037, Πίνακας 1). Επιπλέον, είτε προ-ΕΜΒ ή προ-DOX δεν βελτίωσε τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της ΔΟΞ ή LMB σε κύτταρα NCI-H358 (

P

& gt? 0.05, Σχήμα S1c και S1D).

Εφέ της ΔΟΞ και LMB επί κυτταρικού κύκλου και απόπτωση

παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων θα μπορούσε να είναι το αποτέλεσμα είτε διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση, έτσι οι δύο αυτές πτυχές εξετάστηκαν περαιτέρω με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων Α549 μετά LMB και θεραπεία DOX. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι το ποσοστό των κυττάρων σε G2 /M ήταν 15,1 ± 0,4, 26,9 ± 2,8, 22,7 ± 1,0, 22,9 ± 4,2, 22,5 ± 2,8, και 18,6 ± 1,3 στον έλεγχο, προ-DOX, LMB1, προ -ΟΟΧ + LMB1, LMB5, και προ-DOX + LMB5, αντίστοιχα (Πίνακας 2). Προ-DOX, LMB1, προ-DOX + LMB1, LMB5, και προ-DOX + LMB5 όλα είχε ως αποτέλεσμα μία συσσώρευση στην G2 /M φάση σε σχέση με έλεγχο (

P

& lt? 0,05, Σχήμα 2 και Πίνακας 2 ). Επιπλέον, η ανάλυση κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι το ποσοστό των κυττάρων σε προ-G1 ήταν 5.4 ± 2.2, 9.0 ± 2.1, 8.2 ± 2.0, 18.6 ± 7.1, 10.2 ± 4.7, και 27.5 ± 2.8 στον έλεγχο, προ-DOX, LMB1, προ-DOX + LMB1, LMB5, και προ-DOX + LMB5, αντίστοιχα (Πίνακας 2). Προ-DOX + LMB1 και προ-DOX + LMB5 οδήγησε σε οριστική συσσώρευση στο προ-G1 φάση έναντι όχι μόνο τον έλεγχο αλλά και LMB μόνο (

P

& lt? 0,01, Σχήμα 2 και Πίνακας 2). Ανάλυση της απόπτωσης αποκάλυψε ότι η θεραπεία LMB επάγεται σημαντικά κυτταρικής απόπτωσης (

P

& lt? 0,01, Πίνακας 2). Η απόπτωση αυξήθηκε περαιτέρω μετά κύτταρα συν-θεραπεία με προ-DOX και LMB σύγκριση με LMB μόνη (

P

& lt? 0,01, Πίνακας 2). Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων ήταν 13,2 ± 1,6, 15,8 ± 2,6, 19,2 ± 2,4, 27,1 ± 0,6, 22,4 ± 4,0, και 29,6 ± 2,1 στον έλεγχο, προ-DOX, LMB1, προ-DOX + LMB1, LMB5, και προ -ΟΟΧ + LMB5, αντίστοιχα (Πίνακας 2).

Εκπρόσωπος ιστογράμματα του κυτταρικού κύκλου αναλύει DOX και LMB-επεξεργασμένα κύτταρα Α549. Έλεγχος, προ-DOX, LMB1, προ-DOX + LMB1, LMB5, και προ-DOX + LMB5 συλλέχθηκαν και σημάνθηκαν με αντιδραστήριο κυτταρικού κύκλου γκουάβα (Millipore) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (προ-G1, G0 /G1, S, και G2 /M). Ο άξονας y δείχνει τον αριθμό των κυττάρων που μετρήθηκαν και το x-άξονας δείχνει μια αυξανόμενη ποσότητα του γκουάβα αντιδραστηρίου κυτταρικού κύκλου ενσωμάτωση /κύτταρο (αριστερά προς τα δεξιά). Πειράματα που διεξήχθησαν εις τριπλούν έδωσε παρόμοια αποτελέσματα. LMB1: 1 nM LMB, LMB5:. 5 nM LMB

Η

Δυτική Αναλύσεις Blot της p53, φωσφο-ρ53 (Ser15), φωσφο-ρ53 (Thr55), ρ21, και Survivin έκφρασης της πρωτεΐνης μετά DOX και LMB θεραπεία

τα επίπεδα έκφρασης του p53, φωσφο-ρ53 (Ser15), και ρ21 (ένας μεταγενέστερος στόχος της ρ53) ήταν σημαντικά αυξημένα σε κύτταρα κατεργασμένα με προ-DOX + LMB από εκείνα των ελέγχων και έδειξε ένα σημαντικό αποτέλεσμα δόσης-απόκρισης (Εικόνα 3Α). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ρ53 (αυθαίρετες μονάδες) ήταν 0,02 ± 0,00, 0,03 ± 0,00, 0,07 ± 0,00, 0,13 ± 0,03, 0,45 ± 0,01, και 0,44 ± 0,00 για τον έλεγχο, προ-DOX, LMB1, προ-DOX + LMB1, LMB5, και προ-DOX + LMB5, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β,

P

& lt?. 0.05, LMB1

vs

ελέγχου?

P

& lt? 0,01, προ -ΟΟΧ + LMB1, LMB5, ή προ-DOX + LMB5

vs.

ελέγχου). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης φωσφο-ρ53 (Ser15) (αυθαίρετες μονάδες) ήταν 0,06 ± 0,00, 0,06 ± 0,00, 0,13 ± 0,03, 0,15 ± 0,01, 0,21 ± 0,01, και 0,77 ± 0,04 για τον έλεγχο, προ-DOX, LMB1 , προ-DOX + LMB1, LMB5, και προ-DOX + LMB5, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β,

P

& lt? 0,05, LMB5

vs

ελέγχου?.

