Abstract

Η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου (IBD) είναι μια διαταραχή της χρόνιας φλεγμονής με αυξημένη ευαισθησία σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Η αιτιολογία της IBD είναι ασαφής, αλλά πιστεύεται ότι προκύπτει από μια απορρυθμισμένη προσαρμοστική και έμφυτη ανοσοαπόκριση σε μικροβιακά προϊόντα σε ένα γενετικά ευαίσθητο ξενιστή. υποδοχέας Toll-όπως (TLR) σηματοδότησης που προκαλείται από τα εντερικά συμβιωτικών βακτηρίων διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης του εντέρου, έμφυτη ανοσία και την ενίσχυση των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων ακεραιότητας (IEC). Ωστόσο, ο ρόλος του TLR2 στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου δεν έχει μελετηθεί. Αξιοποιήσαμε το μοντέλο ΑΟΜ-DSS για την κολίτιδα που σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου (CAC) σε αγρίου τύπου (WT) και ΤΙ_Ρ2

– /- ποντίκια. Άνω και κάτω τελεία που συγκομίζονται από WT και TLR2

– /- ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για ιστοπαθολογία, ανοσοϊστοχημεία, ανοσοφθορισμό και ανάλυση κυτοκίνης. Τα ποντίκια με ανεπάρκεια σε TLR2 αναπτύχθηκε σημαντικά περισσότερες και μεγαλύτερες παχέος όγκους από τους ελέγχους WT τους. Παρέχουμε αποδείξεις ότι το επιθήλιο του κόλου του TLR2

– /- ποντίκια έχουν αλλάξει ανοσολογικές αποκρίσεις και απορυθμισμένη πολλαπλασιασμό κάτω από συνθήκες σταθερής κατάστασης και κατά τη διάρκεια της κολίτιδας, τα οποία οδηγούν σε φλεγμονώδη σήματα ανάπτυξης και προδιάθεση για επιτάχυνση της νεοπλασματικής ανάπτυξης. Στο αξιολογούνται τα πρώτα χρονικά σημεία, TLR2

– /- παχύ έντερο παρουσίασαν σημαντική αύξηση της ανώμαλης εστίες κρύπτη (ACF), με αποτέλεσμα οι όγκοι που αναπτύσσονται νωρίτερα και μεγάλωσαν. Επιπλέον, η εντερική μικροπεριβάλλον αποκάλυψαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα IL-6 και IL-17Α ταυτόχρονη με αυξημένη φωσφο-STAT3 εντός ACF. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι στην κολίτιδα, TLR2 παίζει προστατευτικό ρόλο έναντι της ανάπτυξης CAC

Παράθεση:. Lowe EL, Crother TR, Rabizadeh S, Hu Β, Wang Η, Τσεν S, et al. (2010) ΤοΙΙ υποδοχέα 2 Σηματοδοσίας Προστατεύει ποντίκια από την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού του Καρκίνου Κολίτιδα-Induced. PLoS ONE 5 (9): e13027. doi: 10.1371 /journal.pone.0013027

Επιμέλεια: Kathleen A. Kelly, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια στο Λος Άντζελες, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 του Ιουνίου, 2010? Αποδεκτές: 30 Αύγ, 2010? Δημοσιεύθηκε: 27, Σεπτεμβρίου 2010

Copyright: © 2010 Lowe et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (ΑΙ-058128 συμπλήρωμα ΜΑ) και Donna και Jesse Garber Endowment (με KSM και ΜΑ). Επιπλέον, K.S.M. αυτή τη στιγμή υποστηρίζονται από τα του Crohn και Κολίτιδα Ίδρυμα της Αμερικής. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η χρόνια φλεγμονή και τον καρκίνο είναι συνυφασμένα, ειδικά στο έντερο, όπως φαίνεται στην φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (IBD). IBD πιστεύεται ότι προκύπτουν από μια ανάλυση στο επιθηλιακού φραγμού, που ακολουθείται από ακατάλληλες αποκρίσεις σε μικροβιακά προϊόντα με αποτέλεσμα την χρόνια φλεγμονή σε ένα γενετικά ευαίσθητο ξενιστή [1]. IBD σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο για καρκίνο του παχέος εντέρου και είναι σήμερα συνήθως πιστεύεται ότι η χρόνια φλεγμονή σε αυτούς τους ασθενείς οδηγεί στην νεοπλαστικό μετασχηματισμό του εντερικού επιθηλίου [2]. Η σωστή εντερική ανοσία βασίζεται στην ισορροπία μεταξύ ανοσοκαταστολή και κατάλληλα χρονικά απαντήσεις προφλεγμονωδών με προστατευτικό φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Προφλεγμονωδών κυτταροκινών και χημειοκινών που παράγονται κατά τη διάρκεια της χρόνιας εντερικής φλεγμονής σε απόκριση σε συμβιωτικών βακτηρίων δημιουργήσει ένα μικροπεριβάλλον που ενισχύει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση των κυττάρων, και την αγγειογένεση, προωθώντας έτσι την ογκογένεση [3].

εντερικά επιθηλιακά κύτταρα (IEC) πράξη ως η πρώτη γραμμή άμυνας με τη δημιουργία ενός φραγμού έναντι μικροβίων. Οι έμφυτο ανοσοποιητικό υποδοχείς που ανήκουν στην οικογένεια των ΤοΙΙ υποδοχέων (TLR) να βοηθήσει περαιτέρω IEC να διακρίνει φίλο από τον εχθρό από τα περίπλοκα περιβάλλον των μικροβίων. Υπάρχει ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία που να υποστηρίζουν ένα σημαντικό ρόλο για TLR σηματοδότηση για τη διατήρηση της ομοιόστασης εντερικής [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Ποντίκια φωτοαποδομηθεί του TLR2, TLR4, TLR9, ή κοινή μόριο προσαρμογέας τους MyD88, ήταν πιο έντονα ευαίσθητα σε κολίτιδα που επάγεται από τη χημική colitogen δεξτράνη θειικού νατρίου (DSS), οφείλεται εν μέρει στην εξασθενημένη προστατευτικές αποκρίσεις και μείωση της παραγωγής προσταγλανδίνης [7], [ ,,,0],8], [9], [10], [11]. Η θεραπεία με αντιβιοτικά επιδεινώθηκε DSS επαγόμενη κολίτιδα σε MyD88

