Αφηρημένο

Twist1 υπερέκφραση συχνά παρατηρείται σε διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του στομάχου (GC). Παρά το γεγονός ότι το DNA μεθυλίωση του

Twist1

γονίδιο έχει αναφερθεί σε καρκινικά κύτταρα, οι μηχανισμοί που διέπουν τη μεταγραφική ενεργοποίηση παραμένουν αβέβαιες. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε πρώτα επιγενετικές αλλαγές του

Twist1

χρησιμοποιώντας το

Twist1

μεταγραφή-θετικά και -αρνητικοί κυτταρικές σειρές που προέρχονται από την πάγια διάχυτη τύπου μοντέλο ποντικού GC μας. Η θεραπεία με έναν παράγοντα για το DNA απομεθυλίωση 5-αζα-άΟ επανεργοποίησε έκφραση Twist1 σε Twist1 έκφραση-αρνητικά κύτταρα GC. Σύμφωνα με την ειδική της μεθυλίωσης PCR και ανάλυση θειώδους αλληλουχίας, μεθυλίωση στο CpG-πλούσια περιοχή μέσα στο

Twist1

κωδικοποίησης εξόνιο 1, παρά περιοχή του υποκινητή του, ήταν στενά συνδεδεμένη με μεταγραφική σίγηση του

Twist1

έκφραση σε κύτταρα GC ποντικού. Χρωματίνης προσδιορισμοί ανοσοκαθίζησης αποκάλυψε ότι η ενεργός σήμα της ιστόνης H3K4me3 εμπλουτίστηκε στην έκφραση-θετικά κύτταρα Twist1, και ανενεργών σήμα της ιστόνης H3K9me3 εμπλουτίστηκε στην έκφραση-αρνητικά κύτταρα Twist1. Τα επίπεδα έκφρασης του

Suv39h1

και

Suv39h2

, μεθυλτρανσφεράσες ιστονών για H3K9me3, ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το

Twist1

έκφρασης, και νοκ ντάουν του

Suv39h1

ή

Suv39h2

που προκαλείται

Twist1

έκφρασης. Επιπλέον, Sp1 παράγοντα μεταγραφής δεσμεύεται στο εξόνιο 1 ΟρΟ-πλούσια περιοχή στην έκφραση-θετικές κυτταρικές σειρές Twist1, και

Twist1

έκφραση ελαττώθηκε από μιθραμυκίνη, η οποία που παρεμβαίνει στην δέσμευση Sp1 να CpG πλούσιων σε ρυθμιστικές αλληλουχίες. Οι μελέτες μας πρότεινε ότι η

Twist1

μεταγραφή στα κύτταρα GC μπορεί να ρυθμίζεται μέσω πιθανή συνεργασία της μεθυλίωσης του DNA, τροποποίηση των ιστονών σε συγκρότημα με δεσμευτική Sp1 σε CpG πλούσιων περιοχών εντός της περιοχής εξόνιο 1.

Παράθεση: Sakamoto Α, Akiyama Υ, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Υ, Tanaka S (2015) μεθυλίωση του DNA στο 1 Περιφέρεια εξόνιο και πολύπλοκες κανονιστικές ρυθμίσεις της Twist1 έκφραση στα κύτταρα του καρκίνου του στομάχου. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10.1371 /journal.pone.0145630

Επιμέλεια: Tae-Young Ρο, Ποχάνγκ Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας (POSTECH), Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 21, Σεπτεμβρίου του 2015? Αποδεκτές: 6 Δεκεμβρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 22, Δεκ του 2015

Copyright: © 2015 Sakamoto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (C) (24.590.444) και (Α) (25.253.081), και το Πρόγραμμα Α3 Προοπτικής (AA005) από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPs), και την πρακτική έρευνα για την καινοτόμο Ελέγχου Καρκίνου (15Ack0106017h0002) από την Ιαπωνία Οργανισμό για την Ιατρική Έρευνα και την Ανάπτυξη, Αμέντ? https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.

ανταγωνιστικά συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Συντομογραφίες:. BS, όξινο θειώδες αλληλουχίας? CGI, το νησί CpG? ChIP, χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση? DCKO, διπλό knockout όρους του ποντικιού? DGC, διάχυτου τύπου γαστρικό καρκίνο? GAPDH, αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης? GC, γαστρικό καρκίνο? H3K4me3, της ιστόνης H3 λυσίνη 4 τρι-μεθυλίωση? H3K9me3, της ιστόνης H3 λυσίνη 9 tri-μεθυλίωση? H3K27me3, της ιστόνης H3 λυσίνη 27 tri-μεθυλίωση? MSP, μεθυλίωσης αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης-ειδική? RT-PCR, αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφής? qRT-PCR, ποσοτικής RT-PCR? ΕΠΠΕ, ογκοκατασταλτικά γονίδια? TSS, θέση έναρξης της μεταγραφής? 5-αζα-dC, 5-αζα-2′-δεοξυκιτιδίνη

Εισαγωγή

Twist1, ενεργώντας ως βασικός παράγοντας μεταγραφής έλικα-βρόχος-έλικα, συνδέεται άμεσα με στοιχεία E-box (NCANNTGN ) σε συγκεκριμένα γονίδια-στόχους [1]. Twist1 είναι ευρέως γνωστό ότι είναι απαραίτητη για το σχηματισμό μεσοδέρματος κατά τη διάρκεια της πρώιμης εμβρυϊκής ανάπτυξης των Drosophila και ποντικού [2, 3]. Σε ανθρώπινους καρκίνους, έκτοπη έκφραση Twist1 αναφέρεται ότι συνδέεται με κακοήθη εξέλιξη, εισβολή, επιθηλιακά-to-mechencymal μετάβαση, μετάσταση και βλαστική ικανότητα, υποδεικνύοντας δυναμικό ογκογόνο λειτουργίες Twist1 [4-6]. Έτσι, είναι πολύ σημαντικό να διευκρινιστούν οι μεταγραφικές ρυθμιστικές μηχανισμούς Twist1 σε καρκινικά κύτταρα.