P

& lt? 0,01, προ-DOX + LMB5

vs

ελέγχου).. Επιπλέον, η αυξητική ρύθμιση του φωσφο-ρ53 (Ser15) σε προ-DOX + LMB5 ήταν σημαντική σε σύγκριση με την ομάδα LMB5 (

P

& lt? 0,01). Σχετικά επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ρ21 (αυθαίρετες μονάδες) ήταν 0,29 ± 0,08, 0,69 ± 0,01, 0,85 ± 0,09, 1,07 ± 0,03, 1,14 ± 0,08, και 1,57 ± 0,02 για τον έλεγχο, προ-DOX, LMB1, προ-DOX + LMB1 , LMB5 και προ-DOX + LMB5, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β,

P

& lt? 0,01, προ-DOX, LMB1, προ-DOX + LMB1, LMB5, και προ-DOX + LMB5

vs.

ελέγχου). Επιπλέον, η προς τα πάνω ρύθμιση του p21 σε προ-DOX + LMB5 ήταν σημαντική (

P

& lt? 0.05). Σε σύγκριση με την ομάδα LMB5

Α, Επίδραση της προ-DOX + LMB θεραπεία σχετικά με την πρωτεΐνη έκφραση του p53, φωσφο-ρ53 (Ser15), φωσφο-ρ53 (Thr55), ρ21, και survivin σε Α549. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5 μΜ ϋΟΧ 24 ώρες πριν από τη θεραπεία με LMB (1 ηΜ ή 5 ηΜ). Μετά τη θεραπεία LMB 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western για τον προσδιορισμό των επιπέδων πρωτεΐνης. Τα στυπώματα επίσης διερευνήθηκαν για α-τουμπουλίνης για να επιβεβαιωθεί ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης. Β, οι σχετικές εντάσεις των πρωτεϊνών ρ53, φωσφο-ρ53 (Ser15), φωσφο-ρ53 (Thr55), ρ21, και survivin σε σύγκριση με την ένταση του α-τουμπουλίνης. Η ένταση της κάθε ζώνης προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας Ποσότητα Ένα λογισμικό. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD, η = 3. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. LMB1: 1 nM LMB? LMB5: 5 nM LMB? *,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο? **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο? #,

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με LMB5? ##,

P

& lt?. 0.01, σε σύγκριση με LMB5

Η

Σε αντίθεση με p53, φωσφο-ρ53 (Ser15), και τα επίπεδα έκφρασης p21, φωσφο-ρ53 (Thr55) και survivin (άλλο κατάντη στόχος της ρ53) επίπεδα έκφρασης ήταν σημαντικά και η δόση εξαρτώμενο τρόπο μειώθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα με προ-DOX + LMB σε σύγκριση με εκείνες των ελέγχων (Σχήμα 3Α). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης φωσφο-ρ53 (Thr55) (αυθαίρετες μονάδες) ήταν 0,67 ± 0,06, 0,56 ± 0,01, 0,65 ± 0,01, 0,57 ± 0,00, 0,56 ± 0,01, και 0,42 ± 0,00 για τον έλεγχο, προ-DOX, LMB1 , προ-DOX + LMB1, LMB5, και προ-DOX + LMB5, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β,

P

& lt?. 0.01, προ-DOX + LMB5

vs

ελέγχου). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης survivin (αυθαίρετες μονάδες) ήταν 0,28 ± 0,02, 0,23 ± 0,03, 0,23 ± 0,05, 0,14 ± 0,01, 0,12 ± 0,05, και 0,08 ± 0,00 για τον έλεγχο, προ-DOX, LMB1, προ-DOX + LMB1, LMB5, και προ-DOX + LMB5 αντιμετωπίζονται ομάδες, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β,

P

& lt?. 0.05, προ-DOX + LMB5

vs

ελέγχου).

Επιδράσεις της ΔΟΞ και LMB για πυρηνική πρωτεΐνη Προφίλ

πυρηνική Εκχύλιση πρωτεΐνης.

η καθαρότητα των πυρηνικών και κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών ελέγχθηκε με τη χρήση ανάλυσης στυπώματος Western με αντι-ιστόνης 3 και αντι-α-τουμπουλίνης . Η πλειονότητα των α-τουμπουλίνης βρέθηκε μόνο στην κυτταροπλασματική κλάσμα από Α549 και κύτταρα NCI-H358? ιστόνης 3 βρέθηκε μόνο στο πυρηνικό κλάσμα από Α549 και κύτταρα ΝΟΙ-Η358, γεγονός που υποδηλώνει ότι το παρασκεύασμα εμπλουτίστηκε για πυρηνικές πρωτεΐνες (Σχήματα 4Α και S2A).

Α, κηλίδα Western των πρωτεϊνών εκχυλίσεις πυρηνικά και κυτταροπλασματικά από Α549? α-τουμπουλίνης χρησίμευσε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες, και ιστόνης 3 χρησίμευσε ως έλεγχος για πυρηνικές πρωτεΐνες. Β, 2D-ΨΗΦΟ αναλύσεις των πυρηνικών πρωτεϊνών στα κύτταρα Α549 και 3D θέα SQSTM1 στο κελί Α549 με τον έλεγχο του οχήματος ή θεραπεία LMB. Πυρηνικές πρωτεΐνες σε επεξεργασία με LMB ή όχημα ελέγχου σημάνθηκαν με Cy3 (πράσινη κανάλι) και Cy5 (κόκκινη ροή), αντίστοιχα. Πυρηνική πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με βάση το ισοηλεκτρικό σημείο (ΡΙ, οριζόντιος άξονας) και το μοριακό βάρος (ΜΒ, κάθετος άξονας).