– /- ποντίκια και εμπόδισε επιθηλιακά επισκευή, υποδεικνύοντας γενική σηματοδότηση TLR απαιτείται για τη σωστή ανανέωση IEC. Πράγματι, η θεραπεία με TLR2 [8] και TLR9 [12] συνδετήρες κατά τη χορήγηση DSS βελτιώνονται βλάβη κρύπτη και επιτάχυνε την επούλωση. TLR2-συμβιωτικό σηματοδότηση διατηρεί διεπιθηλιακή αντίσταση, προωθεί λαγηνοειδών κυττάρων έκκριση βλεννίνης, και διατηρεί την ομοιόσταση εντός IEC [8], [13], [14], [15]. Τέλος, λόγω της τάσεις της να παραποιήσει προς αποκρίσεις ΤΗ2 [16], [17], [18], [19] και την ενίσχυση της κανονιστικής επιβίωση των κυττάρων Τ [20], [21], [22], TLR2 σηματοδότηση θα μπορούσε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση ενός κατασταλτικού περιβάλλοντος στο παχύ έντερο.

Διάφορες μελέτες έχουν ενοχοποιήσει TLR σηματοδότηση στην εντερική ογκογένεση. Σε πολλαπλά εντερική νεοπλασία (Min) ποντικούς, απώλεια MyD88 σηματοδότηση μείωση του αριθμού των όγκων και μεγεθών υποδηλώνει ότι η σηματοδότηση MyD88 συμβάλλει στην ανάπτυξη και την εξέλιξη [23] του όγκου. Σε ένα διαφορετικό μοντέλο, εμφάνιση όγκου, πολλαπλότητα και το μέγεθος μειώθηκαν μετά αζοξυμεθάνιο (ΑΟΜ) και θεραπεία DSS όταν TLR4 αφαιρεθέντος σε ποντίκια μέσω αναγωγής της έκφρασης TLR4 και σηματοδότηση στα IEC [24], [25]. Επιπλέον, η κολίτιδα και κολίτιδα σχετιζόμενη όγκους του παχέος (CAC) που παράγεται αυθόρμητα σε IL10

– /- ποντίκια μπορούν να βελτιωθούν εάν τα ποντίκια διατηρούνται σε συνθήκες χωρίς μικρόβια [26] ή ταυτόχρονα αποκοπεί από TLR4 [27]. Στο σύνολό τους, αυτές οι μελέτες υποστηρίζουν ότι η ανάπτυξη CAC εξαρτάται από την εντερική αναγνώριση TLR βακτηρίων συμβιωτικών. Παρά τις εμφανείς ρόλους του TLR2 στην ομοιόσταση IEC και ενίσχυση της ανεκτικότητας στο μικροπεριβάλλον χορίου [28], [29], καμία μελέτη δεν έχει διευκρινιστεί το ρόλο που μπορεί να διαδραματίσει TLR2 στο μετασχηματισμό των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων που οδηγεί σε εντερική όγκους.

Εδώ έχουμε αποδείξει ότι TLR2-ανεπαρκή ποντίκια αναπτύσσουν όλο και μεγαλύτερη παχέος όγκους από τα ποντίκια ελέγχου WT μετά τη θεραπεία ΑΟΜ-DSS. Ενισχυμένη ανάπτυξη του παχέος όγκων αποδεικνύεται νωρίς από σημαντικά αυξημένους αριθμούς μη-φυσιολογικών κρυπτών εστιών (ACF) και αυξημένη παραγωγή IL-6, IL-17Α, TNFa και phosphoSTAT3 έκφραση στο εντερικό μικροπεριβάλλον του TLR2

– /- ποντίκια σε σύγκριση με WT ποντίκια. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι TLR2 είναι ένας σημαντικός προστατευτικός παράγοντας στην εντερικού επιθηλίου ομοιόσταση και παρέχουν σημαντικές πληροφορίες σε ένα προηγουμένως μη αναγνωρισμένο ρόλο του TLR2 σηματοδότησης στην CAC.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές και εγκεκριμένα πρωτόκολλα (IACUC # 2838) της φροντίδας των ζώων και τη χρήση επιτροπής Cedars-Sinai Medical Center θεσμικές και στεγάστηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες χωρίς παθογόνα.

Ζώα

Helicobacter αρνητικά άγριου τύπου C57BL /6J και TLR2

– /-. (on /6J φόντο C57BL) ποντικοί ελήφθησαν από το Jackson Laboratory (Bar Harbor, ΜΕ)

επαγωγή όγκων (Σχήμα 1Α)

Κολίτιδα σχετιζόμενη με ορθοκολικό καρκίνο (CAC) προκλήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Εν συντομία, ηλικίας 6-8 εβδομάδων ποντικοί ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (ΙΡ) με 12,5 mg /kg αζοξυμεθάνιο (ΑΟΜ? Sigma-Aldrich Chemical Co, St. Louis, ΜΟ). Μετά από 5 ημέρες, οι ποντικοί έλαβαν 2.5% δεξτράνη θειικού νατρίου (DSS? ΜΡ Biomedicals, Solon, ΟΗ, μοριακό βάρος 35,000-50,000 kDa) νερό για 5 ημέρες ακολουθούμενες από 16 ημέρες από την τακτική πόσιμο νερό. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε δύο κύκλους DSS, ακολουθούμενη από έναν τρίτο κύκλο με 2% DSS νερό χορηγούνται για 4 ημέρες ακολουθούμενη από κανονικό νερό για 10 ημέρες. Την ημέρα 61 μετά την ένεση οι ποντικοί ΑΟΜ ενέθηκαν ΙΡ με 100 mg /kg 5-βρωμο-2-δεοξυουριδίνη (BrdU? Sigma-Aldrich Chemical Co, St. Louis, ΜΟ) και θυσιάστηκαν 2,5 ώρες αργότερα. Για να παρατηρήσουμε τα πρώτα μετασχηματιστική βήματα CAC, τα ποντίκια θυσιάστηκαν 4 ημέρες μετά την ολοκλήρωση του πρώτου κύκλου DSS (14 ημέρες μετά ΑΟΜ). Η κλινική πορεία της νόσου παρακολουθήθηκε με μέτρηση του σωματικού βάρους, η παρατήρηση της πρωκτική αιμορραγία, διάρροια, και αιματηρά κόπρανα κατά τη διάρκεια της θεραπείας DSS.