επιγενετικές μεταβολές, όπως μεθυλίωση του DNA και τροποποίηση ιστονών, είναι στενά συνδεδεμένο με γονιδιακή σίγηση [7-9]. Αν και επιγενετικές μεταβολές στο CGI (νήσος CpG) περιοχή υποκινητή των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (ΟΚΓ) είναι καλά γνωστό ότι σχετίζονται με το γονίδιο αδρανοποίησή τους [10], οι μηχανισμοί επιγενετική ρύθμιση των ογκογονιδίων είναι ελάχιστα κατανοητή. Διάφορες ομάδες έχουν δείξει ότι

Twist1

επανενεργοποιήθηκε με κατεργασία με ένα φάρμακο de-μεθυλίωση, 5-αζα-2′-δεσοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC), σε καρκινικά κύτταρα [11, 12]. Παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA στο υποστηρικτής CGI σε ανθρώπινο

Twist1

έχει συχνά ανιχνευθεί σε πρωτογενείς καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του γαστρικού καρκίνου (GC) [11-14]. Παρ ‘όλα αυτά, υπάρχουν πολλά ευρήματα ότι η μεθυλίωση του DNA στο

Twist1

περιοχή υποκινητή δεν συσχετίζεται με την έκφραση του γονιδίου σε διάφορους καρκίνους [12, 14]. Ενώ

Twist1

μεθυλίωση μπορεί να είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη για να προβλέψει τις κλινικές εκβάσεις ως προς υποτροπής και την επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνους [12, 13, 15], παραμένει αμφιλεγόμενο κατά πόσον ή όχι το

Twist1

μεθυλίωση στην περιοχή υποκινητή οδηγεί σε αποσιώπηση του γονιδίου.

ρύθμιση Μεταγραφική γονιδίων συσχετίζεται με μοτίβα λυσίνη (Κ) μεθυλίωση στην ουρά ιστόνης που αποτελούνται από τρία διαφορετικά κράτη λυσίνη μεθυλίωσης (μονο-, δι- και τρι). Tri-μεθυλίωση της H3K4 (H3K4me3) σχετίζεται με ενεργοποίηση γονιδίου, και ότι από H3K9me3 και H3K27me3 με το γονίδιο καταστολής [7-9]. Παρά το γεγονός ότι αυτά τα σχέδια Η3-methyaltion τρεις ιστόνης συνδέονται με CGI μεθυλίωση καθώς και οι μεταγραφικές ρυθμιστικές μηχανισμούς για

Twist1

υποκείμενες τροποποίηση των ιστονών είναι ελάχιστα κατανοητή στα καρκινικά κύτταρα.

GC είναι η δεύτερη πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο στον κόσμο [16]. GC ταξινομούνται σε δύο κύριες ιστολογικές τύπους? διάχυτη και εντερικά, τα οποία είναι δύο ξεχωριστές οδούς καρκινογόνα [17]. Διάχυτη τύπου γαστρικό καρκίνο (DGC) είναι γνωστό για να δείξει συχνή εισβολή και μετάσταση, με αποτέλεσμα κακή πρόγνωση [18]. Απώλεια Ε-καδερίνης και ρ53 έχει αναφερθεί σε διάχυτου τύπου γαστρικό καρκινογένεση [19-21]. Αρκετές αναφορές δείχνουν συχνές υπερέκφραση του Twist1 στην ανθρώπινη dgcs [22, 23].

Έχουμε ήδη κατασκευαστεί ένα διπλό όρους νοκ-άουτ (DCKO) γραμμή του ποντικιού ως προς E-cadherin και p53, που αδρανοποιούνται ειδικά στο στομάχι [ ,,,0],19]. Όλα τα ποντίκια DCKO αναπτύξει θανατηφόρο dgcs μέσα σε ένα χρόνο, οι φαινότυποι είναι υψηλής διεισδυτικότητας και συχνή μετάσταση στους λεμφαδένες. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης των dgcs στα ποντίκια DCKO ανιχνεύονται στην ανάλυση μικροσυστοιχιών ήταν πολύ παρόμοιες με εκείνες των ανθρώπινων πρωτογενών dgcs πλην εντερική αυτά. Έτσι, το μοντέλο μας ποντίκι DCKO είναι ένα ισχυρό εργαλείο για τη διερεύνηση του ρόλου της λειτουργίας του γονιδίου σε DGC καρκινογένεση και για την ανάπτυξη μιας θεραπευτικής στρατηγικής. Σε αυτή τη μελέτη, ιδρύσαμε Twist1 έκφραση θετικών και -αρνητικοί κυτταρικές γραμμές DGC που προέρχονται από τα ποντίκια DCKO. Ως συνέπεια της ανάλυσης των επιγενετικών αλλαγών, η κοινή ρυθμιστικό μηχανισμό του

Twist1

διαλευκάνθηκε, και αξιολογήθηκαν σε δύο ποντικού και ανθρώπου dgcs σε αυτή τη μελέτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα

in vivo

διαδικασίες αυτές εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας ζώων του Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου (άδεια Νο 0160073A). Όσο για τη φυσιολογική ανθρώπινη γαστρικού βλεννογόνου δείγματα, γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα άτομα, και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου (No.1115).

κυτταροκαλλιέργειες και τα δείγματα ιστού

Έχουμε ήδη δημιουργήσει μια E-cadherin /p53 DCKO (

Atp4b-Cre

+

?

Cdh1

ΙοχΡ /ΙοχΡ

?

Trp53

μοντέλο ποντικού ΙοχΡ /ΙοχΡ

) [19]. Από τους καρκινικούς ιστούς της, ιδρύσαμε πέντε κυτταρικές σειρές ποντικού DGC και τους ονόμασε MDGCs (Shimada S, αδημοσίευτη παρατήρηση). MDGC-1 και κύτταρα MDGC-3 καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ) που περιέχει υψηλής γλυκόζης συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, και MDGC-7, MDGC-8 και MDGC-9 καλλιεργήθηκαν σε F12 του Ham συμπληρωμένο με 5% άλογο του ορού. ανάλυση του DNA έγινε με σκοπό την ανίχνευση της περικοπεί

Cdh1

και

Trp53

αλληλόμορφα (S1 Σχήμα). Οκτώ ανθρώπινες κυτταρικές σειρές GC (ΚΑΤΩ-ΙΙΙ, GCIY, AGS, ΜΚΝ7, ΜΚΝ45, ΜΚΝ74, NUGC4 και HSC60) χρησιμοποιήθηκαν επίσης στην μελέτη αυτή. ΜΚΝ7, ΜΚΝ45, ΜΚΝ74, GCIY και ΚΑΤΩ-III αγοράστηκαν από την τράπεζα κυττάρων RIKEN (Tsukuba, Ιαπωνία). NUGC4 και AGS κύτταρα ελήφθησαν από το Επιστημονικό Ερευνητικό Τράπεζα Ανθρώπινου Δυναμικού (Osaka, Japan) και ATCC (American Type Collection κυττάρων). κύτταρα HSC60 ελήφθησαν από τον Dr. Kazuyoshi Yanagihara (Εθνικό Κέντρο Έρευνας Καρκίνου, Τόκιο, Ιαπωνία) [24]. ΚΑΤΩ-ΙΙΙ, ΜΚΝ7, ΜΚΝ45, ΜΚΝ74, NUGC4, AGS και HSC60 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640, και GCIY καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Eagle Dulbecco, δύο από τα οποία συμπληρώθηκαν με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Για μελέτες de-μεθυλίωση, ποντικού και ανθρώπου κύτταρα GC υπέστησαν αγωγή ημερησίως με 500 ηΜ 5-αζα-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC, Sigma? # A3656) για 72 ώρες. Εμείς αντιμετωπίζονται αυτά τα κύτταρα GC με 100ηΜ τριχοστατίνης Α (TSA, Wako? # 200 – 11993) για 24 ώρες ή 100ηΜ μιθραμυκίνη Α (Wako? # 132 – 17101) για 24 ώρες

Δεκαοκτώ πρωτογενή ιστούς GC και τα αντίστοιχα. μη-καρκινικές γαστρικού βλεννογόνου ελήφθησαν από 15 ποντικούς DCKO. Όσον αφορά τους ανθρώπινους ιστούς στομάχου, χρησιμοποιήσαμε τρία μη-καρκινικές γαστρικού βλεννογόνου από ασθενείς GC. Λάβαμε επίσης πέντε φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνου από το

Atp4b-Cre

–

?

Cdh1

ΙοχΡ /ΙοχΡ

?

Trp53

ΙοχΡ /ΙοχΡ

ποντίκια που χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες σε προηγούμενη μελέτη μας [19]. Σε αυτή τη μελέτη, που ονομάζεται «κανονική γαστρικού βλεννογόνου», αν τα δείγματα ελήφθησαν από ποντικούς ελέγχου, και «μη-καρκινικές γαστρικού βλεννογόνου», αν τα δείγματα ελήφθησαν από ποντικούς DCKO και ανθρώπους ασθενείς με GC στη μελέτη αυτή.

Αντίστροφη μεταγραφή (RT) -PCR και ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR)

Ολικό RNA απομονώθηκε με ένα κιτ RNeasy Mini (Qiagen? # 74134) και cDNA παρασκευάστηκε από RNA χρησιμοποιώντας κιτ SuperScript III (Invitrogen? # 18080044) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Τελικό σημείο RT-PCR που διεξήχθη με πολλαπλούς αριθμούς κύκλου, 28-35 κύκλους. Ως εσωτερικός έλεγχος, αφυδρογονάση γλυκεραλδεϋδης-3-φωσφορικής (

GAPDH

) ενισχύθηκε με 21 κύκλους για την εξασφάλιση της ποιότητας και της ποσότητας cDNA για κάθε RT-PCR. Τα ενισχυμένα προϊόντα φορτώθηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 2% ή ποσοτικοποιείται με ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας LightCycler DNA κύριο SYBR Green Ι (Roche Diagnostics? # 04707516001). Τα προγράμματα ενίσχυσης για την PCR επαναλήφθηκαν για 40 κύκλους για GAPDH και 45cycles για άλλα γονίδια εκτός από το GAPDH. Τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν στον pMD20 Τ-φορέα με τη χρήση ενός κιτ Mighty ΤΑ-κλωνοποίηση (Takara BIO INC? # 6028), και στη συνέχεια αλληλουχήθηκαν απευθείας. Οι αλληλουχίες εκκινητών και τα μεγέθη PCR προϊόντος φαίνεται στον Πίνακα S1.

Ανάλυση μεθυλίωσης

εκχυλίζεται γενωμικού DNA από ποντικού και ανθρώπου κυτταρικές γραμμές GC με την μέθοδο φαινόλης-χλωροφορμίου, και στη συνέχεια διεξάγεται διθειώδες τροποποίηση και η διαδικασία MSP. Κατεργασία όξινου θειώδους του DNA πραγματοποιήθηκε με EZ μεθυλίωσης του DNA-Gold (ZYMO έρευνα? # D5006), και στη συνέχεια μεθυλίωση-ειδική PCR (MSP) διεξήχθη. Εν συντομία, η αντίδραση PCR διεξήχθη για 35 κύκλους σε ένα μίγμα 25 μΙ που περιέχει όξινο θειώδες-τροποποιημένο DNA, 2,5 μΙ 10Χ ρυθμιστικού PCR, 1,25 μΙ 25 mM dNTPs, 25 pmol /l από κάθε εκκινητή και 1 U πολυμεράσης JumpStart RedTaq (Sigma ? # D0563). Οι συνθήκες για την PCR ήταν ως ακολούθως: 95 ° C για 5 λεπτά? 35 κύκλοι των 95 ° C για 1 λεπτό, 53 ° C για 2 λεπτά, και 72 ° C για 1,5 λεπτό? και μία τελική επέκταση στους 72 ° C για 5 λεπτά. Όσο για τους ιστούς GC ποντικού, το DNA εκχυλίστηκε από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστούς. Bisulfite DNA ενισχύθηκε με περιβάλλοντες εκκινητές PCR και στη συνέχεια ένθετες MSP διεξήχθη [25, 26]. Οι αλληλουχίες εκκινητών και τα μεγέθη PCR προϊόντος φαίνεται στον Πίνακα S2