(Α) Σχηματική επισκόπηση του μοντέλου CAC. Μετά την αρχική ένεση ΑΟΜ (12,5 mg /kg), DSS δόθηκε στο πόσιμο νερό (εγκιβωτισμένες περιοχές) που ακολουθείται από την τακτική πόσιμο νερό. Τα ποντίκια θανατώθηκαν την ημέρα 14 ή ένεση ΑΟΜ 61 δοκάρια (Ημέρα 61: n = 19 WT, n = 21 TLR2

– /- ποντίκια). (Β) την αλλαγή τοις εκατό του βάρους κατά τη διάρκεια της θεραπείας ΑΟΜ-DSS. θνησιμότητας (C) Ποντίκι κατά τη διάρκεια της θεραπείας ΑΟΜ-DSS. (Δ) Αριθμός των όγκων παχέος εντέρου ανά ποντίκι που προκαλείται από τη θεραπεία ΑΟΜ-DSS κατά την ημέρα 61. (Ε) Αριθμός όγκων ανά ποντίκι που βρίσκεται στο εγγύς ή άπω παχύ έντερο σε WT ή TLR2

– /- ποντίκια. (F) κατανομή μεγέθους των όγκων του παχέος σχηματίζονται σε WT ή TLR2

– /- ποντίκια. (G) Tumor επιβάρυνση στην ΑΟΜ-DSS θεραπεία WT ή TLR2

– /- ποντίκια. Όλες οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 95% διαστήματα εμπιστοσύνης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM. * = P & lt? 0,05, ** = ρ & lt? 0,01, *** = ρ & lt?. 0.001

Η

Ιστολογική Ανάλυση για Κολίτιδα και Δυσπλασία

Ολόκληρη η άνω και κάτω τελεία ξεπλύθηκαν με PBS και φλας -frozen στο ελβετικό προσανατολισμό ρολό. τομές 7-μm συλλέχθηκαν σε όλο το βάθος του παχέος εντέρου χρησιμοποιώντας κρυοστάτη και χρωματίστηκαν για αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε: Sigma-Aldrich). Ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις στην κολίτιδα και η φλεγμονή βαθμολογήθηκαν από έναν παθολόγο (HW) τυφλωμένοι με τους γονότυπους χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα συστήματα βαθμολόγησης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται στην ενότητα αποτελέσματα ως «συνολική βαθμολογία φλεγμονής», η οποία αντιπροσωπεύει το άθροισμα των βαθμολογιών δίνονται για «φλεγμονή», «έκταση και τη σοβαρότητα της διείσδυσης λευκοκυττάρων» και «επί τοις εκατό συμμετοχή του παχέος εντέρου». Ο ορισμός και βαθμολόγησης για αυτά τα subcriterias έχουν ως εξής:

Φλεγμονή ορίστηκε και σκόραρε ως

: (0) None στην κανονική λεμφικών αδρανών υλικών? (1) Η αυξημένη λεμφικών αδρανών υλικών? (2) Cryptitis (ουδετερόφιλα εντός κρύπτης επιθήλιο)? (3) Κρύπτη απόστημα (ουδετερόφιλα συσσωρεύονται στο εσωτερικό του αυλού κρύπτη, μερικές φορές με ρήξη κρύπτη)? (4) Η εξέλκωση (απώλεια του βλεννογόνου συστατικών και η παρουσία του κοκκιώδους ιστού).

Η έκταση της διείσδυσης λευκοκυττάρων βαθμολογήθηκε ως

: (0) Κανένας? (1) διήθηση περιορίζεται στον βλεννογόνο? (2) διήθηση επέκταση στον υποβλεννογόνιο? (3) διατοιχωματική επέκταση του inflitration.

Η σοβαρότητα της διείσδυσης των λευκοκυττάρων βαθμολογήθηκε με βάση τον αριθμό των διηθητικά κύτταρα ως

: (1) Ήπια? (2) Μέτρια? (3) Σοβαρή.

Ποσοστό Συμμετοχή του παχέος εντέρου βαθμολογήθηκε ως

: (0.25) εάν 1-25% του παχέος εντέρου συμμετείχε? (0.50) αν 26-50% του παχέος εντέρου συμμετείχε? (0.75) εάν 51-75% του παχέος εντέρου ενεπλάκη? (1.00) εάν ενεπλάκη 76-100% του παχέος εντέρου. Ξεχωριστά, έχουμε επίσης μπει το «

έκταση νέκρωσης

» στο κόλον ως εξής: (1) = 25%, (2) = 50%, (3) = 75%, (4) = 100% . Νεοπλάσματα εντοπίστηκαν και σκόραρε για την σοβαρότητα (αδένωμα ή καρκίνωμα

in situ

). Όγκου βάρους σε ποντίκια προσδιορίστηκε από το άθροισμα των εμβαδών όλων των όγκων ανά ποντίκι

BrdU και TUNEL χρώσης

Όλα τα νεοπλάσματα παρατηρούνται από την H & amp?. Ε επιβεβαιώθηκαν μετά BrdU χρώση χρησιμοποιώντας BrdU

In-Situ

Detection Kit (BD Pharmingen, San Diego, CA) σύμφωνα με το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η απόπτωση ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το

In Situ

κυτταρικού θανάτου Ανίχνευση Φλουορεσκεΐνη Kit (Roche, Indianapolis, IN), αντίθετα με DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) και ποσοτικά με ένταση φθορισμού ανά τομέα εστίασης χρησιμοποιώντας ImagePro Plus (Media Cybernetics , Silver Spring, MD). Εγγύς και άπω περιοχές του παχέος εντέρου εξετάστηκαν με τη χρήση μεγαλύτερη από τρεις τομείς εστίασης ανά περιφέρεια σε τουλάχιστον τέσσερις διαφάνειες ανά ζώο.