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασία

Η δοκιμασία ChIP διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα κιτ ChIP-IT Express (μοτίβου δραστικής? # 53008). σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ανοσοκατακρημνίστηκαν εμπλουτισμός DNA ομαλοποιήθηκε ως προς την είσοδο. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν αντι-ιστόνης H3K4me3 (μοτίβου δραστικής? # 39915), αντι-H3K9me3 (μοτίβου δραστικής? # 39765), αντι-H3K27me3 (μοτίβου δραστικής? # 39155), αντι-H3K36me2 (Abcam? # Ab9049) , αντι-Sp1 (Abcam? # ab13370), και αντι-ιστόνης Η3 (Active μοτίβο? # 39163) αντισώματα. Κανονική κουνελιού IgG (Cell Signaling Technology? # 2729s) χρησιμοποιήθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος για chip. Οι αλληλουχίες των εκκινητών και τα μεγέθη των προϊόντων PCR φαίνονται στον Πίνακα S2.

Νοκ ντάουν ανάλυση με τη χρήση μικρών RNAs παρεμβαίνει

siRNA που βασίζεται σε νοκ ντάουν του

Suv39h1

και

Suv39h2

εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτροδιάτρηση (σύστημα διαμόλυνσης νέον, Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. κύτταρα MDGC επιμολύνονται με 50ηΜ siRNA της Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226), ή αρνητικού ελέγχου siRNA (siRNA αποστολή Οικουμενική Αρνητικός μάρτυρας, Sigma). Μετά από 48 ώρες καλλιέργειας, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για RT-PCR, αναλύσεις κηλίδος Western, η μετανάστευση, εισβολή, και δοκιμασία πολλαπλασιασμού.

Ανάλυση Western Blot

κύτταρα GC λύθηκαν με ρυθμιστικό RIPA Pierce (Thermo επιστημονική? # 89900). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές και στη συνέχεια μεταφέρεται σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες, που ακολουθείται από επώαση με αντισώματα διαλύθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS) που περιέχει 2% αποβουτυρωμένο γάλα και 10% Tween 20. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό μελέτη ήταν μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-Twist1 (1: 100, Santa Cruz Bio-technology? # sc-81417), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-Sp1 (1: 200, Active Motif? # 39058), και μονοκλωνικό ποντικού αντι-α-τουμπουλίνης ( 1: 200, Santa Cruz? # sc-8035) αντισώματα. Τα δευτερεύοντα αντισώματα ήταν συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση IgG αντι-κουνελιού (1: 3000, Bio-Rad Laboratories? # 1706518) και αντι-ποντικού IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories? # 1706520). Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν με ImmunoStar AP Substrate (Bio-Rad Laboratories? # 1705018)

Ανοσοϊστοχημεία

τμήματα FFPE (4 μΜ) αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη διαλύματα αιθανόλης και στη συνέχεια ανάκτηση αντιγόνου. διεξήχθη σε ρυθμιστικό 10 mM κιτρικού οξέος με φούρνο μικροκυμάτων. Η ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-Twist1 (Santa Cruz, 1:20) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Η έκφραση του Twist1 ορίστηκε ως θετική πυρηνική χρώση σε περισσότερο από το 10% των κυττάρων, και η ένταση βαθμολογήθηκε AS-(αρνητική), + (ασθενές) και ++ (μέτρια έως ισχυρή) από τρεις ερευνητές ανεξάρτητα.

Αποτελέσματα

έκφραση Twist1 σε ποντικού και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές GC

από DGC ιστούς των ποντικών DCKO,

Twist1

μεταγραφή-θετικές κυτταρικές σειρές (MDGC-7, MDGC- 8 και αρνητικές κυτταρικές γραμμές (MDGC-1 και MDGC-3) MDGC-9) και καθορίστηκαν (Σχήμα 1Α και S2A σχήμα), και η έκφραση του Twist1 πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε σε κάθε κυτταρική σειρά (Εικόνα 1Β). Twist1 έκφραση ενισχύθηκε στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης σε Twist1 έκφραση-αρνητικά κύτταρα MDGC μετά τη θεραπεία με απομεθυλίωση DNA παράγοντα 5-αζα-dC (Σχ 1C και 1ϋ), ενώ η έκφραση του δεν άλλαξε μετά από θεραπεία με αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης TSA (S2B Σύκο). Στα οκτώ ανθρώπινες κυτταρικές GC γραμμές που εξετάστηκαν,

Twist1

έκφραση προς τα κάτω σε τέσσερις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Ε, αριστερά), τρία (ΚΑΤΩ-III, GCIY και AGS), εκ των οποίων απέδειξε την εκ νέου ενεργοποίηση του

Twist1

έκφραση μετά την αγωγή με 5-αζα-άΟ με RT-PCR (παράδειγμα, Σχήμα 1 Ε, δεξιά). Όσο για

Twist1

έκφραση-θετικού κυττάρου GC γραμμές, μετά από 5-αζα-dC θεραπεία, 2.1- και 3.2-φορές πάνω ρύθμιση

Twist1

ανιχνεύθηκε σε ΜΚΝ45 και ΜΚΝ7, αντίστοιχα, με qRT-PCR, ενώ η έκφραση Twist1 δεν άλλαξε σε MDGC-9 κύτταρα (Σχ 1 F).

(Α) RT-PCR ανάλυση του

Twist1

έκφραση mRNA σε κυτταρικές σειρές GC πέντε ποντικού MDGC-1, MDGC-3, MDGC-7, MDGC-8 και MDGC-9) από ποντίκια DCKO. Ποντίκι

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) Έκφραση Twist1 πρωτεΐνης σε κύτταρα MDGC με στύπωση Western. α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Γ και Δ) Επιπτώσεις ενός παράγοντα απομεθυλίωσης DNA σε κύτταρα MDGC. Μετά τη θεραπεία με 5-αζα-dC,

Twist1

έκφρασης up-ρυθμίζονται σε mRNA (C) και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Δ) σε Twist1 έκφραση-αρνητικά κύτταρα MDGC-1 και MDGC-3, αλλά όχι σε Twist1 έκφραση θετικών MDGC-9 κύτταρα. Μ, μακέτα? Α, 5-αζα-DC. (Ε) RT-PCR ανάλυση του

Twist1

έκφραση mRNA σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές GC (ΚΑΤΩ-ΙΙΙ, GCIY, AGS, ΜΚΝ74, ΜΚΝ7, ΜΚΝ45, NUGC4 και HSC60) (αριστερά).

Twist1

έκφρασης πάνω ρυθμισμένα σε επίπεδο mRNA σε ΚΑΤΩ-ΙΙΙ και κυττάρων GCIY μετά από αγωγή 5-αζα-dC (δεξιά). Ανθρώπινα

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. ανάλυση (F) qRT-PCR του

Twist1

έκφραση mRNA σε MDGC-9, ΜΚΝ7 και ΜΚΝ45 κυττάρων με και χωρίς 5-αζα-dC θεραπεία (** Ρ & lt? 0,01).

Η

CGI μεθυλίωση και την έκφραση του

Twist1

σε κυτταρικές σειρές GC

Twist1

έχει μια πυκνή περιοχή CGI από τον ανάδοχο για ολόκληρο το εξώνιο 1, αυτή η περιοχή είναι εξαιρετικά διατηρημένη μεταξύ των σπονδυλωτών, συμπεριλαμβανομένων ποντικού και ανθρώπου (S3 Εικ). Για να διευκρινιστεί η CGI σε ποντικού και ανθρώπου

Twist1

, πραγματοποιήσαμε υπολογιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας UCSC γονιδίωμα Browser (https://genome.ucsc.edu/index.html) και MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /), το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως ως αναγνώριση του CGI και MSP εκκινητών [27]. Αναλύσαμε περίπου 1,4 kb περιοχή, συμπεριλαμβανομένου του υποκινητή και ολόκληρο το εξώνιο 1. UCSC γονιδίωμα Browser για ποντικού και ανθρώπου ανάλυση εμφάνισε ένα CGI στην περιοχή που εξετάστηκε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, υποθετικές δύο θέσεις CGI ανιχνεύθηκαν στην περιοχή τόσο ποντικού και ανθρώπου, όταν χρησιμοποιήσαμε τα κριτήρια της CGI με GC περιεκτικότητα 50% και παρατηρήθηκαν αναλογία CpG 0,8 με MethPrimer (Σχήμα 2Α και 2C) /αναμενόμενο. Αυτές οι δύο υποθετικές περιοχές CGI βρίσκονταν στον υποκινητή και το εξόνιο 1. Δεδομένου ότι η μεθυλίωση στην περιοχή του υποκινητή έχει αναφερθεί σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [12, 14], εξετάσαμε αρχικά την κατάσταση μεθυλίωσης στην περιοχή σε ποντικού και ανθρώπου κυτταρικές γραμμές GC από MSP. Ωστόσο, η κατάσταση μεθυλίωσης στην περιοχή του υποκινητή του

Twist1

δεν αντιστοιχούν σε έκφραση του σε κάθε κυτταρικές σειρές GC εξετάστηκαν (περιοχή Ρ1, Σχήμα 2Α). Για τον προσδιορισμό των κριτικά μεθυλιωμένα περιοχές που συνδυάζονται με την έκφραση σε κύτταρα Twist1 MDGC, εκτελέσαμε περαιτέρω MSP στην περιοχή CGI στο εξόνιο 1 (Ε1-1, Ε1-2 και Ε1-3), και η προβλεπόμενη θέση ακτή CpG βρίσκεται περίπου 1.6 kb από TSS (ιστοσελίδα μεταγραφή εκκίνησης, S1) (Σχήμα 2Α). Ως αποτέλεσμα, CGI μεθυλίωση στην περιοχή (Ε1-1 και Ε1-2) γύρω από την TSS σε

Twist1

εξόνιο 1 βρέθηκε να αντιστοιχεί προς την έκφραση του γονιδίου σε κύτταρα MDGC, αν και δεν υπήρχε συσχετισμός μεταξύ τους στην προβλεπόμενη περιοχή ακτή (S1) και το τέλος του εξονίου 1 περιοχή (Ε1-3) (Εικόνα 2Β, αριστερά) σε κύτταρα MDGC. Δεν μεθυλίωση ανιχνεύθηκε σε οποιαδήποτε περιοχές CpG σε τρεις φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνων χωρίς έκφραση Twist1 από

Atp4b-Cre

–

?

Cdh1

ΙοχΡ /ΙοχΡ

?