ανοσοφθορισμού

Κατεψυγμένα τμήματα σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμόλη. Τα πλακίδια χρωματίστηκαν για πυρηνικά αντιγόνα περαιτέρω καθορίζεται σε 100% μεθανόλη. Αντι-φωσφο-Stat3 και αντι-SS-κατενίνης (αμφότερα από την Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ) αντισώματα επωάστηκαν για 48 ώρες στους 4 ° C που ακολουθείται από επώαση με κατσίκας αντι-κουνελιού-568 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Βιοτινυλιωμένη αντι-νιτροτυροσίνη (Cayman, Ann Arbor, ΜΙ) επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C που ακολουθείται από επώαση με στρεπταβιδίνη-594 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Όλα τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν με DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA). Θετικά κύτταρα μετρήθηκαν σε μεγαλύτερη από πέντε τομείς εστίασης σε τουλάχιστον τέσσερις διαφάνειες ανά ζώο και πυρηνικά φωσφο-Stat3 ένταση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ImagePro Plus.

Απομόνωση και Θεραπεία της lamina propria μονοπύρηνα κύτταρα (LPMC) και μεσεντερίων λεμφαδένων κύτταρα (ΜΙΝ)

Για να αποκτήσετε κύτταρα LP, ολόκληρο το παχύ έντερο ήταν καλά ξεπλένονται με παγωμένο PBS. One-mm τεμάχια παχέος εντέρου επωάστηκαν σε HBSS συμπληρωμένο με 1 mM DTT, 3 mM EDTA, 20 mM HEPES με ανακίνηση στους 37 ° C για 20 λεπτά. κομμάτια Colon πλύθηκαν με HBSS ακολουθούμενη από επώαση σε ρυθμιστικό διάστασης (0.075 U /ml Blendzyme 3, 1,5 U /ml Δισπάσης II, 0,5 mg /ml Dnase Ι [όλα Roche Diagnostics, Mannheim, Germany], 20 mM HEPES, 1,3 mM ασβεστίου χλωρίδιο) με ανάδευση στους 37 ° C για 50 λεπτά. Οι πέψη κόλον στροβιλίστηκαν σύντομα και περαιτέρω διαχωρίστηκαν με αυξανόμενη βελόνες διαμετρήματος, διέρχεται μέσω ενός 40 μm κύτταρο σουρωτήρι και πλένονται με PBS. Μετά από φυγοκέντρηση το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε ένα διάλυμα 45% ΡθγοοΙΙ και που πάνω από ένα διάλυμα 72% Percoll. Τα κύτταρα που βρίσκονται στα μεσόφασης συλλέχθηκαν σε ένα καθαρό σωληνάριο και πλύθηκαν αρκετές φορές. MLN συνεθλίβησαν μεταξύ γυάλινες πλάκες και πλύθηκαν με PBS. Το κυτταρικό εναιώρημα διέρχεται μέσα από ένα σουρωτήρι κύτταρο 40 μm και πλύθηκαν με RPMI. Απομονωμένα λεμφοκύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 10% FBS-υψηλής RPMI γλυκόζη συμπληρωμένο με L-γλουταμίνη (Cellgro? Mediatech Inc., Herndon, VA) και 1% αντιβιοτικό /αντιμυκητιασικό (Sigma-Aldrich Chemical Co, St. Louis, ΜΟ), και διεγέρθηκαν με 1 μg /ml αντι-CD3 (eBioscience, San Diego, CA) και 1 μg /ml αντι-CD28 (eBioscience) για 72 ώρες ή με LPS 1 μg /ml (InvivoGen, San Diego, CA) για 6 ώρες. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C.

Παρασκευή ομογενοποιήματα Colon

κόλον ξεπλένονται καλά με παγωμένο PBS. Άνω και κάτω τελεία στη συνέχεια flash-καταψύχεται σε υγρό άζωτο. Τα πλυμένα και αποστειρωμένα σφαιρίδια οξειδίου του ζιρκονίου (διάμετρος 0,5 mm, που Next Advance, Cambridge, ΜΑ) προστέθηκαν σε όγκο ίσο με εκείνο του ιστού. ιστούς του παχέος εντέρου στη συνέχεια εν συντομία μηχανικά ομογενοποιείται χρησιμοποιώντας το Bullet Blender (Next Advance, Cambridge, ΜΑ) στους 4 ° C. Ένα ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (1 mM EDTA, 50 mM HEPES-NaOH, ρΗ 7,9, 250 mM NaCl, 20 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 1 mM ενεργοποιημένο ορθοβαναδικό, 1% ΝΡ-40, 1 mM DTT) στη συνέχεια προστέθηκε στον ιστό και χάντρες σε όγκο ίσο με εκείνο του ιστού. Αυτό περαιτέρω ομογενοποιείται ακολουθούμενο από περιστροφή στους 4 ° C για 20 λεπτά. Ομογενοποιημένο ιστοί φυγοκεντρήθηκαν για 20 λεπτά στους 4 ° C και 16.100

g

και τα υπερκείμενα φυλάχτηκαν στους -80 ° C.

ELISAs

Τα υπερκείμενα, ομογενοποιήματα παχέος εντέρου ή του ορού ήταν αναλύθηκαν για την παρουσία του TNFa, IL-4, IFNg, IL-17Α, IL-23ρ19 (όλα eBioscience, San Diego, CA), IL-10, IL-6, TGFß, ΜΙΡ-2 (όλα R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ), ή KC, MCP-1 και RANTES (όλα BD Biosciences, San Jose, CA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο που προτείνεται από τον κατασκευαστή.

Στατιστική ανάλυση

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση το λογισμικό GraphPad Prism 4. Στατιστική ανάλυση των καμπυλών επιβίωσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία log-rank. Οι στατιστικές αναλύσεις των μεγεθών των όγκων έγιναν χρησιμοποιώντας το Mann-Whitney test για τους πληθυσμούς δεν ακολουθεί Gaussian κατανομές. Συγκρίσεις δεδομένα μιας μεταβλητής εξής Gaussian κατανομές πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Τ-test δύο ουρών unpaired Student. Όταν ένα F-test έδειξε διακυμάνσεις διέφεραν σημαντικά, διόρθωση Welch στην T-test του Student χρησιμοποιήθηκε. Οι συγκρίσεις των δύο μεταβλητών δεδομένων εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ΑΝΟνΑ με δοκιμή Bonferroni δοκάρια. Συγκρίσεις των δεδομένων καμπύλης επιβίωσης έγιναν χρησιμοποιώντας το log-rank (Mantel-Cox) τεστ. Όλες οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 95% διαστήματα εμπιστοσύνης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM. * = P & lt? 0,05, ** = ρ & lt? 0,01, *** = ρ & lt?. 0.001

Αποτελέσματα

TLR2-ανεπάρκεια οδηγεί σε αυξημένη ανάπτυξη της κολίτιδας που σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι TLR σηματοδότηση και η MyD88 μόριο κοινή προσαρμογέας είναι κριτικά εμπλέκονται στην εντερική ομοιοστασία επιθηλιακών κυττάρων και την ανάπτυξη των εντερικών όγκων [9], [10], [23], [24], αλλά ο ρόλος του TLR2 δεν έχει μελετηθεί εκτεταμένα. Για να εξεταστεί ο ρόλος του TLR2 διάρκεια κολίτιδα σχετιζόμενη ογκογένεση χρησιμοποιήσαμε ένα καθιερωμένο μοντέλο του CAC [4], [24], [30], [31], [32]. WT και TLR2

– /- ποντίκια έλαβαν μια μόνο ένεση του ΑΟΜ που ακολουθείται από χορήγηση τρεις κύκλους του DSS (Σχήμα 1Α). TLR2

– /- ποντίκια είχαν αυξημένη νοσηρότητα όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη απώλεια βάρους κατά τη διάρκεια της θεραπείας (Σχήμα 1Β) και περισσότερο πρωκτική αιμορραγία κατά τη διάρκεια της θεραπείας DSS, σε σύγκριση με τα ποντίκια WT (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Βρήκαμε επίσης αυξημένη θνησιμότητα στην TLR2 – /- ποντίκια σε σύγκριση με ποντίκια άγριου τύπου (4,6% για το WT και 25% για ΤΙ_Ρ2

– /- ποντίκια, αντίστοιχα, p & lt? 0.05), με τους περισσότερους θανάτους συμβαίνουν λίγο μετά την πρώτη διάρκεια του DSS (Σχ 1C). Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της TLR2-ανεπάρκειας για την ανάπτυξη των όγκων κολίτιδα σχετιζόμενη. TLR2

– /- ποντίκια είχαν υψηλότερο φορτίο του όγκου από τα ποντίκια WT. Histolopathological εξέταση αποκάλυψε μια σημαντική αύξηση του αριθμού των όγκων σε TLR2

– /- σε σύγκριση με WT ποντικούς (Σχήμα 1 D). Ο μέσος αριθμός των όγκων ανά ποντικό σχεδόν διπλασιάστηκε σε TLR2-ανεπαρκή ποντίκια σε σύγκριση με WT ποντικούς (6,1 έναντι 3,5, ρ & lt? 0,05). Επειδή εντερική TLR2 είναι πιο έντονα εκφράζεται στο εγγύς κόλον [33], υποθέσαμε ότι ποντίκια που στερούνται TLR2 θα αναπτυχθεί περισσότερο CAC εγγύτατα. Πράγματι, η διαφορά στην ανάπτυξη του όγκου σε TLR2

– /- σε σύγκριση με WT ποντικούς ήταν περισσότερο εμφανής στο εγγύς κόλον (Σχήμα 1 Ε). Εκτός από την αύξηση της έκτασης του όγκου, TLR2-ανεπάρκεια οδήγησε επίσης σε σημαντικά υψηλότερο αριθμό μεγαλύτερων όγκων (& gt? 1 mm

2) (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 1 F) και υψηλότερο φορτίο του όγκου (σχεδόν διπλάσιο) σε TLR2

– /- ποντίκια σε σύγκριση με WT ποντικούς (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 1 G). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι TLR2-ανεπάρκεια βελτιώνει όχι μόνο την προώθηση όγκων αλλά επίσης αυξάνει την εξέλιξη του όγκου.

TLR2 ανεπάρκεια παχύ έντερο έχουν πιο προχωρημένη δυσπλασία και της έκφρασης β-κατενίνης σε σύγκριση με το WT παχύ έντερο

β-κατενίνης σηματοδότηση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανθρώπινη εντερική καρκινογένεση [34] και τις μεταλλάξεις έχουν αναφερθεί σε κολονικό όγκους μυοειδούς ΑΟΜ που προκαλείται [30], [31], [35]. Πράγματι, έντονα θετική κυτταροπλασματική ή πυρηνική χρώση β-κατενίνης παρατηρήθηκε σε μετασχηματισμένο ιστό σε WT και TLR2

– /- ποντίκια (Σχήμα 2Β). WT αδενώματα του παχέος εντέρου (σχήμα 2Α, Β, αριστερά 2 πάνελ) εμφανίζεται κλασικό σωληνοειδείς δομές με διαστρεβλωμένη αδένες και μέτρια οργάνωση. Ωστόσο, TLR2

– /- του παχέος νεοπλάσματα (Σχήμα 2Α, Β, δεξιά 2 πάνελ) εμφανίζεται αλλοιωμένη αδένες με τις περιοχές αυξημένης δομών αποδιοργάνωσης και ηθμοειδή ενδεικτικό του υψηλότερου βαθμού δυσπλασία (δηλαδή καρκίνωμα

in situ)

. Στην πραγματικότητα, η ιστολογική ανάλυση αποκάλυψε σχεδόν διπλάσια συχνότητα εμφάνισης προχωρημένο καρκίνωμα

in situ

(0.3 vs 0.6 σημαίνει καρκίνωμα in situ ανά ποντικό) σε TLR2

– /- ποντίκια σε σύγκριση με WT, που κινήθηκαν προς σημαντικότητα (p & lt? 0,055) (Εικόνα S1)

Η ιστοπαθολογική εξέταση των άνω και κάτω τελείες κατά την ημέρα 61 της θεραπείας ΑΟΜ-DSS.. (Α) με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η & amp? Ε) (αριστερά) ή BrdU χρώση (δεξιά) σειριακή τμήματα της WT ή TLR2

– /- ποντίκια εμφανίζονται. Αρχικό μεγέθυνση 20x (άνω πάνελ) και 100x (κάτω πάνελ) παρουσιάζονται. (Β) χρώση ανοσοφθορισμού για β-κατενίνης. Αρχική μεγέθυνση 100Χ (αριστερό πάνελ) ή 400x (δεξιά πλευρά).