Trp53

ΙοχΡ /ΙοχΡ

ποντίκια (Σχήμα 2Β). Σε ανθρώπινο γαστρικό βλεννογόνο, δεν

Twist1

μεθυλίωση βρέθηκε επίσης σε τρεις μη-καρκινικές γαστρικού βλεννογόνου από ασθενείς GC (Σχήμα 2D), ένα από τα οποία έδειξε πολύ ασθενή

έκφραση Twist1

(δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα ). Εξετάσαμε επίσης επιπρόσθετες τέσσερις μη-καρκινικές γαστρικού βλεννογόνου από ασθενείς GC, ενώ δεν μεθυλίωση ανιχνεύθηκε σε περιοχή Ε1-2 σε οποιεσδήποτε περιπτώσεις (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Bisulfite αλληλουχίας (BS) απέδειξαν ότι η περιοχή CGI στο εξόνιο 1 έδειξε πυκνή μεθυλίωση σε Twist1 έκφραση-αρνητικά κύτταρα MDGC-3 αλλά όχι σε Twist1 θετικά MDGC-9 κύτταρα (BS-c, σχήμα 2Α και 2Β, δεξιά), ενώ εκεί ήταν καμία διαφορά στα πρότυπα μεθυλίωσης μεταξύ τους στην ακτή CpG και περιοχών προαγωγού (BS-a και BS-b, S4A Σχ). Μεταξύ των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών GC, ΚΑΤΩ-III και GCIY χωρίς να

Twist1

έκφρασης έδειξε πυκνή μεθυλίωση CGI στην περιοχή του εξονίου 1 (Ε1-2), η οποία είναι συνεπής με αυτά του ποντικιού

Twist1

(Σχήμα 2C και 2D, αριστερά). Τόσο μεθυλίωση και unmethylation στην περιοχή Ε1-2 ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα ΜΚΝ7 και ΜΚΝ45 με MSP και διθειώδες αλληλουχίας (Σχήμα 2D), τα οποία εκφράζονται basally Twist1 αλλά τα επίπεδα έκφρασης τους αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία 5-αζα-dC (Σχήμα 1 F). Έτσι, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η μεθυλίωση της εξόνιο 1 περιοχή του

Twist1

ανιχνεύεται σε αυτή τη μελέτη συσχετίζεται με την έκφραση του.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση της γονιδιωματικής δομής και η προβλεπόμενη CGI με MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/) του ποντικιού

Twist1

γονίδιο. Δύο CGIs (λεπτή μπλε περιοχές, αριστερά, -358 έως -149? Δεξιά, -96 έως 759) παρατηρήθηκαν στην περιοχή από τον προαγωγό σε ολόκληρο εξόνιο 1 (Παρατηρ /Exp = 0,8,% GC & gt? 50%). Το λυγισμένο βέλος δείχνει τη θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS). Οι μεμονωμένες θέσεις CpG υποδεικνύεται ως πορτοκαλί κάθετες γραμμές. Τα κουτιά υποδηλώνουν το εξόνιο. Τα μαύρα βέλη δικέφαλο δείχνουν τις περιοχές (S1, Ρ1, Ε1-1, Ε1-2 και Ε1-3) εξετάζονται από ειδικούς μεθυλίωσης PCR (MSP). Τα μπλε βέλη δικέφαλο δείχνουν τις περιοχές που εξετάστηκαν με τη δοκιμασία chip. Οι κόκκινες γραμμές δείχνουν τις περιοχές που εξετάστηκαν από όξινο θειώδες αλληλουχίας (BS). (Β) Ανάλυση MSP των κυτταρικών σειρών MDGC και τρεις κανονικές γαστρικού βλεννογόνου από το

Atp4b-Cre

–

?

Cdh1

ΙοχΡ /ΙοχΡ

?

Trp53

ΙοχΡ /ΙοχΡ

ποντίκια στις πέντε περιφέρειες (αριστερά). U: μη μεθυλιωμένη αλληλόμορφα? M: μεθυλιωμένα αλλήλια. BS της περιοχής από την +322 να 670 (BS-C) σε MDGC-3 και MDGC-9 (δεξιά). BS-a και BS-b φαίνονται στο S3 Σχ. Η περιοχή MSP της Ε1-2 και BS-c αντιστοιχούν σε

Twist1

έκφρασης. Μαύροι κύκλοι αντιπροσωπεύουν το μετουσιωμένο ιστοσελίδα CpG? λευκοί κύκλοι αντιπροσωπεύουν τα μη μεθυλιωμένα CpG θέσεις. (C) Σχηματική αναπαράσταση της γονιδιωματικής δομής και η προβλεπόμενη CGI με MethPrimer του ανθρώπινου

Twist1

γονίδιο. Δύο CGIs (αριστερά, -369 έως -138? Σωστά, 91-742) παρατηρήθηκαν (Παρατηρ /Exp = 0,8,% GC & gt? 50%). (D) MSP και BS αναλύσεις ανθρώπινων κυτταρικών σειρών GC και τρεις μη-καρκινικές γαστρικού βλεννογόνου από ασθενείς GC. Εμείς αξιολογούνται τέσσερις περιοχές (αριστερά, Ρ1, Ε1-1, Ε1-2 και Ε1-3) και εξόνιο 1 (δεξιά, 315 – 651, BS-γ) στην ανθρώπινη

Twist 1

γονίδιο, που βρίσκονται αναλόγως με MSP ποντικιού και περιοχές BS. Πυκνά μεθυλίωση ανιχνεύθηκε σε κύτταρα ΚΑΤΩ-III λείπει

Twist1

έκφραση, ενώ ΜΚΝ45 κύτταρα που εκφράζουν

Twist1

εκτίθενται τόσο μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων αλληλόμορφα.

Η

Twist1

μεθυλίωση και έκφραση σε δείγματα ιστών DCKO ποντίκι GC

Εξετάσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης του

Twist1

χρησιμοποιώντας 18 πρωτογενείς ιστούς GC από 15 ποντίκια DCKO. Επειδή οι περιοχές GC ήταν πολύ μικρά και το DNA τους από δείγματα FFPE έδειξαν χαμηλές συγκεντρώσεις, εκτελέσαμε ένθετη MSP [25, 26].