Η

TLR2-ανεπάρκεια οδηγεί σε αυξημένη πρώιμη σχηματισμό ανώμαλης εστιών κρύπτης και στις αρχές του εντέρου ογκογένεση

Επειδή TLR2

– /- ποντίκια ανέπτυξαν σημαντικά μεγαλύτερο παχέος όγκους, είμαστε δίπλα εξέτασε WT και TLR2 ανεπάρκεια παχύ έντερο 14 ημέρες στο σχήμα ΑΟΜ-DSS για τις πρώτες μετασχηματιστική γεγονότα κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης. Σε αυτό το χρονικό σημείο, TLR2

– /- ποντικοί έδειξαν σημαντικά αυξημένη φλεγμονή σε σύγκριση με το WT ποντίκια (συνολική βαθμολογία φλεγμονής 4 vs 6, ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 3Α). Άνω και κάτω τελεία από TLR2

– /- ποντίκια περιείχαν μέτρια έως σοβαρή φλεγμονή που επεκτείνεται μέσω τοιχώματος ενώ φλεγμονής σε WT παχύ έντερο που παρέχεται σε παρόμοιες βάθη, αλλά εμφανίζεται μόνο ήπια έως μέτρια διήθηση των λευκοκυττάρων (Σχήμα 3D). Η αυξημένη φλεγμονή βρεθεί σε αυτό το χρονικό σημείο (14η ημέρα) σε TLR2 – /- ποντίκια συσχετίστηκε επίσης με την πιο σοβαρή απώλεια σωματικού βάρους και αυξημένη θνησιμότητα κατά τη διάρκεια του πρώτου κύκλου του DSS σε μακροχρόνια μελέτη μας (Σχήμα 1Β-C). WT ποντίκια υπέστησαν περαιτέρω πιο εκτεταμένη εξέλκωση και νέκρωση από TLR2

– /- ποντίκια (έκταση της νέκρωσης σε κόλον 2.5 vs 1.3, ρ & lt? 0,01) (Σχήμα 3Β, D). Αντ ‘αυτού, TLR2

– /- ποντίκια παρουσίασε σημάδια αναγέννησης με εξάντληση βλεννίνη, διευρυμένη και υπερχρωματικό πυρήνες, και αυξημένη λόγο πυρήνα προς κυτόπλασμα, όλα ενδεικτική της μη-φυσιολογικών κρυπτών εστιών (ACF), που είναι γνωστό ότι είναι προ-νεοπλασματικές [36 ] (Σχήμα 3D, δεξί πάνελ). Επιπλέον, παρατηρήσαμε παρόμοια πολλαπλασιασμό αλλά μειωμένη απόπτωση σε TLR2

– /- ACF σύγκριση με WT ACF (Σχήμα 3Ε, F), που μπορούν να συμβάλλουν στην επιβίωση των μετασχηματισμένων κυττάρων. Πράγματι, η ποσοτική ανάλυση των ACF αποκάλυψε σημαντική αύξηση των ACF σε TLR2

– /- ποντίκια σε σύγκριση με WT ποντικούς σε εγγύς (ρ & lt? 0.001). Καθώς και άπω παχύ έντερο (ρ & lt? 0,01) (Σχήμα 3C)

Η βαθμολόγηση της φλεγμονής, νέκρωση και ACF κατά την ημέρα 14 της θεραπείας ΑΟΜ-DSS (n = 5 WT και n = 5 TLR2

– /-). (Α) Φλεγμονώδεις βαθμολογίες των άνω και κάτω τελείες. (Β) Έκταση του παχέος νέκρωση. (C) Αριθμός ACF ανά ποντίκι που βρίσκεται στο εγγύς ή άπω παχύ έντερο. (Δ) Η & amp? Ε λεκέδες των σειριακών τμημάτων της άνω και κάτω τελεία. Αρχικό μεγέθυνση 40x (άνω τμήμα) ή 100Χ (κάτω πίνακας). (Ε) Ανοσοϊστοχημική λεκέδες για BrdU. Αρχικό 100x μεγέθυνση. χρώση (F) ανοσοφθορισμού TUNEL. Αρχικό 100x μεγέθυνση. Όλες οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 95% διαστήματα εμπιστοσύνης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM. * = P & lt? 0,05, ** = ρ & lt? 0,01, *** = ρ & lt?. 0.001

Η

TLR2-ανεπάρκεια έχουν αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μειωμένη απόπτωση κατά την πρώιμη CAC ανάπτυξης

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η αναγνώριση των βακτηρίων συμβιούντα μέσω TLRs απαιτείται για εντερικά επιθηλιακά ομοιόσταση, η οποία ελέγχεται από την ισορροπία του πολλαπλασιασμό και την απόπτωση στις κρύπτες [10]. Για να συγκριθούν εντερική ομοιοστασία μεταξύ TLR2

– /- ποντίκια και ποντίκια WT, εξετάσαμε πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων με ενσωμάτωση BrdU και την απόπτωση με χρώση TUNEL για κατάτμηση του DNA σε κολικό κρύπτες. Είναι ενδιαφέρον ότι, πριν από την ΑΟΜ-DSS παρατηρήσαμε σημαντικά μειωμένη αριθμούς BrdU

+ κύτταρα (Σχήμα 4Α) με σημαντικά αυξημένους αριθμούς TUNEL

+ κύτταρα (Σχήμα 4Β) ανά κρύπτη στο εγγύς και άπω παχύ έντερο του TLR2

– /- ποντίκια σε σύγκριση με τους WT. Αντίθετα, μετά από ένα γύρο θεραπείας DSS (ημέρα 14), TLR2

– /- εντερικών κρυπτών επέδειξαν αυξημένη BrdU

+ κύτταρα (ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 4Α, C) και μειωμένη TUNEL

+ κύτταρα (p & lt? 0.001) (Σχήμα 4Β, D) σε σύγκριση με ποντίκια WT, αναφέροντας απορυθμίζεται επιθηλιακά ομοιόστασης σε TLR2

– /- παχύ έντερο κατά τη διάρκεια φλεγμονώδεις καταστάσεις. Επιπλέον, μολονότι η BrdU

+ κύτταρα πρωτίστως εντοπίζεται στην ζώνη των βλαστικών κυττάρων του κρυπτών WT, πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα βρέθηκαν επεκτάθηκε στη μέση περιοχές του TLR2

– /- κρύπτες, όπου τα επιθηλιακά κύτταρα είναι φυσιολογικά διαφοροποιημένα και μη-πολλαπλασιαζόμενα (Σχήμα 4C). Ως εκ τούτου, όπως βλεννογόνου ακεραιότητα επηρεάστηκε σε παχύ έντερο ανεπάρκεια των TLR2, η ικανότητα του IEC να τηρούν τα κατάλληλα σήματα επιβίωσης και θανάτου ήταν σε κίνδυνο, με αποτέλεσμα αντί σε απορυθμισμένη κυτταρική επιβίωση. Για να επιβεβαιωθεί ότι η πρώιμη εντερική ογκογένεση σε TLR2

– /- ποντίκια εξαρτάται από DSS που προκαλείται από φλεγμονή εξετάσαμε WT και TLR2

– /- ποντίκια 14 ημέρες μετά από μία μόνο ένεση του ΑΟΜ (καμία θεραπεία DSS) ως έλεγχοι. Δεν παρατηρήσαμε καμία ευδιάκριτη ACF ή αυξημένη φλεγμονή σε WT ή TLR2-ανεπαρκή παχύ έντερο σε αυτά τα πειράματα ελέγχου (Εικόνα S2) που υποδηλώνει την σημασία της φλεγμονής για την ανάπτυξη των όγκων στα πλαίσια της TLR2-ανεπάρκειας.

Εκτίμηση του πολλαπλασιασμού με χρώση BrdU και την απόπτωση με χρώση TUNEL σε εγγύς και άπω παχύ έντερο από ποντικούς είτε σε θεραπεία για 14 ημέρες με το σχήμα ΑΟΜ-DSS (Ημέρα 14) ή χωρίς θεραπεία ποντικούς (Ημέρα 0) (n = 5), BrdU

+ (Α) και TUNEL

+ κύτταρα (Β) μετρήθηκαν σε ανέπαφα και καλά προσανατολισμένη κρύπτες. BrdU

+ κύτταρα ποσοτικά από τουλάχιστον 20 κρύπτες ανά περιοχή από 4 διαφορετικές διαφάνειες ανά ζώο. (Γ) Ημέρα 14 αντιπροσωπευτικά ανοσοϊστοχημικές κηλίδες για BrdU σε κολικό τμήματα. Αρχικό 100x μεγέθυνση. (D) Ημέρα 14 αντιπροσωπευτικά ανοσοφθορισμού λεκέδες για ΤϋΝΕΕ λεκέδες στα παχέος τμήματα. Αρχικό 100x μεγέθυνση. Όλες οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 95% διαστήματα εμπιστοσύνης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM. . * = Ρ & lt? 0,05, ** = ρ & lt? 0,01, *** = ρ & lt? 0.001

Η

TLR2

– /- ποντίκια έχουν αυξημένη IL-6 και την ενεργοποίηση STAT3 κατά την πρώιμη εντερική ογκογένεση

Εκτός από την αυξημένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και φλεγμονή, ανιχνεύσαμε σημαντικά αυξημένα επίπεδα της IL-6 στον ορό σε TLR2

– /- ποντίκια σε πρώιμα στάδια της ογκογένεσης μετά την αρχική θεραπεία ΑΟΜ-DSS (ημέρα 14) σε σύγκριση να WT ποντικούς (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 5Α). Σημαντικά, IL-6 προωθεί την εξέλιξη του όγκου σε μοντέλα όγκων που σχετίζεται με φλεγμονή μέσω της ενεργοποίησης του STAT3 [37], [38]. Δεν παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές στις συγκεντρώσεις ορού των άλλων προ-φλεγμονωδών κυτοκινών ή χημειοκινών (IL-12ρ40, IL-1β, MCP-1, KC, και ΜΙΡ-2) μεταξύ WT και TLR2

– /- ποντίκια σε ημέρα 14 της θεραπείας ΑΟΜ-DSS (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μπορούμε επίσης ανιχνεύθηκε αυξημένη παραγωγή IL-6 σε ολόκληρο ομογενοποιήματα κόλον από TLR2

– /- ποντίκια την 14η ημέρα της θεραπείας ΑΟΜ-DSS σε σύγκριση με WT ποντικούς (ρ & lt? 0,01) (Σχήμα 5Β). Έλασμα propria μονοπύρηνα κύτταρα (LPMC) απομονώθηκαν από TLR2

– /- ποντικών που υπέστησαν αγωγή με LPS παρήγαγε επίσης περισσότερο IL-6 από WT LPMC (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 5C). Συνεπής με την αύξηση παραγωγής IL-6 σε TLR2

– /- ποντίκια σε πρώιμα στάδια της ογκογένεσης, παρατηρήσαμε σημαντικά αυξημένη πυρηνική συσσώρευση της φωσφορυλιωμένης (ενεργοποιημένης) STAT3 (pSTAT3) σε TLR2

– /- επιθήλιο σε σύγκριση με WT άνω και κάτω τελείες (Σχήμα 5Ε). Ποσοτικοποίηση της έντασης των πυρηνικών pSTAT3 σε ACF αποκάλυψε μια 8-πλάσια αύξηση στην έκφραση pSTAT3 σε TLR2

– /- ACF σύγκριση με WT ACF την ημέρα 14 (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 5F). Επιπλέον, ενώ η έκφραση των πυρηνικών pSTAT3 μέσα TLR2