Twist1

ήταν σημαντικά μεθυλιώθηκε (9/18, 50%) στην πρωτογενή GCs σε σύγκριση με τα αντίστοιχα μη-καρκινικούς ιστούς (1/10, 10%), που είναι στατιστικά σημαντική διαφορά (Ρ & lt? 0,05, Πίνακας 1). Τα αντιπροσωπευτικά δεδομένα από MSP φαίνεται στο σχήμα 3Α. Μεταξύ αυτών, 4 από 10 (40%) περιπτώσεις ήταν εντός του βλεννογόνου και 5 από 8 (62,5%) ήταν επεμβατική GCs (Πίνακας 1). Σε αυτή τη μελέτη,

Twist1

μεθυλίωση-θετικών περιπτώσεων αποδεικνύεται μη μεθυλιωμένα μπάντες MSP, καθώς, η οποία οφείλεται στην παρουσία των φυσιολογικών στρωματικών /ινοβλαστών και φλεγμονωδών κυττάρων σε τομές καρκινικού ιστού, αν και δεν μπορούσε να αρνηθεί τη δυνατότητα μερικής μεθυλίωσης όπως ΜΚΝ45 και ΜΚΝ7 και την ετερογένεια των όγκων.

(Α) Εκπρόσωπος αποτελέσματα των ένθετων ανάλυση MSP του

Twist1

στο dgcs από ποντίκια DCKO και ένα αντίστοιχο μη-καρκινικές γαστρικό βλεννογόνο (λωρίδα N). Οι περιοχές (Ε1-2) αναλύονται φαίνεται στο Σχήμα 2Α. U: μη μεθυλιωμένη αλληλόμορφο? M: μεθυλιωμένο αλλήλιο. (Β) Εκπρόσωπος ανοσοϊστοχημική χρώση των Twist1 πρωτεΐνης σε DGC ιστούς από ποντίκια DCKO. (I) Ισχυρή πυρηνική χρώση των Twist1 πρωτεΐνης σε GC χωρίς μεθυλίωση. (Ii) Αρνητική έκφραση πρωτεΐνης Twist1 σε GC με μεθυλίωση. Αρχική μεγέθυνση, χ400. (C) Περίληψη του

Twist1

μεθυλίωση και την έκφραση στην πρωτοβάθμια dgcs.

Twist1

μεθυλιώθηκε σε 9 από 18 GCs, όπως υποδεικνύεται από τον Μ Η ένταση της χρώσης Twist1 βαθμολογήθηκε AS-(αρνητική), + (ασθενές) και ++ (μέτρια έως ισχυρά). Ποντίκι GCs χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, εντός του βλεννογόνου και επεμβατική GCs σύμφωνα με τα κριτήρια του ανθρώπινου GC συστάθηκε με την ιαπωνική γαστρική Ένωση Καρκίνου [53].

Η

έκφραση της πρωτεΐνης Twist1 ανιχνεύθηκε σε 7 της 18 (38,9%) σε σύγκριση με GCs αντίστοιχα μη-καρκινικές γαστρικού βλεννογόνου με ανοσοϊστοχημεία. Αντιπροσωπευτικές εικόνες που παρουσιάζονται στο Σχήμα 3Β. Αναλύσαμε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ των

Twist1

επίπεδα έκφρασης και μεθυλίωσης σε αυτές τις περιπτώσεις. Μεταξύ των 18 πρωτοβάθμια GC εξετάστηκαν, εννέα περιπτώσεις έδειξαν συσχέτιση μεταξύ

Twist1

μεθυλίωση και της έκφρασης (Σχήμα 3C). Τρεις από τις τέσσερις περιπτώσεις με Twist1 ασθενής έκφραση επέδειξε μεθυλίωση του, πιθανόν ότι η χαμηλή έκφραση του Twist1 μπορεί να προκληθεί από μεθυλίωση του. Ωστόσο, υπόλοιπα πέντε περιπτώσεις δεν επέδειξε μεθυλίωση και την έκφραση (Πίνακας 1).

ιστόνης μεθυλίωση σχετίζεται με την ρύθμιση του

Twist1

έκφραση

επόμενο διερευνήθηκε εάν ή όχι το λυσίνη επίπεδο μεθυλίωσης της ιστόνης Η3 συμβάλλει στην

Twist1

έκφρασης. Χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασίες διεξήχθησαν σχετικά με την προβλεπόμενη CpG ακτή (CP1.3k), προαγωγό (CP1), και τα εξόνια 1 (CE1-1 και CE1-2) και 2 (CE2) περιοχές (σχήμα 2Α). Στις περιοχές CP1 και CE1-2, ενεργό σήμα ιστόνης H3K4me3 εμπλουτίστηκε σε έκφραση-θετικά κύτταρα Twist1 (MDGC-7 και MDGC-9), αλλά ανενεργό σήμα ιστόνης H3K9me3 εμπλουτίστηκε σε έκφραση-αρνητικά κύτταρα Twist1 (MDGC-1 και MDGC -3) (Σχ 4Α και 4Β). δοκιμασίες ChIP εμφάνισαν τόσο H3K4me3 και σήματα H3K9me3 σε MDGC-1 και κύτταρα MDGC-3 με 5-αζα-dC θεραπεία, αναφέροντας τις αυξημένα επίπεδα H3K4me3 σε αυτά τα κύτταρα (Εικόνα 4C). Αντίθετα, τα επίπεδα H3K27me3 και H3K36me2 δεν συσχετίστηκαν με την έκφραση Twist1 σε οποιαδήποτε κύτταρα MDGC εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Όσο για το ανθρώπινο κύτταρο GC γραμμές, μια παρόμοια περιοχή που βρίσκεται από τον προαγωγό σε εξώνιο 1 έδειξε εμπλουτισμό H3K4me3 στο

Twist1

έκφραση θετικών ΜΚΝ45 κύτταρα, και H3K9me3 στο

Twist1

έκφραση αρνητικών ΚΑΤΩ-III κύτταρα (Σχήματα 2C και 4D).

(Α) ιστόνης κατάσταση μεθυλίωσης στην έκφραση-θετικά κύτταρα Twist1 (MDGC-7 και MDGC-9) και -αρνητική κύτταρα (MDGC-1 και MDGC-3). δοκιμασία ChIP διεξήχθη χρησιμοποιώντας H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3 και H3K36me2 αντισώματα. Οι πέντε περιοχές ChIP (CP1.3k, CP1, CE1-1, CE1-2 και CE2) αναλύονται φαίνεται στο Σχήμα 2Α. δειγμάτων εισόδου DNA χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι. (Β) Ημι-ποσοτική ChIP αναλύσεις των ιστονών H3K4me3 και H3K9me3 εμπλουτισμού. ChIP εντάσεις αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας J Image λογισμικού 1.47v, και στη συνέχεια ChIP /Input υπολογίστηκε. Ενεργό σήμα της ιστόνης H3K4me3 εμπλουτίστηκε στην έκφραση-θετικά κύτταρα Twist1, αλλά το σήμα ανενεργό ιστόνης H3K9me3 εμπλουτίστηκε στην έκφραση-αρνητικά κύτταρα Twist1. (Γ) Η σχέση μεταξύ της ιστόνης και CGI μεθυλίωση στα κύτταρα MDGC. MDGC-1 και MDGC-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-άΟ και η κατάσταση μεθυλίωσης των ιστονών του H3K4me3 και H3K9me3 τους εξετάσθηκε με ανίχνευση chip. Τα επίπεδα H3K4me3 αυξήθηκαν σε αυτές τις 5-αζα-άΟ-κατεργασμένων κυττάρων σε σύγκριση σε χωρίς θεραπεία ελέγχους (Σχ 4Α), όπως φαίνεται από τα τρίγωνα. (D) Ημι-ποσοτική ανάλυση τσιπ H3K4me και H3K9me3 σε ανθρώπινα κύτταρα GC. Οι περιοχές (CP1, CE1-2) αναλύονται φαίνεται στο σχήμα 2C. Παρόμοια με τα στοιχεία για το ποντίκι

Twist1

(Σχήμα 4Β), τα επίπεδα H3K4me3 και H3K9me3 εμπλουτίστηκαν στα κύτταρα ΜΚΝ45 και ΚΑΤΩ-ΙΙΙ, αντίστοιχα. Η μέση (στήλη) ± SD (bar) για τρεις ανεξάρτητους ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης σε διαφορετικά πειράματα υποδεικνύεται (** P & lt? 0,01).

Η

Suv39h1

και

Suv39h2

, μια μεθυλοτρανσφεράση των ιστονών, ρυθμίζει H3K9me3

υπάρχουν πολλοί μεθυλτρανσφερασών ιστόνης που σχετίζονται με H3K4, H3K9 και H3K27 [28]. Ως εκ τούτου, για να καθορίσει ποια ιστόνης τροποποίηση ένζυμα είναι υπεύθυνα για την H3K4me3 ή H3K9me3 εμπλουτισμό κατά τη

Twist1

εξόνιο 1 περιοχή στα κύτταρα GC, εξετάσαμε δέκα H3K4me3 (

Mll1

,

Mll2

,

Mll3

,

Mll4

,

Setd1a

,

Setd1b

,

Ash1

,

Ash1l

,

Smyd3

και

Meisetz

), επτά H3K9me3 (

Suv39h1

,

Suv39h2

,

G9a

,

Setdb1

,

Clld8

,

Glp

και

Riz1

), και ένα H3K27me3 (

ΕΖΗ2

) που σχετίζονται με τα γονίδια. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνεται στο Σχήμα 5Α. Μεταξύ αυτών, τα επίπεδα έκφρασης του

Suv39h1

και

Suv39h2

ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το

Twist1

έκφρασης. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων υπόλοιπες 16 ιστόνης methylatasferase εξετάστηκαν δεν συνδέθηκαν με το

Twist1

έκφραση σε κύτταρα MDGC. Πραγματοποιήσαμε siRNA που βασίζεται σε νοκ ντάουν του

Suv39h1

ή

Suv39h2

στις αντίστοιχες έκφραση θετικών MDGC-1 και MDGC-3 κύτταρα με ηλεκτροφόρηση (σχήμα 5Β). Νοκ ντάουν του

Suv39h1

ή

Suv39h2

σε αυτές τις κυτταρικές σειρές οδήγησε σε αύξηση του

Twist1

έκφραση παρατηρείται στην RT-PCR (σχήμα 5Β) και qRT-PCR (MDGC- 1, σχήμα 5C).

(Α) Έκφραση μεθυλτρανσφερασών ιστονών για H3K4 (

Mll1

,

Mll2

,

Mll3

,

Mll4

,

Setd1a και Ash1l

), H3K9 (

Suv39h1

,

Suv39h2

,

G9a και Setdb1

), και H3K27 (

ΕΖΗ2

) προσδιορίστηκε με RT-PCR. Τα επίπεδα έκφρασης του

Suv39H1

και

Suv39H2

ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το

Twist1

έκφρασης.

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β και Γ) Επίδραση του

Suv39h1

ή

Suv39h2

νοκ ντάουν στο

Twist1

έκφραση στα κύτταρα MDGC. RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε MDGC-1 και MDGC 3-κυττάρων με

Twist1

έκφρασης μετά από επιμόλυνση si

Suv39h1

(sih1), si

Suv39h2

(sih2) ή αρνητικού ελέγχου (sinc) siRNA. (Γ) Η

Twist1

,

Suv39h1

και

Suv39h2

επίπεδα mRNA σε κύτταρα MDGC-1 επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με qRT-PCR. Οι κίονες και τα μπαρ δείχνουν μέσους και Τ.Α., αντίστοιχα. ** P & lt?. 0.01

Η

Σύλλογος SP1 με την μεταγραφική ρύθμιση του

Twist1

Η

Η συναίνεση 5 ‘- (G /T) GGGCGG (G /α) (G /A) (C /T) -3 ‘ακολουθία είναι γνωστό ως το μοτίβο σύνδεσης του παράγοντα μεταγραφής SP1 και μια σχέση μεταξύ CGI μεθυλίωση και Sp1 δέσμευσης στον υποκινητή έχει αναφερθεί [29, 30]. Πολλαπλές θέσεις δέσμευσης Sp1 είχαν προβλεφθεί στην CpG-πλούσια περιοχή στο

Twist1

εξώνιο 1 με TFBIND (https://tfbind.hgc.jp) και JASPAR (https://jaspar.binf.ku.dk) .