– /- ACF περιορίστηκε σε άθικτο κρύπτη επιθηλιακά κύτταρα (Σχήμα 5Ε, δεξιά πλευρά), η πυρηνική pSTAT3 στο WT ACF εμφανίστηκε κυρίως σε ατομικό υμένα ή αποστηματικός κρύπτες (Σχήμα 5Ε, αριστερό πάνελ) . Ποσοτική ανάλυση των pSTAT3 κατά την έναρξη δεν αποκάλυψε διαφορές σε TLR2

– /- έναντι WT ποντίκια (Σχήμα 5F)

Πίνακες Α-Γ:. Παραγωγή IL-6 στο WT και TLR2

– /- ποντίκια την 14η ημέρα της θεραπείας ΑΟΜ-DSS μετρήθηκε με ELISA. (Α) Τα επίπεδα ορού της IL-6 (n = 8 WT, n = 9 TLR2

– /-). (Β) IL-6 συγκέντρωση σε ομογενοποιήματα κόλον κανονικοποιήθηκε ως προς τη συγκέντρωση πρωτεΐνης στους ιστούς (n = 3 WT, η = 5 TLR2

– /-). (C) IL-6 έκκρισης από απομονωμένα κύτταρα του κόλου propria lamina σε επεξεργασία με LPS (1 μg /ml) για 6 h (n = 3-5). (D) ανοσοφθορισμού λεκέδες του φωσφο-Stat3 σε κολονική ιστούς του WT και TLR2

– /- ποντίκια κατά την έναρξη. Αρχικό 100x μεγέθυνση. (Ε) χρώση ανοσοφθορισμού της φωσφο-Stat3 σε κολονική ιστούς του WT και TLR2

– /- ποντίκια σε αγωγή για 14 ημέρες με το σχήμα ΑΟΜ-DSS. Κορυφαία πάνελ αρχική μεγέθυνση 40x, κάτω πίνακα αρχική μεγέθυνση 400x. (F) Ποσοτικοποίηση της φωσφο-Stat3 ένταση μετράται σε ACF από μεγαλύτερη από πέντε τομείς εστίασης σε τουλάχιστον τέσσερις διαφάνειες ανά ζώο (η = 5 WT και n = 5 TLR2

– /-). Όλες οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 95% διαστήματα εμπιστοσύνης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM. . * = P & lt? 0,05, ** = ρ & lt? 0,01, *** = ρ & lt? 0.001

Η

TLR2

– /- ποντίκια έχουν αυξημένη Τ

H17 ανοσολογική απόκριση κατά τη διάρκεια της CAC ανάπτυξη

Πρόσφατες μελέτες κατέδειξαν Τ

Η17 κύτταρα στην παθογένεση της IBD [39] και την ογκογένεση του παχέος εντέρου [40]. Εξετάσαμε την έκφραση του Τ

H1, Τ

H2 και Τ

H17 κυτοκινών στο παχύ έντερο των WT και TLR2

– /- ποντίκια κατά τη διάρκεια της πρώιμης ανάπτυξης CAC. Ενώ παρατηρήσαμε μειωμένη παραγωγή IFNg από ομογενοποιήματα κόλον προέρχεται από TLR2

– /- ποντίκια σε σύγκριση με WT ποντικούς την ημέρα 14 (Σχήμα 6Α), παρατηρήσαμε σημαντικά υψηλότερο παραγωγής TNFa σε TLR2 με ανεπάρκεια colons σύγκριση με WT σύμβολο (ρ & lt? 0,05) (Σχ 6Η), μία κυτοκίνη Th 1 είναι γνωστό ότι παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη CAC [32]. Δεν παρατηρήσαμε καμία στατιστικά σημαντικές διαφορές στα επίπεδα της IL-4 (Σχήμα 6C) IL-10 (Σχήμα 6Β) ή στα κολονικό ομογενοποιήματα σε αυτά τα ζώα. Σε αντίθεση, παρατηρήσαμε μια περισσότερο από 2-φορές αύξηση στην IL-17α στην TLR2

– /- ομογενοποιημένα κόλου σε σύγκριση με WT (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 6D). Απομονωμένη LPMCs από TLR2

– /- ποντίκια επίσης παράγεται μεγαλύτερη από 7-φορές περισσότερο IL-17Α σε σύγκριση με το WT κύτταρα όταν επαναδιεγείρονται με αντι-CD3e και αντι-CD28 (ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 6Ε). Παρατηρήσαμε επίσης σημαντικά αυξημένη παραγωγή ΤΟΡ-β σε TLR2 με ανεπάρκεια colons σύγκριση με WT σύμβολο (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 6F). Η αυξημένη παραγωγή του TGF-b ‥ IL-6, και pStat3 σε TLR2

– /- ποντίκια σε σύγκριση με WT υποστηρίζει περαιτέρω τη συμμετοχή των Τ

H17 κύτταρα. IL-23ρ19 είναι μια κυτοκίνη που έχει εμπλακεί στην διατήρηση της Τ

Η17 κύτταρα [41]. Παρατηρήσαμε ότι TLR2

– /- ομογενοποιημένων του παχέος εντέρου έχουν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα IL-23ρ19 κατά την έναρξη σε σύγκριση με το WT άνω και κάτω τελείες (p & lt? 0.001) (Σχήμα 6G). Ωστόσο, μετά την 14η ημέρα της θεραπείας ΑΟΜ-DSS, IL-23ρ19 η παραγωγή αυξήθηκε σημαντικά σε TLR2

– /- παχύ έντερο, μειώνοντας παράλληλα το WT παχύ έντερο (p & lt? 0.001) (Σχήμα 6G), υποστηρίζοντας περαιτέρω την αλληλεπίδραση των TLR2 και Τ

Η17 κύτταρα σε αυτό το μοντέλο. Επιπλέον, σε σύγκριση με το παχύ έντερο WT την ημέρα 14 της θεραπείας ΑΟΜ-DSS, TLR2

– /- παχύ έντερο εμφανίζονται σημαντικά πιο παχέος παραγωγής TNFa (Σχήμα 6Η), είναι γνωστό ότι παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη CAC [32].